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PRACTICA DE LABORATORIO N° 01
TINCION DE GRAM

I. INTRODUCCION

El universo que descubrió Leeuwenhoek estuvo conformado por

bacterias y protozoarios de diversas características. Es por ello que hoy en día
sabemos que hay millones de microorganismos que se encuentran en todos
los lugares de nuestro planeta, en al agua dulce y salada, por tanto viven en el
aire, agua y tierra, se les halla tambien en los alimentos, en el exterior y el
interior de los seres vivos. También causan enfermedades y otros que
son beneficiosos para nosotros.
Por eso es de vital importancia conocer sobre estos microorganismos.
Especialmente hablaremos sobre bacterias, tipos, características y diferencias
entre gramnegativas y positivas.
Las bacterias pertenecen al filum de las Shizomycophyta, se les llama también
microbios o gérmenes. Son de pequeño tamaño. Casi siempre son
unicelulares.
Estan recubiertas por una pared celular de naturaleza quitinosa en su
superficie externa. Poseen prolongaciones filamentosas que les permiten
desplazarse otras tienen flagelos.
La pared celular que rodea a las bacterias es compleja y existen dos formas
básicas: pared celular grampositiva con una gruesa capa de péptidoglucano y
una pared gramnegativa con una delgada capa de péptidoglucano, así como
una membrana externa.

II. OBJETIVOS
- Comprender la base teórica y química de los procedimientos de
tinción diferencial.
- Comprender la base química de la tinción de Gram
- Comprender el procedimiento para diferenciar entre dos grupos
principales de bacterias: Gram positivas y Gram negativas

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III. MATERIALES

MECHERO

ASA DE
SIEMBRA

PORTAOBJETOS

PORTAOBJETOS

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IV. MARCO TEORICO

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias
que NO se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un
color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también "gram
negativas". Esta característica está
íntimamente ligada a la
estructura didérmica dada por
la envoltura celular, pues presenta
doble membrana celular (una
externa y la otra citoplasmática), lo
que refleja un tipo natural de
organización bacteriana. Son uno de
los principales supergrupos
de bacterias y cuando se tratan
como taxón se utiliza también el nombre de Negibacteria2 o Didermata. Las
restantes son las bacterias Gram positivas.

Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que
se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias
Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de
peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante
durante la tinción de Gram.3

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades.

Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria
gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis) y síntomas respiratorios
(Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran
número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades
respiratorias (Haemophilus influenzae,Klebsiella pneumoniae , Legionella
pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia
coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y
enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella

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enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones

nosocomiales (Acinetobacter baumanii).

ESTRUCTURA

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por

una membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada
de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre
la pared celular de estas bacterias.4 Entre la membrana citoplasmática interna y la
membrana externa se localiza el espacio periplásmico relleno de una sustancia
denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición en
estas bacterias. Retienen la safranina.

La membrana externa contiene diversas proteínas, siendo una de ellas

las porinas o canales proteícos que permiten el paso de ciertas sustancias.
También presenta unas estructuras llamadas lipopolisacáridos (LPS), formadas

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por tres regiones: el polisacárido O (antígeno O), una estructura polisacárida

central (KDO) y el lípido A (endotoxina).

Las bacterias Gram-negativas pueden presentar una capa S que se apoya

directamente sobre la membrana externa, en lugar de sobre la pared de
peptidoglicano como sucede en las Gram-positivas. Si presentan flagelos, estos
tienen cuatro anillos de apoyo en lugar de los dos de las bacterias Gram-positivas
porque tienen dos membranas. No presentan ácidos teicoicos niácidos
lipoteicoicos, típicos de las bacterias Gram-positivas. Las lipoproteínas se unen al
núcleo de polisacáridos, mientras que en las bacterias Gram-positivas estos no
presentan lipoproteínas. La mayoría no forma endosporas (Coxiella burnetti, que
produce estructuras similares a las endosporas, es una notable excepción).

Patogenia y tratamiento

Neisseria gonorrhoeae, agente causal de la gonorrea.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Una de las
varias características únicas de las bacterias Gram-negativas es la estructura de
la membrana externa. La parte exterior de la membrana comprende un complejo
de lipopolisacáridos cuya parte lípida actúa como una endotoxina y es
responsable de la capacidad patógena del microorganismo. Este componente
desencadena una respuesta inmune innata que se caracteriza por la producción
de citocinas y la activación del sistema inmunológico. La inflamación es una
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consecuencia común de la producción de citocinas, que también pueden producir

toxicidad. Si la endotoxina entra en el sistema circulatorio, provoca una reacción
tóxica con aumento de la temperatura y de la frecuencia respiratoria y bajada de
la presión arterial. Esto puede dar lugar a un shock endotóxico, que puede ser
fatal.

Esta membrana externa protege a las bacterias de varios antibióticos, colorantes

y detergentes que normalmente dañarían la membrana interna o la pared celular
de peptidoglicano. La membrana externa proporciona a estas bacterias
resistencia a la lisozima y a la penicilina. Afortunadamente, se han desarrollado
otros tratamientos alternativos para combatir la membrana externa de protección
de estos patógenos, tales como la lisozima con EDTA, y el antibiótico ampicilina.
También pueden usarse otras drogas, a
saber, cloranfenicol, estreptomicina y ácido nalidíxico.

FILOGENIA DE LAS BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

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Árbol filogenético de los seres vivos considerando que las bacterias Gram-
positivas (Posibacteria) se han originado a partir de las Gram-negativas
(Negibacteria), de acuerdo con las ideas de Cavalier-Smith.

Dentro del grupo de las bacterias Gram-negativas podemos distinguir dos

subgrupos: Eobacteria yGlycobacteria que se distinguen por la composición de la
membrana externa. En los primeros, la membrana externa presenta solo simples
fosfolípidos, mientras que en los segundos además presenta la inserción de
moléculas complejas de lipopolisacáridos (la estructura típica descrita
anteriormente). Por ello se considera queEobacteria son las bacterias más
primitivas. Incluye a Chlorobi (bacterias fotosintéticas anoxigénicas) y
aDeinococcus-Thermus (quimiorganotrofos extremófilos); estos últimos, aunque
dan positivo en la tinción de Gram son estructuralmente similares a las bacterias
Gram-negativas.

El resto de las bacterias Gram-negativas se clasifican en Glycobacteria.

Las proteobacterias son uno de los grupos principales, incluyendo a Escherichia
coli, Salmonella y
otras enterobacterias, Pseudomonas, Moraxella,Helicobacter, Stenotrophomonas,
Bdellovibrio, bacterias del ácido acético, Legionella y las proteobacterias
alfacomo Wolbachia y muchas otras. Otros grupos notables son
las cianobacterias, espiroquetas y las bacterias verdes del azufre y no del azufre.

No está claro que la segunda membrana sea una característica primitiva o

derivada. Si fuese primitiva, las bacterias Gram-negativas serían las primeras
bacterias en originarse con las Gram-positivas derivándose a partir de
ellas. Cavalier-Smith considera que la doble membrana es una característica
primitiva y que la segunda membrana se perdió al crecer la pared de
peptidoglicano que impide la transferencia de lípidos para formar la membrana
externa. La hipótesis del citoplasma fuera describe un posible modelo para la
aparición de la doble membrana de las bacterias Gram negativas.

*Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da consistencia y forma

esencial para replicación y supervivencia de la bacteria.

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V. PROCEDIMIENTO

1. Previa fijación de la muestra, cubrirla con la solución fenicada de violeta de

genciana o la Hucker.

Tiempo: de 30 a 60 segundos, aproximadamente.

2. Lavar con agua

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3. Cubrir con lugol y dejar actuar de 2 a 3 minutos.

4. Lavar

5. Decolorar con alcohol, solo o con alcohol-acetona hasta que ya no se

desprenda más colorante de la lámina, luego lavar

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6. Contrastar con safranina.

7. Lavar, secar y observar a inmersión.

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VI. RESULTADOS

Estafilococo Bacilo
s

Bacterias Gram positivas de

Los estafilococos son cocos Bacillus (bacilos morados)
Gram positivos

Microbacteria Tuberculosis

Son Bacterias Gram positivas (aunque frente a

esta tinción, son débilmente Gram positivas o
no se tiñen), pero tienen aspectos distintos.

Escherichia coli Escherichia coli

Bacterias Escherichia coli (Gram Bacterias Escherichia coli (Gram

negativas) negativas)

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VII. DISCUSIONES
1. los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es
realmente importante para el diagnóstico y buen tratamiento de la
patología relacionada microorganismos es necesario saber cómo
influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes
entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas en su detección y en el tratamiento. Porque existen
componentes de la pared celular que contribuyen a la virulencia
delas bacterias protegiéndolas de las respuestas inmunitarias. En el
laboratorio se desearía eliminar de forma selectiva las bacterias
Gram positivas de una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram
negativas. La tinción de Gram no es una prueba fiable de tinción de
bacterias en medios de cultivo con escasos nutrientes (p. ej.,
cultivos viejos o en fase estacionaria) o tratados con antibióticos
debido a la degradación del peptidoglicano por parte de estos
fármacos.
2. Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre
las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas

- La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa

capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos:
Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie,
el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano
(también conocido como mureína)

- Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas

es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana
plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio
de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a

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una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está

hecha de proteína,fosfolípido y lipopolisacárido.

- Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente

debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la
pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha
mayor proporción que las Gram negativas.

3. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se

debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble
en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo
se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más
resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este
actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloración azul-violeta.

4. A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe

ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según
la edad de las células (cultivos viejos de bacterias Gram positivas
pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como Gram
negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy
prolongado se puede correr el riesgo que bacterias Gram positivas
se tiñan como Gram negativas),Es por esta situación que junto a la
muestra deben teñirse controles con bacterias Gram positivas (ej. S.
aureus) y Gram negativas (ej. E. coli).
5. Stearn (1923), Los microorganismos Gram positivos pueden
hacerse Gram negativos al aumentar la acidez.

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 Los microorganismos Gram negativos pueden hacerse Gram

positivos al aumentar la alcalinidad.
 Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes
ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la
alcalinidad.
 Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes
básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
 En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy
escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
6. Gianni (1952) comprobó que los microorganismos Gram positivos
Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram
cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se
desarrollaba la sustancia Gram positiva debajo de la pared celular,
para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram
puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un
núcleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la
reacción Gram positiva depende de que se forme una combinación
compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las
proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias
desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese
tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales
de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes Gram positivos
desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario
y toman negativamente el Gram.

7. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared

celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y
colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al
complejo constituido, son los principales factores que intervienen en
el mecanismo de esa coloración.

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VIII. CONCLUSIONES
1. La tinción Gram es una prueba potente y rápida que nos permite diferenciar
dos clases de bacterias estas son: Bacterias grampositivas y las
gramnegativas.
2. Las grampositivas se tiñen de morado ya que el colorante se queda
atrapad en la capa gruesa de peptidoglucanos que rodea a la célula.
3. Las gramnegativas tienen una capa de petidoglucano mucho más delgada
es por ello que no retiene el violeta cristal y por esto las células se tiñen
con safranina y las observamos rojas.
4. Se concluye también que las gram positivas retienen la tinción azul y
conservan el complejo yodocolorante.
5. Las gram negativas quedan decoloradas y pierden el complejo
yodocolorante y pueden ser anaeróbicos y aerobicos.
6. Las bacterias son causantes de infecciones y enfermedades. ALgunas son
beneficiosas para la agricultura, industria, salud y la investigación.
7. El colorante reacciona con la celula bacteriana, pero no con su medio
exterior.
8. Debido eso la tinción es importante para la microbiología debido a que:
- Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo
rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.
- Permite el estudio de las estructuras internas de la celula bacteriana,
tales como paredes celulares vacuolas o cuerpos celulares.
- Permite el empleo de mayores amplificadores.

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IX. CUESTIONARIO

1. Mencione 2 maneras de cómo realiza la fijación de la muestra.

1. Examen en fresco.- Este método tiene la ventaja de una gran

simplicidad y por otra parte no produce alteración alguna en las
muestras; en histología animal se presentan grandes inconvenientes
para su uso, puesto que sólo pueden utilizarse, bien para organismos
vivos de pequeño tamaño o bien para piezas sumergidas durante un
tiempo limitado en líquidos fisiológicos. Los vegetales presentan ventajas
sobre los animales, ya que se pueden fácilmente cultivar en el laboratorio
o bien llevarlos desde el campo al mismo sin que los procesos de lisis se
presenten con la rapidez que ocurren en los tejidos animales.

Aún teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha
frecuencia debe recurrirse en histología vegetal al uso de fijadores, bien
porque las muestras se recojan lejos del laboratorio durante campañas
botánicas más o menos amplias o porque los trabajos se prolonguen
excesivamente debido a largos tratamientos, por lo que es necesario
recurrir a la fijación de las muestras a estudiar.

2. Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se

sumergen en la solución fijadora. Hay que tener en cuenta algunas
precauciones.

1) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para

que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience
a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetración del fijador
y de las características del tejido. Por ejemplo, si tiene cavidades por
donde penetre la solución fijadora el volumen podría ser mayor.

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Fijación por inmersión.

2) El volumen recomendado de fijador es 20 veces superior al volumen

de la pieza.

3) El tiempo de fijación depende de cada tipo de fijador. Una agitación

suave durante la fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye
el tiempo.

2. Explique el fundamento de la coloración Gram.

La coloracion gram consiste en adicionar cierta cantidad de algún colorante
donde se puede observar que las bacterias que se tiñen de un color azul
son gram positivas y las de un tiñe rojo o de color rosa son positivas.

3. Explique la función del lugol y en que favorece a la coloración

El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro

de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el
yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I 2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta.

4. Si usted, pudiera elegir entre el alcohol y el alcohol-acetona ¿Cuál

elegirías?

El alcohol – acetona porque es mejor disolviendo el contenido lipídico de la

pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular)

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5. Qué otros colorantes de contraste se podrían utilizar

Los colorantes que también se podrían usar serian el azul de metileno,

cristal violeta, safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con
componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacaridos ácidos (las envueltas externas de los
microorganismos están por lo general cargadas negativamente).

6. Por qué la necesidad de utilizar el objetivo de inmersión

Porque la necesidad de utilizar el objetivo de inmersión. Los rayos que

desde la muestra se dirigen al objetivo atraviesas el vidrio del cubre objeto
y al pasar al aire se separa de la normal. Algunos rayos incluso sufren
reflexión total en la interface vidrio – aire. Solo llega al microscopio una
pequeña parte de la luz que parte de la muestra, con el problema que
conlleva para la visión.

7. Por qué en algunos procedimientos varían los tiempos de exposición

a los colorantes

Porque en algunos procedimientos varían los tiempos de exposición a los

colorantes. Esto es debido

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X. BIBLIOGRAFIA
1. www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm
2. www.bio-nica.info/biblioteca/BacteriasEnfermedades.pdf
3. http://www.danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/tincion/tincion_gramneg.
html
4. D.Male; J. Brostoff; D. Broth;I. Roitt. Inmunología. España. Séptima edición.
Editor Elsevier Mosby, 2007. 535 p.
5. Patrick.R.Murray. Microbiología Médica. España, 5ta edición. Editor Elsevier
Mosby 2006 . 963 p.
6. Patrick R. Murray , Ken S. Rosenthal, Michael A, Pfaller . Microbiologia Medica,
6ta Edicion 2009 Elsevier España, S.L
7. http://es.scribd.com/doc/43696269/Tincion-de-gram-Introduccion-desarrollo-e-
interpretacion-de-resultados-Practica-2
8. http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram#Fundamentos_de_diferenci
aci.C3.B3n_de_Gram_positivo_y_Gram_negativo

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