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Subsecretaría de Educación Superior

Tecnológico Nacional de México


fIG Instituto Tecnológico de Orizaba

Instituto Tecnológico de Orizaba


INGENIERÍA QUÍMICA

Reporte Final Residencias Profesionales

TEMA:
“ESTUDIO DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN CONTINUA A PARTIR DE JUGO
DE CAÑA Y RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS PARA LA OBTENCIÓN DE
BIOETANOL”

LUGAR DE REALIZACIÓN:
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA

ASESOR INTERNO:
DRA. LETICIA LÓPEZ ZAMORA

PRESENTAN:
HÉCTOR DANIEL HERNÁNDEZ RAMOS
JOSÉ ALFREDO ORTÍZ MARTÍNEZ

NO. DE CONTROL
13010602
13010631

ORIZABA, VER AGOSTO – DICIEMBRE 2017


AGRADECIMIENTOS

i
RESUMEN

Hoy en día a nivel mundial, a raíz del agotamiento de los combustibles fósiles, ha
incrementado la necesidad de desarrollar nuevas energías renovables a través de diferentes
procesos que puedan ir sustituyendo paulatinamente el uso de estos energéticos. Los
biocombustibles ofrecen una alternativa viable y sustentable que no atenta contra el medio
ambiente teniendo como uno de sus mayores exponentes el bioetanol de segunda generación,
debido a que es producido a partir de recursos naturales, dentro de los cuales se encuentran
residuos como la madera, olote y el café que cuentan con alto contenido lignocelulósico
(celulosa, hemicelulosa y lignina) y el jugo del bagazo de caña el cual presenta un potencial
alto de azúcares fermentables. En México dependiendo de la zona es común encontrar este
tipo de materiales, pero no se ha estudiado ampliamente el potencial fermentativo que pueden
llegar a tener en un proceso continuo, ya que los residuos lignocelulósicos al contar con una
estructura complicada, deben seguir tratamientos diferentes con el fin desglosar su anatomía.
Se aplicó un pretratamiento ácido a los residuos con el fin de remover la mayor cantidad de
hemicelulosa, un pretratamiento alcalino para la remoción de lignina y se llevó a cabo una
cinética prueba de una hidrólisis enzimática aprovechando el contenido de celulosa,
utilizando celulasa Cellic CTec3, la cual demostró que los pretratamientos utilizados
previamente no fueron los óptimos, ya que no se alcanzó una concentración de azúcares alta.
Los jugos provenientes del pretratamiento ácido recibieron un proceso de reducción hasta
alcanzar una concentración de 100 g/L de azucares fermentables y un ajuste de pH a 5.5 con
NaOH, mientras que el jugo de bagazo de caña se adaptó a una concentración de azucares de
140 g/L. A partir de un diseño simplex centroide se llevaron a cabo cinéticas de crecimiento
con el fin de obtener el óptimo para el mejor medio de adaptación de cada uno utilizando
como material biológico la levadura Saccharomyces cerevisiae ITV01. Para su posterior
análisis se tomó como variable de respuesta la µmáx. El estudio de la fermentación continua
se llevó a cabo utilizando para el jugo de bagazo de caña tres diferentes tasas de dilución (τ)
(0.04, 0.06 y 0.08) mientras que para los jugos hidrolizados se ocupó solo a 0.08, bajo las
condiciones de inoculo de 3x106 células/mL para la fermentación Batch hasta alcanzar el
máximo crecimiento de levaduras, en un fermentador de 1.2 L a un volumen de operación de
1 L. En este proceso se evaluó la cantidad de biomasa durante la fermentación, asi como
también la cantidad de azucares reductores y la cantidad de etanol producido.

ii
INDICE
Lista de Figuras vii
Lista de Tablas ix
INTRODUCCIÓN x
DESCRIPCIÓN DE LA ORGANIZACIÓN x
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA xi
DELIMITACIÓN xii
OBJETIVO GENERAL. xii
OBJETIVOS ESPECÍFICOS. xii
JUSTIFICACIÓN xiii
CAPÍTULO I I
1.1 Materiales lignocelulósicos 2
1.1.1 Estado del arte 2
1.1.2 Composición de materiales lignocelulósicos 2
1.2 Caña de azúcar 3
1.3 Jugo de caña de azúcar. 3
1.4 Biocombustibles 4
1.4.1 Biocombustibles de primera generación 5
1.4.2 Biocombustibles de segunda generación 5
1.4.3 Biocombustibles de tercera generación 5
1.4.4 Bioetanol 6
1.4.5 Bioetanol como combustible 6
1.4.6 Ventajas del bioetanol 7
1.4.7 Desventajas del bioetanol 8
1.5 Estructuras lignocelulósicas 8
1.5.1 Celulosa 9
1.5.2 Hemicelulosa 10
1.5.3 Lignina 11
1.5.4 Influencia de la biomasa lignocelulósica en su procesamiento 13
1.6 Hidrólisis 13
1.6.1 Hidrólisis ácida 13
1.6.2 Hidrólisis alcalina 14
1.6.3 Hidrólisis enzimática 14

iii
1.7 Fermentación 15
1.7.1 Parámetros y condiciones de operación en la fermentación 15
1.7.2 Fermentación Batch 16
1.7.3 Fermentación Continua 16
1.7.4 Cinética de crecimiento de las levaduras en la fermentación 17
1.8 Elementos fermentadores 18
1.8.1 Levaduras modificadas 18
1.8.2 Levadura Saccharomyces Cerevisiae 19
1.9 Trabajos relacionados realizados por otros autores 19
CAPÍTULO II 23
2.1 Alcances y limitaciones 23
2.1.1 Alcances 23
2.1.2 Limitaciones 23
2.2 Procedimiento y descripción de actividades 23
2.3 Metodología 23
2.4 Obtención de los residuos lignocelulósicos 23
2.5 Caracterización 24
2.5.1 Humedad 24
2.5.2 Determinación de carbohidratos estructurales y lignina (NREL) 24
2.5.3 Grados Brix (°Bx) 25
2.5.4 pH 25
2.5.5 Determinación de azúcares (DNS) 25
2.5.6 Determinación de alcohol. 25
2.6 Acondicionamiento de la materia prima 25
2.7 Hidrólisis. 25
2.7.1 Pretratamiento ácido 25
2.7.2 Pretratamiento alcalino 26
2.7.3 Hidrólisis enzimática 27
2.7.4 Inactivación de la enzima 28
2.8 Nutrientes 29
2.8.1 Material biológico 29
2.8.2 Activación de la levadura 29
2.8.3 Medios de cultivo 29

iv
2.8.4 Medios de conservación 29
2.9 Condiciones de fermentación 30
2.9.1 Precultivo y preinóculo 30
2.9.2 Fermentación por lotes (Cinéticas) 31
2.9.3 Velocidad máxima de crecimiento (μmax) 31
2.9.4 Análisis de Biomasa 32
2.9.5 Conteo celular 32
2.9.6 Productividad 32
2.10 Análisis de la materia prima e hidrolizados por HPLC 33
2.10.1 Análisis de datos a partir de HPLC para NREL 33
2.11 Fermentaciones 34
2.11.1 Montaje de equipo 34
2.11.2 Montaje del equipo en sistema de fermentación continúa. 34
2.11.3 Flujo de alimentación al reactor en sistema continuo. 35
2.11.4 Tiempo de residencia(𝝉) en sistema continuo 35
2.11.5 Fermentación con jugo de caña en cultivo continuo en fermentador de 1L 36
2.11.5.1 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.04 36
2.11.5.2 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.06 37
2.11.5.3 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.08 37
2.11.6 Fermentación con jugos hidrolizados en sistema continuo en fermentador de
1L. 37
2.11.6.1 Fermentación continua con jugo hidrolizado de Olote y café en fermentador
de 1L a D=0.08 38
CAPÍTULO III 23
3.1 Obtención de los residuos lignocelulósico 40
3.2 Resultados de la caracterización 40
3.3 Hidrólisis 41
3.3.1 Hidrólisis ácida 41
3.3.2 Pretratamiento Alcalino 42
3.3.3 Hidrólisis Enzimática 43
3.4 Fermentación por lotes 45
3.4.1 Comportamiento del Jugo de caña 46
3.4.2 Comportamiento del hidrolizado ácido del olote 48
3.4.3 Comportamiento del hidrolizado ácido del café 51

v
3.4.4 Comportamiento del hidrolizado ácido de la madera 54
3.5 Fermentaciones 55
3.5.1 Fermentación Continua de Jugo de Caña 55
3.5.2 Fermentación Continua de Hidrolizados ácidos 57
3.6 Evaluación de consumo de sustrato y producción de etanol 59
3.7 Evaluación estadística 61
3.8 Productividad optima de la fermentación continua del jugo de caña. 68
Conclusiones 69
Recomendaciones 70
Bibliografía 71
Anexo A 75
Anexo B 76
Anexo C 84
Anexo D 85

vi
Lista de Figuras
FIGURA PAG

2.1 Equipo de fermentación continuo. 35


3.1 Caracterización de la materia prima 41
3.2 Concentración de azucares del hidrolizado ácido del olote 44
3.3 Concentración de azucares del hidrolizado ácido de la madera 44
3.4 Concentración de azucares del hidrolizado ácido del café 44
3.5 Cinética para la obtención de la µmax del jugo de caña 46
3.6 Cinética de biomasa para el jugo de caña 47
3.7 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el 48
jugo de caña
3.8 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el 48
jugo de caña
3.9 Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del olote 49

3.10 Cinética de crecimiento de biomasa para jugo hidrolizado de olote. 50

3.11 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el 51
jugo hidrolizado ácido de olote
3.12 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el 51
jugo hidrolizado ácido de olote
3.13 Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del café 52

3.14 Cinética de crecimiento de biomasa para jugo hidrolizado del café 53


3.15 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo 54
hidrolizado ácido del café
3.16 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el 54
jugo hidrolizado ácido del café

3.17 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.04 h-1 55

3.18 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.06 h-1 56

vii
3.19 Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.08 h-1 57

3.20 Cinética de hidrolizado de café con una tasa de dilución de 0.08 h-1 58

3.21 Cinética de hidrolizado ácido de Olote con una tasa de dilución de 0.08 h -1 59

3.22 Consumo de sustrato y producción de etanol en el Jugo de Caña 60

3.23 Consumo de sustrato y producción de etanol en el Hidrolizado de Olote 60

3.24 Consumo de sustrato y producción de etanol en hidrolizado de café 61

3.25 Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del jugo de caña 63

3.26 Diagrama de contorno del diseño simplex centroide para el jugo de caña. 63

3.27 Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del olote hidrolizado.. 65

3.28 Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del café hidrolizado. 66

3.29 Tasa de dilución optima de la fermentación continua del jugo de caña 68

viii
Tablas
TABLA PAG
1.1 Composición de diferentes materiales lignocelulósicos. (SungyChen, 3
2002, citado por Cuervo et al., 2009)
1.2 4
Composición de azucares en el jugo de caña. (Meade&Chen, 1997,
citado por Espinoza, 2015).
2.1 4
Parámetros para la caracterización de los residuos lignocelulósicos

2.2 Composición del medio para conservación de la S. Cerevisiae ITV01 24

2.3 Medio de activación para la S.Cerevisiae ITV-01 30


2.4 Medio de preadaptación para la S.Cerevisiae ITV-01 30

2.5 Diseño simplex de sales para cinéticas. 31


3.1 Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del 42
pretratamiento ácido
3.2 Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del 43
pretratamiento alcalino
3.3 Nomenclatura utilizada en combinación de sales 45

3.4 ANOVA diseño de mezclas para el jugo de caña. 62

3.5 Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del jugo de caña. 64

3.6 ANOVA diseño de mezclas para el hidrolizado de olote 65

3.7 Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del hidrolizado 66
del olote
3.8 ANOVA diseño de mezclas para el hidrolizado de café 67
B1 Longitudes de onda sugerida para el espectro UV 79

B2 Intervalos de concentración sugeridos para normas de 82


calibración

ix
ESTUDIO DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN CONTINUA A PARTIR DE
JUGO DE CAÑA Y RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS PARA LA OBTENCIÓN
DE BIOETANOL
INTRODUCCIÓN

Existe una tendencia global, en el desarrollo de las energías renovables, esto obliga a
considerar un portafolio amplio y competitivo de proyectos así como medidas audaces, lo
que incluye tanto la eliminación de barreras y promoción de la energía renovable, así como
la consideración de otras tecnologías no fósiles (Lovettet al., 2011).

México no es la excepción y enfrenta retos en materia ambiental, donde los costos a la salud
y al ambiente derivados de la generación y del uso de la energía son significativos. Si se
pretende que la energía acompañe un crecimiento económico del país por arriba del histórico,
será necesario aumentar la capacidad instalada del parque de generación para suministrar la
energía asociada, tanto a un mayor consumo industrial, como al crecimiento poblacional
(CONAPO, 2013, citado por Siliceo, 2014).

México cuenta con una meta para incrementar el porcentaje de energías no fósiles para la
generación de electricidad en por lo menos 35% al 2024. Por lo que la producción y
utilización de biocombustibles ha generado un renovado interés en los últimos años,
destacándose su contribución en la diversificación de la oferta energética, en un intento por
reducir la dependencia hacia los combustibles derivados del petróleo, reducir las emisiones
de gases de efecto invernadero, promover el desarrollo de la agricultura y generar mayores
niveles de empleo (Secretaría de Energía, 2014, citado por Siliceo 2014.

DESCRIPCIÓN DE LA ORGANIZACIÓN

El Instituto Tecnológico de Orizaba (I.T.O.) se ubica en Oriente 9, Col. Emiliano Zapata Sur,
Orizaba, Veracruz., C.P. 94320.

Es una institución pública de educación superior tecnológica que forma parte del Tecnológico
Nacional de México (TecNM).

En sus primeros años, este centro tecnológico estaba enfocado a formar técnicos de la
industria textil, muy relevante en ese tiempo en Orizaba. Pero al formarse la Escuela Superior
x
de Ingeniería Textil en el IPN se consideró innecesario cambiar la orientación inicial del
centro, el cual se centró a formar técnicos para la Industria Azucarera. En un decreto
presidencial del 10 de julio de 1952 fue creada la Comisión Nacional de la Caña de Azúcar
y se establecía la creación de Instituto Tecnológico Orizabeño. En la práctica, el Centro
Tecnológico de Orizaba pasó a ser la institución que ordenaba el decreto.

En un principio el Instituto Tecnológico de Orizaba era una de las veintiocho escuelas de


educación tecnológica dependientes del IPN, pero desde el año de 1958 se integró a la
Dirección General de Institutos tecnológicos Foráneos como la sexta escuela dependiente de
dicha Dirección.

En la actualidad se imparten 8 carreras a nivel licenciatura, ofrece 5 programas de maestrías


al igual que un programa de doctorado en ciencias de la ingeniería.

Cuenta con la Misión de fortalecer los servicios educativos a través de la cobertura, equidad,
promoción e inclusión, en la formación integral de los estudiantes impulsando la innovación,
ciencia y tecnología; para consolidar la vinculación con pertinencia en los diferentes sectores
estratégicos, modernizando la gestión institucional con transparencia y rendición de cuentas
en un ámbito sustentable.

La carrera de ingeniería química tiene como objetivo general:

Formar profesionistas en Ingeniería Química competentes para investigar, generar y aplicar


el conocimiento científico y tecnológico, que le permita identificar y resolver problemas de
diseño, operación, adaptación, optimización y administración en industrias químicas y de
servicios, con calidad, seguridad, economía, usando racional y eficientemente los recursos
naturales, conservando el medio ambiente, cumpliendo el código ético de la profesión y
participando en el bienestar del país.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La población mundial está creciendo continua e indefinidamente. Este crecimiento ocasiona


un incremento en la demanda de alimentos, combustibles y energéticos. Sin embargo,
nuestros recursos son finitos y tienen un límite que pronto será alcanzado. La utilización de

xi
los combustibles fósiles ha sido un gran motor para el desarrollo de la sociedad, a medida
que este recurso se agota, se hace más evidente la importancia de hacer una transición hacia
un esquema energético más sostenible. Este esquema sustentable estaría basado en el
aprovechamiento de distintas fuentes de energía y entre ellas destacan, las energías
renovables. A nivel mundial, aproximadamente 90% de la energía consumida proviene de
fuentes no renovables (Pérez, 2009)

DELIMITACIÓN

La fermentación se realizó empleando un medio de cultivo sintético de activación y un medio


de preadaptación utilizando jugo de caña y residuos lignocelulósicos y empleando como
levadura la Saccharomyces cerevisiae ITV-01.

OBJETIVO GENERAL.

Determinar las mejores condiciones que favorezcan la producción de bioetanol a partir de


jugo de bagazo de caña y residuos lignocelulósicos

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

1. Evaluar el efecto de la velocidad de agitación, concentración de levadura y tiempo en


el proceso fermentativo de jugo de sorgo dulce mediante un diseño 23

2. Caracterizar mediante HPLC la calidad del bioetanol

3. Realizar un análisis estadístico que permita determinar las variables más importantes
y los rangos más adecuados de operación

RECONCIDERACIÓN

Estas residencias forman parte del proyecto financiado SAGARPA – CONACYT, titulado
“Producción de bioetanol de 2ª generación, a partir de residuos agroindustriales y
enzimas obtenidas de microorganismos autóctonos”, con clave 291143, mismo que inició
en el mes de diciembre, en lugar del mes de agosto que era lo inicialmente planeado. Esta
situación, provocó un retraso en las actividades que requerían realizarse en otras

xii
instituciones, por lo que fue necesario reconsiderar el trabajo inicialmente propuesto,
llevando a la realización de los siguientes objetivos:

1. Obtener y caracterizar tres tipos de residuos lignocelulósicos


2. Obtener azúcares fermentables de tres residuos lignocelulósicos mediante hidrólisis
enzimática
3. Obtener azúcares fermentables de tres residuos lignocelulósicos mediante pretratamiento
alcalino
4. Determinar experimental de la velocidad máxima de crecimiento celular en diferentes
sustratos para la producción de etanol
5. Evaluar la concentración de producto y sustrato en el proceso de fermentación continua y por
lotes.
6. Analizar estadísticamente la velocidad máxima de crecimiento y la productividad del proceso
de fermentación.

Todo lo anterior, permitió un estudio más amplio tanto del jugo de caña como de los residuos
lignocelulósicos que lo originalmente considerado.

JUSTIFICACIÓN

El bioetanol es una fuente de energía alternativa que es a la vez renovable y respetuoso del
medio ambiente. Puede ser producido a partir de materias primas como el grano de maíz,
yuca, caña de azúcar, caña de azúcar, melaza y sorgo dulce, entre otros.

Los materiales lignocelulósicos son los que ofrecen un mayor potencial para la producción
de bioetanol. Una gran parte de los materiales con alto contenido en celulosa, susceptibles de
ser utilizados para estos fines, se generan como residuos en los procesos productivos de los
sectores agrícola, forestal e industrial. Los residuos agrícolas proceden de cultivos leñosos,
herbáceos y de cereales. Por su parte, los residuos de origen forestal proceden de los
tratamientos silvícola y de mejora o mantenimiento de los montes y masas forestales

La Saccharomyces cerevisiae es ampliamente usada en la producción de etanol, donde


además de las cepas de lavadura, nutrientes y la capacidad misma de la levadura para producir

xiii
etanol, esta dependerá de la concentración de azúcar en el medio de fermentación
[Phukoetphimet al., 2016].

La fermentación etanólica clásica es un proceso de baja productividad debido


fundamentalmente a dos causas: empleo de procesos discontinuos y aparición de inhibición
por productos a determinadas de concentraciones de etanol en el medio de cultivo, por lo que
las alternativas propuestas para mejorar la misma van encaminadas en el sentido de emplear
distintos tipos de fermentadores continuos [Martínez et al., 1993].

Un fermentador de tanque agitado (FCTA) es similar a un fermentador discontinuo, excepto


en que se añaden dispositivos para alimentación y descarga constante en la cual, la diferencia
fundamental esta, en el hecho de que el contenido del recipiente está en estado estacionario
[Castañón-Rodríguez et al., 2015], donde la población microbiana se mantiene es un estado
continuo de crecimiento balanceado con adición y sustracción de materia y energía
[Atkinson, 2002].

En un sistema ideal FCTA en el estado estacionario. (X) concentración de células, (S)


concentración de sustrato y (P) concentración de producto, permanecen constantes, donde la
evaluación de la calidad del medio representa una importante herramienta para conocer la
respuesta del microorganismo ante del medio y se genere producto en condiciones óptimas.
Los sistemas de fermentación continua se evalúan mediante sistemas de quimiostato y
turbiostato [Atkinson, 2002].

xiv
CAPÍTULO I

FUNDAMENTOS TEÓRICOS
CAPITULO I. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

1.1 Materiales lignocelulósicos


1.1.1 Estado del arte

El uso de material lignocelulósico como materia prima para la producción limpia de etanol,
parece ser una atractiva solución dada las futuras tendencias del uso del bioetanol como un
combustible para transporte y su demanda para una producción sostenible de energía.

Los materiales lignocelulósicos presentan una estructura compuesta principalmente por tres
componentes (celulosa, hemicelulosa y lignina). En los procesos de degradación de
materiales lignocelulósicos se pueden identificar algunos tratamientos comunes utilizados
para la producción de azúcares fermentables. Estos tratamientos pueden ser físicos, químicos,
enzimáticos o con microorganismos. Así mismo la factibilidad de cada tratamiento depende
del consumo de energía, selectividad, costos del proceso y velocidad de degradación.

La estructura química, el grado de entrecruzamiento de los componentes que forman los


materiales lignocelulósicos, la composición de sus componentes principales, están
relacionadas con el material de origen del cual proceden. Igualmente, la estructura de los
materiales lignocelulósicos determina sus propiedades mecánicas, la resistencia al ataque de
microorganismos, enzimas, agentes químicos y establece la dificultad de degradar este tipo
de materiales. Por lo que se puede asegurar, que la naturaleza del sustrato y el método de
pretratamiento usado, influye sobre la eficiencia de degradación del material lignocelulósico
(González y García, 2013).

1.1.2 Composición de materiales lignocelulósicos

La composición de un material lignocelulósico varía dependiendo de muchos factores, entre


los que podemos citar: especie, clima, nutrientes, ubicación, entre otros. Es importante
conocer la cantidad de celulosa contenida en los materiales lignocelulósicos, pues en ella,
principalmente, se encuentra el potencial para generar biocombustibles.

En la Tabla 1.1 se muestran los diversos materiales lignocelulósicos y su relación porcentual


con respecto al contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina (Cuervo et al., 2009).

2
Tabla 1.1 Composición de diferentes materiales lignocelulósicos. (SungyChen, 2002, citado por Cuervo et al.,
2009)
Material Lignocelulósico. Celulosa (%) Hemicelulosa (%) Lignina (%)
Madera dura 40-55 24-40 18-25
Madera suave 45-50 25-35 25-35
Cascara de nuez 25-30 25-30 30-40
Olote de maíz 45 35 15
Desechos de pastos 25-40 35-40 18-30
Papel 85-99 0 0-15
Paja de Trigo 30 50 15
Hojas 15-20 80-85 0
Algodón 80-95 0 0
Papel Periódico 40-55 25-40 18-30

1.2 Caña de azúcar

La caña de azúcar es una gramínea tropical, un pasto gigante emparentado con el sorgo y el
maíz, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser
extraído y cristalizado forma el azúcar. Forma espiguillas pequeñas agrupadas en rosetas y
rodeadas por largas fibras sedosas. Se conocen diversas variedades cultivadas que se
diferencian por el color y la altura de los tallos (Fajardo y Sarmiento, 2007).

1.3 Jugo de caña de azúcar.

Los jugos de la caña de azúcar contienen pequeñas cantidades de almidón, aproximadamente


entre 50 y 70 mg/l, en forma de gránulos, los cuales durante la molienda se separan del tejido
vegetal y se solubilizan en forma de dos estructuras moleculares: la amilosa y la amilopectina.
La amilosa es esencialmente un glucano lineal con enlaces de glucosa -(1.4) y la
amilopectina, aunque es también un glucano, exhibe uniones -(1.4) asociadas con una
estructura altamente ramificada de enlaces -(1.6) (Espinoza, 2015). En la Tabla 1.2 se
muestran los diferentes constituyentes presentes en el jugo de caña en porcentajes tanto en
azucares como en sales.

3
Tabla 1.2. Composición de azucares en el jugo de caña. (Meade&Chen, 1997, citado por Espinoza, 2015).
Constituyentes en el Jugo de Caña Porcentajes
Azúcares
 Sacarosa 75 – 92
 Glucosa 70 – 88
 Fructosa 2–4
Sales
 Inorgánicas 3.0 – 3.4
 Orgánicas 1.5 – 4.5
Ácidos Orgánicos 1–3
Aminoácidos 1.5 – 5.5

1.4 Biocombustibles

Biocombustible es todo aquel combustible producido directamente de la biomasa o mediante


su transformación y que puede substituir a combustibles de origen fósil. El termino bio indica
que su origen es biológico y por ende renovable. Un ejemplo de ello es el biogás, el cual es
un combustible rico en metano obtenido a partir de la digestión anaeróbica de residuos
orgánicos, este biogás es capaz de reemplazar al Gas LP.

El bioetanol puede obtenerse de varias fuentes vegetales (biomasa), de acuerdo a la Secretaría


de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Ganadería, Pesca y Alimentación, el bioetanol
se clasifica en tres generaciones, dependiendo del tipo de fuente.

A los biocombustibles se les atribuye los siguientes beneficios:

• Su carácter renovable, puesto que se puede disponer de ellos en los volúmenes


deseados y de esta manera disminuir la dependencia por combustibles fósiles.
• Su neutralidad en CO2, debido a que las emisiones de CO2 en su ciclo productivo
pueden ser neutralizadas por el CO2 absorbido durante el crecimiento de los cultivos
energéticos mediante fotosíntesis

4
• La reducción de emisiones en su combustión de material particulado y dióxido de
azufre, entre otros que afectan la salud humana y el medio ambiente.

Son estos tres beneficios los que convierten a los biocombustibles en una alternativa
energética viable frente a la problemática ambiental y energética (Alejos y Calvo, 2015).

1.4.1 Biocombustibles de primera generación

Proviene de cultivos que pueden ser empleados también para la alimentación humana o
animal y que se procesan a partir de los métodos que tradicionalmente se han empleado para
producir alcohol. Entre los principales biocombustibles de primera generación se encuentran
el bioetanol, el biodiesel y el biogás (Gómez, 2016).

Los cultivos adecuados son los que tienen altas concentraciones de azúcares, como la caña
de azúcar, el sorgo dulce o la remolacha; o altas concentraciones de almidones, como el maíz,
la yuca o la papa.

1.4.2 Biocombustibles de segunda generación

Es el que se produce a partir de materias primas o materiales lignocelulósicos que pueden


convertirse en celulosa, como los residuos de la madera, o de cultivos alimenticios como los
desechos del maíz y el trigo o el bagazo de la caña de azúcar. Su procesamiento requiere de
tecnologías avanzadas y aunque ya hay algunas plantas productoras en el mundo, todavía
está en fase experimental (Alejos y Calvo, 2015).

1.4.3 Biocombustibles de tercera generación

Los biocombustibles de tercera generación son aquellos que utilizan la ciencia de la genética
para mejorar el crecimiento, rendimiento y características de los cultivos energéticos para
obtener materia prima de mejor calidad para producir biocombustibles. El cultivo de
microalgas, de las cuales puede extraerse aceite para la producción de biodiesel, es un
representante de esta tecnología (Alejos y Calvo, 2015).

5
Aunque son las que prometen una mayor productividad para generar bioetanol, aún se
encuentran en fase experimental y no están listas para producir bioetanol en cantidades
industriales de una manera rentable.

1.4.4 Bioetanol

Las perspectivas de agotamiento de los combustibles fósiles sumado a la demanda creciente


de energía, sitúan a los biocombustibles líquidos como una alternativa energética renovable,
en el marco de la creciente valoración de combustibles que tengan bajo impacto en la emisión
de carbono. El bioetanol constituye alrededor del 90% del biocombustible producido a escala
mundial (Bueno et al.,2009).

En la actualidad, hablar de la energía sin mencionar el uso de los biocombustibles es casi


inimaginable. Es por ello que una de las herramientas más aceptadas a nivel científico y social
es la sustitución de los combustibles fósiles por energías alternativas, aquellas que ayuden a
contrarrestar el problema de los aumentos en la temperatura del planeta que influyen en los
gases de efecto invernadero y los daños que tiene hacia el medio ambiente. Hoy en día, una
de las alternativas concretamente viable es la producción de Bioetanol. El consumo de estas
nuevas alternativas disminuyen las importaciones de energías fósiles como lo es el crudo y
se contribuye al impulso de las diversas actividades tanto agrícolas como industriales y se
mejora el grado de autosuficiencia de energía (Bueno et al.,2009).

Con el paso del tiempo, el tema de los biocombustibles se va desarrollando de manera rápida
al igual que los avances tecnológicos van a la par con este crecimiento.

1.4.5 Bioetanol como combustible

El Bioetanol es un biocombustible de origen vegetal que se produce a partir de la


fermentación de materia orgánica rica en azúcar como puede ser la caña de azúcar,
remolacha, vino, etc., así como también de la transformación en azúcar del almidón empleado
que está presente en los diversos cereales. Estos azúcares se encuentran combinados en
diferentes formas como la sacarosa, almidón, hemicelulosa, celulosa y lignina. Dependiendo
de la materia prima utilizada para su producción se derivan diversos subproductos que son
utilizados en diferentes industrias entre las cuales destacan la industria de la alimentación y
de la energética.
6
El Bioetanol se produce por la fermentación de los azúcares contenidos en la materia orgánica
de las plantas. Se lleva a cabo un proceso en el cual se obtiene alcohol hidratado el cual tiene
un contenido aproximado de 5% H2O, que posteriormente mediante una deshidratación
puede ser empleado como combustible. El Bioetanol obtenido mezclado con la gasolina
genera un biocombustible de alto poder energético, el cual tendrá características muy
parecidas a las de la gasolina, pero tendrá una importante reducción en las emisiones
contaminantes (Gracia, 2011).

Para que el Bioetanol contribuya al cien por ciento a las necesidades como combustible,
necesita de un balance energético positivo, el cual se lleva a cabo mediante la consideración
de algunas variables:

 Cantidad de energía contenida en el producto al final de la producción.


 Cantidad de energía consumida directamente para la producción de etanol.
 Calidad del Bioetanol resultante.
 Energía consumida en la planta productora.
Almidón Azúcar Fermentación

 Mediante la fermentación directa de productos azucarados:


𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶𝐻3 𝐶𝐻2 𝑂𝐻(1) 2𝐶𝑂2 (𝑔) + 𝐻2 𝑂 (𝑙) (1.1)

1.4.6 Ventajas del bioetanol

De acuerdo a Guerra et al.(2008) los puntos siguientes presentan varias ventajas para la
producción de bioetanol:

 Es una fuente de combustible renovable


 Reduce dependencia del petróleo del extranjero
 Es una fuente más limpia de combustible
 Aumenta el octano del combustible con un coste pequeño
 Virtualmente utilizable en todos los vehículos
 Fácil de producir y almacenar

7
 Los biocarburantes emiten un 40-80 % menos de gases invernaderos que los combustibles
fósiles
 El bioetanol es superior medioambientalmente al resto de los carburantes más
importantes
 Reduce la formación de la lluvia ácida
 Mejora la calidad del aire en zonas urbanas
 No contamina el agua
 Con su producción puede reducirse los residuos
 En mezcla con gasolina, aumenta el número de octanos y promueve una mejor
combustión
 Reduce las emisiones contaminantes como monóxido de carbono (CO) e hidrocarburos,
con un bajo costo. Se estima que la reducción es de 40 a 80 % menos de gases invernadero
que los combustibles fósiles
 Es virtualmente utilizable en todos los vehículos con motor a gasolina

1.4.7 Desventajas del bioetanol

Para poder utilizar el bioetanol como combustible se necesita llevar a cabo varias
modificaciones dentro del motor, y así no alterar significativamente el consumo. Aumentar
la relación de compresión:

 Variar la mezcla de combustible / aire


 Bujías resistentes a mayores temperaturas y presiones
 Conductos resistentes al ataque de alcoholes
 Se debe agregar un mecanismo que facilite el arranque en frío(Guerra et al., 2008).

1.5 Estructuras lignocelulósicas

La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal y más abundante


componente de la biomasa producida por la fotosíntesis, anualmente se forman 200,000
millones de toneladas en el mundo. El interés por el uso de materiales lignocelulósicos como
materia prima en procesos de transformación por microorganismos es importante desde hace
varias décadas. Entre las razones fundamentales se tienen que:

8
 La materia lignocelulósica es el producto agroindustrial de mayor abundancia.
 Es una fuente de materia prima renovable, por constituir una parte estructural en el reino
vegetal
 Los materiales lignocelulósicos son menos costosos que los materiales
convencionalmente utilizados para producir etanol (Cuervo et al., 2009).

1.5.1 Celulosa

La celulosa es un polímero lineal en el que los enlaces β-1,4, glicosídicos se unen para formar
unidades de repetición de celobiosa.

La celulosa producida de esta manera existe de forma natural en dos formas. La primera se
conoce como celulosa pura, e incluye celulosas producidas en su estado natural, como el
algodón y la celulosa bacteriana; y la presentan algunas algas y animales marinos como los
tunicados. La segunda se denomina celulosa compleja, e incluye la mayoría de las celulosas
presentes en la naturaleza, siendo el componente fundamental de la pared celular de las
plantas superiores (Pecoraro, 2008, citado por Lacerda, 2015).

La celulosa se compone de dos moléculas de glucosa unidas y esterificadas por enlaces β-1,4
glicosídicos que se estructuran en largas cadenas lineales (micro fibrillas) unidas por puente
de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals intramoleculares, formando una estructura
cristalina resistente a la hidrolisis y regiones amorfas susceptibles a la degradación
enzimática.

En su mayoría, los carbohidratos presentes en la naturaleza se encuentran en forma de


polisacáridos, estos no solamente están compuestos por azúcares unidos por enlaces
glicosídicos, sino también pueden contener estructuras sacáridas poliméricas unidas por
enlaces covalentes a aminoácidos, péptidos, proteínas, lípidos y otras estructuras (Pérez et
al., 2002, citado por Medina-Morales et al., 2011).

La celulosa es el polímero más abundante de la naturaleza, recibe el nombre de biopolímero


ya que forma parte de estructuras biológicas vegetales. Su estructura está formada por
monómeros de glucosa unidos por enlaces en el carbono 1 y el carbono 4 por medio de una

9
unión β, es de peso molecular alto. (Laureano-Pérez et al.,2005, citado por Sánchez et
al.,2010)

1.5.2 Hemicelulosa

El termino hemicelulosa se utiliza para definir los polisacáridos que normalmente se asocian
con la celulosa en las paredes celulares (Rogalinski 2008, citado por Lacerda, 2015). Se
producen en estrecha asociación con la celulosa y la lignina y contribuyen a la rigidez de las
paredes celulares de las plantas. Las hemicelulosas constituyen alrededor del 20-30% de la
masa total de las plantas anuales y perennes. Tienen una composición heterogénea formada
por diferentes unidades estructurales de azúcares neutros.

Estos azúcares pueden ser carbohidratos de cinco carbonos (xilosa y arabinosa) y


carbohidratos de seis carbonos (galactosa, glucosa y manosa). Algunas hemicelulosas
contienen adicionalmente ácido urónico. También se pueden encontrar mananos,
glucomananos,glucanos, xiloglucanos, ramnogalactouronanos, y en los xilanos encontramos
los arabionxilanos O-acetil-4-Ometilglucuronoxilano (Spiridon y Popa 2008, citado por
Lacerda, 2015)

El componente hemicelulósico principal de algunos materiales vegetales como maderas


duras son los xilanos y en maderas suaves el glucomamano. Este polímero es de peso
molecular más bajo que la celulosa y contiene ramificaciones con cadenas laterales cortas de
azúcares diferentes fácilmente hidrolizables (Hendriks y Zeeman, 2009)

La xilosa es la unidad estructural más abundante en las plantas leñosas, estas unidades se
unen por enlaces glicosídicos en las posiciones 1 y 4. Entre las caracteristicas de la
hemicelulosa se encuentran: su alto carácter hidrofilico, contienen cadenas
considerablemente ramificadas , naturaleza altamente amorfa y un grado de polimerización
(DP) entre 100 y 200 (Yang y Wiman, 2008, citado por Lacerda, 2015)

Los polisacáridos estructurales tienen propiedades dramáticamente diferentes a los


polisacáridos de almacén de energía (almidón), aunque su composición puede ser similar a
estos. Estos polisacáridos estructurales se encuentran en las paredes celulares de todas las
plantas; es uno de los principales componentes que proveen estructura y fuerza. La celulosa

10
es un homopolímero lineal de glucosa similar a una α-amilosa del almidón. La diferencia
estructural que existe entre ellas, la cual altera completamente las propiedades del polímero,
es que en la celulosa las unidades de glucosa están unidas por enlaces β 1-4 y en la α-amilosa
el enlace es α 1-4. La conformación más estable conferida por enlaces glucosídicos es dada
por el enlace β 1-4, ya adopta que una conformación extendida, referida como un listón
extendido. La posición de los polímeros de esas cadenas permite un eficiente Inter
encadenamiento por medio de puentes de hidrógeno, que es la base de la fuerza de la celulosa
(Garret y Grisham, 1996, citado por Medina-Morales et al., 2011).

La hemicelulosa se puede unir a las microfibrillas de celulosa mediante enlaces de hidrogeno,


formando una proteccion que impide el contacto entre microfibrillas y produciendo una red
cohesiva. El xiloglucano es la principal hemicelulosa presente en muchas paredes celulares
primarias . Sin embargo, en la pared celular secundaria, que predominan en la biomasa de las
plantas , las hemicelulosas son tipicamente mas xilanos y arabino-xilanos. La hemicelulosa
comprende entre 20 a 50% de los polisacaridos presente en el material lignocelulosico, y por
lo tanto contribuye significativamente a la produccion de biocombustibles liquidos (Spiridon
y Popa 2008, citado por Lacerda, 2015).

1.5.3 Lignina

La lignina está asociada con la celulosa y hemicelulosa en la composición del material


lignocelulósico. Es un material hidrófobo con estructura tridimensional, altamente
ramificada y puede ser clasificado como un polifenol que está constituido por un enlace
irregular de diversas unidades de fenilpropano que pueden contener grupos hidroxilo y
metoxilo como sustituyentes en el grupo fenilo. Los enlaces éter dominan la unión de entre
las unidades de la lignina, que cuenta con una gran numero de interconexiones.

La lignina es soluble en agua y presenta una densidad de 1.3 g/ml 25°C. La lignina no posee
unas características estructurales bien definidas, como en el caso de la celulosa. El problema
esta en que la estructura esta conformada por diversas unidades que no se repiten de forma
regular. La composición y la estructura de la lignina (Sifontes y Domine, 2013) dependen de
varios factores como:

11
 Material de origen
 Forma de extracción
 Forma de aislamiento

La fuerza de adhesion entre las fibras de celulosa y lignina aumenta por la existencia de
enlaces covalentes entre las cadenas de lignina y componentes de la celulosa y de
hemicelulosa (John y Thomas 2008, citado por Lacerda 2015).

El principal propósito de la lignina es dar soporte estructural a la planta, impermeabilidad y


resistencia a ataques microbianos o a stress oxidativo. Este polímero es insoluble en agua y
ópticamente inactivo, en conjunto hace que la degradación de la lignina sea difícil (Fengel y
Wegener, 1984, citado por Prinsen, 2010).

La lignina es uno de los más abundantes polímeros orgánicos, superado apenas por la
celulosa. Es inusual como biopolímero, debido a su heterogeneidad y la falta de una
estructura primaria definida. Se define la estructura de la lignina de acuerdo con las siguientes
características:

 Son polímeros vegetales construidos a base de unidades de fenilpropanoides


 Presentan la mayor parte del grupo metoxilo totales contenidos en la madera
 Son resistentes a la hidrólisis ácida , fácilmente oxidables, solubles en bisulfito, alcalisis
caliente, y fácilmente condensables con fenoles o tioles
 Cuando se hace reaccionar con nitrobenceno, en una solución alcalina caliente, las
ligninas producen principalmente vainillina, siringaldehido y p-hidroxibenzaldehido, en
función del origen de las ligninas
 Cuando se colocan a ebullición en una solución etanólica de ácido clorhídrico, las
ligninas forman monómeros del tipo “cetonas de Hibbert” (es una mezcla de cetonas
aromáticas resultantes de la ruptura de los principales enlaces éter (β-O-4) entre unidades
de lignina)(Sun 2010, citada por Lacerda 2015)

Entre los residuos agrícolas, se encuentran los de la industria azucarera, siendo el bagazo de
la caña de azúcar, el material más utilizado y estudiado debido a que es un residuo abundante,
renovable y de bajo costo(Viñals-Verde et al.,2009)

12
La producción de etanol a partir de residuos agrícolas y forestales, para propósitos
energéticos, es un reto tecnológico sobre el cual se trabaja intensamente hoy. El bioetanol
puede ser obtenido, a partir de diferentes materias primas ricas en: azúcares (caña de azúcar,
remolacha azucarada, sorgo dulce), almidones (trigo, maíz, cebada, yuca) y celulosa
(desechos agrícolas, forestales y municipales) (Bueno et al.,2009).

1.5.4 Influencia de la biomasa lignocelulósica en su procesamiento

La estructura del material lignocelulósico, fuente de origen, edad, características


morfológicas y características químicas y estructurales de sus componentes químicos,
celulosa, hemicelulosa, lignina, extractivos y cenizas, tienen una influencia fundamental en
los procesos empleados para la transformación por vía química, física o enzimática del
material lignocelulósico en diferentes productos.

Es de gran importancia realizar una caracterización completa del material, para conocer de
manera detallada su estructura y características químicas del mismo y sus componentes, de
forma de poder diseñar los tratamientos más eficaces para lograr una transformación eficiente
del material.

Otro aspecto de gran importancia a tener en cuenta en el aprovechamiento de los materiales


lignocelulósicos es su manipulación y almacenamiento. Al ser materiales biodegradables, las
condiciones de almacenamiento y manipulación, son de gran importancia para la
conservación del material en las condiciones adecuadas para su procesamiento, evitando las
pérdidas que se puedan producir por procesos de fermentación y degradación incontrolados,
que pueden afectar seriamente las propiedades del material y disminuir sensiblemente su
rendimiento(Abril y Navarro, 2012).

1.6 Hidrólisis

1.6.1 Hidrólisis ácida

La hidrólisis ácida es una forma de realizar el pretratamiento de los materiales


lignocelulósicos, la cual busca principalmente dos objetivos. Primeramente, desorganizar la
estructura celular del material para dejar expuesta la celulosa con el objetivo de facilitar la
acción de las enzimas o los ácidos en el proceso de la hidrolisis. Como segundo objetivo se

13
tiene que hidrolizar la hemicelulosa hasta xilosa y/o sus monómeros respectivos. Los dos
hidrolizados ácidos, hemicelulósico y celulósicos, que contienen esencialmente xilosa y
glucosa, respectivamente, se pueden fermentar en un proceso posterior para obtener
finalmente etanol (Lavarack 2002, citado por Jaramillo, 2013)

Un método muy utilizado para separar las hemicelulosas de la celulosa es la hidrólisis ácida,
donde la materia prima lignocelulósica es sometida a una solución ácida a temperaturas
medias. De este pretratamiento se obtiene una solución rica en xilosa y un residuo sólido que
contiene celulosa y lignina (Viñals-Verde et al 2009)

1.6.2 Hidrólisis alcalina

La hidrólisis alcalina se lleva a cabo con soluciones diluidas de NaOH, produciendo una
reacción de saponificación rompiendo los enlaces de tipo éster que unen la hemicelulosa con
la lignina. La porosidad del material lignocelulósico aumenta, gracias a la hinchazón que
provoca el tratamiento con NaOH (Buranov, 2008, citado por Pezoa, 2010).

Los tratamientos alcalinos, buscan reducir la cristalinidad de la celulosa, disociar el complejo


celulosa-lignina, aumentar el área superficial y eliminar o disminuir la presencia de
sustancias que interfieren o dificultan tanto la hidrólisis enzimática como la fermentación de
los azúcares reductores generados (Pernaleteet al., 2008).

1.6.3 Hidrólisis enzimática

En la hidrólisis enzimática, la sacarificación de la celulosa se lleva a cabo enzimáticamente


mediante celulasa, las cuales producen la ruptura de las cadenas poliméricas de la celulosa y
la hemicelulosa, que previamente han sido modificadas estructuralmente mediante un
pretratamiento. A partir de la celulosa se obtiene glucosa, mientras que a partir de la
hemicelulosa se obtienen diferentes monosacáridos, tales como la xilosa, glucosa, arabinosa,
galactosa, y manosa. La principal ventaja de este tipo de hidrólisis es que no presenta
problemas de corrosión.

El procedimiento más común consiste en poner en contacto la disolución de enzima con la


muestra del sustrato lignocelulósico, manteniendo el pH, la temperatura y la homogeneidad

14
de la mezcla durante todo el proceso. Los factores que afectan a la hidrolisis enzimática son:
el tipo de sustrato, la actividad celulasa y las condiciones de reacción: temperatura y pH
(Parameswaran et al., 2011)

1.7 Fermentación

En términos generales, la fermentación se describe como unos de los procesos de oxidación


en el cual, la transformación de moléculas complejas a unas moléculas más simples conlleva
a la generación de un producto final orgánico que tendrá liberación de energía.

Las principales responsables para que se lleve a cabo la fermentación son las levaduras. Una
de ellas es la que se usa con más frecuencia y se conoce como Saccharomyces-cerevisiae.
Existen diferentes estudios para la producción de Bioetanol mediante otros hongos y
bacterias, pero el uso a nivel industria es mínimo (Montaño, 2014).

El uso de la Saccharomyces-cerevisiae es importante en la reacción para la obtención de


Bioetanol ya que convierte las hexosas en etanol en condiciones anaeróbicas, generando 2
moles de ATP por cada mol de hexosa consumida además también genera 2 moles de etanol.
Este microorganismo tiene la capacidad también de convertir las hexosas en CO2. Esta
conversión se da en un medio aeróbico y se sintetiza mediante la reacción:

(1.2)
En esta reacción la molécula de glucosa se transforma en dos moléculas de alcohol y dos de
dióxido de carbono (Cepeda y Jaramillo, 2009).

1.7.1 Parámetros y condiciones de operación en la fermentación

 pH. Diversos estudios realizados han encontrado que la máxima producción de alcohol
se obtiene a un pH de 4.2, mientras que la menor se obtiene a un pH de 3.7. En el caso
del menor es probable que sea demasiado bajo para logar llevar a cabo una activación
eficiente en las enzimas necesarias para la fermentación y hace que el intercambio iónico
dentro de la célula sufra un descontrol, que hará que concentre su energía en regular su
sistema y no en llevar a cabo la fermentación de azúcar presente en el sustrato. Es por
ello que pH cercanos al neutro facilitan la flora microbiana contaminante en el proceso

15
que conlleva a la formación de subproductos indeseables. Así mismo, la inversión de la
sacarosa a sus componentes monoméricos presente en el sustrato, aumenta a medida que
el pH disminuye incidiendo en el tiempo de fermentación.
 Temperatura. La fermentación se lleva a cabo en una temperatura óptima de 32°C y a
partir de los 30° hasta los 35° C es cuando el proceso se incrementa. Excederse de este
rango de temperatura amplifica a la probabilidad de desarrollo de microorganismos que
afectan el proceso de fermentación.
 Concentración de azúcar. Con el paso del tiempo y de diversas pruebas se ha podido
conocer que la concentración de etanol se puede incrementar cuando se eleva la
concentración de sustrato, pero dicho aumento repercute en el tiempo de toma la
fermentación afectando la productividad. Originando que la concentración de sustrato, la
producción de alcohol y el tiempo de fermentación son directamente proporcionales y
dependen y varían de los requerimientos y capacidad para poder llevar a cabo el proceso.
 Requerimientos de oxígeno. Cuando el medio se encuentra en ausencia de oxígeno y rico
en niveles de glucosa favorece a la producción de alcohol (Perales, 2015)

1.7.2 Fermentación Batch

Llamada también fermentación discontinua o por lote, son de gran importancia comercial
para su amplio uso. Las técnicas de instalación de los cultivos discontinuos, van a depender
de si el proceso es aerobio o anaerobio.

Una fermentación discontinua “Batch” puede considerarse como un sistema cerrado. A


tiempo cero (t0), la solución esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se
permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo
de toda la fermentación no se adiciona nada, excepto oxigeno (en forma de aire), un agente
antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo,
la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos, cambia generalmente en
forma continua como resultado del metabolismo de células (Fajardo y Sarmiento, 2007).

1.7.3 Fermentación Continua

16
La biotecnología y los bioprocesos han logrado posicionarse como una de las principales
técnicas para la obtención de diversos productos a nivel industrial. Un bioproceso es un
conjunto de técnicas que emplean los organismos vivos para poder obtener o modificar
diferentes productos. Estas técnicas generalmente consisten en procesos de fermentación, en
los cuales se lleva a cabo la transformación por acción microbiana de determinados sustratos
de un medio de cultivo en diversos productos que pueden ser obtenidos mediante el
crecimiento controlado de células.

Se han desarrollado diferentes tipos de operaciones que pueden influir de cierta manera en
los procesos de fermentación y por lo tanto en el producto final. Estas operaciones permiten
clasificar los procesos de fermentación y se refieren a la adición y salida de sustrato que
necesitan las células para poder llevar a cabo la fermentación. Una de estas operaciones es la
fermentación continua.

En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva se añade


continuamente y una cantidad equivalente del cultivo, con los microorganismos se saca
simultáneamente del sistema.

Consiste en mantener constante el número de células y la concentración d sustrato así siempre


tenemos a las células en la misma fase y en principio este cultivo es eterno en el tiempo. La
fase estacionaria se consigue porque dejan de existir los nutrientes o porque el metabolismo
de las células produce sustancias tóxicas para ellas y por tanto dejan de crecer (Chávez,
2006).

1.7.4 Cinética de crecimiento de las levaduras en la fermentación

El crecimiento poblacional en las levaduras es el resultado de la división celular y la


progresión del ciclo celular. La cinética de crecimiento comprende de cuatro fases
principales: fase de latencia, fase exponencial, fase diáuxica y fase estacionaria.

La fase de latencia (lag) refleja el tiempo requerido en las levaduras para adaptarse a su nuevo
entorno, sintetizando ribosomas y enzimas necesarios para generar una mayor tasa de
crecimiento. La duración de esta fase dependerá tanto del tamaño poblacional inicial como
de la idoneidad de las condiciones ambientales presentes. Una vez las células comienzan a

17
metabolizar activamente, comienza la replicación del DNA y poco después las células se
dividen. Este momento determinara la segunda fase de crecimiento, la fase exponencial,
periodo en el cual las células se dividen con su mayor tasa de crecimiento específico (µmáx.).
El tiempo que necesita la población para doblar su número se denomina “tiempo de
generación” y se halla profundamente influenciado por el medio de crecimiento, la
temperatura y el tipo de cepa empleada, aunque generalmente ronda los 90-120 min en
condiciones favorables. La tercera fase del crecimiento de las levaduras es la fase diáuxica,
un periodo de crecimiento lento en el cual la levadura cambia de un metabolismo
fermentativo a otro respiratorio a causa de la falta de azúcares en el medio, convirtiéndose el
etanol en la fuente principal de carbono. Finalmente y debido al agotamiento de los nutrientes
en el medio u otros factores ambientales como la presencia de metabolitos tóxicos o altas
temperaturas, el metabolismo celular se ralentiza y la división celular se detiene, entrando la
célula en su última fase, la fase estacionaria. Aunque bien es cierto que las células pueden
sobrevivir en esta fase durante largos periodos de tiempo gracias a modificaciones en su
pared celular, al almacenamiento en su citoplasma de reservas de carbono o a una
ralentización dramática en su transcripción y traducción, las células terminarán autolisándose
y muriendo si las condiciones ambientales óptimas no se restablecen (Navarro, 2016).

1.8 Elementos fermentadores

En la fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta de un sustrato llevado


a cabo por un microorganismo en ausencia de oxígeno. La pueden desarrollar tanto
organismos anaerobios estrictos como anaerobios facultativos. Desde hace miles de años, el
hombre los ha venido utilizando con fines aplicados para obtener diversos tipos de productos
a partir de las fermentaciones que se llevaban a cabo. Otras veces se aprovechan los
microorganismos por su capacidad de excreción de un compuesto determinado, que pueden
tener interés industrial (metabolitos, antibióticos, etc.). Cuando estas reacciones se llevan a
escala industrial, los microorganismos se suelen cultivar en grandes contenedores llamados
fermentadores o biorreactores (Navarro, 2016).

1.8.1 Levaduras modificadas

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En la actualidad se estudia el uso de microorganismos genéticamente modificados como una
alternativa tecnológica viable para la producción de etanol, debido a que para una producción
de etanol más eficiente y con menos costo es necesario que la levadura tradicional fermente
los azúcares de cuatro y cinco a etanol o existan otros microorganismos que lo realicen.
(Viñals-Verde et al., 2009)

1.8.2 Levadura Saccharomyces Cerevisiae

La levadura Saccharomyces-Cerevisiae un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente


estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así como por su
capacidad de producir etanol. Este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien
definidas cuando es cultivado en medios líquidos con glucosa como fuente de carbono: la
fase lag, la fase logarítmica, el cambio diáuxico, la fase postdiáuxica y la fase estacionaria.

La fase de latencia (lag) es un periodo de adaptación en el cual la célula se prepara para


dividirse. Durante la fase logarítmica las células alcanzan su máxima velocidad de
duplicación y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce etanol. Al
disminuir la concentración de glucosa, las células atraviesan por el cambio diáuxico, un
periodo breve de tiempo en el cual no hay división, y la célula cambia de un metabolismo
fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiáuxica las células usan como fuente de
carbono el etanol producido durante la fase logarítmica e incrementan su resistencia al estrés
gradualmente; en tanto que la fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio
se han agotado y no hay división celular. En esta fase, las células acumulan carbohidratos de
reserva como trehalosa y glucógeno, alcanzan el máximo nivel de resistencia a estrés y su
pared celular se vuelve más gruesa y resistente a la digestión por liticasa (Folch-Mallol et al.,
2004).

1.9 Trabajos relacionados realizados por otros autores

González et al., (2011), mediante una optimización del proceso de hidrólisis enzimática de
una mezcla de paja de frijol a través de cuatro tipos de madera para determinar la composición
química de la mezcla y se sometió a tres pretratamientos con Hidróxido de sodio con
diferentes relaciones liquido-solido, para posteriormente llevar a cabo una hidrolisis

19
enzimática, utilizando una carga enzimática de celulosa (Celluclast proporcionado por
Novozyme). Encontrando que el rendimiento máximo de azúcares reductores fue de 92% con
un pretratamiento de NaOH durante la hidrolisis enzimática, valorando que es posible detener
el proceso de hidrolisis a las 48 hrs a expensas de una pérdida de 15% de rendimiento.

López et al., (2008),a través de una optimización de del proceso de obtención enzimática de
azúcares fermentables a través de aserrín de pino se llevó a cabo una hidrolisis enzimática
mediante pretratamientos con NaOH para poder obtener la mejor recuperación de azúcares.
Posterior a los pretratamientos correspondientes se obtuvo que las mejores condiciones de
operación para un mejor rendimiento que fue de 48% con una solución de NaOH al 8% y
tener un tiempo de tratamiento de 85 min.

Tejeda et al., (2010), mediante la producción de bioetanol a partir de la fermentación de


jarabes de cascaras de naranja y piña se determinó la cantidad de azúcares reductores. Se
llevó a cabo un tratamiento físico y con hidróxido de sodio se llevó a cabo la remoción de
lignina. Se efectuó una hidrolisis acida con ácido sulfúrico para posteriormente llevarlo a una
fermentación en la cual se utilizó Saccharomyces-Cerevisiae durante siete horas. Se pudo
observar que las cascaras de naranja son las de mejor comportamiento ya que poseen un
mayor porcentaje de azúcares reductores y por consiguiente se produjo una mayor cantidad
de etanol.

Bonifacino-Buttiglione (2012), llevando a cabo una deslignificación del bagazo de caña de


azúcar para su uso en la producción de bioetanol. Se realizó una hidrolisis enzimática al
bagazo de caña pretratado (anteriormente se le dio otro pretratamiento) en la cual se utilizó
una celulasa comercial caracterizada previamente y se obtuvieron las condiciones óptimas de
operación para la hidrolisis la cual debe ser una concentración de 5% (p/v) con un tiempo de
incubación de 36 h para pasar a la obtención del bioetanol utilizando Saccharomyces-
Cerevisiae como microorganismo productor, logrando obtener un 3.2 g/L de etanol y una
eficiencia del 62%.

Dopicoet al., (2014), mediante un estudio preliminar sobre la influencia de microondas en


una hidrolisis alcalina utilizando bagazo para la obtención de pulpa de celulosa. Se llevó a
cabo un pretratamiento al bagazo el cual fue prehidrolizado el cual fue tratado con tres
diferentes concentración de hidróxido de sodio con una temperatura constante para conseguir

20
los resultados óptimos, el cual fue que con 20% de NaOH se obtiene el valor más alto de
celulosa (83.2%).

21
CAPÍTULO II

MATERIALES Y METODOS
CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Alcances y limitaciones

2.1.1 Alcances

Se desarrollará el estudio y ajustes del proceso de fermentación continua para la obtención


de bioetanol a partir de jugo de caña y residuos lignocelulósicos, que permitirá evaluar el
rendimiento del producto final, a partir de un proceso de pretratamiento hidrolítico a la
materia prima, la cual se llevará a cabo utilizando técnicas químicas convencionales. De
dicho estudio se evaluaran las mejores condiciones de operación de la materia prima para
alcanzar un rendimiento en la concentración de azúcares para el proceso de fermentación
continua.
2.1.2 Limitaciones

La principal limitación que presenta la metodología se encuentra en la falta de equipos y


materiales, debido a que ya no es un proyecto a nivel laboratorio, sino a planta piloto por las
cantidades de materia prima que se utilizará. El proceso para la hidrólisis ácida, básica y
enzimática se lleva a cabo en un lapso de tiempo considerable.

2.2 Procedimiento y descripción de actividades

Las actividades realizadas durante el tiempo de residencias profesionales para la obtención


de bioetanol a partir de residuos lignocelulósicos parten de una revisión bibliográfica acorde
a conceptos generales y específicos a cerca del estado del arte de los biocombustibles
conociendo las técnicas y puntos de operación requeridas con las que hoy en día se cuenta.
Se plantea la metodología acorde a los objetivos planteados, adecuando técnicas sobre el
tratamiento a la materia prima y determinaciones químicas.

2.3 Metodología

2.4 Obtención de los residuos lignocelulósicos

Los residuos con los que se trabajará fueron seleccionados debido a su contenido de materia
orgánica lignocelulósica estos son madera, olote y cáscara de café. Los residuos fueron
adquiridos de diferentes zonas de la región y se trabajaron a la par con las mismas condiciones

23
de técnica de hidrólisis. El tamaño del material lignocelulósico, tanto de la madera como del
café, se encuentran en un tamaño adecuado para los pretratamientos (ácido y alcalino),
mientras que el olote, se encuentra en forma completa, alargado, por lo tanto es necesario
llevar a cabo procedimientos mecánicos manuales para reducir el tamaño y así poder
incrementar la eficiencia de los pretratamientos.

2.5 Caracterización

La caracterización de cada uno de los residuos lignocelulósicos consiste en un análisis


composicional para determinar el porcentaje de humedad, contenido de celulosa,
hemicelulosa y lignina, esta se encuentran especificadas en la Tabla 2.1.

Tabla 2.1: Parámetros para la caracterización de los residuos lignocelulósicos


Prueba Método Anexo
Humedad Termobalanza A
Hemicelulosa Determinación de carbohidratos estructurales y B
lignina (NREL)
Celulosa y lignina Determinación de carbohidratos estructurales y B
lignina (NREL)

2.5.1 Humedad

El contenido de humedad se determinó colocando 1 g (±0.5 g) de cada uno de los residuos


lignocelulósicos en una termo-balanza AMB-50 iniciando el análisis de la materia prima
hasta que el equipo indicara el fin de la prueba. Se realizó este proceso por duplicado para
tener una mejor certeza en el resultado. (Anexo A)

2.5.2 Determinación de carbohidratos estructurales y lignina (NREL)

Para la determinación de carbohidratos estructurales y lignina en la biomasa se llevó a cabo


un procedimiento analítico en el laboratorio de plantas piloto utilizando la técnica
recomendada por NREL (National Renewable Energy Laboratory) procedente del
laboratorio nacional de los EE.UU. Departamento de Energía. (Sluiter et al.2012) (Anexo
B).

24
2.5.3 Grados Brix (°Bx)

El contenido de azúcares presentes en el jugo de los hidrolizados de los residuos


lignocelulósicos se determinó en un refractómetro Marca ATAGO, modelo MASTER-50H.

2.5.4 pH

El pH se midió una vez obtenido el total de jugo de cada lote de los diferentes residuos
lignocelulósicos, mediante un potenciómetro Marca Conductronic, ModelopH140, del
Laboratorio de Procesos de cristalización y generación de biocombustibles.

2.5.5 Determinación de azúcares (DNS)

La determinación de azucares reductores libres, se llevó a cabo a través del método DNS
(Miller, 1959). (Anexo C).

2.5.6 Determinación de alcohol.

Para la determinación de alcohol se llevó a cabo la Técnica de Dicromato de potasio


(Bohringer-Jackob, 1964). (Ver Anexo D).

2.6 Acondicionamiento de la materia prima

Cada uno de los residuos lignocelulósicos (Madera, olote y cascara de café) fueron adquiridos
de diferentes zonas de la región centro del estado de Veracruz y a través de procedimientos
mecánicos manuales, se redujeron a un tamaño adecuado para facilitar el pretratamiento
hidrolítico.

2.7 Hidrólisis.

2.7.1 Pretratamiento ácido

Se hidrolizó el residuo lignocelulósico, el tratamiento inicia con la preparación de una


solución de H2SO4 al 1.5 %, la cual debe mezclarse con el residuo a fin de obtener un contacto
previo al proceso del autoclave, la Relación Líquido-Solido (RLS) establecida para este
tratamiento es de 5:1, para esto es indispensable realizar el análisis de humedad con la

25
finalidad de conocer la cantidad de agua aun contenida en el material, misma cantidad que
será descontada en el momento de preparar la solución de ácido, logrando el mínimo
desperdicio de reactivos.

Los hidrolizados ácidos fueron llevados a cabo en vasos de vidrio refractarios con una
capacidad de almacenar hasta 1 Kg de bagazo, el tratamiento se realizó en una autoclave
marca AESA modelo CV-250 a una presión de 15 psia (1.2 Kg/cm2) durante 33 min, siendo
estos independientes al tiempo en que el autoclave tarda en alcanzar la presión establecida
(aproximadamente 35 min) y al tiempo en que se enfría (aproximadamente 25 min).

Se realizó un prensado manual del material para tratar de extraer la mayor cantidad de líquido
posible el cual se almacenó en contenedores con una capacidad de 20 L cada uno, dicha
fracción liquida recuperada contiene glucosa y xilosa por lo que es un medio idóneo para
desempeñar una fermentación y una siguiente destilación.

El residuo prensado se pesó para calcular la relación de agua que se debe utilizar en los
lavados, recordando que la RLS utilizada es 5:1, depositándolo en una marmita de acero
inoxidable junto con el agua, homogenizando la mezcla para lograr una mayor remoción de
la hemicelulosa aún presente, la mezcla se dejó reposar durante 10 min, separando la fase
líquida (agua de lavado) de la sólida (residuo lignocelulósico), exprimiendo únicamente con
las manos y colocando el residuo en un recipiente adecuado, el agua de lavado es almacenada
en contenedores de 20 L y guardada para la siguiente parte del proceso ya que gracias a su
pH bajo esta tiene la capacidad de disminuir el pH de la hidrólisis alcalina.

Cuando se ha terminado el primer lavado, el residuo exprimido es vertido nuevamente en la


marmita con una capacidad de 80 L y se procede a realizar el segundo lavado con la misma
relación de agua que en el primer lavado, finalmente se vuelven a separar ambas fases y esta
vez el residuo debe de exprimirse perfectamente para lograr eliminar la mayor cantidad de
agua posible. Se recupera un volumen considerable de la fase liquida, a la cual se le miden
los °Bx de dicha solución.

2.7.2 Pretratamiento alcalino

El residuo lignocelulósico tratado ácidamente se vierte en un recipiente, posteriormente se


agrega el H2O2 al 4 %, preparado de acuerdo con la cantidad y humedad del material (la

26
cantidad de agua presente en el material es equivalente a la cantidad de agua que se debe de
descontar en el momento de preparar la solución para la reacción, representando un ahorro
considerable en el agua de proceso, disminuyendo los efluentes líquidos finales), en una RLS
16:1.

La mezcla se agita para homogenizar y lograr un mejor contacto entre el residuo


lignocelulósico y la fase liquida, dejando reposar durante 10 min para que todo el residuo
lignocelulósico pueda humedecerse perfectamente bien. Transcurrido este tiempo, se procede
a ajustar el pH de la reacción a 11.5 con NaOH 10 M. Una vez que la mezcla ha alcanzado
el pH óptimo, se debe de dejar llevar a cabo la reacción por un tiempo estimado de 45 h con
una agitación ocasional de 5 min por cada hora durante el día y un reposo completo durante
la noche.

Al finalizar las 45 h, es necesario separar la fase sólida de la liquida, empleando mallas o


tamices que faciliten el filtrado de la mezcla pues al tratarse de cantidades grandes y del alto
nivel de degradado del bagazo, este proceso suele ser tardío. Durante este procedimiento no
existe el prensado de la fase sólida, pues únicamente se exprime con las manos. Una vez
obtenida toda la celulosa, es necesario exponer a secado solar durante 48 h, con la finalidad
de eliminar la máxima cantidad de agua posible en el material. La primera fase liquida
recuperada tiene un pH relativamente alto y es por este motivo que todo este líquido se debe
de almacenar en garrafones, para ser utilizados posteriormente.

Es importante mencionar el ajuste de pH (NaOH con el H2O2) produce una reacción


exotérmica, lo que incrementa el volumen hasta el doble del original, por esta razón el equipo
destinado para este proceso se debe de utilizar únicamente al 50 % de su capacidad
manteniendo espacio libre para la espuma originada durante la estabilización de la reacción.

2.7.3 Hidrólisis enzimática

Una vez obtenida la celulasa, se le determinó su humedad mediante una Termobalanza


modelo AMB-50 y se procedió a realizar la hidrólisis enzimática empleando la enzima
Celulasa CellicCTe3 de Novozymes.

27
La fase líquida empleada fue de CH3COONa 0.05 M siguiendo la RLS de 5:1, % enzima p/p
de 5 (la densidad de la Cellic CTec3 es de 1.2 g/mL). La reacción debe realizarse a un pH
de 5.0, para lo cual se utiliza NaOH 10 M en caso de que se encuentre un pH demasiado
ácido o ácido acético glacial para un pH muy alcalino, una vez establecido el pH la reacción
se deja llevar a cabo durante 51 h.

Una vez iniciada la hidrólisis, fue evidente que la gran cantidad de celulosa hacía difícil el
trabajo del agitador, motivo por el cual la reacción se dejó sin agitación durante las primeras
20 h, tiempo en el que fue posible observar el buen funcionamiento de la enzima.

Después de las primeras 20 h, se instaló el agitador con su respectivo temporizador, dejando


desarrollarse la reacción durante las 31 h restantes, al final del proceso la celulosa se había
degradado parcialmente para dos de los tres residuos y se visualiza dos fases tanto líquida
como sólida, no se llega a una degradación total de la materia tratada debido a que no son las
condiciones óptimas para cada uno de los residuos.

2.7.4 Inactivación de la enzima


Al finalizar el tiempo de reacción, es necesario inactivar la enzima, el proceso provoca un
choque térmico en la reacción presente. Para ello es necesario detener la agitación y la
temperatura proporcionada al tanque, vaciar el contenido de la mezcla en un recipiente
adecuado y someterla a baño maría con agua corriente a una temperatura de entre 95 y 100
°C durante 10 min, transcurrido este tiempo realizar un baño de hielo durante 10 min. Lo
anterior detendrá la actividad enzimática obteniéndose una mezcla compuesta de los
azúcares y celulosa que no se degrado durante el proceso conformado de celulosa cristalina
y celulosa amorfa siendo esta última de un aspecto altamente viscoso.

Una vez inactivada la enzima, es posible proceder a la separación de ambas fases, a la


totalidad de la fase líquida se le cuantifican los °Brix, mediante el uso de un refractómetro.
Los °Bx proporcionan un indicio aproximado de los g/L de glucosa a determinar en el HPLC,
siendo 1 °Brix equivalente a 10 g/L de glucosa. El líquido obtenido aun contiene trazas de
celulosa diluidas, que es necesario removerlas completamente mediante un proceso de
filtración para finalmente separar ambas fases. El líquido total obtenido debe ser almacenado

28
en congelación para una mejor conservación de los azúcares y un posterior análisis mediante
HPLC cuantificando los g/L de glucosa obtenidos.

2.8 Nutrientes
2.8.1 Material biológico

La cepa de S. Cerevisiae ITV01, que fue aislada de melazas de caña de azúcar por (Ortiz-
Zamora, 2006 citado por Partida, 2017) fue proporcionada por el laboratorio de biotecnología
del Instituto Tecnológico de Veracruz.

2.8.2 Activación de la levadura

Con la finalidad de activar la levadura proporcionada por el ITV, se tomó el vial con la
levadura S. CerevisiaeITV-01 y se adicionó en 100 mL del medio de activación en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml a pH 5.5 durante 16 h a 250 rpm y 30 °C en una incubadora con
agitación Marca STIK, Modelo Shaking Incubator PS-B2125.

Transcurrido este tiempo, se realizó la siembra inoculando 2 ml del medio de activación en


cajas Petri que contienen medio de conservación (Tabla 2.1) y se incubaron a pH 5.5 durante
24 h a 25 rpm y 30 °C.

2.8.3 Medios de cultivo


La cepa debe ser conservada en refrigeración a 4 °C, resembrada cada mes en el medio de
conservación (Tabla 2.2)

Tabla 2.2 Composición del medio para conservación de la S. Cerevisiae ITV01


Componente Concentración (g/L)
Agar-Agar 20
Glucosa 100
Extracto de levadura 10

2.8.4 Medios de conservación

Para la conservación de la levadura se utilizó un medio de conservación sintético de


activación (Tabla 2.3), un medio de preadaptación utilizando jugo de caña (Tabla 2.4) y un

29
medio con el mejor residuo lignocelulósico estudiado tras la fase de hidrólisis ácida para la
fermentación variando los nutrientes.

Los medios contenidos en matraces Erlenmeyer de 250 mL fueron esterilizados en autoclave


a 121 °C durante 15 min, así como los matraces de 500 mL que se utilizaron para la cinética.

Tabla 2.3. Medio de activación para la S.Cerevisiae ITV-01


Componente Concentración (g/L)
Glucosa 20
KH2PO4 5
(NH4)2SO4 2
Extracto de levadura 1
MgSO4.7H2O 0.4

Tabla 2.4. Medio de preadaptación para la S.Cerevisiae ITV-01


Componente Concentración (g/L)
KH2PO4 5
(NH4)2SO4 2
Extracto de levadura 1
MgSO4.7H2O 0.4

2.9 Condiciones de fermentación

2.9.1 Precultivo y preinóculo

Para llevar a cabo la activación de la levadura y obtener mejores resultados en cuanto al


desarrollo del microorganismo durante la fermentación, se tomaron tres asadas de la caja
Petri en la que se encuentra resembrada, y se incubó en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
conteniendo 100 mL de medio sintético a pH 5.5 durante 12 h a 200 rpm y 30 °C en una
incubadora con agitación Marca STIK, Modelo Shaking Incubator PS-B2125.

Una vez transcurrido el tiempo, se realizó el pase al medio del preinóculo, se mantuvieron
también las mismas condiciones a un pH 5.5, de 3 x 106células viables/mL y nuevamente se

30
incubó por 12 h a 200 rpm y 30 °C. Transcurrido este tiempo se inocularon los matraces
preparados para la cinética, con 3 x 106células viables/mL.

2.9.2 Fermentación por lotes (Cinéticas)

Las cinéticas de fermentación se llevaron a cabo a nivel matraz, utilizando una incubadora
con agitación Marca STIK, Modelo Shaking Incubator PS-B2125. En matraces Erlenmeyer
de 250 mL, se trabajó con un volumen de operación de 180 mL de jugo de caña y de jugo
hidrolizado ácido de cada uno de los residuos lignocelulósicos, llevando a 140 g/L la
concentración de azúcares del jugo de caña y a 100 g/L para los residuos ácidos. Bajo el
esquema presentado por el diseño simple centroide que se muestra en la Tabla 2.5y a
condiciones de operación de 200 rpm y 30 °C, tomando muestras cada cuatro horas
incluyendo el tiempo cero, se iniciaron las cinéticas.

Tabla 2.5. Diseño simplex de sales para cinéticas.


Variable X1 X2 X3
Codificada
Matraz KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O
g/L
1 7.000 0.000 0.000
2 0.000 5.000 0.000
3 0.000 0.000 1.500
4 3.500 2.500 0.000
5 3.500 0.000 0.750
6 0.000 2.500 0.750
7 2.333 1.667 0.500
8 4.667 0.833 0.250
9 1.167 3.333 0.250
10 1.167 0.833 1.000

2.9.3 Velocidad máxima de crecimiento (μmax)

Se determinó la velocidad máxima de crecimiento (μmax) a partir de la ecuación 2.1

31
𝐿𝑛(𝑋0 )−𝐿𝑛(𝑋𝑛 )
𝜇𝑚𝑎𝑥 = (2.1)
𝑡

Donde: 𝑋0 son los (g/L) de la muestra a conocer,𝑋𝑛 los (g/L) de la muestra en el tiempo 0 y
t es el tiempo de la muestra que se desea conocer en (h).

2.9.4 Análisis de Biomasa

La cantidad de biomasa en absorbancia se llevará a cabo mediante densidad óptica (DO) en


un espectrofotómetro a 620 nm, llevando a cabo diluciones para estar dentro de un rango de
0.2 y 0.8. Utilizando posteriormente el polinomio de peso seco para Saccharomyces
Cerevisiae

𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 ( 𝐿 ) = 0.3697 (𝐷𝑂) + 0.001 (2.2)

2.9.5 Conteo celular

Mediante el empleo de la cámara de Neubauer se realizó la cuenta celular con su previa


dilución adecuada con agua destilada para poder contar un número máximo de 300 células.
Los conteos se realizaron en las 5 principales regiones (cuadros) con la que cuenta la cámara,
cuatro de ellos ubicados en las 4 esquinas, con 16 cuadros más pequeños en su interior, y uno
más en el centro, el cual cuenta con 16 más chicos en su interior y en su interior otros 16
internos más chicos.

La concentración de células (X) por mililitro está dada por la ecuación 2.3

(2.3)

Donde: N es el número de células contadas, Nc es el Número de cuadros contados y D es la


Dilución empleada

2.9.6 Productividad

El cálculo de la productividad (Q) se llevará a cabo mediante la ecuación 2.4 la cual se


expresa en g/Lh.

32
𝑃𝑓
𝑄= (2.4)
𝑡𝑓

2.10 Análisis de la materia prima e hidrolizados por HPLC

Las muestras liquidas una vez filtradas fueron centrifugadas a 10,000 rpm por 10 min a 4°C
y congeladas, para posteriormente ser analizadas por cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC). Antes de ser analizadas por HPLC las muestras fueron descongeladas y
tratadas con una solución de BaO 0.3 M y de ZnSO4al 5 % p/v con la finalidad de eliminar
impurezas presentes tales como proteínas y almidones entre otras que son capaces de tapar
tanto los filtros como la precolumna y columna del HPLC (Partida, 2017). La relación
utilizada fue 8:1:1, dejando reposar por 10 min después de una agitación vigorosa de los
tubos eppendorf, pasando posteriormente a una centrifugación durante 10 min a 10,000rpm.

Se determinó a partir de HPLC los valores del área bajo la curva para la glucosa, xilosa y
arabinosa para su conversión a porcentaje para cada uno de los residuos e hidrolizados
utilizando las regresiones lineales correspondientes a las ecuaciones 2.3, 2.4 y 2.5, para su
posterior análisis por la técnica de NREL utilizando una columna ShodexSH1011, específica
para la separación de azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes.

La fase móvil empleada fue H2SO40.05 N, Velocidad de flujo, 0.6 mL/min; Temperatura de
la columna, 55°C; Tipo de detector: índice de refracción Marca Waters modelo 2414;
Volumen de inyección, 10 µL y 20 min de duración de análisis por muestra. El software
utilizado fue Empower (Waters), que reporta directamente la concentración de la muestra
mediante una correlación con estándares previamente realizados (glucosa anhidra, grado
alimenticio de Golden Bell Reactivos y fructosa grado reactivo de Baker, ambas en
concentraciones de 100, 50, 16.6, 10, 5, 2.5,1.66, 1.25, 1, 0.50 y 0.33 g/L; glicerol anhidro,
grado reactivo, Baker en concentraciones de 10, 5, 1.66, 1, 0.5, 0.25, 0.16, 0.12, 0.10, 0.05 y
0.03 g/L ; ácido acético glacial, grado reactivo, Baker en concentraciones de 30, 15, 5, 3, 1.5,
0.75,0.5, 0.37, 0.3, 0.15 y 0.1 g/L, y alcohol etílico absoluto anhidro, grado reactivo, Baker
en concentraciones de 10, 5, 1.66, 1, 0.5, 0.25, 0.16, 0.12, 0.10, 0.05 y 0.03 g/L)

2.10.1 Análisis de datos a partir de HPLC para NREL

33
Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la glucosa.

(2.5)

Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la xilosa.

(2.6)

Ecuación para curva de NREL para los valores del área bajo la curva de la arabinosa.

(2.7)

2.11 Fermentaciones

Las fermentaciones se llevaron a cabo en un fermentador de cristal refractario proporcionado


por el laboratorio de fisicoquímica del Instituto Tecnológico de Orizaba, con una capacidad
de 1.2 L. Se utilizó un volumen de operación de 1 L el cual se trabajó dentro del área del
laboratorio de cristalización y biocombustibles, sección plantas piloto.

2.11.1 Montaje de equipo

Se trabajó con un reactor de vidrio refractario con capacidad de 1.2L, el cual cuenta con
termopozo, dos tomas de muestra y un par de juntas que evitan que haya un intercambio de
materia hacia el fermentador. El reactor fue adaptado a un equipo de jarras de 6 plazas para
así proporcionar la agitación necesaria para llevar a cabo las fermentaciones y se instaló una
paleta de metal en una de las plazas. Puesto que el proceso de fermentación debe ser a una
temperatura controlada, se utilizó una resistencia tipo banda adaptada a la superficie del
reactor, la cual va conectada a corriente y el cual cuenta con regulador de temperatura.

2.11.2 Montaje del equipo en sistema de fermentación continúa.

Para llevar a cabo la fermentación continua se montó el equipo de fermentación descrito en


el apartado 2.11.1, al cual se le adaptó en cada una de su toma de muestra una salida y una
entrada en un sistema de interconexión de plástico. La entrada de muestra al reactor va
conectado a un matraz erlenmeyer de 1L el cual funge como reservorio y el contiene el
sustrato que será alimentado a determinado tiempo dependiendo de la taza de dilución
obtenida para cada uno de los jugos, tanto hidrolizados como de caña. La salida muestra del

34
reactor se conecta aun Matraz erlenmeyer que tiene la función de recabar los jugos cuando
se empieza a extraer y a inocular simultáneamente como se muestra en la Figura 2.1.

Figura 2.1 Equipo de fermentación continuo

Los cultivos para la fermentación continua se realizaron a una concentración de azucares para
el jugo de caña de 140 g/L y una concentración azucares de 100 g/L para los hidrolizados
ácidos de la madera, olote y café. Las condiciones para fermentación fueron las siguientes:
inoculo de 3x106 células/mL; pH. 5.5; Temperatura de 30°C y una agitación a 150 rpm, en
un fermentador de 1.2 L. Se le realizaron los métodos analíticos antes descritos para la
cuantificación de células vivas, alcohol y azucares.

2.11.3 Flujo de alimentación al reactor en sistema continuo.

Mediante la ecuación 2.8 se determinaron los flujos de alimentación para cada tipo de medio
tanto para el jugo de caña como de los jugos hidrolizados ácidos. Los caudales de entrada y
salida se iniciaron durante la fase de crecimiento exponencial. La corriente de entrada
contenía todos los nutrientes necesarios, pero no células. La corriente de salida contenía
células, nutrientes sin reaccionar y productos de fermentación.

𝑭=𝑫. 𝑽 (2.8)

Donde: F es el Flujo de alimentación (mL/h), D es la Tasa de dilución (h-1) y V es el volumen


de operación del fermentador (mL)

2.11.4 Tiempo de residencia(𝝉) en sistema continuo

35
Cada tasa de dilución estudiada fue evaluada por un período de un tiempo de residencia en
el fermentador (𝜏 = 1/𝐷) para garantizar estabilidad en el sistema durante la operación
continua. Para evitar contaminación dentro del reservorio debido a los tiempos de residencia
empleados, cada tipo de medio fue esterilizado previo al arranque de la fermentación.
Mediante la ecuación 2.9 se calculó el tiempo de residencia para la fermentación continua de
acuerdo a cada una de las tazas de solución propuestas.

𝟏
𝝉= (2.9)
𝑫

Donde: 𝜏 es el tiempo de residencia(h) y D es la Tasa de dilución (h-1)

2.11.5 Fermentación con jugo de caña en cultivo continuo en fermentador de 1L

Se prepararon 2 L de jugo de caña a una concentración de azúcares de 140 g/L. 1 L se vertió


dentro del reactor, el consiguiente litro fue depositado en 1 matraz erlenmeyer de 1L, el cual
fungirá como reservorio, ambos fueron llevados a la autoclave a condiciones óptimas para
esterilizar. Una vez terminado el ciclo de esterilización, ambos fueron enfriados a
temperatura ambiente. Tanto el reactor como el reservorio se montaron dentro del equipo de
fermentación descrito en el punto 2.11.2, de igual manera, siguiendo el punto anterior se
llevaron a cabo las fermentaciones con las condiciones de operación descritas.

Se realizaron tres fermentaciones a diferentes tazas de dilución propuestas (h-1), las cuales
fueron de 0.04, 0.06 y 0.08 respectivamente, siguiendo el cálculo de la ecuación 2.7 se
determinó el tiempo de residencia para la fermentación continua, mientras que para la
obtención del cálculo del flujo de alimentación y de salida que se adicionará al reactor cada
hora se utilizó la ecuación 2.6. Para cada una de las fermentaciones se evaluó el número de
células, sustrato y producto obtenido.

2.11.5.1 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.04

Para la tasa de dilución de 0.04 h-1, el flujo empleado fue de 40 mL/h, lo que significa tener
un tiempo de residencia (𝜏) de 25 h, a este tiempo se le suman las 12 h que tarda la levadura
en tener su máximo nivel de crecimiento. Al momento de tiene el máximo crecimiento de
células, se comienza la fermentación continua, en ese momento se adiciona y se extrae
simultáneamente la cantidad del flujo calculado.
36
2.11.5.2 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.06

En lo que respecta para la tasa de dilución de 0.06 h-1, el flujo requerido fue de 60 mL/h, lo
que denota que el sistema tiene un tiempo de residencia (𝜏) de 16 h, aunado al tiempo que
tarda la fermentación Batch en llegar a tener el máximo de crecimiento de células. En la
Figura 3.9 se observa que a partir de la hora 12 se comenzó la fermentación continúa teniendo
una concentración inicial de 1.25x108de células vivas, al momento de adicionar y extraer la
cantidad de flujo descrita antes, se visualiza que busca mantenerse estable, no se observa que
sea linealmente puesto que sigue oscilando el sistema pero se encuentra en estado continuo.

2.11.5.3 Fermentación continua con jugo de caña en fermentador de 1L a D=0.08

En el caso de la tasa de tasa de dilución de 0.08 h-1, el flujo necesario fue de 40 mL/h, lo que
indica que el tiempo de residencia (𝜏) fue de12 h, a este tiempo se le agregan las 12 h que
tarda en tener el punto máximo de células. En la Figura 3.10 se visualiza la cinética de células
viables iniciando con la fermentación batch a una concentración de 3x106 Cel/mL
posteriormente al llegar a su máximo de células a un tiempo de 16 h, se inició la fermentación
continúa agregando y extrayendo la cantidad correspondiente dependiendo de la dilución. Se
observa que al momento iniciar la fermentación continua al momento de realizar el conteo
es muy que existe un movimiento de oscilación, pero mantiene su tendencia estable.

2.11.6 Fermentación con jugos hidrolizados en sistema continuo en fermentador de 1L.

De acuerdo a los datos obtenidos de las cinéticas realizadas a partir de los jugos ácidos de los
hidrolizados, se trabajó con las mejores condiciones para enriquecer cada uno de estos jugos
y llevarlos a condiciones óptimas de fermentación. El medio de fermentación fue sometido a
un proceso de concentración para llevarlo a 10°Bx, posteriormente se realizó un ajuste de pH
con NaOH 10M hasta llevarlos a un pH 5.5. Estos jugos fueron enriquecidos a un 25% con
glucosa ya que se observa que por sí mismos, aunque se encuentren a una concentración de
azucares de 50 g/L, no tienen un crecimiento adecuado ya que carecen de sustrato suficiente
para mantener la levadura viva.

Se adaptaron 2 L de jugos de los hidrolizados a una concentración de azucares de 100 g/L.


del cual 1 L se colocó dentro del reactor, el consiguiente litro fue depositado en 1 matraz
erlenmeyer de 1L, el cual fungirá como reservorio, ambos fueron sometidos a un ciclo de
37
esterilización en la autoclave. Tanto el reactor como el reservorio se montaron dentro del
equipo de fermentación y se llevaron a cabo las fermentaciones bajo las condiciones descritas
en el punto 2.11.2.

2.11.6.1 Fermentación continua con jugo hidrolizado de Olote y café en


fermentador de 1L a D=0.08

Se realizó una fermentación continua para cada uno de los jugos hidrolizados, tanto del olote
como el café, a una sola tasa de dilución propuesta, la cual fue de0.08 h-1. De acuerdo a la
ecuación 2.7 el tiempo de residencia (𝜏) es de 12 h para ambas fermentaciones continuas,
mientras que con la ecuación 2.6 se determinó el flujo necesario que sería de 80 mL/h, el cual
se adicionará al reactor y se extraerá cada hora. Para cada una de las fermentaciones se evaluó
el número de células, sustrato y producto obtenido.

38
CAPÍTULO III

RESULTADOS
CAPÍTULO III: RESULTADOS

En este apartado se presentan los resultados que se consideran desde la obtención de los
residuos lignocelulósicos, la caracterización en laboratorio de esta materia prima, la
realización de la hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina y llevando a nivel matraz la hidrólisis
enzimática utilizando la enzima (Cellic CTec3), finalmente los resultados de las
fermentaciones, tanto de los hidrolizados ácidos mejor evaluados como de las fermentaciones
a partir de jugo de caña, utilizando levadura ITV01, evaluando las tasas de dilución a
diferentes condiciones de nutrientes.

3.1 Obtención de los residuos lignocelulósico

Los residuos lignocelulósicos empleados en este trabajo son característicos de la región


centro del estado de Veracruz. La cantidad de café empleado se obtuvo de la zona cafetalera
de la ciudad de Córdoba, Ver; tanto la madera como el olote fueron colectados en el mercado
central de la ciudad de Orizaba, Ver. Toda esta materia prima fue obtenida completamente
seca y libre de cualquier otra materia ajena. Para obtener mejores resultados en los posteriores
tratamientos, se realizó una reducción de tamaño a través de un proceso mecánico de
trituración.

3.2 Resultados de la caracterización

La caracterización de la materia prima se llevó a cabo bajo las normas y técnicas mencionadas
en la sección 2.5 del capítulo 2. El porcentaje de humedad determinado fue de 12.3%, 9.4%
y 16.1% para la madera, olote y café respectivamente, estos valores son utilizados para la
determinación de lignina, celulosa y hemicelulosa, en la Figura3.1 se muestran los valores
obtenidos a través de estas técnicas, los cuales representan la composición característica de
estos residuos, se observa que de estas tres materias primas, tanto la madera como el olote
cuentan con un mayor porcentaje de celulosa con respecto al café, sin embargo se observa
que la hemicelulosa tanto del café como de la madera son un 35% más bajo con respecto a
lo obtenido con el olote. La cantidad de fibra determinada de la madera como del olote se
encuentran dentro de los rangos descritos de celulosa, hemicelulosa y lignina reportados por
(Sungy Chen, 2002, citado por Cuervo et al., 2009) en la cual se observa una variación de
5% de cada uno de estos. A fin de remover mayor cantidad de lignina y hemicelulosa con

40
respecto a lo reportado en la Figura 3.1, se realizó una serie de pretratamientos tanto ácidos
como alcalinos.

MADERA OLOTE

7% 16% 3%
% Lignina 11%
% Lignina
25% 39%
% Celulosa
% Celulosa
52% 47%
% Hemicelulosa % Hemicelulosa

Otros Otros

CAFÉ

% Lignina
9%
29%
% Celulosa
25%
37%
% Hemicelulosa

Otros

Figura 3.1 Caracterización de la materia prima

3.3 Hidrólisis
3.3.1 Hidrólisis ácida

El contenido de humedad después de esta etapa se determinó empleando una termo-balanza


modelo AMB-50, con la cual se obtuvo que la madera cuenta con un 9.92%, el olote con
10.97% y el café con un 4.2%. El porcentaje de humedad determinado, después de esta etapa,
es empleado para los posteriores análisis indicados en la sección 2.5 del capítulo 2, los cuales
se muestran los resultados en la Tabla 3.1 en la cual se observa que hay un aumento de
celulosa del 18% para la madera, 9% para el olote y de un 13% para el café, el aumento de
celulosa se aprecia de mejor manera con el paso de los pretratamientos que se van aplicando
a los residuos, ya que en la etapa de hidrólisis enzimática, lo que consume principalmente la

41
enzima es celulosa. Con respecto a la hemicelulosa se denota una disminución del de 6%,
11%, y 0.44% para la madera, olote y café respectivamente, mientras que para la lignina, se
observa que existe una disminución en su porcentaje con respecto a la materia prima de un
5.73% para la madera, 4.7% de olote y un 0.45% para el café. El pretratamiento
proporcionado en esta etapa indica que existe una remoción de hemicelulosa y un aumento
en la cantidad de celulosa, mientras que la caída en el porcentaje de lignina es mínima, no
siendo tan efectivo este pretratamiento en este último rublo. Es importante recalcar que la
degradación y remoción de compuestos del material depende de la concentración y cantidad
de ácido, temperatura y tiempo de hidrólisis.

Los °Bx se determinaron empleando un refractómetro Marca ATAGO, modelo MASTER-


50H, los cuales representan la cantidad de azúcares presente en los hidrolizados ácidos puesto
que estos jugos se llevarán a fermentación. De acuerdo a Partida (2017) 1 °Bx equivale a 10
g/L.

Tabla 3.1. Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del pretratamiento ácido
ANÁLISIS MATERIA PRIMA
Madera Olote Café
°Bx 5 5 7
% Lignina 10.27 6.32 8.56
% Celulosa 70.04 55.51 49.16
% Hemicelulosa 19.31 24.43 14.48

3.3.2 Pretratamiento Alcalino

Bajo las condiciones indicadas en la sección 2.7.2, se obtuvieron los porcentajes de fibra
después del pretratamiento hidrolítico alcalino, en el cual se observa en la Tabla 3.2 que la
cantidad de lignina que se removió de una fase a otra fue significativa teniendo para la madera
una reducción del 3%, 4.3% para el olote y un 3.5% para el café, lo que indica que el
pretratamiento es efectivo para la reducción de lignina pero pudiera haber una mayor
remoción si se contará con los óptimos para cada uno de los residuos. Se observa de igual
forma, que el contenido de celulosa en el caso del olote y el café aumentan en un 30% y 14%
respectivamente comparándolo con la etapa anterior. En el caso de la hemicelulosa, hay una

42
disminución en el caso de la madera y el olote, mientras que para el café existe un ligero
aumento en este porcentaje, esto se puede deber a que existen otros compuestos que
interfieren en la lectura final.

Tabla 3.2 Caracterización de los residuos lignocelulósicos después del pretratamiento alcalino

MATERIA PRIMA
ANÁLISIS
Madera Olote Café
% Lignina 8.28 1.99 5.06
% Celulosa 67.73 84.93 63.47
% Hemicelulosa 16.16 12.71 19.09

3.3.3 Hidrólisis Enzimática

Se llevó a cabo una cinética prueba de una hidrólisis enzimática a nivel matraz, la cual tuvo
como objeto evaluar los pretratamientos hidrolíticos tanto ácido como alcalino de la materia
prima lignocelulósica, se siguieron las condiciones descritas en el apartado 2.7.3a un tiempo
de residencia de 72 h, en la cual se cuantificaron los azúcares fermentables presentes
mediante HPLC. Los resultados arrojaron que durante las primeras 20 h de residencia, para
los tres residuos el consumo de la enzima Cellic CTecC3 fue muy lento por lo cual no fue
que hasta la hora 22 se decidió comenzar a graficar, en este tiempo se observa un aumento
constante en la concentración de azúcares en los tres residuos y no fue hasta la hora 40que
tanto el café como la madera obtuvieron su máxima de 2.96g/L y 0.153 g/L concentración
de azucares respectivamente, mientras que el olote continuó con su crecimiento hasta la hora
55, de ahí tuvo un pequeño decremento pero continuó aumentando hasta que terminó el
tiempo de hidrólisis con una concentración máxima de azucares de 9.4 g/L.

El residuo lignocelulósico que tuvo una mayor concentración de azúcares en respuesta a la


hidrólisis enzimática, como se visualiza en la Figura 3.2, fue el olote, lo cual permite observar
que los pretratamientos tanto ácido como alcalino tuvieron una mejor aceptación en este
residuo con respecto a la madera Figura 3.3 y el café Figura 3.4, esto se debe a que tuvo una
mayor remoción de lignina y hemicelulosa en los pretratamientos, lo cual aumento la
cantidad de celulosa que la enzima pudo procesar de mejor manera.

43
10

Concentración de azúcares (g/L)


9.5

8.5

7.5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Figura 3.2 Concentración de azucares del hidrolizado ácido del olote

0.155
Concentración de azúcares (g/L)

0.15

0.145

0.14

0.135

0.13

0.125
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Figura 3.3 Concentración de azúcares del hidrolizado ácido de la madera

3.1
Concentracion de azúcares

2.9
2.7
2.5
(g/L)

2.3
2.1
1.9
1.7
1.5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Figura.3.4 Concentración de azúcares del hidrolizado ácido del café

44
3.4 Fermentación por lotes

De acuerdo a la Tabla 2.5 propuesta en la sección 2.9.2 se realizaron las cinéticas a nivel
matraz a una capacidad de 250 mL, para conocer la mejor concentración de sales posible en
una fermentación por lotes, e implementado la ecuación 2.1 propuesta en la sección 2.9.3, se
determinó la μmax a partir de los g/L de células presentes en un tiempo determinado. El jugo
de caña se ajustó a una concentración de azúcares de 140 g/L, mientras que para los
hidrolizados ácidos de los residuos lignocelulósicos que se encontraban a un pH de 5, se
necesitó reducir y llevarlo a una concentración de azúcares de 100g/L. Se evaluó el número
de células vivas como se describe en el apartado 2.9.4, determinación de azúcares a través de
la técnica de DNS siguiendo los lineamientos descritos en el anexo C y determinación de
etanol por el método de Dicromato de Potasio establecido en el anexo D.

Para una mejor comprensión en la Tabla 3.3 se presenta la nomenclatura empleada para la
combinación de sales utilizadas en las cinéticas realizadas.

Tabla 3.3. Nomenclatura utilizada en combinación de sales


CONTENIDO (g/L)

CÓDIGO KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O

CS-1 7.000 0.000 0.000

CS-2 0.000 5.000 0.000

CS-3 0.000 0.000 1.500

CS-4 3.500 2.500 0.000

CS-5 3.500 0.000 0.750

CS-6 0.000 2.500 0.750

CS-7 2.333 1.667 0.500

CS-8 4.667 0.833 0.250

CS-9 1.167 3.333 0.250

CS-10 1.167 0.833 1.000

45
3.4.1 Comportamiento del Jugo de caña
En la Figura 3.5, se observa el comportamiento de las cinéticas realizadas con el fin de
determinarla µmax utilizando la ecuación descrita en el apartado 2.9.3, transcurrido un
periodo de tiempo de 32 h., se observa que el mejor valor evaluado se alcanza en tiempo de
12 h teniendo como valor máximo 0.3695, este corresponde al código CS-9 de la Tabla 3.3
formulación descrita en el apartado3.4, lo cual arroja que debe tener una formulación de
1.167 g/L de KH2PO4, 3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250 g/L de MgSO4.7H2O

0.4

0.35
CS-1
0.3
CS-2

0.25 CS-3
µ max (h-1)

CS-4
0.2
CS-5
0.15 CS-6
CS-7
0.1
CS-8
0.05 CS-9

0 CS-10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)

Figura 3.5 Cinética para la obtención de la µmax del jugo de caña

Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante 32 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones, determinando el
punto máximo que llegó a reproducirse la levadura ITV-01 siendo de 28.6x107 células/ml,
en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura 3.6.

46
3.50E+08

3.00E+08 CS-1
CS-2
Biomsa (cel/mL) 2.50E+08
CS-3
2.00E+08 CS-4

1.50E+08 CS-5
CS-6
1.00E+08
CS-7

5.00E+07 CS-8
CS-9
0.00E+00
CS-10
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (h)

Figura 3.6 Cinética de biomasa para el jugo de caña

Mediante la técnica mencionadas en la sección 2.5.5 y 2.5.6 que refieren a DNS y Dicromato
de Potasio, se llevaron a cabo la cinética para la cuantificación de azúcares y de alcohol
respectivamente, la cual se evaluó durante un tiempo de 32 h, donde se en las Figuras 3.7 y
3.8 un descenso en la concentración de azúcares en todas las cinéticas, las cuales partieron
de una concentración inicial de 140 g/L y se observa que la relación de sales mejor evaluada
corresponde la concentración correspondiente al código S CS-9 con las condiciones 1.167g/L
de KH2PO4, 3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250g/L de MgSO4.7H2O, en la cual se observa que
hay un consumo constante de azúcares, el cual se mantiene constante el tiempo de
crecimiento, terminado en una concentración de azúcares de 70 g/L . De igual manera en la
Figura 3.7 y 3.8 se muestran la cinéticas de crecimiento de la cantidad de alcohol presente en
cada una de las series evaluadas, partiendo de un valor inicial de 0 g/L de etanol, la serie
mejor evaluada se identificó como P CS-9 que obtuvo el valor máximo de 0.537 g/L de etanol
en un tiempo de 32 h con las condiciones de 0 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L
de MgSO4.7H2O..

47
Figura 3.7 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo de caña

Figura 3.8 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo de caña

3.4.2 Comportamiento del hidrolizado ácido del olote

Una vez concluida la hidrólisis ácida, los hidrolizados resultantes del café y del olote,
presentaron un pH de 0.25 y 0.39 para cada uno respectivamente, lo que hizo necesario
emplear NaOH 10M, para llevarlos al pH de 5.5 requerido para iniciar el proceso
fermentativo. Se observó que al adicionar la solución básica, el hidrolizado cambió su
aspecto, tomando un color más obscuro, puede decirse que la solución de NaOH es muy
agresiva para el jugo hidrolizado.

48
Empleando las formulaciones de la Tabla 3.3, se evaluó la µmax en un tiempo de 18 h como
se muestra en la Figura 3.9,a cual tiene un valor de µmax de 0.2417 en un tiempo estimado de
6 h, la formulación CS-2 es la que presentó un mejor resultado, con las condiciones de 0 g/L
de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L de MgSO4.7H2O.

0.3

CS-5
0.25
CS-1
0.2 CS-2
-1)
µ max (h

CS-3
0.15
CS-4

0.1 CS-6
CS-7
0.05 CS-8
CS-9
0
0 5 10 15 20 CS-10
Tiempo (h)

Figura 3.9 Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del olote

Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante un tiempo de 20 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones
descritas en la Tabla 3.3, determinando el punto máximo que llegó a reproducirse la levadura
ITV-01 siendo de 37x107 células/ml, en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura
3.10.

49
4.00E+07

3.50E+07
CS-1
3.00E+07 CS-2
Biomsa (cel/mL)
2.50E+07 CS-3
CS-4
2.00E+07
CS-5
1.50E+07 CS-6
CS-7
1.00E+07
CS-8
5.00E+06
CS-9
0.00E+00 CS-10
0 5 10 15 20
Tiempo (h)

Figura 3.10 Cinética de crecimiento de biomasa para jugo hidrolizado de olote.

Mediante la técnica de DNS y de Dicromato de Potasio, se llevó a cabo la cinética para la


cuantificación de azúcares y de alcohol respectivamente, la cual se evaluó durante un tiempo
de 18 h en 5 muestreos cada 3 h, se puede observa tanto en la Figura 3.11 como en la Figura
3.12 que existe un claro descenso en la concentración de azúcares en todas las cinéticas, todas
partiendo de una concentración inicial de 100 g/L y teniendo como la mejor formulación
evaluada la concentración de sales correspondiente al código S CS-5 con las condiciones 3.5
g/L de KH2PO4, 0 g/L de (NH4)2SO4 y 0.75g/L de MgSO4.7H2O, en la cual se observa que
hay un consumo moderado de azúcares haciendo constante y controlada la cinética pero un
mayor tiempo de crecimiento terminado en una concentración de azúcares de 31.11 g/L . De
igual manera en la Figura 3.11 y 3.12 se muestran la cinéticas de crecimiento de la cantidad
de alcohol presente en cada una de las series evaluadas, partiendo de un valor inicial de 0 g/L
de etanol, la serie mejor evaluada se identificó como P CS-4 que obtuvo el valor máximo de
0.876 g/L de etanol en un tiempo de 18 h con las condiciones de 3.5 g/L de KH2PO4, 2.5 g/L
de (NH4)2SO4 y 0 g/L de MgSO4.7H2O...

50
Figura 3.11 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo hidrolizado ácido
de olote

Figura 3.12 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo hidrolizado ácido
de olote

3.4.3 Comportamiento del hidrolizado ácido del café

Retomando lo descrito en el apartado 3.4.2, terminada la etapa de hidrólisis ácida, los


hidrolizados resultantes del café, presentaron un pH de 0.39, lo que hizo necesario emplear
NaOH 10M, para llevarlos al pH de 5.5 requerido para iniciar el proceso fermentativo en las
cinéticas. Se observó de igual manera que al adicionar la solución básica, el hidrolizado

51
cambió su aspecto, tomando un color más obscuro, denotando que la solución de NaOH es
muy agresiva para el jugo hidrolizado por su cambio tan brusco de pH.

Empleando las formulaciones de la Tabla 3.3, se evaluó la µmax en un tiempo de 14 h como


se muestra en la Figura 3.13, la cual tiene un valor de µmax de 0.58 en un tiempo estimado de
2 h, la formulación CS-3 es la que presentó un mejor resultado, con las condiciones de 0 g/L
de KH2PO4, 0 g/L de (NH4)2SO4 y 1.5 g/L de MgSO4.7H2O.

0.7

0.6 CS-1
CS-2
0.5
CS-3
µmax h-1

0.4 CS-4

0.3 CS-5
CS-6
0.2
CS-7
0.1 CS-8

0 CS-9
0 5 10 15 CS-10
Tiempo (h)

Figura 3.13. Cinética para la obtención de la µmax del hidrolizado ácido del café

Mediante el conteo de células se realizó la cinética de biomasa del jugo de caña, se evaluó
durante un tiempo de 20 h el crecimiento de células de cada una de las 10 formulaciones
descritas en la Tabla 3.3, determinando el punto máximo que llegó a reproducirse la levadura
ITV-01 siendo de 37x107 células/ml, en un tiempo de 16 h como se muestra en la Figura
3.14.

52
7.00E+07

6.00E+07 CS-1
CS-2
5.00E+07

Biomsa (cel/mL)
CS-3
4.00E+07 CS-4

3.00E+07 SC-5
CS-6
2.00E+07
CS-7
1.00E+07 CS-8

0.00E+00 CS-9
0 5 10 15 CS-10
Tiempo (h)

Figura 3.14.Cinética de crecimiento de biomasa para jugo hidrolizado del café

Llevando a cabo la técnica de DNS y de Dicromato de Potasio, se realizaron las cinéticas


correspondientes para la cuantificación de azucares y de alcohol respectivamente, cada serie
se evalúo durante un tiempo de 18 h en 5 muestreos cada 3 h. Se visualiza en la Figura 3.15
como en la Figura 3.16 un descenso en la concentración de azucares en todas las cinéticas ya
que fueron consumidas parcialmente por el accionar de la levadura ITV01, se inició con
concentración de 100 g/L y se observó que la formulación de sales mejor evaluada
corresponde al código S CS-9 con las condiciones 1.167g/L de KH2PO4, 3.333 g/L de
(NH4)2SO4 y 0.250 g/L de MgSO4.7H2O. Se observa que mantiene un consumo parcial de
azúcares dentro de las primeras 10 h y al alcanzar un tiempo de 12 h denota su nivel más
bajo en su concentración, el cual concluyó en 21.66 g/L. En ambas Figuras (3.15, 3.16)se
muestran la cinéticas de crecimiento de la cantidad de alcohol presente en cada una de las
series evaluadas, partiendo de un valor inicial de 0 g/L de etanol, la serie mejor evaluada se
identificó como P CS-3 la cual tuvo un comportamiento lineal y constante y obtuvo el valor
máximo de 0.895 g/L de etanol en un tiempo de 15 h con las condiciones de 0g/L de KH2PO4,
0 g/L de (NH4)2SO4 y 1.5 g/L de MgSO4.7H2O.

53
Figura 15. Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-1 a CS-5 para el jugo hidrolizado ácido
del café

Figura 3.16 Relación Sustrato (S) Vs Producto (P) para cinéticas CS-6 a CS-10 para el jugo hidrolizado ácido
del café

3.4.4 Comportamiento del hidrolizado ácido de la madera

Mediante una cinética de crecimiento de biomasa, se evaluaron los tres residuos durante un
periodo de 37 h, en donde la concentración inicial de levaduras fue de 3x106Cel/mL,
transcurrido el tiempo, se observa que por parte del jugo hidrolizado de madera, el punto en
donde registró la concentración más alta de células fue en la hora 4 teniendo 8x106Cel/mL,
después de lo cual en las horas posteriores de análisis se observa una caída muy pronunciada

54
hasta una nula existencia de microorganismos, en este momento se optó por declinar las
cinéticas para este residuo lignocelulósico, ya que no tuvo un crecimiento significativo y se
descartó al no poder contar un control adecuado y pudiera afectar al momento de trasladar a
fermentación continua, esto se debe a que el medio en el que la levadura ITV01 se desarrolla
no es el óptimo debido a la solución de NaOH empleada para aumentar el pH es demasiada
agresiva e inhibe el microorganismo.

3.5 Fermentaciones
3.5.1 Fermentación Continua de Jugo de Caña

Se llevó a cabo la fermentación continua del Jugo de Caña evaluando tres diferentes tasas de
dilución 0.04, 0.06 y 0.08 h-1 respectivamente, monitoreándose el comportamiento obtenido
tanto de biomasa, producto y sustrato. En la Figura 3.17, se puede observar el
comportamiento de la tasa de dilución de 0.04 h-1, en la cual la máxima concentración de
producto fue de 0.91 g/L, logrando tener una reducción del sustrato hasta 5.54 g/L,
obteniendo una productividad de 0.03g/Lh.

Tiempo

Figura 3.17. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.04 h-1

55
Para la tasa de dilución de 0.06 h -1 que se muestra en la Figura 3.18 se observa que se tuvo
una máxima concentración de 0.90 g/L, obteniendo una productividad de 0.06 g/Lh, así como
también se obtuvo una concentración final de sustrato de 5.89 g/L.

Por lo que respecta a la tasa de dilución de 0.08 h -1, la cual se muestra en la Figura 3.19, se
obtuvo una productividad de 0.05g/Lh, logrando una mayor concentración de producto de
0.54 g/L y obteniendo una concentración final de sustrato de 0.7 g/L.

Tiempo

Figura 3.18. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.06 h-1

56
Tiempo
Figura 3.19. Cinética de Jugo de Caña con una tasa de dilución de 0.08 h-1

Cabe destacar que durante el tiempo de las fermentaciones continuas en las tres diferentes
tasas de dilución se logró mantener constante la concentración de biomasa dentro del reactor,
ya que en este caso no se tuvieron complicaciones con el sistema de fermentación en cuanto
a la agitación, que existiera un lavado de células al momento de suministrar cada hora la
cantidad indicada en cada tasa de dilución, así como también se logró mantener en 30° C la
temperatura del reactor lo que permitió que el proceso tuviera un comportamiento estable.

3.5.2 Fermentación Continua de Hidrolizados ácidos

Se evaluaron tres residuos mediante hidrolisis ácida, madera, café y olote respectivamente
para que posteriormente a los jugos resultantes de la hidrólisis se llevarán a fermentación. De
acuerdo a las cinéticas obtenidas de cada uno de los residuos se optó por descartar la madera
ya que fue el residuo que no tuvo un buen comportamiento respecto a las células, al no tener
un crecimiento celular significativo, ya que para poder llevar a cabo las cinéticas se comienza
con una concentración de células de 3x106, para lo cual en la cinética de la madera después
de monitorear hasta 37 h se encontró que el máximo de células que llego a tener fue de 8x106,

57
lo cual dificultaría el control dentro del proceso continuo. Es por eso que se optó por no
seguir con una fermentación continua de este material. Mientras que para el café y olote se
evaluaron a una sola tasa de dilución la cual fue de 0.08 h-1. En la que se obtuvieron los
valores de concentración máxima de producto, así como el monitoreo del sustrato y la
concentración de biomasa.

En la Figura 3.20 se muestra el comportamiento de la cinética del café en al cual se tuvo una
productividad de 0.07 g/Lh obteniendo una concentración final de producto de 0.90 g/L así
como una concentración final de sustrato de 10.29 g/L.

Tiempo

Figura 3.20. Cinética de hidrolizado de Café con una tasa de dilución 0.08 h-1

Por su parte en la cinética del olote que se muestra en la Figura 3.21 con una tasa de dilución
de 0.08 h-1 se tuvo una concentración final de producto de 0.90 g/L obteniendo una
productividad de 0.07 g/Lh y una concentración final de sustrato de 8.15 g/L.s

58
Tiempo
Figura 3.21. Cinética de hidrolizado ácido de Olote con una tasa de dilución de 0.08 h -1

Respecto a las fermentaciones de los hidrolizados se puede notar una concentración de


producto final con respecto al jugo de caña y una productividad que fue de 0.07 g/Lh en los
dos materiales. Estas fermentaciones tuvieron un buen comportamiento a pesar de que se le
suministro NaOH, 10 M, el cual fue muy agresivo con respecto a los jugos y afectaba la
dosificación de sales suministrada, ya que complicaba el desarrollo de la levadura.

3.6 Evaluación de consumo de sustrato y producción de etanol

En cada una de las cinéticas se evaluó el crecimiento celular, producción de etanol y consumo
de sustrato respectivamente, para lo cual en la Figura 3.22 que corresponde a la cinética de
jugo de caña se puede observar la producción de etanol de 0.53 g/L contra el consumo de
sustrato que fue de una concentración final de 0.76 g/L que se obtuvo en la dosificación de
sales número 9, que se muestra en la Tabla 2.5 del apartado 2.9.2 la cual fue la que mayor
crecimiento celular presentó.

59
Figura 3.22.Consumo de sustrato y producción de etanol en el Jugo de Caña

Mientras que en la cinética de hidrolizado de olote que se muestra en la Figura 3.23, en la


dosificación de sales 2, mostrada en la Tabla 2.5 de la sección 2.9.2 se obtuvo el mayor
crecimiento celular, observándose que la mayor concentración de producto fue de 0.88 g/L
y una concentración de sustrato final de 31.74 g/L.

Figura 3.23. Consumo de sustrato y producción de etanol en el Hidrolizado de Olote

60
Por su parte el hidrolizado de café la mayor concentración celular se obtiene en la
dosificación de sales 3 de la Tabla 2.5 de la sección 2.9.2, en la cual se obtiene una
concentración de producto de 0.89 g/L y un consumo de sustrato final de 26.77 g/L, como se
observa en la Figura 3.24

Figura 3.24. Consumo de sustrato y producción de etanol en hidrolizado de café

3.7 Evaluación estadística

El estudio de las formulaciones de sales para la levadura Saccharomyces cerevisiae ITV01,


evaluadas mediante un Diseño de Mezclas, se analizó estadísticamente empleando el
software MINITAB17, sobre diferentes sustratos estudiados.

La Tabla 3.4, presenta el ANOVA del jugo de caña, el cual todos lo p-valores son mayores
a 0.05 lo cual verifica que cada una de las sales y por separado tienen un efecto significativo
sobre el proceso de crecimiento exponencial, además con una R2 de 86.08% del modelo
descrito en la ecuación 3.1, el cual garantiza la fiabilidad de las correlaciones del modelo
sobre la experimentación, evaluando la μmax, como variable de respuesta.

61
Tabla 3.4- ANOVA diseño de mezclas para el jugo de caña.

FUENTE GL SC SEC SC MC F P
AJUST
AJUST
Regresión 8 0.000928 0.000928 0.000116 0.77 0.712

Lineal 2 0.000017 0.000000 0.000000 0.00 1.000

Cuadrático 3 0.000443 0.000100 0.000033 0.22 0.876

KH2PO4*(NH4)SO4 1 0.000073 0.000000 0.000000 0.00 0.964

KH2PO4*MgSO4 H2 1 0.000050 0.000000 0.000000 0.00 0.964

(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.000320 0.000091 0.000091 0.60 0.679

Cúbico especial 1 0.000345 0.000345 0.000345 2.30 0.371


KH2PO4*(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.000345 0.000345 0.000345 2.30 0.371

Cúbico completo 2 0.000123 0.000123 0.000062 0.41 0.741

KH2PO4*(NH4)SO4*(-) 1 0.000007 0.000009 0.000009 0.06 0.843

KH2PO4*MgSO4 H2*(-) 1 0.000116 0.000116 0.000116 0.77 0.541

Error residual 1 0.000150 0.000150 0.000150

Total 9 0.001078

𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑗𝑢𝑔𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎ñ𝑎 𝑐𝑎ñ𝑎 = 0.000073𝑥12 𝑥22 + 0.000050𝑥12 𝑥32 + 0.000320𝑥22 𝑥32 +
0.000345𝑥13 𝑥23 𝑥33 + 0.000007𝑥13 𝑥23 + 0.000116𝑥23 𝑥33 (3.1)

En la Figura 3.25 se muestra el gráfico de superficie de respuesta del diseño de mezcla para
la búsqueda de la dosificación adecuada de sales nutrientes para fortificar el cultivo por lotes,
donde se puede observar que las sales por si solas ofrecen una baja aceleración de crecimiento
celular, sin embargo en los niveles medios de operación se observa una maximización en el
proceso donde se alcanza una μmax de 0.0833 h-1 , esto se puede confirmar con el diagrama
de contornos que se muestra en la Figura 3.26, donde se encuentra una zona optima de la
combinación de sales nutrientes.

62
KH2PO4

Figura 3.25. Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del jugo de caña

KH2PO4

(NH44)SO
(NH )SO44 MgSO4 H2O

Figura 3.26.- Diagrama de contorno del diseño simplex centroide para el jugo de caña.

Para encontrar los valores óptimos de la mezcla se utilizó el software MINITAB17, con un
resultado obtuvo un valor de 0.7966 h-1 bajo la composición que se encuentra en la Tabla 3.5,
donde la sección de variables naturales se refiere a la cantidad en g/L que se necesita para
encontrar el mayor crecimiento de células en la fermentación, y se puede observar que el
KH2PO4 y el (NH4)2SO4 son minerales no tan necesarios para la función metabólica de las

63
levaduras de forma contraria el MgSO7 es un mineral requerido en casi el 50% del total
proporcionado durante el análisis.

Tabla 3.5.- Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del jugo de caña.

Componente Codificado (%) Naturales (g/L)

KH2PO4 31.31 2.1917

(NH4)SO4 25.13 1.2565

MgSO4 43.56 0.6534 g

Optimo crecimiento 0.7966 h-1

Para los hidrolizados ácidos de los residuos lignocelulósicos, no tuvo un comportamiento


ideal comparada contra el jugo de caña, debido a que se alcanzó una 𝜇𝑚𝑎𝑥 de 0.0666 h-1 y
0.0909 h-1 respectivamente, debido a la naturaleza acida del medio que aunque se tuvo un
ajuste de pH, esto no deja al sustrato de una forma idónea para que ocurra la fermentación,
puesto que el NaOH, es muy agresivo y se puede observar un oscurecimiento del jugo
hidrolizado, puesto que la influencia de las sales nutrientes en estos medios se puede
visualizar en la Figura 3.27 que las sales no pueden ejercer su funcionamiento metabólico de
las levaduras en la fermentación, estadísticamente se obtuvo una R2 de 77.69% del modelo
descrito en la ecuación 3.3, el cual evalúa el crecimiento celular como variable de respuesta
y en el ANOVA de la Tabla 3.3 se observa que con p-valores mayores a 0.05 cada una de las
sales efecto unitario y combinado son significativas en el proceso de fermentación.

64
KH2PO4 (NH4)SO4
.

Figura 3.27.. Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del olote hidrolizado

Tabla 3.6.- ANOVA diseño de mezclas para el hidrolizado de olote.


Fuente GL SC Sec SC Ajuste MCAjust F P

Regresión 8 0.003412 0.003412 0.000427 0.43 0.836


Lineal 2 0.001738 0.000686 0.000343 0.34 0.770

Cuadrático 3 0.001269 0.001413 0.000471 0.47 0.759

KH2PO4*(NH4)SO4 1 0.000107 0.000135 0.000135 0.14 0.776

KH2PO4*MgSO4 H2 1 0.000196 0.000196 0.000196 0.20 0.735


(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.000924 0.000950 0.000950 0.95 0.508

Cúbico especial 1 0.000018 0.000018 0.000018 0.02 0.914

KH2PO4*(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.000387 0.000387 0.000194 0.19 0.849

Cúbico completo 2 0.006058 0.006058 0.003029 0.44 0.731

KH2PO4*(NH4)SO4*(-) 1 0.000015 0.001786 0.001786 0.26 0.702


KH2PO4*MgSO4 H2*(-) 1 0.000018 0.000018 0.000018 0.87 0.523

Error residual 1 0.001001 0.001001 0.001001

Total 9 0.004414

𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑜𝑙𝑜𝑡𝑒 = 0.000107𝑥12 𝑥22 + 0.000196𝑥12 𝑥32 + 0.000924𝑥22 𝑥32 + 0.000387𝑥23 𝑥33 +
0.000015𝑥13 𝑥23 + 0.000018𝑥33 (3.2)

65
Se observa en la Tabla 3.6 que la fuente de potasio por si sola minimiza el crecimiento celular,
por lo que el mayor crecimiento ocurre cuando la sal de amonio y la sal de magnesio se
encuentran un 50% de cada una, ignorando la utilización de la sal de potasio, con estas
condiciones se obtiene las mejores condiciones para llevar a cabo el cultivo por lotes,
numéricamente se pude observar mediante la Tabla 3.7.

Tabla 3.7. Dosificación óptima para el proceso de cultivo por lotes del hidrolizado del olote

Componente Codificado (%) Naturales (g)

KH2PO4 0.00 0.0000

(NH4)SO4 46.46 2.3230

MgSO4 53.54 0.8031

Optimo crecimiento 0.7376 h-1

De forma similar se encuentra el hidrolizado del café que se visualiza en la Figura 3.28,
donde la sal de potasio minimiza el crecimiento de células, pero de forma contraria se observa
que por separado el MgSO4 y el (NH4)SO4 son capaces de desarrollar el crecimiento de las
levaduras y este ultima en mayor proporción desarrolla el metabolismo celular, por lo que no
es una respuesta viable no se ocupa,

KH2PO4

(NH4)SO4

MgSO4 H2O

Figura 3.28.- Superficie de respuesta de mezcla simplex centroide del café hidrolizado

66
.
La combinación de mezcla idónea arrojada por el modelo de la ecuación 3.4 y
estadísticamente se obtuvo una R2 de 77.31% del modelo 3.4 el cual garantiza la fiabilidad
de las correlaciones del modelo sobre la experimentación, evaluando el crecimiento celular
como variable de respuesta y el ANOVA de la Tabla 3.8, demuestra que con p-valores
mayores a 0.05, las sales de forma unitaria y sobre efecto combinado son significativas
durante el proceso de crecimiento celular, en el proceso de fermentación.

𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑐𝑎𝑓𝑒 = 0.001822𝑥12 𝑥22 + 0.004763𝑥12 𝑥32 + 0.036992𝑥22 𝑥32 + 0.001259𝑥23 𝑥33 +
0.000015𝑥13 𝑥23 + 0.006043𝑥33 (3.3)

Tabla 3.8. ANOVA diseño de mezclas para el hidrolizado de café

Fuente GL SC Sec SC Ajust MCAjust F P

Regresión 8 0.103092 0.103092 0.012887 1.85 0.517

Lineal 2 0.052198 0.044471 0.022235 3.19 0.368

Cuadrático 3 0.043577 0.036160 0.012053 1.73 0.497

KH2PO4*(NH4)SO4 1 0.001822 0.003543 0.003543 0.51 0.606


KH2PO4*MgSO4 H2 1 0.004763 0.002881 0.002881 0.41 0.636

(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.036992 0.026895 0.026895 3.86 0.300

Cúbico especial 1 0.001259 0.001259 0.001259 0.18 0.744


KH2PO4*(NH4)SO4*MgSO4 H2 1 0.001259 0.001259 0.001259 0.18 0.744

Cúbico completo 2 0.006058 0.006058 0.003029 0.44 0.731

KH2PO4*(NH4)SO4*(-) 1 0.000015 0.001786 0.001786 0.26 0.702

KH2PO4*MgSO4 H2*(-) 1 0.006043 0.006043 0.006043 0.87 0.523

Error residual 1 0.006992 0.006992 0.006992

Total 9 0.000054

67
3.8 Productividad optima de la fermentación continua del jugo de caña.

La Figura 3.29 muestra la tasa de dilución óptima encontrada para la fermentación continua
del jugo de caña donde la tasa de 0.06 h-1 con una productividad, Q, de 0.9030 g/Lh superando
en un 18 % a la obtenida en el cultivo por lote de 0.0744 g/Lh, comparando la tasa de dilución
de 0.04 h-1, para los residuos lignocelulósicos de café y madera que son 0.07 y 0.09
respectivamente, se puede observar que son altamente competitivos con el jugo de caña, es
por ellos que se debe evaluar diferentes tasas de dilución para los residuos lignocelulósicos.

0.1

0.09
Productividad (Q)

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
Tasa de dilusión (h-1)

Figura 3.29.- Tasa de dilución optima de la fermentación continua del jugo de caña

68
Conclusiones

El tratamiento hidrolítico ácido implementado a la biomasa permitió remover en promedio


un 19.4 % de lignina y un 34.1% de hemicelulosa, mientras que hubo un aumento del 27.7%
en la celulosa. Durante el tratamiento hidrolítico alcalino se observó una disminución del
57.2% de lignina, 38.9% de hemicelulosa y un aumento del 60.9% de celulosa, todo con
respecto a la materia prima.

Los resultados de la hidrólisis enzimática arrojaron que el residuo lignocelulósico que tuvo
una mayor concentración de azúcares fue el olote con 9.4 g/L de azucares fermentables,
mientras que el café como la madera, obtuvieron una máxima de 2.96g/L y 0.153 g/L
concentración de azucares respectivamente.

Las cinéticas realizadas para obtener la óptima formulación de medio de adaptación arrojaron
que para el jugo de bagazo de caña, la velocidad máxima de crecimiento (µmax) se alcanza en
tiempo de 12 h, obteniendo un valor de 0.3695, con la formulación de 1.167 g/L de KH2PO4,
3.333 g/L de (NH4)2SO4 y 0.250 g/L de MgSO4.7H2O. El jugo hidrolizado ácido del olote se
evaluó en un tiempo de 18 h, el cual obtuvo un valor de µmax de 0.2417 en un tiempo estimado
de 6 h, con la formulación 0 g/L de KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 0 g/L de MgSO4.7H2O.
Mientras que el jugo hidrolizado ácido del café se evaluó en un tiempo de 14 h la cual obtuvo
un valor de µmax de 0.58 en un tiempo estimado de 2 h, la cual refiere a la formulación 0 g/L
de KH2PO4, 0 g/L de (NH4)2SO4 y 1.5 g/L de MgSO4.7H2O.

69
Recomendaciones
Realizar un pretratamiento de molienda más eficaz para reducir el tamaño de la partícula de
los residuos, a fin de mejorar el contacto con el medio durante los tratamientos ácidos y
alcalinos.

Llevar a cabo un estudio para la optimización de los pretratamientos ácidos, alcalinos y


enzimáticos para obtener una mejor concentración de azucares fermentables en la etapa final.

Realizar estudios para evaluar otros tipos de medios tanto ácidos como alcalinos que, durante
las etapas hidrolíticas, puedan remover mayor cantidad de lignina y hemicelulosa sin generar
desechos nocivos para el medio ambiente.

Evaluar el comportamiento de diferentes enzimas, tanto comerciales como modificadas, a fin


de comparar la eficiencia de los pretratamientos en la obtención de azucares fermentables.

Implementar un sistema de intercambio de sustrato-producto a fin de garantizar un proceso


100% adiabático durante la fermentación continua a nivel laboratorio, que no interfiera en el
comportamiento de la cinética, proporcionando un sistema de agitación constante que
favorezca el proceso de fermentación.

70
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http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223123848002

74
Anexo A
Determinación de humedad mediante TermobalanzaAMB-50

Procedimiento:
1. Conectar la termobalanza a la toma de corriente
2. Abrir la cubierta del equipo y limpiar perfectamente el platillo metálico
3. Tarar la termobalanza oprimiendo el botón “Tare”
4. Depositar la muestra a la cual se le determinará la humedad, la cantidad de muestra
recomendada debe de ser alrededor de ±0.5 g (peso marcado por la propia termobalanza)
5. Cerrar la cubierta del equipo y comenzar el proceso oprimiendo el botón “start”
6. Dejar funcionar el equipo durante 30 min ininterrumpidos
7. Al finalizar el tiempo establecido, la termobalanza proporcionará un número en su pantalla,
el cual corresponde al número de Sólidos Totales, este dato debe anotarse debido a que se
utilizará posteriormente.
8. Retirar el platillo metálico de la termobalanza y eliminar la muestra analizada, limpiar
perfectamente la termobalanza, y desconectar el equipo.
9. La humedad de la muestra se calcula mediante la ecuación A1.1

%Humedad = 100% - ST (A1.1)

Dónde: ST es el Número de sólidos totales determinados (%).

75
Anexo B
Determinación de carbohidratos estructurales y lignina en la biomasa

Procedimiento analítico de laboratorio(REGAZO)


Fecha de publicación: abril de 2008Fecha de revisión: agosto de 2012
(Versión 08-03-2012)

Procedimiento

1. Preparar la muestra para análisis e hidrolizar.

1.1 Colocar un número adecuado de crisoles filtrantes en el horno de mufla a 575 ± 25 °


C durante un mínimo de 4 h. Retirar los crisoles del horno directamente en un
desecador y enfríe durante un período de tiempo específico, se recomienda una hora.
Pesar los crisoles con una precisión de 0.1 mg y registrar este peso. Es importante
mantener los crisoles en un orden determinado, si no están marcados con
identificadores. Las calcomanías de marcado permanente están disponibles en Wale
Apparatus. No marque la parte inferior del crisol filtrante con un marcador de
porcelana, ya que esto impedirá la filtración.

1.2 Volver a colocar el crisol en el horno de mufla a 575 ± 25 ° C y la ceniza a peso


constante. El peso constante se define como menos de ± 0.3 mg de cambio en el peso
sobre una hora de recalentamiento del crisol.

1.3 Pesar 300.0 ± 10.0 mg de la muestra a tratar en un tubo de ensaye de capacidad de 20


mL previamente tarado en la balanza. Registre el peso con una precisión de 0.1 mg.
Cada muestra debe ser analizada en duplicado, como mínimo.

1.4 Añadir 3.00 ± 0.01 mL de ácido sulfúrico al 72% a cada tubo de ensaye. Se realizó
agitación manual para mezclar bien durante un lapso de un minuto, o hasta que la
muestra esté bien mezclada.

76
1.5 Colocar el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado a 30 ± 3 ° C e incubar la
muestra durante 60 ± 5 min. Se agita la muestra cada 5 a 10 min sin retirar la muestra
del baño. La agitación es esencial para asegurar un contacto uniforme entre ácido y
partículas y una hidrólisis uniforme.

1.6 Una vez completada la hidrólisis de 60 min, retirar los tubos del baño de agua.
Diluir el ácido a una concentración del 4% añadiendo 84.00 ± 0.04 ml de agua
destilada. Se vierte el contenido de los tubos de ensaye en cada uno de los frascos de
250 mL con tapa de baquelita utilizando parte de los 84 mL para la dilución. Se.
mezcla la muestra invirtiendo el tubo varias veces para eliminar la separación de fases
entre capas de ácido de alta y baja concentración

Nota: El volumen de la solución al 4% será de 86.73 mL, como se demuestra en siguientes


cálculos.

 Densidad 72% H2SO4 = d72% H2SO4 = 1.6338 g / mL

 Densidad H2O = dH2O = 1.00 g / mL

 Densidad 4% H2SO4 = d4% H2SO4 = 1.025 g / mL

a. El peso de 3.00 ml de H2SO4 al 72% es:

3.00 ml 72% H2SO4 x d72% H2SO4 = 4.90 g H2SO4 al 72%

b. La composición de 3 ml de H2SO4 al 72% es:

4.90 g 72% H2SO4 x 72% (peso ácido) = 3.53 g ácido


4.90 g H2SO4al 72% x 28% (agua en peso) = 1.37 g de agua

c. La concentración de H2SO4 después de la dilución es:

3.53 g ácido / (84.00 g H2O + 4.90 g H2SO4 al 72%) = 3.97% H2SO4 (p / p)

d. El volumen total de solución presente después de la dilución es:

(4.90 g de H2SO4 + 84.00 g de H2O) x (d4%H2SO4)-1 = 86.73 Ml

77
1.7 Preparar un conjunto de normas de recuperación del azúcar (SRS) que se tomarán a
través de la hidrólisis restante y se utilizarán para corregir las pérdidas debidas a la
destrucción de azúcares durante la hidrólisis ácida diluida. SRS debe incluir D - (+)
glucosa, D - (+) xilosa, D (+) galactosa, - L (+) arabinosa y D - (+) manosa. Las
concentraciones de azúcar SRS deben elegirse para que se parezcan más a las
concentraciones de azúcares en la muestra de ensayo. Pesar las cantidades requeridas
de cada azúcar, a 0.1 mg más cercano, y agregar 10.0 ml de agua desionizada. Añadir
348 μl de ácido sulfúrico al 72%. Transfiera el SRS a un tubo de presión y la tapa
firmemente.

1.7.1 No se requiere un SRS nuevo para cada análisis. Se puede producir una gran
cantidad de patrones de recuperación de azúcar, se filtran a través de filtros
de 0.2 μm, se dispensan en alícuotas de 10.0 mL en recipientes sellados y se
etiquetan. Pueden almacenarse en un congelador y retirarse cuando sea
necesario. Descongele y vórtice el SRS congelado antes de usarlo. Si se usan
SRS congelados, se añade la cantidad apropiada de ácido a la muestra
descongelada y se agita en vórtice antes de transferirla a un tubo de presión.

1.8 Colocar los tubos de ensaye en la autoclave. Autoclave las muestras selladas y las
normas de recuperación de azúcar durante una hora a 121 °C. Después de completar
el ciclo de autoclave, deje que los hidrolizados se enfríen lentamente a temperatura
ambiente cercana antes de retirar las tapas. (Si no se lleva a cabo la etapa 2.1 extraiga
una alícuota de 10 mL del licor para usar en la etapa 5)

2 Analizar la muestra para la lignina insoluble en ácido.

2.1 Filtrar en vacío la solución de hidrolizadadespués de terminado el ciclo en la


autoclave a través de crisoles filtrantes previamente pesados. Capture el filtrado en
un matraz filtrante.

2.2 Transferir una alícuota, aproximadamente 50 ml, en una botella de almacenamiento


de muestras. Esta muestra se usará para determinar lignina soluble en ácido así como
carbohidratos. La determinación de lignina soluble en ácido debe realizarse dentro de

78
las 6 h siguientes a la hidrólisis. Si el licor de hidrólisis debe almacenarse, se debe
almacenar en un máximo de dos semanas. Es importante recoger la alícuota de licor
antes de continuar con el paso 2.3.

2.3 Utilizar agua destilada para transferir cuantitativamente todos los sólidos restantes
del tubo de ensaye al crisol filtrante. Enjuague los sólidos con un mínimo de 50 ml
de agua destilada. Se puede usar agua destilada caliente en lugar de agua a
temperatura ambiente para disminuir el tiempo de filtración.

2.4 Secar el crisol y el residuo insoluble en ácido a 105 ± 3 °C en a estufa hasta que se
consiga un peso constante, usualmente un mínimo de cuatro horas.

2.5 Retirar las muestras de la estufa y enfriar en un desecador durante una hora. Registrar
el peso del crisol y el residuo seco a 0.1 mg.

2.6 Colocar los crisoles y el residuo en el horno de mufla a 575 ± 25 ° C durante 2h.
Esperar un tiempo específico, alrededor de 6 h, a que baje la temperatura hasta 100°
C

2.7 Retirar cuidadosamente el crisol del horno directamente en un desecador y enfríelo


durante un tiempo de 30 min. Pesar los crisoles y la ceniza a 0.1 mg más cercano y
registrar el peso. Coloque los crisoles de nuevo en el horno y la ceniza a un peso
constante.

3 Analizar la muestra para la lignina soluble en ácido como sigue.

3.1 En un espectrofotómetro UV-Visible, ejecutar un fondo de agua destilada o ácido


sulfúrico al 4%.

3.2 Usando la alícuota de licor de hidrólisis obtenida en la etapa 2.2, mida la absorbancia
de la muestra a una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro UV-Visible.
Consulte la Tabla B1.1para conocer los valores de longitud de onda sugeridos.

79
Tabla B1 Longitudes de onda sugerida para el espectro UV
Tipo de Biomasa Lambda Max Absortividad a Longitud de Absortividad a
(nm) Lambda máx. onda longitud de onda
(L / g cm) recomendada recomendada
(nm) (nm)
Pinus Radiata - NIST 198 25 240 12
SRM 8493
Bagasse- 198 40 240 25
NIST SRM 8491
CornStover- NREL
fuente de alimentación 198 55 320 30
suministrada
Populus deltoides- 197 60 240 25
NIST SRM 8492

Diluir la muestra según sea necesario para llevar la absorbancia al rango de 0.7-1.0,
registrando la dilución. Se puede usar agua destilada o ácido sulfúrico al 4% para
diluir la muestra, pero el mismo disolvente debe usarse como blanco. Registre la
absorbancia a tres decimales. La reproducibilidad debe ser de ± 0.05 unidades de
absorbancia. Analizar cada muestra por duplicado, como mínimo. (Este paso debe
realizarse dentro de las seis horas siguientes a la hidrólisis.)

3.3 Calcule el peso en seco del horno (ODW) de la muestra libre de extractivos, usando
el contenido promedio de sólidos totales.

𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑖𝑟𝑒 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝑋 % 𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠


𝑂𝐷𝑊 = (B.1.1)
100

3.4 Calcular la cantidad de lignina soluble en ácido presente en la muestra mediante el


cálculo con la ecuación B.1.2

(B.1.2)

Dónde: UVabs es la absorbancia UV-Vis promedio para la muestra en la longitud de onda


apropiada (ver Tabla B2)

Líquido de hidrólisis en volumen = volumen de filtrado (86.73 ml)

80
(B.1.3)

Donde: ε es la Absortividad de la biomasa a una longitud de onda específica (ver tabla B1),
la Muestrade ODW es el peso de la muestra (mg) y Pathlength es la trayectoria de la celda
UV-Vis (Ancho de la celda en cm)

4 Analizar la muestra para los carbohidratos estructurales.

4.1 Preparar una serie de normas de calibración que contengan los compuestos que se van
a cuantificar, haciendo referencia a la Tabla B.2 para el rango de concentración
sugerido. Utilice un punto de cuatro calibraciones. Si los estándares se preparan fuera
de los rangos sugeridos, el nuevo rango para estas curvas de calibración debe ser
validado.

Tabla B.2 Intervalos de concentración sugeridos para normas de calibración

Componente Rango de concentración sugerido (mg / ml)


D-celobiosa 0.1-4.0
D(+)glucosa 0.1-4.0
D(+)xilosa 0.1-4.0
D(+)galactosa 0.1-4.0
L(+)arabinosa 0.1-4.0
D(+)manosa 0.1-4.0
Medio del rango lineal, la concentración no
CVS es igual a un punto de calibración (se
sugiere 2.5)

4.2 Preparar un estándar independiente de verificación de calibración (CVS) para cada


conjunto de normas de calibración. Utilice reactivos de una fuente o lote distintos de
los utilizados en la preparación de los estándares de calibración. Prepare el CVS a
una concentración que caiga en medio del rango validado de la curva de calibración.
El CVS debe analizarse en la HPLC después de cada conjunto de calibración ya
intervalos regulares a lo largo de la secuencia, agrupando grupos de muestras. El CVS

81
se utiliza para verificar la calidad y la estabilidad de la (s) curva (s) de calibración a
lo largo de la ejecución.

4.3 Usando el licor de hidrólisis obtenido en la etapa 2.2, transfiera una alícuota de
aproximadamente 20 ml de cada licor a un matraz Erlenmeyer de 50 ml.

4.4 Utilizar carbonato de calcio para neutralizar cada muestra a pH 5-6. Evite neutralizar
a un pH mayor que 6 monitorizando con papel pH. Añadir el carbonato de calcio
lentamente después de alcanzar un pH de 4. Remueva la muestra con frecuencia.
Después de alcanzar el pH 5-6, detener la adición de carbonato cálcico, dejar reposar
la muestra y decantar el sobrenadante. El pH del líquido después de la sedimentación
será aproximadamente 7. (Nunca se debe permitir que las muestras excedan un pH de
9, ya que esto dará como resultado una pérdida de azúcares).

4.5 Preparar la muestra para el análisis de HPLC pasando el líquido decantado a través
de un filtro de 0.2 μm a un vial de muestreo automático. Sellar y etiquetar el vial.
Prepare cada muestra por duplicado, reservando uno de los duplicados para su análisis
posterior si es necesario. Si es necesario, las muestras neutralizadas se pueden
almacenar en el refrigerador durante tres o cuatro días. Después de este tiempo, las
muestras deben considerarse comprometidas debido al potencial crecimiento
microbiano. Después del almacenamiento en frío, verificar las muestras de la
presencia de un precipitado. Las muestras que contengan un precipitado deben ser
filtradas de nuevo, mientras estén frías, a través de un filtro de 0.2 μm.

4.6 Analizar los patrones de calibración, CVS y muestras por HPLC usando una columna
de azúcar Shodex SP0810 o BioradAminex HPX-87P equipada con la columna de
protección apropiada.

Condiciones de HPLC:

 Volumen de inyección: 10-50 μL, dependiendo de la concentración y los límites


del detector
 Fase móvil: Agua de grado HPLC, 0.2 μm filtrada ydesgasificada
 Caudal: 0.6 ml/min

82
 Temperatura de la columna: 80-85 ° C
 Temperatura del detector: lo más cerca posible de la temperatura de la columna
 Detector: índice de refracción
 Tiempo de ejecución: 35 min

4.7 Compruebe los cromatogramas de la muestra de ensayo respecto a la presencia de


celobiosa y azúcares oligoméricos. Los niveles de celobiosa mayores de 3 mg/ml
indican hidrólisis incompleta. Las muestras frescas deben ser hidrolizadas y
analizadas

4.8 .Verificar los cromatogramas de la muestra de ensayo con respecto a la presencia de


picos eluyendo antes de celobiosa (tiempo de retención de 4-5 min usando las
condiciones recomendadas). Estos picos pueden indicar altos niveles de productos de
degradación del azúcar en la muestra anterior, lo que es indicativo de una hidrólisis
excesiva. Todas las muestras de los lotes que muestren evidencia de hiperhidrólisis
deben tener muestras frescas hidrolizadas y analizadas.

5 Analizar la muestra con respecto al contenido de acetilo, si es necesario.

5.1 Preparar ácido sulfúrico 0.005 M (0.01 N) para su uso como fase móvil de HPLC. En
un matraz aforado de 2 l, añadir 2.00 ml de ácido sulfúrico normalizado 10 N y llevar
al volumen con agua de grado HPLC. Filtrar a través de un filtro de 0.2 μm y
desgasear antes de usar. Si no se dispone de ácido sulfúrico 10N, también se puede
usar ácido sulfúrico concentrado. 278 \ mu l de ácido sulfúrico concentrado llevado
al volumen en un matraz aforado de 1 L con agua de grado HPLC también producirán
ácido sulfúrico 0.005 M.

83
Anexo C
Determinación de azúcares Reductores Libres por el método DNS (Miller, 1959).

Reactivo Utilizados: g/L


a) Hidróxido de Sodio 10
b) Acido, 3.5 dinitrosalisílico (DNS) 10
c) Tartrato de sodio y potasio 200
d) Fenol 2
e) Metabisulfito de sodio 0.5

Preparación de la solución de DNS:


Disolver los reactivos en aproximadamente 600 ml. de agua destilada dejando al último el
ácido 3,5 dinitrosalisílico, el cual se debe ir adicionando poco a poco hasta lograrse su
completa disolución, posteriormente aforar a 1 litro con agua destilada.

Procedimiento:
Adicionar en tubos de ensayo 0.5 ml de muestra, añadirle 1.5 ml de solución DNS, agitar,
colocar los tubos de ensaye en baño de agua a punto de ebullición durante 15 min. Enfriar a
temperatura ambiente, agregar 8 ml de agua destilada y agitar. Leer la absorbancia a 550 nm.

84
Anexo D
Determinación de etanol por el método de Dicromato de Potasio.
(Bohringer y Jakob, 1964).

Reactivos utilizados: g/l


a) Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) 33.77
b) Ácido Sulfúrico (H2SO4) 325.00

Preparación de la solución de Dicromato de potasio:


Se diluye el ácido sulfúrico en aproximadamente 400 ml de agua destilada, se deja enfriar y
se agrega el Dicromato diluido en aproximadamente 200 ml de agua destilada; por último se
afora a 1 litro con agua destilada.
Procedimiento:
A 1 ml. de muestra se agregan 2 ml. de solución de Dicromato de potasio, agitar y dejar
reposar durante 10 min. ; Posteriormente agregar 5 ml. de agua destilada, agitar nuevamente
y leer la absorbancia a 585 nm.

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