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TEMA:
“ESTUDIO DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN CONTINUA A PARTIR DE JUGO
DE CAÑA Y RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS PARA LA OBTENCIÓN DE
BIOETANOL”
LUGAR DE REALIZACIÓN:
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA
ASESOR INTERNO:
DRA. LETICIA LÓPEZ ZAMORA
PRESENTAN:
HÉCTOR DANIEL HERNÁNDEZ RAMOS
JOSÉ ALFREDO ORTÍZ MARTÍNEZ
NO. DE CONTROL
13010602
13010631
i
RESUMEN
Hoy en día a nivel mundial, a raíz del agotamiento de los combustibles fósiles, ha
incrementado la necesidad de desarrollar nuevas energías renovables a través de diferentes
procesos que puedan ir sustituyendo paulatinamente el uso de estos energéticos. Los
biocombustibles ofrecen una alternativa viable y sustentable que no atenta contra el medio
ambiente teniendo como uno de sus mayores exponentes el bioetanol de segunda generación,
debido a que es producido a partir de recursos naturales, dentro de los cuales se encuentran
residuos como la madera, olote y el café que cuentan con alto contenido lignocelulósico
(celulosa, hemicelulosa y lignina) y el jugo del bagazo de caña el cual presenta un potencial
alto de azúcares fermentables. En México dependiendo de la zona es común encontrar este
tipo de materiales, pero no se ha estudiado ampliamente el potencial fermentativo que pueden
llegar a tener en un proceso continuo, ya que los residuos lignocelulósicos al contar con una
estructura complicada, deben seguir tratamientos diferentes con el fin desglosar su anatomía.
Se aplicó un pretratamiento ácido a los residuos con el fin de remover la mayor cantidad de
hemicelulosa, un pretratamiento alcalino para la remoción de lignina y se llevó a cabo una
cinética prueba de una hidrólisis enzimática aprovechando el contenido de celulosa,
utilizando celulasa Cellic CTec3, la cual demostró que los pretratamientos utilizados
previamente no fueron los óptimos, ya que no se alcanzó una concentración de azúcares alta.
Los jugos provenientes del pretratamiento ácido recibieron un proceso de reducción hasta
alcanzar una concentración de 100 g/L de azucares fermentables y un ajuste de pH a 5.5 con
NaOH, mientras que el jugo de bagazo de caña se adaptó a una concentración de azucares de
140 g/L. A partir de un diseño simplex centroide se llevaron a cabo cinéticas de crecimiento
con el fin de obtener el óptimo para el mejor medio de adaptación de cada uno utilizando
como material biológico la levadura Saccharomyces cerevisiae ITV01. Para su posterior
análisis se tomó como variable de respuesta la µmáx. El estudio de la fermentación continua
se llevó a cabo utilizando para el jugo de bagazo de caña tres diferentes tasas de dilución (τ)
(0.04, 0.06 y 0.08) mientras que para los jugos hidrolizados se ocupó solo a 0.08, bajo las
condiciones de inoculo de 3x106 células/mL para la fermentación Batch hasta alcanzar el
máximo crecimiento de levaduras, en un fermentador de 1.2 L a un volumen de operación de
1 L. En este proceso se evaluó la cantidad de biomasa durante la fermentación, asi como
también la cantidad de azucares reductores y la cantidad de etanol producido.
ii
INDICE
Lista de Figuras vii
Lista de Tablas ix
INTRODUCCIÓN x
DESCRIPCIÓN DE LA ORGANIZACIÓN x
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA xi
DELIMITACIÓN xii
OBJETIVO GENERAL. xii
OBJETIVOS ESPECÍFICOS. xii
JUSTIFICACIÓN xiii
CAPÍTULO I I
1.1 Materiales lignocelulósicos 2
1.1.1 Estado del arte 2
1.1.2 Composición de materiales lignocelulósicos 2
1.2 Caña de azúcar 3
1.3 Jugo de caña de azúcar. 3
1.4 Biocombustibles 4
1.4.1 Biocombustibles de primera generación 5
1.4.2 Biocombustibles de segunda generación 5
1.4.3 Biocombustibles de tercera generación 5
1.4.4 Bioetanol 6
1.4.5 Bioetanol como combustible 6
1.4.6 Ventajas del bioetanol 7
1.4.7 Desventajas del bioetanol 8
1.5 Estructuras lignocelulósicas 8
1.5.1 Celulosa 9
1.5.2 Hemicelulosa 10
1.5.3 Lignina 11
1.5.4 Influencia de la biomasa lignocelulósica en su procesamiento 13
1.6 Hidrólisis 13
1.6.1 Hidrólisis ácida 13
1.6.2 Hidrólisis alcalina 14
1.6.3 Hidrólisis enzimática 14
iii
1.7 Fermentación 15
1.7.1 Parámetros y condiciones de operación en la fermentación 15
1.7.2 Fermentación Batch 16
1.7.3 Fermentación Continua 16
1.7.4 Cinética de crecimiento de las levaduras en la fermentación 17
1.8 Elementos fermentadores 18
1.8.1 Levaduras modificadas 18
1.8.2 Levadura Saccharomyces Cerevisiae 19
1.9 Trabajos relacionados realizados por otros autores 19
CAPÍTULO II 23
2.1 Alcances y limitaciones 23
2.1.1 Alcances 23
2.1.2 Limitaciones 23
2.2 Procedimiento y descripción de actividades 23
2.3 Metodología 23
2.4 Obtención de los residuos lignocelulósicos 23
2.5 Caracterización 24
2.5.1 Humedad 24
2.5.2 Determinación de carbohidratos estructurales y lignina (NREL) 24
2.5.3 Grados Brix (°Bx) 25
2.5.4 pH 25
2.5.5 Determinación de azúcares (DNS) 25
2.5.6 Determinación de alcohol. 25
2.6 Acondicionamiento de la materia prima 25
2.7 Hidrólisis. 25
2.7.1 Pretratamiento ácido 25
2.7.2 Pretratamiento alcalino 26
2.7.3 Hidrólisis enzimática 27
2.7.4 Inactivación de la enzima 28
2.8 Nutrientes 29
2.8.1 Material biológico 29
2.8.2 Activación de la levadura 29
2.8.3 Medios de cultivo 29
iv
2.8.4 Medios de conservación 29
2.9 Condiciones de fermentación 30
2.9.1 Precultivo y preinóculo 30
2.9.2 Fermentación por lotes (Cinéticas) 31
2.9.3 Velocidad máxima de crecimiento (μmax) 31
2.9.4 Análisis de Biomasa 32
2.9.5 Conteo celular 32
2.9.6 Productividad 32
2.10 Análisis de la materia prima e hidrolizados por HPLC 33
2.10.1 Análisis de datos a partir de HPLC para NREL 33
2.11 Fermentaciones 34
2.11.1 Montaje de equipo 34
2.11.2 Montaje del equipo en sistema de fermentación continúa. 34
2.11.3 Flujo de alimentación al reactor en sistema continuo. 35
2.11.4 Tiempo de residencia(𝝉) en sistema continuo 35
2.11.5 Fermentación con jugo de caña en cultivo continuo en fermentador de 1L 36
2.11.5.1 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.04 36
2.11.5.2 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.06 37
2.11.5.3 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.08 37
2.11.6 Fermentación con jugos hidrolizados en sistema continuo en fermentador de
1L. 37
2.11.6.1 Fermentación continua con jugo hidrolizado de Olote y café en fermentador
de 1L a D=0.08 38
CAPÍTULO III 23
3.1 Obtención de los residuos lignocelulósico 40
3.2 Resultados de la caracterización 40
3.3 Hidrólisis 41
3.3.1 Hidrólisis ácida 41
3.3.2 Pretratamiento Alcalino 42
3.3.3 Hidrólisis Enzimática 43
3.4 Fermentación por lotes 45
3.4.1 Comportamiento del Jugo de caña 46
3.4.2 Comportamiento del hidrolizado ácido del olote 48
3.4.3 Comportamiento del hidrolizado ácido del café 51
v
3.4.4 Comportamiento del hidrolizado ácido de la madera 54
3.5 Fermentaciones 55
3.5.1 Fermentación Continua de Jugo de Caña 55
3.5.2 Fermentación Continua de Hidrolizados ácidos 57
3.6 Evaluación de consumo de sustrato y producción de etanol 59
3.7 Evaluación estadística 61
3.8 Productividad optima de la fermentación continua del jugo de caña. 68
Conclusiones 69
Recomendaciones 70
Bibliografía 71
Anexo A 75
Anexo B 76
Anexo C 84
Anexo D 85
vi
Lista de Figuras
FIGURA PAG
3.11 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el 51
jugo hidrolizado ácido de olote
3.12 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el 51
jugo hidrolizado ácido de olote
3.13 Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del café 52
3.17 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.04 h-1 55
3.18 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.06 h-1 56
vii
3.19 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.08 h-1 57
3.20 Cinética de hidrolizado de café con una tasa de dilución de 0.08 h-1 58
3.21 Cinética de hidrolizado ácido de Olote con una tasa de dilución de 0.08 h -1 59
3.26 Diagrama de contorno del diseño simplex centroide para el jugo de caña. 63
viii
Tablas
TABLA PAG
1.1 Composición de diferentes materiales lignocelulósicos. (SungyChen, 3
2002, citado por Cuervo et al., 2009)
1.2 4
Composición de azucares en el jugo de caña. (Meade&Chen, 1997,
citado por Espinoza, 2015).
2.1 4
Parámetros para la caracterización de los residuos lignocelulósicos
3.5 Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del jugo de caña. 64
3.7 Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del hidrolizado 66
del olote
3.8 ANOVA diseño de mezclas para el hidrolizado de café 67
B1 Longitudes de onda sugerida para el espectro UV 79
ix
ESTUDIO DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN CONTINUA A PARTIR DE
JUGO DE CAÑA Y RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS PARA LA OBTENCIÓN
DE BIOETANOL
INTRODUCCIÓN
Existe una tendencia global, en el desarrollo de las energías renovables, esto obliga a
considerar un portafolio amplio y competitivo de proyectos así como medidas audaces, lo
que incluye tanto la eliminación de barreras y promoción de la energía renovable, así como
la consideración de otras tecnologías no fósiles (Lovettet al., 2011).
México no es la excepción y enfrenta retos en materia ambiental, donde los costos a la salud
y al ambiente derivados de la generación y del uso de la energía son significativos. Si se
pretende que la energía acompañe un crecimiento económico del país por arriba del histórico,
será necesario aumentar la capacidad instalada del parque de generación para suministrar la
energía asociada, tanto a un mayor consumo industrial, como al crecimiento poblacional
(CONAPO, 2013, citado por Siliceo, 2014).
México cuenta con una meta para incrementar el porcentaje de energías no fósiles para la
generación de electricidad en por lo menos 35% al 2024. Por lo que la producción y
utilización de biocombustibles ha generado un renovado interés en los últimos años,
destacándose su contribución en la diversificación de la oferta energética, en un intento por
reducir la dependencia hacia los combustibles derivados del petróleo, reducir las emisiones
de gases de efecto invernadero, promover el desarrollo de la agricultura y generar mayores
niveles de empleo (Secretaría de Energía, 2014, citado por Siliceo 2014.
DESCRIPCIÓN DE LA ORGANIZACIÓN
El Instituto Tecnológico de Orizaba (I.T.O.) se ubica en Oriente 9, Col. Emiliano Zapata Sur,
Orizaba, Veracruz., C.P. 94320.
Es una institución pública de educación superior tecnológica que forma parte del Tecnológico
Nacional de México (TecNM).
En sus primeros años, este centro tecnológico estaba enfocado a formar técnicos de la
industria textil, muy relevante en ese tiempo en Orizaba. Pero al formarse la Escuela Superior
x
de Ingeniería Textil en el IPN se consideró innecesario cambiar la orientación inicial del
centro, el cual se centró a formar técnicos para la Industria Azucarera. En un decreto
presidencial del 10 de julio de 1952 fue creada la Comisión Nacional de la Caña de Azúcar
y se establecía la creación de Instituto Tecnológico Orizabeño. En la práctica, el Centro
Tecnológico de Orizaba pasó a ser la institución que ordenaba el decreto.
Cuenta con la Misión de fortalecer los servicios educativos a través de la cobertura, equidad,
promoción e inclusión, en la formación integral de los estudiantes impulsando la innovación,
ciencia y tecnología; para consolidar la vinculación con pertinencia en los diferentes sectores
estratégicos, modernizando la gestión institucional con transparencia y rendición de cuentas
en un ámbito sustentable.
xi
los combustibles fósiles ha sido un gran motor para el desarrollo de la sociedad, a medida
que este recurso se agota, se hace más evidente la importancia de hacer una transición hacia
un esquema energético más sostenible. Este esquema sustentable estaría basado en el
aprovechamiento de distintas fuentes de energía y entre ellas destacan, las energías
renovables. A nivel mundial, aproximadamente 90% de la energía consumida proviene de
fuentes no renovables (Pérez, 2009)
DELIMITACIÓN
OBJETIVO GENERAL.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
3. Realizar un análisis estadístico que permita determinar las variables más importantes
y los rangos más adecuados de operación
RECONCIDERACIÓN
Estas residencias forman parte del proyecto financiado SAGARPA – CONACYT, titulado
“Producción de bioetanol de 2ª generación, a partir de residuos agroindustriales y
enzimas obtenidas de microorganismos autóctonos”, con clave 291143, mismo que inició
en el mes de diciembre, en lugar del mes de agosto que era lo inicialmente planeado. Esta
situación, provocó un retraso en las actividades que requerían realizarse en otras
xii
instituciones, por lo que fue necesario reconsiderar el trabajo inicialmente propuesto,
llevando a la realización de los siguientes objetivos:
Todo lo anterior, permitió un estudio más amplio tanto del jugo de caña como de los residuos
lignocelulósicos que lo originalmente considerado.
JUSTIFICACIÓN
El bioetanol es una fuente de energía alternativa que es a la vez renovable y respetuoso del
medio ambiente. Puede ser producido a partir de materias primas como el grano de maíz,
yuca, caña de azúcar, caña de azúcar, melaza y sorgo dulce, entre otros.
Los materiales lignocelulósicos son los que ofrecen un mayor potencial para la producción
de bioetanol. Una gran parte de los materiales con alto contenido en celulosa, susceptibles de
ser utilizados para estos fines, se generan como residuos en los procesos productivos de los
sectores agrícola, forestal e industrial. Los residuos agrícolas proceden de cultivos leñosos,
herbáceos y de cereales. Por su parte, los residuos de origen forestal proceden de los
tratamientos silvícola y de mejora o mantenimiento de los montes y masas forestales
xiii
etanol, esta dependerá de la concentración de azúcar en el medio de fermentación
[Phukoetphimet al., 2016].
xiv
CAPÍTULO I
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
CAPITULO I. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
El uso de material lignocelulósico como materia prima para la producción limpia de etanol,
parece ser una atractiva solución dada las futuras tendencias del uso del bioetanol como un
combustible para transporte y su demanda para una producción sostenible de energía.
Los materiales lignocelulósicos presentan una estructura compuesta principalmente por tres
componentes (celulosa, hemicelulosa y lignina). En los procesos de degradación de
materiales lignocelulósicos se pueden identificar algunos tratamientos comunes utilizados
para la producción de azúcares fermentables. Estos tratamientos pueden ser físicos, químicos,
enzimáticos o con microorganismos. Así mismo la factibilidad de cada tratamiento depende
del consumo de energía, selectividad, costos del proceso y velocidad de degradación.
2
Tabla 1.1 Composición de diferentes materiales lignocelulósicos. (SungyChen, 2002, citado por Cuervo et al.,
2009)
Material Lignocelulósico. Celulosa (%) Hemicelulosa (%) Lignina (%)
Madera dura 40-55 24-40 18-25
Madera suave 45-50 25-35 25-35
Cascara de nuez 25-30 25-30 30-40
Olote de maíz 45 35 15
Desechos de pastos 25-40 35-40 18-30
Papel 85-99 0 0-15
Paja de Trigo 30 50 15
Hojas 15-20 80-85 0
Algodón 80-95 0 0
Papel Periódico 40-55 25-40 18-30
La caña de azúcar es una gramínea tropical, un pasto gigante emparentado con el sorgo y el
maíz, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser
extraído y cristalizado forma el azúcar. Forma espiguillas pequeñas agrupadas en rosetas y
rodeadas por largas fibras sedosas. Se conocen diversas variedades cultivadas que se
diferencian por el color y la altura de los tallos (Fajardo y Sarmiento, 2007).
3
Tabla 1.2. Composición de azucares en el jugo de caña. (Meade&Chen, 1997, citado por Espinoza, 2015).
Constituyentes en el Jugo de Caña Porcentajes
Azúcares
Sacarosa 75 – 92
Glucosa 70 – 88
Fructosa 2–4
Sales
Inorgánicas 3.0 – 3.4
Orgánicas 1.5 – 4.5
Ácidos Orgánicos 1–3
Aminoácidos 1.5 – 5.5
1.4 Biocombustibles
4
• La reducción de emisiones en su combustión de material particulado y dióxido de
azufre, entre otros que afectan la salud humana y el medio ambiente.
Son estos tres beneficios los que convierten a los biocombustibles en una alternativa
energética viable frente a la problemática ambiental y energética (Alejos y Calvo, 2015).
Proviene de cultivos que pueden ser empleados también para la alimentación humana o
animal y que se procesan a partir de los métodos que tradicionalmente se han empleado para
producir alcohol. Entre los principales biocombustibles de primera generación se encuentran
el bioetanol, el biodiesel y el biogás (Gómez, 2016).
Los cultivos adecuados son los que tienen altas concentraciones de azúcares, como la caña
de azúcar, el sorgo dulce o la remolacha; o altas concentraciones de almidones, como el maíz,
la yuca o la papa.
Los biocombustibles de tercera generación son aquellos que utilizan la ciencia de la genética
para mejorar el crecimiento, rendimiento y características de los cultivos energéticos para
obtener materia prima de mejor calidad para producir biocombustibles. El cultivo de
microalgas, de las cuales puede extraerse aceite para la producción de biodiesel, es un
representante de esta tecnología (Alejos y Calvo, 2015).
5
Aunque son las que prometen una mayor productividad para generar bioetanol, aún se
encuentran en fase experimental y no están listas para producir bioetanol en cantidades
industriales de una manera rentable.
1.4.4 Bioetanol
Con el paso del tiempo, el tema de los biocombustibles se va desarrollando de manera rápida
al igual que los avances tecnológicos van a la par con este crecimiento.
Para que el Bioetanol contribuya al cien por ciento a las necesidades como combustible,
necesita de un balance energético positivo, el cual se lleva a cabo mediante la consideración
de algunas variables:
De acuerdo a Guerra et al.(2008) los puntos siguientes presentan varias ventajas para la
producción de bioetanol:
7
Los biocarburantes emiten un 40-80 % menos de gases invernaderos que los combustibles
fósiles
El bioetanol es superior medioambientalmente al resto de los carburantes más
importantes
Reduce la formación de la lluvia ácida
Mejora la calidad del aire en zonas urbanas
No contamina el agua
Con su producción puede reducirse los residuos
En mezcla con gasolina, aumenta el número de octanos y promueve una mejor
combustión
Reduce las emisiones contaminantes como monóxido de carbono (CO) e hidrocarburos,
con un bajo costo. Se estima que la reducción es de 40 a 80 % menos de gases invernadero
que los combustibles fósiles
Es virtualmente utilizable en todos los vehículos con motor a gasolina
Para poder utilizar el bioetanol como combustible se necesita llevar a cabo varias
modificaciones dentro del motor, y así no alterar significativamente el consumo. Aumentar
la relación de compresión:
8
La materia lignocelulósica es el producto agroindustrial de mayor abundancia.
Es una fuente de materia prima renovable, por constituir una parte estructural en el reino
vegetal
Los materiales lignocelulósicos son menos costosos que los materiales
convencionalmente utilizados para producir etanol (Cuervo et al., 2009).
1.5.1 Celulosa
La celulosa es un polímero lineal en el que los enlaces β-1,4, glicosídicos se unen para formar
unidades de repetición de celobiosa.
La celulosa producida de esta manera existe de forma natural en dos formas. La primera se
conoce como celulosa pura, e incluye celulosas producidas en su estado natural, como el
algodón y la celulosa bacteriana; y la presentan algunas algas y animales marinos como los
tunicados. La segunda se denomina celulosa compleja, e incluye la mayoría de las celulosas
presentes en la naturaleza, siendo el componente fundamental de la pared celular de las
plantas superiores (Pecoraro, 2008, citado por Lacerda, 2015).
La celulosa se compone de dos moléculas de glucosa unidas y esterificadas por enlaces β-1,4
glicosídicos que se estructuran en largas cadenas lineales (micro fibrillas) unidas por puente
de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals intramoleculares, formando una estructura
cristalina resistente a la hidrolisis y regiones amorfas susceptibles a la degradación
enzimática.
9
unión β, es de peso molecular alto. (Laureano-Pérez et al.,2005, citado por Sánchez et
al.,2010)
1.5.2 Hemicelulosa
El termino hemicelulosa se utiliza para definir los polisacáridos que normalmente se asocian
con la celulosa en las paredes celulares (Rogalinski 2008, citado por Lacerda, 2015). Se
producen en estrecha asociación con la celulosa y la lignina y contribuyen a la rigidez de las
paredes celulares de las plantas. Las hemicelulosas constituyen alrededor del 20-30% de la
masa total de las plantas anuales y perennes. Tienen una composición heterogénea formada
por diferentes unidades estructurales de azúcares neutros.
La xilosa es la unidad estructural más abundante en las plantas leñosas, estas unidades se
unen por enlaces glicosídicos en las posiciones 1 y 4. Entre las caracteristicas de la
hemicelulosa se encuentran: su alto carácter hidrofilico, contienen cadenas
considerablemente ramificadas , naturaleza altamente amorfa y un grado de polimerización
(DP) entre 100 y 200 (Yang y Wiman, 2008, citado por Lacerda, 2015)
10
es un homopolímero lineal de glucosa similar a una α-amilosa del almidón. La diferencia
estructural que existe entre ellas, la cual altera completamente las propiedades del polímero,
es que en la celulosa las unidades de glucosa están unidas por enlaces β 1-4 y en la α-amilosa
el enlace es α 1-4. La conformación más estable conferida por enlaces glucosídicos es dada
por el enlace β 1-4, ya adopta que una conformación extendida, referida como un listón
extendido. La posición de los polímeros de esas cadenas permite un eficiente Inter
encadenamiento por medio de puentes de hidrógeno, que es la base de la fuerza de la celulosa
(Garret y Grisham, 1996, citado por Medina-Morales et al., 2011).
1.5.3 Lignina
La lignina es soluble en agua y presenta una densidad de 1.3 g/ml 25°C. La lignina no posee
unas características estructurales bien definidas, como en el caso de la celulosa. El problema
esta en que la estructura esta conformada por diversas unidades que no se repiten de forma
regular. La composición y la estructura de la lignina (Sifontes y Domine, 2013) dependen de
varios factores como:
11
Material de origen
Forma de extracción
Forma de aislamiento
La fuerza de adhesion entre las fibras de celulosa y lignina aumenta por la existencia de
enlaces covalentes entre las cadenas de lignina y componentes de la celulosa y de
hemicelulosa (John y Thomas 2008, citado por Lacerda 2015).
La lignina es uno de los más abundantes polímeros orgánicos, superado apenas por la
celulosa. Es inusual como biopolímero, debido a su heterogeneidad y la falta de una
estructura primaria definida. Se define la estructura de la lignina de acuerdo con las siguientes
características:
Entre los residuos agrícolas, se encuentran los de la industria azucarera, siendo el bagazo de
la caña de azúcar, el material más utilizado y estudiado debido a que es un residuo abundante,
renovable y de bajo costo(Viñals-Verde et al.,2009)
12
La producción de etanol a partir de residuos agrícolas y forestales, para propósitos
energéticos, es un reto tecnológico sobre el cual se trabaja intensamente hoy. El bioetanol
puede ser obtenido, a partir de diferentes materias primas ricas en: azúcares (caña de azúcar,
remolacha azucarada, sorgo dulce), almidones (trigo, maíz, cebada, yuca) y celulosa
(desechos agrícolas, forestales y municipales) (Bueno et al.,2009).
Es de gran importancia realizar una caracterización completa del material, para conocer de
manera detallada su estructura y características químicas del mismo y sus componentes, de
forma de poder diseñar los tratamientos más eficaces para lograr una transformación eficiente
del material.
1.6 Hidrólisis
13
tiene que hidrolizar la hemicelulosa hasta xilosa y/o sus monómeros respectivos. Los dos
hidrolizados ácidos, hemicelulósico y celulósicos, que contienen esencialmente xilosa y
glucosa, respectivamente, se pueden fermentar en un proceso posterior para obtener
finalmente etanol (Lavarack 2002, citado por Jaramillo, 2013)
Un método muy utilizado para separar las hemicelulosas de la celulosa es la hidrólisis ácida,
donde la materia prima lignocelulósica es sometida a una solución ácida a temperaturas
medias. De este pretratamiento se obtiene una solución rica en xilosa y un residuo sólido que
contiene celulosa y lignina (Viñals-Verde et al 2009)
La hidrólisis alcalina se lleva a cabo con soluciones diluidas de NaOH, produciendo una
reacción de saponificación rompiendo los enlaces de tipo éster que unen la hemicelulosa con
la lignina. La porosidad del material lignocelulósico aumenta, gracias a la hinchazón que
provoca el tratamiento con NaOH (Buranov, 2008, citado por Pezoa, 2010).
14
de la mezcla durante todo el proceso. Los factores que afectan a la hidrolisis enzimática son:
el tipo de sustrato, la actividad celulasa y las condiciones de reacción: temperatura y pH
(Parameswaran et al., 2011)
1.7 Fermentación
Las principales responsables para que se lleve a cabo la fermentación son las levaduras. Una
de ellas es la que se usa con más frecuencia y se conoce como Saccharomyces-cerevisiae.
Existen diferentes estudios para la producción de Bioetanol mediante otros hongos y
bacterias, pero el uso a nivel industria es mínimo (Montaño, 2014).
(1.2)
En esta reacción la molécula de glucosa se transforma en dos moléculas de alcohol y dos de
dióxido de carbono (Cepeda y Jaramillo, 2009).
pH. Diversos estudios realizados han encontrado que la máxima producción de alcohol
se obtiene a un pH de 4.2, mientras que la menor se obtiene a un pH de 3.7. En el caso
del menor es probable que sea demasiado bajo para logar llevar a cabo una activación
eficiente en las enzimas necesarias para la fermentación y hace que el intercambio iónico
dentro de la célula sufra un descontrol, que hará que concentre su energía en regular su
sistema y no en llevar a cabo la fermentación de azúcar presente en el sustrato. Es por
ello que pH cercanos al neutro facilitan la flora microbiana contaminante en el proceso
15
que conlleva a la formación de subproductos indeseables. Así mismo, la inversión de la
sacarosa a sus componentes monoméricos presente en el sustrato, aumenta a medida que
el pH disminuye incidiendo en el tiempo de fermentación.
Temperatura. La fermentación se lleva a cabo en una temperatura óptima de 32°C y a
partir de los 30° hasta los 35° C es cuando el proceso se incrementa. Excederse de este
rango de temperatura amplifica a la probabilidad de desarrollo de microorganismos que
afectan el proceso de fermentación.
Concentración de azúcar. Con el paso del tiempo y de diversas pruebas se ha podido
conocer que la concentración de etanol se puede incrementar cuando se eleva la
concentración de sustrato, pero dicho aumento repercute en el tiempo de toma la
fermentación afectando la productividad. Originando que la concentración de sustrato, la
producción de alcohol y el tiempo de fermentación son directamente proporcionales y
dependen y varían de los requerimientos y capacidad para poder llevar a cabo el proceso.
Requerimientos de oxígeno. Cuando el medio se encuentra en ausencia de oxígeno y rico
en niveles de glucosa favorece a la producción de alcohol (Perales, 2015)
Llamada también fermentación discontinua o por lote, son de gran importancia comercial
para su amplio uso. Las técnicas de instalación de los cultivos discontinuos, van a depender
de si el proceso es aerobio o anaerobio.
16
La biotecnología y los bioprocesos han logrado posicionarse como una de las principales
técnicas para la obtención de diversos productos a nivel industrial. Un bioproceso es un
conjunto de técnicas que emplean los organismos vivos para poder obtener o modificar
diferentes productos. Estas técnicas generalmente consisten en procesos de fermentación, en
los cuales se lleva a cabo la transformación por acción microbiana de determinados sustratos
de un medio de cultivo en diversos productos que pueden ser obtenidos mediante el
crecimiento controlado de células.
Se han desarrollado diferentes tipos de operaciones que pueden influir de cierta manera en
los procesos de fermentación y por lo tanto en el producto final. Estas operaciones permiten
clasificar los procesos de fermentación y se refieren a la adición y salida de sustrato que
necesitan las células para poder llevar a cabo la fermentación. Una de estas operaciones es la
fermentación continua.
La fase de latencia (lag) refleja el tiempo requerido en las levaduras para adaptarse a su nuevo
entorno, sintetizando ribosomas y enzimas necesarios para generar una mayor tasa de
crecimiento. La duración de esta fase dependerá tanto del tamaño poblacional inicial como
de la idoneidad de las condiciones ambientales presentes. Una vez las células comienzan a
17
metabolizar activamente, comienza la replicación del DNA y poco después las células se
dividen. Este momento determinara la segunda fase de crecimiento, la fase exponencial,
periodo en el cual las células se dividen con su mayor tasa de crecimiento específico (µmáx.).
El tiempo que necesita la población para doblar su número se denomina “tiempo de
generación” y se halla profundamente influenciado por el medio de crecimiento, la
temperatura y el tipo de cepa empleada, aunque generalmente ronda los 90-120 min en
condiciones favorables. La tercera fase del crecimiento de las levaduras es la fase diáuxica,
un periodo de crecimiento lento en el cual la levadura cambia de un metabolismo
fermentativo a otro respiratorio a causa de la falta de azúcares en el medio, convirtiéndose el
etanol en la fuente principal de carbono. Finalmente y debido al agotamiento de los nutrientes
en el medio u otros factores ambientales como la presencia de metabolitos tóxicos o altas
temperaturas, el metabolismo celular se ralentiza y la división celular se detiene, entrando la
célula en su última fase, la fase estacionaria. Aunque bien es cierto que las células pueden
sobrevivir en esta fase durante largos periodos de tiempo gracias a modificaciones en su
pared celular, al almacenamiento en su citoplasma de reservas de carbono o a una
ralentización dramática en su transcripción y traducción, las células terminarán autolisándose
y muriendo si las condiciones ambientales óptimas no se restablecen (Navarro, 2016).
18
En la actualidad se estudia el uso de microorganismos genéticamente modificados como una
alternativa tecnológica viable para la producción de etanol, debido a que para una producción
de etanol más eficiente y con menos costo es necesario que la levadura tradicional fermente
los azúcares de cuatro y cinco a etanol o existan otros microorganismos que lo realicen.
(Viñals-Verde et al., 2009)
González et al., (2011), mediante una optimización del proceso de hidrólisis enzimática de
una mezcla de paja de frijol a través de cuatro tipos de madera para determinar la composición
química de la mezcla y se sometió a tres pretratamientos con Hidróxido de sodio con
diferentes relaciones liquido-solido, para posteriormente llevar a cabo una hidrolisis
19
enzimática, utilizando una carga enzimática de celulosa (Celluclast proporcionado por
Novozyme). Encontrando que el rendimiento máximo de azúcares reductores fue de 92% con
un pretratamiento de NaOH durante la hidrolisis enzimática, valorando que es posible detener
el proceso de hidrolisis a las 48 hrs a expensas de una pérdida de 15% de rendimiento.
López et al., (2008),a través de una optimización de del proceso de obtención enzimática de
azúcares fermentables a través de aserrín de pino se llevó a cabo una hidrolisis enzimática
mediante pretratamientos con NaOH para poder obtener la mejor recuperación de azúcares.
Posterior a los pretratamientos correspondientes se obtuvo que las mejores condiciones de
operación para un mejor rendimiento que fue de 48% con una solución de NaOH al 8% y
tener un tiempo de tratamiento de 85 min.
20
los resultados óptimos, el cual fue que con 20% de NaOH se obtiene el valor más alto de
celulosa (83.2%).
21
CAPÍTULO II
MATERIALES Y METODOS
CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1.1 Alcances
2.3 Metodología
Los residuos con los que se trabajará fueron seleccionados debido a su contenido de materia
orgánica lignocelulósica estos son madera, olote y cáscara de café. Los residuos fueron
adquiridos de diferentes zonas de la región y se trabajaron a la par con las mismas condiciones
23
de técnica de hidrólisis. El tamaño del material lignocelulósico, tanto de la madera como del
café, se encuentran en un tamaño adecuado para los pretratamientos (ácido y alcalino),
mientras que el olote, se encuentra en forma completa, alargado, por lo tanto es necesario
llevar a cabo procedimientos mecánicos manuales para reducir el tamaño y así poder
incrementar la eficiencia de los pretratamientos.
2.5 Caracterización
2.5.1 Humedad
24
2.5.3 Grados Brix (°Bx)
2.5.4 pH
El pH se midió una vez obtenido el total de jugo de cada lote de los diferentes residuos
lignocelulósicos, mediante un potenciómetro Marca Conductronic, ModelopH140, del
Laboratorio de Procesos de cristalización y generación de biocombustibles.
La determinación de azucares reductores libres, se llevó a cabo a través del método DNS
(Miller, 1959). (Anexo C).
Cada uno de los residuos lignocelulósicos (Madera, olote y cascara de café) fueron adquiridos
de diferentes zonas de la región centro del estado de Veracruz y a través de procedimientos
mecánicos manuales, se redujeron a un tamaño adecuado para facilitar el pretratamiento
hidrolítico.
2.7 Hidrólisis.
25
finalidad de conocer la cantidad de agua aun contenida en el material, misma cantidad que
será descontada en el momento de preparar la solución de ácido, logrando el mínimo
desperdicio de reactivos.
Los hidrolizados ácidos fueron llevados a cabo en vasos de vidrio refractarios con una
capacidad de almacenar hasta 1 Kg de bagazo, el tratamiento se realizó en una autoclave
marca AESA modelo CV-250 a una presión de 15 psia (1.2 Kg/cm2) durante 33 min, siendo
estos independientes al tiempo en que el autoclave tarda en alcanzar la presión establecida
(aproximadamente 35 min) y al tiempo en que se enfría (aproximadamente 25 min).
Se realizó un prensado manual del material para tratar de extraer la mayor cantidad de líquido
posible el cual se almacenó en contenedores con una capacidad de 20 L cada uno, dicha
fracción liquida recuperada contiene glucosa y xilosa por lo que es un medio idóneo para
desempeñar una fermentación y una siguiente destilación.
El residuo prensado se pesó para calcular la relación de agua que se debe utilizar en los
lavados, recordando que la RLS utilizada es 5:1, depositándolo en una marmita de acero
inoxidable junto con el agua, homogenizando la mezcla para lograr una mayor remoción de
la hemicelulosa aún presente, la mezcla se dejó reposar durante 10 min, separando la fase
líquida (agua de lavado) de la sólida (residuo lignocelulósico), exprimiendo únicamente con
las manos y colocando el residuo en un recipiente adecuado, el agua de lavado es almacenada
en contenedores de 20 L y guardada para la siguiente parte del proceso ya que gracias a su
pH bajo esta tiene la capacidad de disminuir el pH de la hidrólisis alcalina.
26
cantidad de agua presente en el material es equivalente a la cantidad de agua que se debe de
descontar en el momento de preparar la solución para la reacción, representando un ahorro
considerable en el agua de proceso, disminuyendo los efluentes líquidos finales), en una RLS
16:1.
27
La fase líquida empleada fue de CH3COONa 0.05 M siguiendo la RLS de 5:1, % enzima p/p
de 5 (la densidad de la Cellic CTec3 es de 1.2 g/mL). La reacción debe realizarse a un pH
de 5.0, para lo cual se utiliza NaOH 10 M en caso de que se encuentre un pH demasiado
ácido o ácido acético glacial para un pH muy alcalino, una vez establecido el pH la reacción
se deja llevar a cabo durante 51 h.
Una vez iniciada la hidrólisis, fue evidente que la gran cantidad de celulosa hacía difícil el
trabajo del agitador, motivo por el cual la reacción se dejó sin agitación durante las primeras
20 h, tiempo en el que fue posible observar el buen funcionamiento de la enzima.
28
en congelación para una mejor conservación de los azúcares y un posterior análisis mediante
HPLC cuantificando los g/L de glucosa obtenidos.
2.8 Nutrientes
2.8.1 Material biológico
La cepa de S. Cerevisiae ITV01, que fue aislada de melazas de caña de azúcar por (Ortiz-
Zamora, 2006 citado por Partida, 2017) fue proporcionada por el laboratorio de biotecnología
del Instituto Tecnológico de Veracruz.
Con la finalidad de activar la levadura proporcionada por el ITV, se tomó el vial con la
levadura S. CerevisiaeITV-01 y se adicionó en 100 mL del medio de activación en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml a pH 5.5 durante 16 h a 250 rpm y 30 °C en una incubadora con
agitación Marca STIK, Modelo Shaking Incubator PS-B2125.
29
medio con el mejor residuo lignocelulósico estudiado tras la fase de hidrólisis ácida para la
fermentación variando los nutrientes.
Una vez transcurrido el tiempo, se realizó el pase al medio del preinóculo, se mantuvieron
también las mismas condiciones a un pH 5.5, de 3 x 106células viables/mL y nuevamente se
30
incubó por 12 h a 200 rpm y 30 °C. Transcurrido este tiempo se inocularon los matraces
preparados para la cinética, con 3 x 106células viables/mL.
Las cinéticas de fermentación se llevaron a cabo a nivel matraz, utilizando una incubadora
con agitación Marca STIK, Modelo Shaking Incubator PS-B2125. En matraces Erlenmeyer
de 250 mL, se trabajó con un volumen de operación de 180 mL de jugo de caña y de jugo
hidrolizado ácido de cada uno de los residuos lignocelulósicos, llevando a 140 g/L la
concentración de azúcares del jugo de caña y a 100 g/L para los residuos ácidos. Bajo el
esquema presentado por el diseño simple centroide que se muestra en la Tabla 2.5y a
condiciones de operación de 200 rpm y 30 °C, tomando muestras cada cuatro horas
incluyendo el tiempo cero, se iniciaron las cinéticas.
31
𝐿𝑛(𝑋0 )−𝐿𝑛(𝑋𝑛 )
𝜇𝑚𝑎𝑥 = (2.1)
𝑡
Donde: 𝑋0 son los (g/L) de la muestra a conocer,𝑋𝑛 los (g/L) de la muestra en el tiempo 0 y
t es el tiempo de la muestra que se desea conocer en (h).
𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 ( 𝐿 ) = 0.3697 (𝐷𝑂) + 0.001 (2.2)
La concentración de células (X) por mililitro está dada por la ecuación 2.3
(2.3)
2.9.6 Productividad
32
𝑃𝑓
𝑄= (2.4)
𝑡𝑓
Las muestras liquidas una vez filtradas fueron centrifugadas a 10,000 rpm por 10 min a 4°C
y congeladas, para posteriormente ser analizadas por cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC). Antes de ser analizadas por HPLC las muestras fueron descongeladas y
tratadas con una solución de BaO 0.3 M y de ZnSO4al 5 % p/v con la finalidad de eliminar
impurezas presentes tales como proteínas y almidones entre otras que son capaces de tapar
tanto los filtros como la precolumna y columna del HPLC (Partida, 2017). La relación
utilizada fue 8:1:1, dejando reposar por 10 min después de una agitación vigorosa de los
tubos eppendorf, pasando posteriormente a una centrifugación durante 10 min a 10,000rpm.
Se determinó a partir de HPLC los valores del área bajo la curva para la glucosa, xilosa y
arabinosa para su conversión a porcentaje para cada uno de los residuos e hidrolizados
utilizando las regresiones lineales correspondientes a las ecuaciones 2.3, 2.4 y 2.5, para su
posterior análisis por la técnica de NREL utilizando una columna ShodexSH1011, específica
para la separación de azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes.
La fase móvil empleada fue H2SO40.05 N, Velocidad de flujo, 0.6 mL/min; Temperatura de
la columna, 55°C; Tipo de detector: índice de refracción Marca Waters modelo 2414;
Volumen de inyección, 10 µL y 20 min de duración de análisis por muestra. El software
utilizado fue Empower (Waters), que reporta directamente la concentración de la muestra
mediante una correlación con estándares previamente realizados (glucosa anhidra, grado
alimenticio de Golden Bell Reactivos y fructosa grado reactivo de Baker, ambas en
concentraciones de 100, 50, 16.6, 10, 5, 2.5,1.66, 1.25, 1, 0.50 y 0.33 g/L; glicerol anhidro,
grado reactivo, Baker en concentraciones de 10, 5, 1.66, 1, 0.5, 0.25, 0.16, 0.12, 0.10, 0.05 y
0.03 g/L ; ácido acético glacial, grado reactivo, Baker en concentraciones de 30, 15, 5, 3, 1.5,
0.75,0.5, 0.37, 0.3, 0.15 y 0.1 g/L, y alcohol etílico absoluto anhidro, grado reactivo, Baker
en concentraciones de 10, 5, 1.66, 1, 0.5, 0.25, 0.16, 0.12, 0.10, 0.05 y 0.03 g/L)
33
Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la glucosa.
(2.5)
Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la xilosa.
(2.6)
Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la arabinosa.
(2.7)
2.11 Fermentaciones
Se trabajó con un reactor de vidrio refractario con capacidad de 1.2L, el cual cuenta con
termopozo, dos tomas de muestra y un par de juntas que evitan que haya un intercambio de
materia hacia el fermentador. El reactor fue adaptado a un equipo de jarras de 6 plazas para
así proporcionar la agitación necesaria para llevar a cabo las fermentaciones y se instaló una
paleta de metal en una de las plazas. Puesto que el proceso de fermentación debe ser a una
temperatura controlada, se utilizó una resistencia tipo banda adaptada a la superficie del
reactor, la cual va conectada a corriente y el cual cuenta con regulador de temperatura.
34
reactor se conecta aun Matraz erlenmeyer que tiene la función de recabar los jugos cuando
se empieza a extraer y a inocular simultáneamente como se muestra en la Figura 2.1.
Los cultivos para la fermentación continua se realizaron a una concentración de azucares para
el jugo de caña de 140 g/L y una concentración azucares de 100 g/L para los hidrolizados
ácidos de la madera, olote y café. Las condiciones para fermentación fueron las siguientes:
inoculo de 3x106 células/mL; pH. 5.5; Temperatura de 30°C y una agitación a 150 rpm, en
un fermentador de 1.2 L. Se le realizaron los métodos analíticos antes descritos para la
cuantificación de células vivas, alcohol y azucares.
Mediante la ecuación 2.8 se determinaron los flujos de alimentación para cada tipo de medio
tanto para el jugo de caña como de los jugos hidrolizados ácidos. Los caudales de entrada y
salida se iniciaron durante la fase de crecimiento exponencial. La corriente de entrada
contenía todos los nutrientes necesarios, pero no células. La corriente de salida contenía
células, nutrientes sin reaccionar y productos de fermentación.
𝑭=𝑫. 𝑽 (2.8)
35
Cada tasa de dilución estudiada fue evaluada por un período de un tiempo de residencia en
el fermentador (𝜏 = 1/𝐷) para garantizar estabilidad en el sistema durante la operación
continua. Para evitar contaminación dentro del reservorio debido a los tiempos de residencia
empleados, cada tipo de medio fue esterilizado previo al arranque de la fermentación.
Mediante la ecuación 2.9 se calculó el tiempo de residencia para la fermentación continua de
acuerdo a cada una de las tazas de solución propuestas.
𝟏
𝝉= (2.9)
𝑫
Se realizaron tres fermentaciones a diferentes tazas de dilución propuestas (h-1), las cuales
fueron de 0.04, 0.06 y 0.08 respectivamente, siguiendo el cálculo de la ecuación 2.7 se
determinó el tiempo de residencia para la fermentación continua, mientras que para la
obtención del cálculo del flujo de alimentación y de salida que se adicionará al reactor cada
hora se utilizó la ecuación 2.6. Para cada una de las fermentaciones se evaluó el número de
células, sustrato y producto obtenido.
Para la tasa de dilución de 0.04 h-1, el flujo empleado fue de 40 mL/h, lo que significa tener
un tiempo de residencia (𝜏) de 25 h, a este tiempo se le suman las 12 h que tarda la levadura
en tener su máximo nivel de crecimiento. Al momento de tiene el máximo crecimiento de
células, se comienza la fermentación continua, en ese momento se adiciona y se extrae
simultáneamente la cantidad del flujo calculado.
36
2.11.5.2 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.06
En lo que respecta para la tasa de dilución de 0.06 h-1, el flujo requerido fue de 60 mL/h, lo
que denota que el sistema tiene un tiempo de residencia (𝜏) de 16 h, aunado al tiempo que
tarda la fermentación Batch en llegar a tener el máximo de crecimiento de células. En la
Figura 3.9 se observa que a partir de la hora 12 se comenzó la fermentación continúa teniendo
una concentración inicial de 1.25x108de células vivas, al momento de adicionar y extraer la
cantidad de flujo descrita antes, se visualiza que busca mantenerse estable, no se observa que
sea linealmente puesto que sigue oscilando el sistema pero se encuentra en estado continuo.
En el caso de la tasa de tasa de dilución de 0.08 h-1, el flujo necesario fue de 40 mL/h, lo que
indica que el tiempo de residencia (𝜏) fue de12 h, a este tiempo se le agregan las 12 h que
tarda en tener el punto máximo de células. En la Figura 3.10 se visualiza la cinética de células
viables iniciando con la fermentación batch a una concentración de 3x106 Cel/mL
posteriormente al llegar a su máximo de células a un tiempo de 16 h, se inició la fermentación
continúa agregando y extrayendo la cantidad correspondiente dependiendo de la dilución. Se
observa que al momento iniciar la fermentación continua al momento de realizar el conteo
es muy que existe un movimiento de oscilación, pero mantiene su tendencia estable.
De acuerdo a los datos obtenidos de las cinéticas realizadas a partir de los jugos ácidos de los
hidrolizados, se trabajó con las mejores condiciones para enriquecer cada uno de estos jugos
y llevarlos a condiciones óptimas de fermentación. El medio de fermentación fue sometido a
un proceso de concentración para llevarlo a 10°Bx, posteriormente se realizó un ajuste de pH
con NaOH 10M hasta llevarlos a un pH 5.5. Estos jugos fueron enriquecidos a un 25% con
glucosa ya que se observa que por sí mismos, aunque se encuentren a una concentración de
azucares de 50 g/L, no tienen un crecimiento adecuado ya que carecen de sustrato suficiente
para mantener la levadura viva.
Se realizó una fermentación continua para cada uno de los jugos hidrolizados, tanto del olote
como el café, a una sola tasa de dilución propuesta, la cual fue de0.08 h-1. De acuerdo a la
ecuación 2.7 el tiempo de residencia (𝜏) es de 12 h para ambas fermentaciones continuas,
mientras que con la ecuación 2.6 se determinó el flujo necesario que sería de 80 mL/h, el cual
se adicionará al reactor y se extraerá cada hora. Para cada una de las fermentaciones se evaluó
el número de células, sustrato y producto obtenido.
38
CAPÍTULO III
RESULTADOS
CAPÍTULO III: RESULTADOS
En este apartado se presentan los resultados que se consideran desde la obtención de los
residuos lignocelulósicos, la caracterización en laboratorio de esta materia prima, la
realización de la hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina y llevando a nivel matraz la hidrólisis
enzimática utilizando la enzima (Cellic CTec3), finalmente los resultados de las
fermentaciones, tanto de los hidrolizados ácidos mejor evaluados como de las fermentaciones
a partir de jugo de caña, utilizando levadura ITV01, evaluando las tasas de dilución a
diferentes condiciones de nutrientes.
La caracterización de la materia prima se llevó a cabo bajo las normas y técnicas mencionadas
en la sección 2.5 del capítulo 2. El porcentaje de humedad determinado fue de 12.3%, 9.4%
y 16.1% para la madera, olote y café respectivamente, estos valores son utilizados para la
determinación de lignina, celulosa y hemicelulosa, en la Figura3.1 se muestran los valores
obtenidos a través de estas técnicas, los cuales representan la composición característica de
estos residuos, se observa que de estas tres materias primas, tanto la madera como el olote
cuentan con un mayor porcentaje de celulosa con respecto al café, sin embargo se observa
que la hemicelulosa tanto del café como de la madera son un 35% más bajo con respecto a
lo obtenido con el olote. La cantidad de fibra determinada de la madera como del olote se
encuentran dentro de los rangos descritos de celulosa, hemicelulosa y lignina reportados por
(Sungy Chen, 2002, citado por Cuervo et al., 2009) en la cual se observa una variación de
5% de cada uno de estos. A fin de remover mayor cantidad de lignina y hemicelulosa con
40
respecto a lo reportado en la Figura 3.1, se realizó una serie de pretratamientos tanto ácidos
como alcalinos.
MADERA OLOTE
7% 16% 3%
% Lignina 11%
% Lignina
25% 39%
% Celulosa
% Celulosa
52% 47%
% Hemicelulosa % Hemicelulosa
Otros Otros
CAFÉ
% Lignina
9%
29%
% Celulosa
25%
37%
% Hemicelulosa
Otros
3.3 Hidrólisis
3.3.1 Hidrólisis ácida
41
enzima es celulosa. Con respecto a la hemicelulosa se denota una disminución del de 6%,
11%, y 0.44% para la madera, olote y café respectivamente, mientras que para la lignina, se
observa que existe una disminución en su porcentaje con respecto a la materia prima de un
5.73% para la madera, 4.7% de olote y un 0.45% para el café. El pretratamiento
proporcionado en esta etapa indica que existe una remoción de hemicelulosa y un aumento
en la cantidad de celulosa, mientras que la caída en el porcentaje de lignina es mínima, no
siendo tan efectivo este pretratamiento en este último rublo. Es importante recalcar que la
degradación y remoción de compuestos del material depende de la concentración y cantidad
de ácido, temperatura y tiempo de hidrólisis.
Tabla 3.1. Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del pretratamiento ácido
ANÁLISIS MATERIA PRIMA
Madera Olote Café
°Bx 5 5 7
% Lignina 10.27 6.32 8.56
% Celulosa 70.04 55.51 49.16
% Hemicelulosa 19.31 24.43 14.48
Bajo las condiciones indicadas en la sección 2.7.2, se obtuvieron los porcentajes de fibra
después del pretratamiento hidrolítico alcalino, en el cual se observa en la Tabla 3.2 que la
cantidad de lignina que se removió de una fase a otra fue significativa teniendo para la madera
una reducción del 3%, 4.3% para el olote y un 3.5% para el café, lo que indica que el
pretratamiento es efectivo para la reducción de lignina pero pudiera haber una mayor
remoción si se contará con los óptimos para cada uno de los residuos. Se observa de igual
forma, que el contenido de celulosa en el caso del olote y el café aumentan en un 30% y 14%
respectivamente comparándolo con la etapa anterior. En el caso de la hemicelulosa, hay una
42
disminución en el caso de la madera y el olote, mientras que para el café existe un ligero
aumento en este porcentaje, esto se puede deber a que existen otros compuestos que
interfieren en la lectura final.
Tabla 3.2 Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del pretratamiento alcalino
MATERIA PRIMA
ANÁLISIS
Madera Olote Café
% Lignina 8.28 1.99 5.06
% Celulosa 67.73 84.93 63.47
% Hemicelulosa 16.16 12.71 19.09
Se llevó a cabo una cinética prueba de una hidrólisis enzimática a nivel matraz, la cual tuvo
como objeto evaluar los pretratamientos hidrolíticos tanto ácido como alcalino de la materia
prima lignocelulósica, se siguieron las condiciones descritas en el apartado 2.7.3a un tiempo
de residencia de 72 h, en la cual se cuantificaron los azúcares fermentables presentes
mediante HPLC. Los resultados arrojaron que durante las primeras 20 h de residencia, para
los tres residuos el consumo de la enzima Cellic CTecC3 fue muy lento por lo cual no fue
que hasta la hora 22 se decidió comenzar a graficar, en este tiempo se observa un aumento
constante en la concentración de azúcares en los tres residuos y no fue hasta la hora 40que
tanto el café como la madera obtuvieron su máxima de 2.96g/L y 0.153 g/L concentración
de azucares respectivamente, mientras que el olote continuó con su crecimiento hasta la hora
55, de ahí tuvo un pequeño decremento pero continuó aumentando hasta que terminó el
tiempo de hidrólisis con una concentración máxima de azucares de 9.4 g/L.
43
10
8.5
7.5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
0.155
Concentración de azúcares (g/L)
0.15
0.145
0.14
0.135
0.13
0.125
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
3.1
Concentracion de azúcares
2.9
2.7
2.5
(g/L)
2.3
2.1
1.9
1.7
1.5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
44
3.4 Fermentación por lotes
De acuerdo a la Tabla 2.5 propuesta en la sección 2.9.2 se realizaron las cinéticas a nivel
matraz a una capacidad de 250 mL, para conocer la mejor concentración de sales posible en
una fermentación por lotes, e implementado la ecuación 2.1 propuesta en la sección 2.9.3, se
determinó la μmax a partir de los g/L de células presentes en un tiempo determinado. El jugo
de caña se ajustó a una concentración de azúcares de 140 g/L, mientras que para los
hidrolizados ácidos de los residuos lignocelulósicos que se encontraban a un pH de 5, se
necesitó reducir y llevarlo a una concentración de azúcares de 100g/L. Se evaluó el número
de células vivas como se describe en el apartado 2.9.4, determinación de azúcares a través de
la técnica de DNS siguiendo los lineamientos descritos en el anexo C y determinación de
etanol por el método de Dicromato de Potasio establecido en el anexo D.
Para una mejor comprensión en la Tabla 3.3 se presenta la nomenclatura empleada para la
combinación de sales utilizadas en las cinéticas realizadas.
45
3.4.1 Comportamiento del Jugo de caña
En la Figura 3.5, se observa el comportamiento de las cinéticas realizadas con el fin de
determinarla µmax utilizando la ecuación descrita en el apartado 2.9.3, transcurrido un
periodo de tiempo de 32 h., se observa que el mejor valor evaluado se alcanza en tiempo de
12 h teniendo como valor máximo 0.3695, este corresponde al código CS-9 de la Tabla 3.3
formulación descrita en el apartado3.4, lo cual arroja que debe tener una formulación de
1.167 g/L de KH2PO4, 3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250 g/L de MgSO4.7H2O
0.4
0.35
CS-1
0.3
CS-2
0.25 CS-3
µ max (h-1)
CS-4
0.2
CS-5
0.15 CS-6
CS-7
0.1
CS-8
0.05 CS-9
0 CS-10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante 32 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones, determinando el
punto máximo que llegó a reproducirse la levadura ITV-01 siendo de 28.6x107 células/ml,
en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura 3.6.
46
3.50E+08
3.00E+08 CS-1
CS-2
Biomsa (cel/mL) 2.50E+08
CS-3
2.00E+08 CS-4
1.50E+08 CS-5
CS-6
1.00E+08
CS-7
5.00E+07 CS-8
CS-9
0.00E+00
CS-10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)
Mediante la técnica mencionadas en la sección 2.5.5 y 2.5.6 que refieren a DNS y Dicromato
de Potasio, se llevaron a cabo la cinética para la cuantificación de azúcares y de alcohol
respectivamente, la cual se evaluó durante un tiempo de 32 h, donde se en las Figuras 3.7 y
3.8 un descenso en la concentración de azúcares en todas las cinéticas, las cuales partieron
de una concentración inicial de 140 g/L y se observa que la relación de sales mejor evaluada
corresponde la concentración correspondiente al código S CS-9 con las condiciones 1.167g/L
de KH2PO4, 3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250g/L de MgSO4.7H2O, en la cual se observa que
hay un consumo constante de azúcares, el cual se mantiene constante el tiempo de
crecimiento, terminado en una concentración de azúcares de 70 g/L . De igual manera en la
Figura 3.7 y 3.8 se muestran la cinéticas de crecimiento de la cantidad de alcohol presente en
cada una de las series evaluadas, partiendo de un valor inicial de 0 g/L de etanol, la serie
mejor evaluada se identificó como P CS-9 que obtuvo el valor máximo de 0.537 g/L de etanol
en un tiempo de 32 h con las condiciones de 0 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L
de MgSO4.7H2O..
47
Figura 3.7 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo de caña
Figura 3.8 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo de caña
Una vez concluida la hidrólisis ácida, los hidrolizados resultantes del café y del olote,
presentaron un pH de 0.25 y 0.39 para cada uno respectivamente, lo que hizo necesario
emplear NaOH 10M, para llevarlos al pH de 5.5 requerido para iniciar el proceso
fermentativo. Se observó que al adicionar la solución básica, el hidrolizado cambió su
aspecto, tomando un color más obscuro, puede decirse que la solución de NaOH es muy
agresiva para el jugo hidrolizado.
48
Empleando las formulaciones de la Tabla 3.3, se evaluó la µmax en un tiempo de 18 h como
se muestra en la Figura 3.9,a cual tiene un valor de µmax de 0.2417 en un tiempo estimado de
6 h, la formulación CS-2 es la que presentó un mejor resultado, con las condiciones de 0 g/L
de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L de MgSO4.7H2O.
0.3
CS-5
0.25
CS-1
0.2 CS-2
-1)
µ max (h
CS-3
0.15
CS-4
0.1 CS-6
CS-7
0.05 CS-8
CS-9
0
0 5 10 15 20 CS-10
Tiempo (h)
Figura 3.9 Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del olote
Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante un tiempo de 20 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones
descritas en la Tabla 3.3, determinando el punto máximo que llegó a reproducirse la levadura
ITV-01 siendo de 37x107 células/ml, en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura
3.10.
49
4.00E+07
3.50E+07
CS-1
3.00E+07 CS-2
Biomsa (cel/mL)
2.50E+07 CS-3
CS-4
2.00E+07
CS-5
1.50E+07 CS-6
CS-7
1.00E+07
CS-8
5.00E+06
CS-9
0.00E+00 CS-10
0 5 10 15 20
Tiempo (h)
50
Figura 3.11 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo hidrolizado ácido
de olote
Figura 3.12 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo hidrolizado ácido
de olote
51
cambió su aspecto, tomando un color más obscuro, denotando que la solución de NaOH es
muy agresiva para el jugo hidrolizado por su cambio tan brusco de pH.
0.7
0.6 CS-1
CS-2
0.5
CS-3
µmax h-1
0.4 CS-4
0.3 CS-5
CS-6
0.2
CS-7
0.1 CS-8
0 CS-9
0 5 10 15 CS-10
Tiempo (h)
Figura 3.13. Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del café
Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante un tiempo de 20 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones
descritas en la Tabla 3.3, determinando el punto máximo que llegó a reproducirse la levadura
ITV-01 siendo de 37x107 células/ml, en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura
3.14.
52
7.00E+07
6.00E+07 CS-1
CS-2
5.00E+07
Biomsa (cel/mL)
CS-3
4.00E+07 CS-4
3.00E+07 SC-5
CS-6
2.00E+07
CS-7
1.00E+07 CS-8
0.00E+00 CS-9
0 5 10 15 CS-10
Tiempo (h)
53
Figura 15. Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo hidrolizado ácido
del café
Figura 3.16 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo hidrolizado ácido
del café
Mediante una cinética de crecimiento de biomasa, se evaluaron los tres residuos durante un
periodo de 37 h, en donde la concentración inicial de levaduras fue de 3x106Cel/mL,
transcurrido el tiempo, se observa que por parte del jugo hidrolizado de madera, el punto en
donde registró la concentración más alta de células fue en la hora 4 teniendo 8x106Cel/mL,
después de lo cual en las horas posteriores de análisis se observa una caída muy pronunciada
54
hasta una nula existencia de microorganismos, en este momento se optó por declinar las
cinéticas para este residuo lignocelulósico, ya que no tuvo un crecimiento significativo y se
descartó al no poder contar un control adecuado y pudiera afectar al momento de trasladar a
fermentación continua, esto se debe a que el medio en el que la levadura ITV01 se desarrolla
no es el óptimo debido a la solución de NaOH empleada para aumentar el pH es demasiada
agresiva e inhibe el microorganismo.
3.5 Fermentaciones
3.5.1 Fermentación Continua de Jugo de Caña
Se llevó a cabo la fermentación continua del Jugo de Caña evaluando tres diferentes tasas de
dilución 0.04, 0.06 y 0.08 h-1 respectivamente, monitoreándose el comportamiento obtenido
tanto de biomasa, producto y sustrato. En la Figura 3.17, se puede observar el
comportamiento de la tasa de dilución de 0.04 h-1, en la cual la máxima concentración de
producto fue de 0.91 g/L, logrando tener una reducción del sustrato hasta 5.54 g/L,
obteniendo una productividad de 0.03g/Lh.
Tiempo
Figura 3.17. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.04 h-1
55
Para la tasa de dilución de 0.06 h -1 que se muestra en la Figura 3.18 se observa que se tuvo
una máxima concentración de 0.90 g/L, obteniendo una productividad de 0.06 g/Lh, así como
también se obtuvo una concentración final de sustrato de 5.89 g/L.
Por lo que respecta a la tasa de dilución de 0.08 h -1, la cual se muestra en la Figura 3.19, se
obtuvo una productividad de 0.05g/Lh, logrando una mayor concentración de producto de
0.54 g/L y obteniendo una concentración final de sustrato de 0.7 g/L.
Tiempo
Figura 3.18. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.06 h-1
56
Tiempo
Figura 3.19. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.08 h-1
Cabe destacar que durante el tiempo de las fermentaciones continuas en las tres diferentes
tasas de dilución se logró mantener constante la concentración de biomasa dentro del reactor,
ya que en este caso no se tuvieron complicaciones con el sistema de fermentación en cuanto
a la agitación, que existiera un lavado de células al momento de suministrar cada hora la
cantidad indicada en cada tasa de dilución, así como también se logró mantener en 30° C la
temperatura del reactor lo que permitió que el proceso tuviera un comportamiento estable.
Se evaluaron tres residuos mediante hidrolisis ácida, madera, café y olote respectivamente
para que posteriormente a los jugos resultantes de la hidrólisis se llevarán a fermentación. De
acuerdo a las cinéticas obtenidas de cada uno de los residuos se optó por descartar la madera
ya que fue el residuo que no tuvo un buen comportamiento respecto a las células, al no tener
un crecimiento celular significativo, ya que para poder llevar a cabo las cinéticas se comienza
con una concentración de células de 3x106, para lo cual en la cinética de la madera después
de monitorear hasta 37 h se encontró que el máximo de células que llego a tener fue de 8x106,
57
lo cual dificultaría el control dentro del proceso continuo. Es por eso que se optó por no
seguir con una fermentación continua de este material. Mientras que para el café y olote se
evaluaron a una sola tasa de dilución la cual fue de 0.08 h-1. En la que se obtuvieron los
valores de concentración máxima de producto, así como el monitoreo del sustrato y la
concentración de biomasa.
En la Figura 3.20 se muestra el comportamiento de la cinética del café en al cual se tuvo una
productividad de 0.07 g/Lh obteniendo una concentración final de producto de 0.90 g/L así
como una concentración final de sustrato de 10.29 g/L.
Tiempo
Figura 3.20. Cinética de hidrolizado de Café con una tasa de dilución 0.08 h-1
Por su parte en la cinética del olote que se muestra en la Figura 3.21 con una tasa de dilución
de 0.08 h-1 se tuvo una concentración final de producto de 0.90 g/L obteniendo una
productividad de 0.07 g/Lh y una concentración final de sustrato de 8.15 g/L.s
58
Tiempo
Figura 3.21. Cinética de hidrolizado ácido de Olote con una tasa de dilución de 0.08 h -1
En cada una de las cinéticas se evaluó el crecimiento celular, producción de etanol y consumo
de sustrato respectivamente, para lo cual en la Figura 3.22 que corresponde a la cinética de
jugo de caña se puede observar la producción de etanol de 0.53 g/L contra el consumo de
sustrato que fue de una concentración final de 0.76 g/L que se obtuvo en la dosificación de
sales número 9, que se muestra en la Tabla 2.5 del apartado 2.9.2 la cual fue la que mayor
crecimiento celular presentó.
59
Figura 3.22.Consumo de sustrato y producción de etanol en el Jugo de Caña
60
Por su parte el hidrolizado de café la mayor concentración celular se obtiene en la
dosificación de sales 3 de la Tabla 2.5 de la sección 2.9.2, en la cual se obtiene una
concentración de producto de 0.89 g/L y un consumo de sustrato final de 26.77 g/L, como se
observa en la Figura 3.24
La Tabla 3.4, presenta el ANOVA del jugo de caña, el cual todos lo p-valores son mayores
a 0.05 lo cual verifica que cada una de las sales y por separado tienen un efecto significativo
sobre el proceso de crecimiento exponencial, además con una R2 de 86.08% del modelo
descrito en la ecuación 3.1, el cual garantiza la fiabilidad de las correlaciones del modelo
sobre la experimentación, evaluando la μmax, como variable de respuesta.
61
Tabla 3.4- ANOVA diseño de mezclas para el jugo de caña.
FUENTE GL SC SEC SC MC F P
AJUST
AJUST
Regresión 8 0.000928 0.000928 0.000116 0.77 0.712
Total 9 0.001078
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑗𝑢𝑔𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎ñ𝑎 𝑐𝑎ñ𝑎 = 0.000073𝑥12 𝑥22 + 0.000050𝑥12 𝑥32 + 0.000320𝑥22 𝑥32 +
0.000345𝑥13 𝑥23 𝑥33 + 0.000007𝑥13 𝑥23 + 0.000116𝑥23 𝑥33 (3.1)
En la Figura 3.25 se muestra el gráfico de superficie de respuesta del diseño de mezcla para
la búsqueda de la dosificación adecuada de sales nutrientes para fortificar el cultivo por lotes,
donde se puede observar que las sales por si solas ofrecen una baja aceleración de crecimiento
celular, sin embargo en los niveles medios de operación se observa una maximización en el
proceso donde se alcanza una μmax de 0.0833 h-1 , esto se puede confirmar con el diagrama
de contornos que se muestra en la Figura 3.26, donde se encuentra una zona optima de la
combinación de sales nutrientes.
62
KH2PO4
Figura 3.25. Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del jugo de caña
KH2PO4
(NH44)SO
(NH )SO44 MgSO4 H2O
Figura 3.26.- Diagrama de contorno del diseño simplex centroide para el jugo de caña.
Para encontrar los valores óptimos de la mezcla se utilizó el software MINITAB17, con un
resultado obtuvo un valor de 0.7966 h-1 bajo la composición que se encuentra en la Tabla 3.5,
donde la sección de variables naturales se refiere a la cantidad en g/L que se necesita para
encontrar el mayor crecimiento de células en la fermentación, y se puede observar que el
KH2PO4 y el (NH4)2SO4 son minerales no tan necesarios para la función metabólica de las
63
levaduras de forma contraria el MgSO7 es un mineral requerido en casi el 50% del total
proporcionado durante el análisis.
Tabla 3.5.- Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del jugo de caña.
64
KH2PO4 (NH4)SO4
.
Figura 3.27.. Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del olote hidrolizado
Total 9 0.004414
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑜𝑙𝑜𝑡𝑒 = 0.000107𝑥12 𝑥22 + 0.000196𝑥12 𝑥32 + 0.000924𝑥22 𝑥32 + 0.000387𝑥23 𝑥33 +
0.000015𝑥13 𝑥23 + 0.000018𝑥33 (3.2)
65
Se observa en la Tabla 3.6 que la fuente de potasio por si sola minimiza el crecimiento celular,
por lo que el mayor crecimiento ocurre cuando la sal de amonio y la sal de magnesio se
encuentran un 50% de cada una, ignorando la utilización de la sal de potasio, con estas
condiciones se obtiene las mejores condiciones para llevar a cabo el cultivo por lotes,
numéricamente se pude observar mediante la Tabla 3.7.
Tabla 3.7. Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del hidrolizado del olote
De forma similar se encuentra el hidrolizado del café que se visualiza en la Figura 3.28,
donde la sal de potasio minimiza el crecimiento de células, pero de forma contraria se observa
que por separado el MgSO4 y el (NH4)SO4 son capaces de desarrollar el crecimiento de las
levaduras y este ultima en mayor proporción desarrolla el metabolismo celular, por lo que no
es una respuesta viable no se ocupa,
KH2PO4
(NH4)SO4
MgSO4 H2O
Figura 3.28.- Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del café hidrolizado
66
.
La combinación de mezcla idónea arrojada por el modelo de la ecuación 3.4 y
estadísticamente se obtuvo una R2 de 77.31% del modelo 3.4 el cual garantiza la fiabilidad
de las correlaciones del modelo sobre la experimentación, evaluando el crecimiento celular
como variable de respuesta y el ANOVA de la Tabla 3.8, demuestra que con p-valores
mayores a 0.05, las sales de forma unitaria y sobre efecto combinado son significativas
durante el proceso de crecimiento celular, en el proceso de fermentación.
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑐𝑎𝑓𝑒 = 0.001822𝑥12 𝑥22 + 0.004763𝑥12 𝑥32 + 0.036992𝑥22 𝑥32 + 0.001259𝑥23 𝑥33 +
0.000015𝑥13 𝑥23 + 0.006043𝑥33 (3.3)
Total 9 0.000054
67
3.8 Productividad optima de la fermentación continua del jugo de caña.
La Figura 3.29 muestra la tasa de dilución óptima encontrada para la fermentación continua
del jugo de caña donde la tasa de 0.06 h-1 con una productividad, Q, de 0.9030 g/Lh superando
en un 18 % a la obtenida en el cultivo por lote de 0.0744 g/Lh, comparando la tasa de dilución
de 0.04 h-1, para los residuos lignocelulósicos de café y madera que son 0.07 y 0.09
respectivamente, se puede observar que son altamente competitivos con el jugo de caña, es
por ellos que se debe evaluar diferentes tasas de dilución para los residuos lignocelulósicos.
0.1
0.09
Productividad (Q)
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
Tasa de dilusión (h-1)
Figura 3.29.- Tasa de dilución optima de la fermentación continua del jugo de caña
68
Conclusiones
Los resultados de la hidrólisis enzimática arrojaron que el residuo lignocelulósico que tuvo
una mayor concentración de azúcares fue el olote con 9.4 g/L de azucares fermentables,
mientras que el café como la madera, obtuvieron una máxima de 2.96g/L y 0.153 g/L
concentración de azucares respectivamente.
Las cinéticas realizadas para obtener la óptima formulación de medio de adaptación arrojaron
que para el jugo de bagazo de caña, la velocidad máxima de crecimiento (µmax) se alcanza en
tiempo de 12 h, obteniendo un valor de 0.3695, con la formulación de 1.167 g/L de KH2PO4,
3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250 g/L de MgSO4.7H2O. El jugo hidrolizado ácido del olote se
evaluó en un tiempo de 18 h, el cual obtuvo un valor de µmax de 0.2417 en un tiempo estimado
de 6 h, con la formulación 0 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L de MgSO4.7H2O.
Mientras que el jugo hidrolizado ácido del café se evaluó en un tiempo de 14 h la cual obtuvo
un valor de µmax de 0.58 en un tiempo estimado de 2 h, la cual refiere a la formulación 0 g/L
de KH2PO4, 0 g/L de (NH4)2SO4 y 1.5 g/L de MgSO4.7H2O.
69
Recomendaciones
Realizar un pretratamiento de molienda más eficaz para reducir el tamaño de la partícula de
los residuos, a fin de mejorar el contacto con el medio durante los tratamientos ácidos y
alcalinos.
Realizar estudios para evaluar otros tipos de medios tanto ácidos como alcalinos que, durante
las etapas hidrolíticas, puedan remover mayor cantidad de lignina y hemicelulosa sin generar
desechos nocivos para el medio ambiente.
70
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74
Anexo A
Determinación de humedad mediante TermobalanzaAMB-50
Procedimiento:
1. Conectar la termobalanza a la toma de corriente
2. Abrir la cubierta del equipo y limpiar perfectamente el platillo metálico
3. Tarar la termobalanza oprimiendo el botón “Tare”
4. Depositar la muestra a la cual se le determinará la humedad, la cantidad de muestra
recomendada debe de ser alrededor de ±0.5 g (peso marcado por la propia termobalanza)
5. Cerrar la cubierta del equipo y comenzar el proceso oprimiendo el botón “start”
6. Dejar funcionar el equipo durante 30 min ininterrumpidos
7. Al finalizar el tiempo establecido, la termobalanza proporcionará un número en su pantalla,
el cual corresponde al número de Sólidos Totales, este dato debe anotarse debido a que se
utilizará posteriormente.
8. Retirar el platillo metálico de la termobalanza y eliminar la muestra analizada, limpiar
perfectamente la termobalanza, y desconectar el equipo.
9. La humedad de la muestra se calcula mediante la ecuación A1.1
75
Anexo B
Determinación de carbohidratos estructurales y lignina en la biomasa
Procedimiento
1.4 Añadir 3.00 ± 0.01 mL de ácido sulfúrico al 72% a cada tubo de ensaye. Se realizó
agitación manual para mezclar bien durante un lapso de un minuto, o hasta que la
muestra esté bien mezclada.
76
1.5 Colocar el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado a 30 ± 3 ° C e incubar la
muestra durante 60 ± 5 min. Se agita la muestra cada 5 a 10 min sin retirar la muestra
del baño. La agitación es esencial para asegurar un contacto uniforme entre ácido y
partículas y una hidrólisis uniforme.
1.6 Una vez completada la hidrólisis de 60 min, retirar los tubos del baño de agua.
Diluir el ácido a una concentración del 4% añadiendo 84.00 ± 0.04 ml de agua
destilada. Se vierte el contenido de los tubos de ensaye en cada uno de los frascos de
250 mL con tapa de baquelita utilizando parte de los 84 mL para la dilución. Se.
mezcla la muestra invirtiendo el tubo varias veces para eliminar la separación de fases
entre capas de ácido de alta y baja concentración
77
1.7 Preparar un conjunto de normas de recuperación del azúcar (SRS) que se tomarán a
través de la hidrólisis restante y se utilizarán para corregir las pérdidas debidas a la
destrucción de azúcares durante la hidrólisis ácida diluida. SRS debe incluir D - (+)
glucosa, D - (+) xilosa, D (+) galactosa, - L (+) arabinosa y D - (+) manosa. Las
concentraciones de azúcar SRS deben elegirse para que se parezcan más a las
concentraciones de azúcares en la muestra de ensayo. Pesar las cantidades requeridas
de cada azúcar, a 0.1 mg más cercano, y agregar 10.0 ml de agua desionizada. Añadir
348 μl de ácido sulfúrico al 72%. Transfiera el SRS a un tubo de presión y la tapa
firmemente.
1.7.1 No se requiere un SRS nuevo para cada análisis. Se puede producir una gran
cantidad de patrones de recuperación de azúcar, se filtran a través de filtros
de 0.2 μm, se dispensan en alícuotas de 10.0 mL en recipientes sellados y se
etiquetan. Pueden almacenarse en un congelador y retirarse cuando sea
necesario. Descongele y vórtice el SRS congelado antes de usarlo. Si se usan
SRS congelados, se añade la cantidad apropiada de ácido a la muestra
descongelada y se agita en vórtice antes de transferirla a un tubo de presión.
1.8 Colocar los tubos de ensaye en la autoclave. Autoclave las muestras selladas y las
normas de recuperación de azúcar durante una hora a 121 °C. Después de completar
el ciclo de autoclave, deje que los hidrolizados se enfríen lentamente a temperatura
ambiente cercana antes de retirar las tapas. (Si no se lleva a cabo la etapa 2.1 extraiga
una alícuota de 10 mL del licor para usar en la etapa 5)
78
las 6 h siguientes a la hidrólisis. Si el licor de hidrólisis debe almacenarse, se debe
almacenar en un máximo de dos semanas. Es importante recoger la alícuota de licor
antes de continuar con el paso 2.3.
2.3 Utilizar agua destilada para transferir cuantitativamente todos los sólidos restantes
del tubo de ensaye al crisol filtrante. Enjuague los sólidos con un mínimo de 50 ml
de agua destilada. Se puede usar agua destilada caliente en lugar de agua a
temperatura ambiente para disminuir el tiempo de filtración.
2.4 Secar el crisol y el residuo insoluble en ácido a 105 ± 3 °C en a estufa hasta que se
consiga un peso constante, usualmente un mínimo de cuatro horas.
2.5 Retirar las muestras de la estufa y enfriar en un desecador durante una hora. Registrar
el peso del crisol y el residuo seco a 0.1 mg.
2.6 Colocar los crisoles y el residuo en el horno de mufla a 575 ± 25 ° C durante 2h.
Esperar un tiempo específico, alrededor de 6 h, a que baje la temperatura hasta 100°
C
3.2 Usando la alícuota de licor de hidrólisis obtenida en la etapa 2.2, mida la absorbancia
de la muestra a una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro UV-Visible.
Consulte la Tabla B1.1para conocer los valores de longitud de onda sugeridos.
79
Tabla B1 Longitudes de onda sugerida para el espectro UV
Tipo de Biomasa Lambda Max Absortividad a Longitud de Absortividad a
(nm) Lambda máx. onda longitud de onda
(L / g cm) recomendada recomendada
(nm) (nm)
Pinus Radiata - NIST 198 25 240 12
SRM 8493
Bagasse- 198 40 240 25
NIST SRM 8491
CornStover- NREL
fuente de alimentación 198 55 320 30
suministrada
Populus deltoides- 197 60 240 25
NIST SRM 8492
Diluir la muestra según sea necesario para llevar la absorbancia al rango de 0.7-1.0,
registrando la dilución. Se puede usar agua destilada o ácido sulfúrico al 4% para
diluir la muestra, pero el mismo disolvente debe usarse como blanco. Registre la
absorbancia a tres decimales. La reproducibilidad debe ser de ± 0.05 unidades de
absorbancia. Analizar cada muestra por duplicado, como mínimo. (Este paso debe
realizarse dentro de las seis horas siguientes a la hidrólisis.)
3.3 Calcule el peso en seco del horno (ODW) de la muestra libre de extractivos, usando
el contenido promedio de sólidos totales.
(B.1.2)
80
(B.1.3)
Donde: ε es la Absortividad de la biomasa a una longitud de onda específica (ver tabla B1),
la Muestrade ODW es el peso de la muestra (mg) y Pathlength es la trayectoria de la celda
UV-Vis (Ancho de la celda en cm)
4.1 Preparar una serie de normas de calibración que contengan los compuestos que se van
a cuantificar, haciendo referencia a la Tabla B.2 para el rango de concentración
sugerido. Utilice un punto de cuatro calibraciones. Si los estándares se preparan fuera
de los rangos sugeridos, el nuevo rango para estas curvas de calibración debe ser
validado.
81
se utiliza para verificar la calidad y la estabilidad de la (s) curva (s) de calibración a
lo largo de la ejecución.
4.3 Usando el licor de hidrólisis obtenido en la etapa 2.2, transfiera una alícuota de
aproximadamente 20 ml de cada licor a un matraz Erlenmeyer de 50 ml.
4.4 Utilizar carbonato de calcio para neutralizar cada muestra a pH 5-6. Evite neutralizar
a un pH mayor que 6 monitorizando con papel pH. Añadir el carbonato de calcio
lentamente después de alcanzar un pH de 4. Remueva la muestra con frecuencia.
Después de alcanzar el pH 5-6, detener la adición de carbonato cálcico, dejar reposar
la muestra y decantar el sobrenadante. El pH del líquido después de la sedimentación
será aproximadamente 7. (Nunca se debe permitir que las muestras excedan un pH de
9, ya que esto dará como resultado una pérdida de azúcares).
4.5 Preparar la muestra para el análisis de HPLC pasando el líquido decantado a través
de un filtro de 0.2 μm a un vial de muestreo automático. Sellar y etiquetar el vial.
Prepare cada muestra por duplicado, reservando uno de los duplicados para su análisis
posterior si es necesario. Si es necesario, las muestras neutralizadas se pueden
almacenar en el refrigerador durante tres o cuatro días. Después de este tiempo, las
muestras deben considerarse comprometidas debido al potencial crecimiento
microbiano. Después del almacenamiento en frío, verificar las muestras de la
presencia de un precipitado. Las muestras que contengan un precipitado deben ser
filtradas de nuevo, mientras estén frías, a través de un filtro de 0.2 μm.
4.6 Analizar los patrones de calibración, CVS y muestras por HPLC usando una columna
de azúcar Shodex SP0810 o BioradAminex HPX-87P equipada con la columna de
protección apropiada.
Condiciones de HPLC:
82
Temperatura de la columna: 80-85 ° C
Temperatura del detector: lo más cerca posible de la temperatura de la columna
Detector: índice de refracción
Tiempo de ejecución: 35 min
5.1 Preparar ácido sulfúrico 0.005 M (0.01 N) para su uso como fase móvil de HPLC. En
un matraz aforado de 2 l, añadir 2.00 ml de ácido sulfúrico normalizado 10 N y llevar
al volumen con agua de grado HPLC. Filtrar a través de un filtro de 0.2 μm y
desgasear antes de usar. Si no se dispone de ácido sulfúrico 10N, también se puede
usar ácido sulfúrico concentrado. 278 \ mu l de ácido sulfúrico concentrado llevado
al volumen en un matraz aforado de 1 L con agua de grado HPLC también producirán
ácido sulfúrico 0.005 M.
83
Anexo C
Determinación de azúcares Reductores Libres por el método DNS (Miller, 1959).
Procedimiento:
Adicionar en tubos de ensayo 0.5 ml de muestra, añadirle 1.5 ml de solución DNS, agitar,
colocar los tubos de ensaye en baño de agua a punto de ebullición durante 15 min. Enfriar a
temperatura ambiente, agregar 8 ml de agua destilada y agitar. Leer la absorbancia a 550 nm.
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Anexo D
Determinación de etanol por el método de Dicromato de Potasio.
(Bohringer y Jakob, 1964).
85