Actividad Enzimática

Integrantes:
Enmanuel Samudio 4-806-820
enmanuel806samudio@gmail.com
Allison Espinosa 4-801-1006
allisonespinosa29@gmail.com
Stefany Batista
stefany.99.23@gmail.com
Silvia

Biología General 3011

Escuela de medicina y cirugía
Facultad ciencias de la salud y medicina
Columbus University
David Chirichi República de Panamá
Profesora: Angela Aguila
 Resumen
El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción
catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los
inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir
el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones
del sustrato y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza
iónica del medio, la temperatura, entre otros. Se evalúa la influencia de estos
factores en la reacción catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los
intermediarios en una reacción y el papel que juegan en la reacción enzimática, es
decir, para predecir mecanismos de reacción. Es esencial entender estos
mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para
combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. También
es usual medir la actividad enzimática con diferentes sustratos para entender su
especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u
organismos para entender cómo las diferencias en actividad están relacionadas con
la función y/o la fisiología del organismo del que proceden. En este laboratorio se
realizaron distintos métodos (cambio de temperatura, peróxido de hidrogeno,
vinagre, solución de bicarbonato de sodio en agua) que afectan la afectan o influyen
en la actividad enzimática para así saber en qué circunstancia el ph del hígado,
papa, pimentón y tomate cambia y ver que reacción sucede al cambiar y así
entender porque la actividad enzimática es importante y porque sucede esto.
Palabras Claves
 Peróxido de Hidrogeno
 Catalasa
 Desinfectante
 actividad enzimática
 antioxidantes
 termodinámica
 metabolismo
 catalizadores
 Biuret
 Objetivos
 Comprobar la reacción sobre el
peróxido de hidrógeno por acción
de la enzima catalasa, presente en
tejidos animales y vegetales
determinando los productos de
reacción.
 Estudiar algunos factores que
afectan la actividad enzimática,
como la temperatura, el pH, la
concentración del sustrato y de la
enzima y la presencia de
inhibidores.
 Confrontar los conocimientos
teóricos adquiridos en clases con
las actividades experimentales en
el laboratorio.
 Observar la actividad de la
catalasa.
 Entender por qué se utiliza el
peróxido de hidrogeno como
desinfectante y el uso de la
catalasa en alimentos como
antioxidantes.
Marco Teórico
Las enzimas son moléculas de
naturaleza proteica que catalizan
reacciones químicas, siempre que
sean termodinámicamente posibles:
una enzima hace que una reacción
química que es energéticamente
posible (ver energía libre de Gibbs),
pero que transcurre a una velocidad
muy baja, sea cinéticamente
favorable, es decir, transcurra a mayor
velocidad que sin la presencia de la
enzima. En estas reacciones, las
enzimas actúan sobre unas moléculas
denominadas sustratos, las cuales se
convierten en moléculas diferentes
denominadas productos. Casi todos
los procesos en las células necesitan
enzimas para que ocurran a unas
tasas significativas. A las reacciones
mediadas por enzimas se las
denomina reacciones enzimáticas.
Debido a que las enzimas son
extremadamente selectivas con sus
sustratos y su velocidad crece solo
con algunas reacciones, el conjunto
(set) de enzimas presentes en una
célula determina el tipo de
metabolismo que tiene esa célula. A
su vez, esta presencia depende de la
regulación de la expresión génica
correspondiente a la enzima. Como
todos los catalizadores, las enzimas
funcionan disminuyendo la energía de
activación (ΔG‡) de una reacción, de
forma que la presencia de la enzima
acelera sustancialmente la tasa de
reacción. Las enzimas no alteran el
balance energético de las reacciones
en que intervienen, ni modifican, por lo
tanto, el equilibrio de la reacción, pero
consiguen acelerar el proceso incluso
en escalas de millones de veces. Una
reacción que se produce bajo el
control de una enzima, o de un
catalizador en general, alcanza el
equilibrio mucho más deprisa que la
correspondiente reacción no
catalizada.
Al igual que ocurre con otros
catalizadores, las enzimas no son
consumidas en las reacciones que
catalizan, ni alteran su equilibrio
químico. Sin embargo, las enzimas
difieren de otros catalizadores por ser
más específicas. La gran diversidad
de enzimas existentes cataliza
alrededor de 4000 reacciones
bioquímicas distintas. No todos los
catalizadores bioquímicos son
proteínas, pues algunas moléculas de
ARN son capaces de catalizar
reacciones (como la subunidad 16S
de los ribosomas en la que reside la
actividad peptidil transferasa).
También cabe nombrar unas
moléculas sintéticas denominadas
enzimas artificiales capaces de
catalizar reacciones químicas como
las enzimas clásicas. La actividad de
las enzimas puede ser afectada por
otras moléculas. Los inhibidores
enzimáticos son moléculas que
disminuyen o impiden la actividad de
las enzimas, mientras que los
activadores son moléculas que
incrementan dicha actividad.
Asimismo, gran cantidad de enzimas
requieren de cofactores para su
actividad. Muchas drogas o fármacos
son moléculas inhibidoras.
Igualmente, la actividad es afectada
por la temperatura, el pH, la
concentración de la propia enzima y
del sustrato, y otros factores físico-
químicos. Muchas enzimas son
usadas comercialmente, por ejemplo,
en la síntesis de antibióticos o de
productos domésticos de limpieza.
Además, son ampliamente utilizadas
en diversos procesos industriales,
como son la fabricación de alimentos,
distinción de vaqueros o producción
de biocombustibles.
Factores que afectan a la actividad
enzimática
Diferentes factores ambientales
pueden afectar a la actividad
enzimática. Destacaremos dos: el pH
y la temperatura.
Efecto del pH: El pH es otro factor
que influye en la actividad enzimática,
debido a que el pH influye en la
ionización de los grupos funcionales
de los aminoácidos que forman la
proteína enzimática. Cada enzima
realiza su acción dentro de un
determinado intervalo de pH, dentro
de este intervalo habrá un pH óptimo
donde la actividad enzimática será
máxima. Por debajo del pH mínimo o
por encima del pH máximo el enzima
se inactiva ya que se desnaturaliza. En
la mayoría de las enzimas el pH
óptimo está próximo a la neutralidad,
aunque hay excepciones. La mayoría
de los enzimas presentan un pH
óptimo para el cual su actividad es
máxima; por encima o por debajo de
ese pH la actividad disminuye
bruscamente. Este efecto se debe a
que, al ser los enzimas de naturaleza
proteica, al igual que otras proteínas,
se desnaturalizan y pierden su
actividad si el pH varía más allá de
unos límites estrechos. De ahí la
conocida importancia biológica de los
sistemas tampón. En la mayor parte
de los casos el pH óptimo está
próximo a la neutralidad, en
consonancia con el pH intracelular,
pero existen enzimas con pH óptimo
muy diverso según sea el pH del
medio en el que habitualmente actúan
(los enzimas proteolíticos del jugo
gástrico tienen pHs óptimos próximos
a 2 ya que este es el pH de dicho
jugo). Por último existen algunos
enzimas a los que el pH no afecta en
absoluto.
Efecto de la temperatura: Al igual
que ocurre con la mayoría de las
reacciones químicas, la velocidad de
las reacciones catalizadas por
enzimas se incrementa con la
temperatura. La variación de la
actividad enzimática con la
temperatura es diferente de unos
enzimas a otros en función de la
barrera de energía de activación de la
reacción catalizada. Sin embargo, a
diferencia de lo que ocurre en otras
reacciones químicas, en las
reacciones catalizadas por enzimas se
produce un brusco descenso de la
actividad cuando se alcanza una
temperatura crítica. Este efecto no es
más que un reflejo de la
desnaturalización térmica del enzima
cuando se alcanza dicha temperatura.
La Temperatura influye en la actividad
enzimática. En general por cada 10ºC
que aumente la temperatura la
velocidad de la reacción aumenta de 2
a 4 veces. Esta regla se cumple hasta
que la temperatura alcanza un valor
máximo (T° óptima) donde la actividad
es máxima. Esto se debe a que al
aumentar la T° aumenta el movimiento
de las moléculas y, por tanto aumenta
la probabilidad de encuentro entre el S
y el E. Si la T° aumenta por encima de
la T° óptima, disminuye e incluso cesa
la actividad enzimática debido a que la
enzima se desnaturaliza. Cada
enzima posee una T° óptima, en las
enzimas humanas suele estar
alrededor de 37ºC. Los animales
poiquilotermos debido a que carecen
de mecanismos para regular la Tª
corporal, se ven obligados a hibernar
en la estación fría pues la actividad de
sus enzimas debido a las bajas
temperaturas es muy baja.
Inhibidores: Son compuestos
químicos que se unen al enzima, en
distintos puntos del mismo y
disminuyen o incluso impiden su
actividad. Estos compuestos pueden
ser de distintos tipos: iones, moléculas
orgánicas y a veces el producto final
de la reacción. A la acción que realizan
se la denomina inhibición. La
inhibición puede ser:
 Inhibición irreversible: Cuando el
inhibidor impide permanentemente
la actividad enzimática, bien
porque se une de forma
permanente con grupos
funcionales importantes del centro
activo o bien porque altera su
estructura. A estos inhibidores se
les denomina venenos y a la
inhibición que realizan se la
denomina envenenamiento del
enzima. Ej. La penicilina que inhibe
las enzimas que sintetizan la pared
bacteriana. El ion cianuro actúa
sobre la citocromo oxidasa
(enzima respiratorio).
 Inhibición reversible: El inhibidor
se une al enzima de forma
temporal mediante enlaces débiles
e impide el normal funcionamiento
del mism, pero no la inutiliza
permanentemente. Puede ser de
dos tipos: Competitiva: El inhibidor
es similar al sustrato y se puede
unir al centro activo del enzima
impidiendo que lo haga el sustrato.
Es decir ambos, inhibidor y
sustrato compiten por unirse al
centro activo del enzima. La acción
suele anularse aumentando la
concentración del sustrato No
competitiva: El inhibidor no
compite con el sustrato, puede
actuar de 2 formas:
 Sobre el enzima, uniéndose a él en agentes alteran las fuerzas de
un lugar diferente al centro activo y dispersión, los enlaces de hidrógeno y
modificando su estructura lo que los enlaces iónicos.
dificulta que el enzima se pueda
Materiales y Reactivos
unir con el sustrato.
 Sobre el complejo E-S uniéndose a Materiales
él y dificultando su desintegración Tubos de ensayo 22
y por lo tanto la formación de los Vasos de precipitados 2
productos. Tiras de ph 22
Estufa 1
La descomposición del peróxido de Bisturí 1
hidrógeno es un proceso biológico pipeta 1
importante. Debido a que el peróxido Cuchara de Combustión 1
de hidrógeno (H2O2) es fuertemente Probeta 2
oxidante, puede ser fisiológicamente Gradilla 1
nocivo. Por esta razón, la sangre y el Malla de asbesto 1
hígado de los seres vivos contienen
una enzima, la catalasa, que cataliza
Reactivos
la descomposición del peróxido de
Hígado 5 trozos
hidrógeno en agua y oxígeno, como se
papa 5 trozos
observa en esta reacción
Pimentón 5 trozos
2 H2O2+ catalasa 2 H2O2+O2. tomate 5 trozos
Agua oxigenada 38 ml
Si el hígado se macera, las células se Vinagre Blanco 16 ml
rompen, con lo cual la reacción con Solución de bicarbonato
peróxido de hidrógeno se lleva a cabo 16ml
de sodio en agua
con más rapidez y la espuma que Biuret 2 ml
resulta se debe al desprendimiento de Agua 10 ml
oxígeno gaseoso de la mezcla de la Saliva ?
reacción. La enzima catalasa, al ser
una proteína puede desnaturalizarse.
La desnaturalización de una proteína
implica la alteración de sus estructuras
secundaria, terciaria o cuaternaria,
dejando intacta la estructura primaria;
el resultado de esto es que la proteína
nativa (como se encuentra en la
célula) pierde su actividad biológica.
La desnaturalización de las proteínas
ocurre cuando se exponen al calor
(temperatura mayor a 50 grados
Celsius), la luz ultravioleta, los ácidos,
las bases, los disolventes orgánicos y
las sales de metales pesados; estos
 Metodología Repita el mismo procedimiento con
la papa, pimentón, tomate.
Actividad de la catalasa:
Actividad enzimática de la amilasa
1. Marcar 3 tubos de ensayo con letra
salival
A, B, C.
2. Cortar 3 pedacitos de hígado. 1. Recolecte saliva (no moco) en un
3. Agregue al tubo A: Hígado + 2ml vaso químico.
de H2O2. 2. agregue 10 ml de agua y revuelva.
4. Agregue al tubo B: Hígado + 2ml 3. Tome 2 tubos de ensayos y
de vinagre blanco. enumérelos 1 y 2.
5. Agregue al tubo C: Hígado + 2ml 4. En el tubo 1 agregue 1ml de
de solución de bicarbonato de solución de salva preparada.
sodio en agua. 5. En el tubo 1 agregue 1ml de agua
6. Observe durante 3 minutos. 6. Agregue 1ml de solución de biuret
7. Anote lo que sucedido en cada a los tubos 1 y 2.
tubo de ensayo. 7. Coloque los tunos en un vaso
químico y observe.
PH
Diseño Experimental
1. Mida el ph de los 3 tubos de
ensayo.
2. Anote.
3. Luego deseche el sobrante del
tubo B y C dejando el hígado.
4. Añada a cada tubo de ensayo (B y
C), 2ml de H2O2.
5. Observe lo sucedido y anote.
6. Tome el pH
Factores que afectan la actividad
enzimática
1. Colocar 2 tubos de ensayo y
enumerarlos.
2. Hervir un pedazo de hígado en un
vaso de precipitados hasta que se
cosa.
3. Colocar en cada tubo lo siguiente:
 Tubo 1: pedacitos de hígado crudo
+ peróxido de hidrogeno.
 Tubo 2: pedacitos de hígado
Cosido + peróxido de hidrogeno.
4. Anote los resultados y mida el pH
 Resultados y Cálculos 1. ¿Qué es la velocidad de una
reacción enzimática?
Reactivos Hígado
La cinética química puede ser
H2O2 5ph
descrita como el estudio de un
Vinagra blanco 3ph
sistema químico cuya composición
Solución de Bicarbonato de
9ph cambia con el tiempo. Estos
sodio en agua
H2O2 5ph cambios pueden realizarse en
Cosido 6ph cualquier estado de la materia
(sólido, líquido o gas) de una
substancia. Una reacción que
Reactivos Tomate ocurre en una sola fase, se conoce
H2O2 7ph como una reacción homogénea,
Vinagra blanco 3ph por el contrario, una reacción que
Solución de Bicarbonato de ocurre en la interface entre dos
9ph
sodio en agua fases, es una reacción
H2O2 4ph
heterogénea
Cosido 5ph
2. ¿Cómo se define la constante de
Michael (km) de una reacción
Reactivos Pimiento enzimática?
H2O2 4ph La representación gráfica de la
Vinagra blanco 2ph ecuación de Michaelis-Menten (v0
Solución de Bicarbonato de frente a [S]0) es una hipérbola
9ph
sodio en agua (Figura de la izquierda). La Vmax
H2O2 5ph corresponde al valor máximo al
Cosido 9ph que tiende la curva experimental, y
la KM corresponde a la
Reactivos Papa concentración de sustrato a la cual
H2O2 4ph la velocidad de la reacción es la
Vinagra blanco 2ph mitad de la Vmax.
Solución de
Bicarbonato de sodio 9ph
en agua
H2O2 4ph
Cosido 7ph

Reactivo Solución de saliva

Biuret 12ph
3. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de
Reactivo Agua algunas enzimas?
Biuret 11ph
Las enzimas son proteínas que
circulan en el organismo
constantemente, cumpliendo
funciones extremadamente
importantes. Posibilitan que se
cumplan las reacciones químicas
del metabolismo en general. Sin
ellas sería imposible el mismo
metabolismo y por lo tanto la vida.
Son muchísimas y cada una de
ellas se encarga de que se realicen
ciertas reacciones. A su vez dentro
de cada una existen variables de
las mismas que se llaman
isoenzimas. Algunas son
fabricadas en ciertos órganos y
actúan fuera de él. Como ejemplos
tenemos a las glándulas como el
páncreas que fabrica la lipasa y la
amilasa que actúan en el proceso
digestivo. Otras actúan dentro del
mismo órgano como es el caso de
las transaminasas GOT y GPT del
hígado o las LDH en el corazón.
Sin embargo muy pocas enzimas
son enteramente específicas de
cada órgano. La GOT se halla en
muchos órganos no solo en el
hígado. Las enzimas normalmente
se hallan en cierta cantidad en la
sangre por una cuestión del
recambio celular normal. La célula
al morir o destruirse libera su
contenido y entre ese contenido
hay enzimas. Pero la situación
cambia mucho cuando un órgano
sufre una patología como es el
caso de una hepatitis que daña al
hígado o un infarto agudo de
miocardio en donde el tejido es
dañado y se liberan al torrente
sanguíneo una cantidad muy
grande de éstas. En el laboratorio
es mucho más práctico medir la
actividad de una proteína de éstas
que medir su cantidad en el suero.
Revela mucho mejor la presencia y
el accionar de esta. Por este
motivo la medición de la actividad
enzimática constituye un poderoso
método para diagnosticar algunas
patologías, pero también sirve para
evaluar el proceso en una
enfermedad. Esta área tan
importante en el laboratorio se
denomina enzimología clínica. Por
ejemplo es importante saber si una
hepatitis está respondiendo al
tratamiento y por supuesto
esperamos que los valores vayan
bajando durante dicho tratamiento.
También sirve para evaluar
tumores hepáticos o cirrosis como
en el alcoholismo que se mide la
GGT del hígado.
4. ¿Cuáles son las enzimas cuya
determinación tiene valor
diagnostico?
Las enzimas biológicas permiten
que las reacciones metabólicas
procedan con rapidez. Las
enzimas con significado clínico
funcionan en forma intracelular.
Cuando se produce algún daño a
los tejidos por enfermedades o
lesiones, se liberan enzimas a la
circulación y su actividad puede
medirse como indicador de dichos
daños. La actividad enzimática
varía de acuerdo con la ubicación
celular. Por lo tanto, el patrón de
elevación enzimática es útil para
detectar y diferenciar diversas
enfermedades. Además existen
varias isoenzimas en las que se
observa una leve diferencia
estructural de la enzima que
depende del tejido primario en el
cual se sintetiza. Esta diferencia
estructural permite separar las
enzimas totales en todas sus
formas isoezimáticas. Por este
motivo, en vez de la determinación
de una sola enzima, las baterías de
pruebas enzimáticas que constan
del análisis de dos o más enzimas
o isoenzimas en vez de la
determinación de una sola enzima,
ofrecen una mayor sensibilidad y
especificidad diagnósticas para la
detección de afecciones. La
batería enzimática característica
para diversas afecciones cardiacas
está conformadas de análisis de
CK, isoenzima CK, LDH,
isoenzima LDH y AST. La
isoenzima CK-MB y el patrón
isoenzimático invertido de LDH
proporcionan mayor información
diagnóstica para detectar el infarto
al miocardio. Las enzimas que se
solicitan para el diagnóstico de
afecciones hepáticas incluyen
AST, ALT, GGT y ALP. De ellas la
AST y la ALT se elevan más en
afecciones hepatocelulares,
mientras que la GGT y la ALP
indican, con mayor frecuencia,
afecciones hepatobiliares. La
batería de pruebas enzimáticas
para afecciones pancreáticas
están conformadas de análisis de
AMS y LPS; la CK total y la CK-MN
son los indicadores más
específicos de afecciones
musculares. A medida que se
cuente con tecnología más
avanzada, los análisis enzimáticos
ofrecerán una sensibilidad y
especificidad diagnósticas aún
mayores, con capacidad para
distinguir y detectar mejor las
isoenzimas y las isoformas de las
mismas.
5. ¿Qué reacción cataliza la
catalasa? ¿Dónde se encuentra?
¿Por qué es tan importante?
La Catalasa es una enzima
presente en muchos tipos de
células. Su función es proteger a
las células del efecto tóxico del
peróxido de hidrógeno (agua
oxigenada) producido en distintas
reacciones redox
Cataliza la reacción:
2 H2O2 -----------> 2 H20 + O2
Fue una de las primeras enzimas
purificadas y ha sido muy
estudiada. Es una de las enzimas
más eficientes con una velocidad
de aproximadamente 200,000
transformaciones/segundo/subuni
dad. La proteína es un tetrámero
formado por cuatro subunidades
idénticas (350,000 kD). Cada
monómero contiene un grupo
prostético Hemo en el centro
activo. En algunas especies
también contiene una molécula de
NADP por subunidad cuya función
es proteger a la enzima de la
oxidación por su sustrato H2O2.
Discusión de Resultados
 Conclusiones
Como producto del análisis de los
resultados del experimento realizado
en el laboratorio, se pueden extraer las
siguientes conclusiones:
 La temperatura es un factor
determinante en las reacciones
enzimáticas porque acelera o
retarda la acción de las enzimas, lo
que se evidencia con la producción
de burbujas.
 Para que la catalasa funcione
correctamente debe tener un ph
neutro y temperatura ambiente.
Referencias Bibliográficas
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MORALES ÁLVAREZ, E.D.:
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Visitar Web: Universidad de
Quindio, Facultad de Educación.
Consulta 27 de julio de 2010.
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