Polipéptidos y proteínas con influencia en la calidad

de la espuma de la cerveza y métodos analíticos

utilizados en su estudio

Filipe Silva I ; Isabel Ferreira MPLVO II * ; Natércia Teixeira III

I
Servicio de Bioquímica / REQUI M TE - Servicio de Ciencia de los Alimentos, Facultad de Farmacia,
Universidad de Oporto, R. Aníbal Cunha, 164, 4099-030 Oporto - Portugal
II
REQUI M TE - Servicio de Ciencia de los Alimentos, Facultad de Farmacia, Universidad de Oporto R.
Aníbal Cunha, 164, 4099-030 Oporto - Portugal
III
IBMC, R. Campo Alegre, 823, 4150-180 Oporto - Portugal, Servicio de Bioquímica, Facultad de
Farmacia, Universidad de Oporto, R. Aníbal Cunha, 164, 4099-030 Oporto - Portugal

ABSTRACT

La revisión de los polipropéptidos y la proteína que influye, directa o indirectamente, la calidad de la

espuma de color, así como los criterios de análisis utilizados en sus estudios, se presentan. Protein Z,
LTP1 y hordein / glutelin fragmentos originados desde malt tienen una influencia directa sobre la
espuma de cerveza. La otra proteína, como malt hordeas y albinas y trigo puroindolines, are, to
some degree, también importante para la cerveza de color de calidad. Protein hydrophobicity está
atenuado a los parámetros de parámetro para mejorar la calidad de la espuma. Los electrophoretic,
los métodos de análisis y los métodos de análisis de anticuerpos se utilizan actualmente para el
estudio de los péptidos y la proteína presente en barley, malt, wort, cerveza, y espuma. Los mejores
resultados se obtienen cuando se aplican las combinaciones de estos métodos.

Palabras clave: cerveza; los polípeptides y la proteína; métodos analíticos.

INTRODUCCIÓN
Una de las primeras características utilizadas en la evaluación de una cerveza es la calidad de su
espuma. Por su capacidad de influir en la decisión de compra de los consumidores es un factor muy
importante para la industria cervecera.

La forma en que una cerveza es dispensada tiene gran influencia en la formación de espuma. El
mantenimiento de la espuma formada, sin embargo, depende esencialmente de la presencia de
espuma agentes y agentes promotores con ningún efecto perjudicial para el mismo uno .

Las proteínas procedentes de la cebada son el principal constituyente capaz de estabilizar la espuma
de la cerveza su 1 . Sus niveles en la cerveza son una indicación de la calidad de la espuma 2 y
depende del tipo de cebada utilizada 3 , la región y el país en el que se produjo 4 .

La cerveza tiene una concentración peptídica de aproximadamente 500 mg / L. Mientras que

algunos de los polipéptidos y proteínas, de masas moleculares comprendidas entre 10 y 40 kDa, no
presentan ninguna función en la cerveza (excepto en la contribución nutricional y en el flavour),
otras son responsables de la formación de turbidez coloidal y otras (alrededor de 25%) que
participan en espuma proceso de estabilización 5 .

Los compuestos nitrogenados existentes en la cerveza, resultantes de la degradación de las

proteínas que se produce durante las fases de malta y producción, son comúnmente denominados
polipéptidos, restringiendo el término proteína a las moléculas que permanecen intactas. Por lo
tanto, muchos investigadores han identificado propiedades de polipéptidos y proteínas que tienen
un impacto en la formación y estabilidad de espuma de la cerveza 6-9 . Estos compuestos presentan
diferentes pesos moleculares e hidrofobicidad. Se acepta en general que cuanto mayor es la
hidrofobicidad es, la mayor estabilidad que dan la espuma 1,10,11. Sin embargo, las propiedades de
estas moléculas que juegan un papel en la espuma de la cerveza y que establecen interacciones con
otros compuestos, especialmente los derivados de lúpulo iso-a-ácidos, son todavía temas
controvertidos 11-14 .

Varios métodos analíticos se utilizan en el estudio de los polipéptidos y de las proteínas con
influencia en la calidad de la espuma de la cerveza. Los más utilizados, y que presentan mayores
potencialidades, son los electroforéticos, cromatográficos e inmunológicos.

En este trabajo de revisión se abordarán los polipéptidos y las proteínas con influencia en la calidad
de la espuma de la cerveza y luego los métodos analíticos que se han utilizado en su estudio.

POLIPEPTIDOS Y PROTEÍNAS CON INFLUENCIA EN LA CALIDAD DE LA ESPUMA DE LA CERVEZA

Los polipéptidos y proteínas que influyen en la calidad de la espuma de la cerveza tienen diferentes
orígenes, características y efectos sobre la espuma, que se resumen en la Tabla 1 .

Proteína Z
La forma de la proteína Z presente en la cerveza (también llamado antígeno 1) se origina a partir de
proteína de cebada Z 15 , que es una albúmina 16,17 que puede estar presente en dos isoformas:
proteína y proteína Z7 Z4 18 . En la cebada y la malta proteína Z4 es el más abundante (80%) 18 .

El peso molecular de la proteína Z es de aproximadamente 40 000 5,15,16,19 . Esta está formada por
dos proteínas genéticamente diferentes (conocidas por antígeno 1a y antígeno 1b),
inmunológicamente relacionadas, separables por SDS-PAGE. Las dos formas presentes en la cerveza
derivada de dos de albúmina de cebada endospermo (proteína Z7 Z4 y proteína) 19 .

Mientras que un antígeno tiene un punto isoeléctrico de 5.1 a 5.4 15 la proteína purificada Z, que lo
originó, tiene un punto isoeléctrico de 5.5 a 5.8 20 . Esta diferencia puede ser debida a la glicosilación
de los residuos de lisina en antígeno 1 y el contenido de aminoácidos inferior en este
(aproximadamente 16% menos) 15 . proteína Z es una glicoproteína de 21 que contiene hexosas y
pentosas 5 .

proteína Z se mantiene prácticamente sin cambios a lo largo del proceso de producción de

cerveza 17,22,23 . Es termoestable 19 y resistente a la proteolisis 24 debido a sus propiedades
inhibidoras de las proteasas 2 .

La proteína Z tiene una influencia sobre la espuma de la cerveza y la nubosidad 15,19 . Está presente
en la cerveza en una concentración de aproximadamente 20 a 170 mg / l 19,23 . Según Yokoi et al 22 ,
la proteína Z es ventajoso para la estabilidad de la espuma de cerveza, debido a su alta
hidrofobicidad, su punto isoeléctrico cerca del pH de la cerveza y a su actividad superficial
viscométrica peculiar.

Varios investigadores sugirieron que la proteína Z funcionó como estabilizador de

espuma 11,16,22,25 . Sin embargo, otros investigadores utilizando las cervezas después de la
eliminación de la proteína Z 26,27 o espuma cervezas producidas a partir de malta pobre en proteínas
Z4 17 , no observaron una pérdida significativa de la estabilidad de los respectivos espumas. Para
Leiper et al 5 , la proteína Z no muestra ningún papel directo en la formación de espuma puede, sin
embargo, desempeñar un papel en la estabilización de la misma, después de que se ha formado.

Por otra parte, Evans et al 2,18 informaron que sólo el componente de la proteína Z Z4, forma
dominante de esta proteína 17 está asociado con la estabilidad de la espuma, no teniendo, sin
embargo, cualquier relación entre dicho componente y Z7 estabilidad.

LTP1

El "Protein Lipid Transfer 1" (LTP1) derivado de la LTP1 cerveza a partir de cebada, que es una
albúmina 24existente en los granos de aleurona de dicho cereal de 5,28 . Esta proteína fue
inicialmente denominada "Probable Amylasa / Proteasa Inhibitor" (PAPI), ya que se verificó que era
homóloga de los inhibidores de la amilasa y de la proteasa. Más tarde, para demostrar que era
homólogo a "Las proteínas de transferencia de lípidos" (LTP), que llegó a ser conocido como la
PTL1 5 .
El peso molecular de LTP1 se refiere a menudo como siendo aproximadamente 9.700 5,11,24,27,29,30 . Es
una proteína básica 31 que consiste en 91 aminoácidos 5.28 , con un punto isoeléctrico de 9 24,28 .

En cuanto a su configuración, el LTP1 cebada se compone de cuatro segmentos en la hélice 29 ,

estabilizado por cuatro puentes disulfuro intramoleculares 29,31 y una larga, flexible segmento C-
terminal 29 . La forma de la espuma LTP1 encontró contiene ocho residuos de cisteína, lo que
probablemente estará presente como cistina (forma oxidada) en la cerveza 11 y cuatro residuos de
lisina, que son sitios potenciales de glicosilación 24 .

El PTL1 está glicosilada, probablemente debido a las reacciones de Maillard, lo que podría explicar
su resistencia a muchas enzimas, que entran en contacto con él durante el procesamiento de la
cerveza 24 . Mientras que algunos investigadores sugieren que PTL1 de la cebada de malta inhibe
algunos endoproteasas cisteína 30 , otros refutan esta hipótesis 32 .

El LTP1 muestra una alta estabilidad con respecto al calor y proteasas 28 . De acuerdo a Lusk y
colaboradores 11 , los cuatro puentes disulfuro PTL1 probablemente protejan esta proteína durante
las etapas del malteado y la producción de cerveza. Sin embargo, et al Jégou 24 concluyen que LTP1
experimenta notables modificaciones químicas tales como la reducción de los puentes disulfuro,
hidrólisis y reacciones de Maillard. Se propuso además que los cambios sufridos por LTP1 durante el
procesamiento de la cerveza, inducen un mayor potencial de formación de espuma 16 .

Más recientemente, se confirmó la existencia de dos formas de la LTP1 cebada: la LTP1 con peso
molecular de 9.689, y LTP1b con peso molecular 9.983 5,24 . Ambas formas se modifican durante el
procesamiento de la cerveza, o por reducción de enlaces disulfuro, glicosilación o por 24 .

Lusk et al 33 informaron de que LTP1 pierde su estructura la hélice durante la etapa de ebullición del
mosto y se oxida su único residuo de metionina. Estos autores atribuyeron a esta forma de LTP1,
presente en la espuma, la designación de fLTP1.

La LTP1 de la cebada pertenece a una extensa familia de proteínas de las plantas, denominadas
"non-specific Lipid Transfer Proteins" (nsLTP). La función in vivo de estas proteínas es
desconocida. Sin embargo, se ha sugerido que están involucrados en respuestas a situaciones de
estrés, tales como exposición a agentes patógenos, ausencia de agua, temperatura muy elevada o
muy baja y presencia de sales. Se propuso además que los monómeros actúan como soportes para
la síntesis de la cutina 28 .

Las referencias a un segundo no - LTP específica (la LTP2) con 7 kDa 31 no está hecho, sin embargo,
cualquier referencia a un posible papel en la espuma de la cerveza.

Mientras que algunos investigadores sugieren que LTP1 está implicado en la estabilidad de espuma
de 5,11 , otros proponen que esto no funciona como un estabilizador, sino como la formación de
espuma promotor 16 . A su vez, Evans y colegas 2 demostraron que LTP1 no está relacionado con la
estabilidad de la espuma.
Sørensen et al 16 mostraron que una fracción de proteína de cerveza que contiene Z, pero no LTP1,
no producir espuma. Sin embargo, cuando esta fracción se añadía a otra, que contenía LTP1, la
estabilidad de la espuma de esta era mejorada.

Hordeas

Las hordeínas son proteínas (prolaminas) de almacenamiento, existentes en los granos de cebada,
representando cerca del 40% de la cantidad total de proteína encontrada en el grano. Por lo general,
se dividen en hordeínas A (<20 kDa), B (30-45 kDa) C (45-75 kDa) y D (100 kDa) 34.35 . Las hordeínas A
no se consideran verdaderas proteínas de almacenamiento. Algunos autores han informado de la
existencia de hordeínas g 35 , haciendo, sin embargo, ninguna referencia a su peso molecular. Las
fracciones B y C representan el 70-80% y 10-12% del contenido total de hordeínas, respectivamente,
mientras que las hordeínas D y g son fracciones minoritarias 35 .

Howard et al 36 recomiendan el uso de cuantificación de D hordeína, como un método alternativo

para la cuantificación de la proteína total en la determinación de la calidad de diferentes variedades
de malteado de cebada.

La extracción de las hordeas de la cebada se efectúa utilizando mezclas de alcohol y agua o

soluciones de detergentes. Estas proteínas presentan, en el estado nativo, una capacidad de
estabilización de espuma de cerveza inferior a la presentada por las albúminas. Se sabe que su
tratamiento con ácido no afecta la capacidad de estabilización de la espuma. Por su parte, el
tratamiento térmico aumenta ligeramente dicha estabilización. La desnaturalización de hordeínas
conduce a un aumento de su hidrofobicidad, una característica importante para la estabilización de
la espuma 37 .

Las cisteína-proteasas hidrolizan la fracción proteica de las hordeínas. Una proteolisis limitada de
estas proteínas, realizada por estas enzimas, lleva a un aumento sustancial de sus capacidades
estabilizadoras de espuma. Sin embargo, la acción de la proteinasa (levadura proteinasa) resulta en
disminución de la capacidad dijo equilibrador 37 .

Fragmentos de hordeas y glutelinas

Varios autores sugieren que los polipéptidos derivados de la fragmentación de hordeas y glutelinas
tienen influencia en la espuma de la cerveza.

Sørensen et al 16 sugirieron que algunos fragmentos hordeínas y glutelinas, así como estabilizantes,
funcionan como promotores de formación de espuma. fragmentos Más recientemente han descrito
rica en cisteína de hordeína, que se procesan en los desarrolladores de espuma durante las etapas
de maceración y la cocción del mosto 27 y otra rica en prolina, con alrededor de 15 a 32 kD, que está
implicado en la formación turbidez en la cerveza 5 .

Sheehan y Skerritt 38 informaron, además, que ciertos polipéptidos derivados de hordeínas son
sensibles a las proteasas y las condiciones se ven significativamente afectados por la fase de
maceración. Por otro lado, parece existir, además, una acumulación de polipéptidos, con pesos
moleculares entre 8000 y 18000, en la espuma de la cerveza, en el curso del envejecimiento de la
misma, influenciando positivamente las propiedades visco-elásticas de películas proteicas
compuestos por proteína Z 25 .

Albuminas

Las albúminas de la cebada se extraen en solución acuosa y presentan en su estado nativo una
capacidad estabilizadora de espuma ligeramente superior a la de las hordeas. Esta diferencia se
vuelve aún más pronunciada después de la desnaturalización, especialmente si esta es inducida por
el calor. La desnaturalización de la albúmina conduce también a un aumento de la hidrofobicidad 37 .

La capacidad superior de estabilización de espuma de las albúminas, en relación a las hordeas,

refleja probablemente la mayor elasticidad superficial de sus moléculas. Esta capacidad se aumenta
en la presencia de ácidos amarrar derivados del lúpulo. Cuando se somete a proteolisis por tripsina y
proteinasa A, albúmina fracción de proteína pierde su estabilización de la espuma capacidad, a la
intemperie, sin embargo, la digestión realizada por cisteína proteasas 37 .

Se ha observado por varios autores que la estabilidad de la espuma depende no sólo de la capacidad
individual de proteínas y polipéptidos a dicha estabilización, pero también en las proporciones
relativas de la albúmina y hordeínas 39 .

Puroindolinas

Las puraindolinas existentes en la cerveza son proteínas procedentes del trigo (utilizado en la
producción de algunos tipos de cerveza) y tienen la capacidad de conectarse a los lípidos. La adición
de tales proteínas exógenas, cerveza, atenúa los efectos negativos de los lípidos en la misma
espuma 40 .

Se cree que las puroindolinas trigo se unen a lípidos libres, evitando así que la desestabilización de la
espuma 40,41. Sin embargo, la información disponible sobre este grupo de proteínas es reducida.

Métodos analíticos utilizados en el estudio de los polipéptidos y de las proteínas con influencia en
la calidad de la espuma de la cerveza

Métodos electroforéticos

Los métodos electroforéticos se han utilizado en el estudio de los polipéptidos y de las proteínas
que, directa o indirectamente, están relacionados con la calidad de la espuma de la cerveza.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) se aplicó por varios
investigadores en el estudio de hordeínas de muestras de cebada y de malta con el fin de identificar
diferentes cultivares y determinar la calidad de malteado 35,36, 42-44 . En este tipo de muestras, SDS-
PAGE se puede utilizar además para confirmar la ausencia de proteínas específicas en determinadas
variedades 17 . Kapp y Bamforth 37 utilizado este método electroforético para evaluar el impacto de
la proteolisis controlada, elegido para simular los efectos de malteado y fabricación de cerveza,
albúminas y hordeínas aisladas en cebada.

Una vez que las proteínas de SDS-PAGE separados según su peso molecular se utiliza a menudo en la
caracterización de proteínas de cerveza y polipéptidos 5,19,38,41,45,46 y espuma 5,11,25,27, 29 , así como sus
precursores de cebada y de malta 34 . La caracterización de biomoléculas también puede
complementarse mediante la determinación de los puntos isoeléctricos utilizando enfoque
isoeléctrico (IEF) 21,22,47 .

electroforesis bidimensional (2D-PAGE), a su vez, es una metodología que combina las ventajas de la
IEF SDS-PAGE y también se utiliza en la purificación, identificación y caracterización de la proteína Z
y LTP1 19,30 . El 2D-página también se utilizó en el estudio de la proteómica de diferentes maltas de
cebada y para determinar su calidad , el malteado 48 .

La electroforesis capilar también se ha aplicado en el estudio de las proteínas de la cerveza. Esta

metodología ha sido utilizada por Lusk y co - trabajadores 33 con el fin de determinar los cambios
sufridos por el LTP1 y la proteína Z a lo largo del proceso de producción de cerveza ( Tabla 2 ).

Métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos se utilizan a menudo separación, aislamiento o purificación de

polipéptidos y proteínas de la cebada y la cerveza. Esta separación puede lograrse mediante
diferentes tipos de cromatografía: interacción hidrófoba (HIC) 17,22,23,41,45,49 , filtración en
gel 15,16,21,24,30,33,46,47,50 , intercambio iónico 11,15,16,22,24,29,30 y afinidad, utilizando diferentes ligandos
como son los ejemplos concanavaliva 47,51 o anticuerpos específicos para ciertas proteínas 26,27 .

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una evolución de los métodos cromatográficos
más tradicionales y se ha aplicado con beneficios incuestionables. método de HPLC en fase inversa
(RP-HPLC) se ha utilizado para estudiar la composición de los diferentes hordeínas en cultivares de
cebada 34 y la separación de las proteínas de espuma de la cerveza 11 . Algunos investigadores
aplicaron esta metodología tanto en la purificación de la forma de LTP1 cebada 24,30 como la forma
existente en la cerveza 24 . La HPLC de filtración en gel, a su vez, se utiliza tanto en la purificación de
la proteína Z 26,33 como en la purificación de LTP1 cerveza 30 ( Tabla 3).

Métodos inmunológicos

El método ELISA ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") es quizás el método inmunológico más

utilizado en el estudio de los polipéptidos y de las proteínas relacionadas con la calidad de la
espuma de la cerveza. Este método se ha utilizado para cuantificar el nivel de espuma - la promoción
de proteínas (proteína Z4, Z7 proteína y / o LTP1) 2,4,17,18,26,29,52,53 , proteínas implicadas en el proceso
de la turbidez de la cerveza 4,52 y específicos polipéptidos, tales como reportado por Vaag et al 27 con
un peso molecular de 17000. el método ELISA también se utilizó para probar la capacidad de otras
pruebas inmunoquímicas utilizados en el estudio de estos polipéptidos 54y caracterización de
anticuerpos para la unión a las fracciones de proteínas específicas 45 . Onishi et al 53 informaron de
que el alginato de propilenglicol (aditivo utilizado para mejorar la estabilidad de la espuma), que a
veces se utiliza durante la producción de cerveza, puede interferir en la unión de anticuerpos
monoclonales frente a ciertas proteínas.

Otro sistema inmune ampliamente utilizado es la "transferencia de western", que ha sido aplicado al
estudio de proteínas en espuma de la cerveza 55,56 , proteína Z de la cerveza y sus precursores
cebada 17,19 y también el LTP1 16,29 . Mills y co - trabajadores 45 han utilizado este método para probar
la eficacia de un panel de 15 anticuerpos monoclonales específicos para una fracción de proteína de
la cerveza.

A su vez, la inmunoelectroforesis, que es un método que combina las ventajas de las técnicas
inmunológicas con el electroforética fue utilizado por Asano y Hashimoto 47 para aclarar el origen de
las proteínas de cerveza relacionados con una espuma. Hejgaard y Kaersgaard 15 , en el otro lado,
han optado por la utilización de cohete inmuno, que es una de las variantes de los métodos de
imunoelectroforéticos, la cuantificación de la proteína Z (1 antígeno) presente en la cerveza y
Hollemans y Tonies 26 implementarse que, también en la evaluación de la eficacia de un método de
remoción de la misma proteína Z de la espuma de la cerveza. La inmunoelectroforesis cruzada, otra
de las variantes de los métodos inmunoelectroforéticos, fue utilizada por Sørensen y
colaboradores16, la detección de la proteína Z (Tabla 4).

Cuadro 4

CONCLUSIONES

La proteína Z, la LTP1 y algunos fragmentos de hordeas y glutelinas son los compuestos más
estudiados y considerados más importantes para la calidad de la espuma de la cerveza. De este
modo, se justifica la mayor cantidad de información disponible relativa a estos compuestos, en
comparación con la obtenida sobre los otros grupos de proteínas y polipéptidos de la cerveza. Sin
embargo, algunas proteínas, como las hordeas y las albúminas de la malta y las puraindolinas del
trigo, también se mencionan como teniendo alguna influencia en la referida espuma.

Según algunos autores, mayor es la hidrofobicidad de la proteína, la mayor es su actividad de

promotor de espuma 1,10,11 , que es consistente con los estudios realizados por nuestro grupo de
investigación 13 , en el que se encontró que los altos niveles de polipéptidos hidrofóbicos tienen una
influencia positiva en la estabilidad de la espuma. Sin embargo, se verificó también que la presencia
de niveles mínimos de iso a ácidos es imprescindible para obtener una espuma estable.

Los métodos electroforéticos, cromatográficos e inmunológicos se han utilizado en el estudio de los

polipéptidos y de las proteínas que influyen en la calidad de la espuma de la cerveza en muestras de
cebada, malta, mosto, cerveza y espuma. La elección de cualquiera de los métodos presentados
depende siempre del objetivo del estudio, utilizando generalmente una combinación de varios
métodos.

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