UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTAD DE INGENIERÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

Observación de la influencia de la luz UV en el fenotipo de E.coli y reparación del ADN mediante el mecanismo
de fotorreactivación.
Ivonne Lorena Ramirez Parra Fecha de la práctica: 15 de Agosto del 2018
Maria Alejandra Franco Ospina Fecha de entrega : 30 de Agosto del 2018

1. Introducción

En general el ambiente de los seres humanos se encuentra rodeado de gran variedad de bacterias y a su vez
dentro de su mismo cuerpo, el ejemplo claro de una de ellas es la bacteria E. coli la cual normalmente se
encuentra en gran variedad de alimentos como las carnes y/o vegetales que se consumen a diario por el ser
humano, por tal razón esta bacteria también se puede encontrar en los intestinos, esta puede llegar a tener efectos
como positivos o como negativos para el ser humano debido a que está en su gran mayoría cumple la función de
ayudar al cuerpo a descomponer y a digerir los alimentos, sin embargo ciertos tipos de E.coli pueden salir de los
intestinos y llegar a la sangre lo cual puede causar enfermedades, es de gran importancia aclarar que esta es una
de las bacterias que más se utiliza en procesos biológicos y prácticamente todos los procesos de Ingeniería
Genética pasan por alguna etapa en la que interviene E. coli.

Por ello con el paso de los años la luz UV ha sido ampliamente utilizada como una alternativa de la esterilización
química y la reducción de los organismos vegetativos en productos alimenticios (Laminkanra, 2005), y con el
paso del tiempo se ha identificado que esta presenta ciertos mecanismos de inactivación que realizan las
transformación fotoquímica de bases nitrogenada como las pirimidinas en el ADN de las bacterias, virus y otros
patógenos para formar dímeros, y de esta forma suprimen su capacidad de reproducción y por consiguiente de
generar enfermedades, esto debido a que los microorganismo son inactivados por la irradiación con luz UV
como resultado del daño fotoquímico a sus ácidos nucleicos lo cual lleva a la formación de dímeros los cuales si
llegan a ser bastantes dentro del microorganismos impide que se replique su ADN y ARN, impidiendo así su
reproducción y provocando además un efecto letal sobre las células (Simopoulos, 1995).

Estos fotoproductos dado por la radiación UV (longitud de onda entre 250 y 320 nm) ocasionan alteraciones
químicas en las bases del ADN en la inhibición de replicacion y transcripcion por ellos se busca y es necesario la
inversión de los efectos mutagénicos mediante el proceso de fotorreactivación (Figura 1) , donde se lleva a cabo
la catalización con una fotoliasa que posee dos cromóforos que captan un fotón, siendo energía utilizada para
poder revertir el dímero quebrando el enlace covalente entre las pirimidinas reparando el daño en el ADN. Estas
fotoliasas se han hallado en bacterias, hongos, plantas y vertebrados (Cardona, Y. 2014).
 Figura 1​. Mecanismo de reparación directa del ADN por fotorreactivación (Cardona, Y. 2014)

Por otra parte, también se pueden presentar otros modos de reparación directa de ADN como lo es la alquil
transferencia donde se insertan compuestos electrofílicos altamente reactivos con afinidad por centros
nucleofílicos en macromoléculas orgánicas al ADN o la desmetilación oxidativa como por ejemplo en el estudio
dado para el E.coli específicamente en la proteína AlkB, donde es la encargada de desmetilar oxidativamente las
bases lesionadas revertiendolas y liberando el grupo metilo en formaldehído (Cardona, Y. 2014).

2. Objetivos

Objetivo General
Identificar el comportamiento del sistema fotoliasa en E.coli cuando este se encuentra en exposición de
radiación U.V y la luz visible, determinando la tasa de mutación de este con respecto a su sensibilidad con la
penicilina y la enzima 𝜷-galactosidasa

Objetivos específicos

● Evaluar la tasa de mutación de E.coli en agar LB y MacConkey con el fin de identificar las principales
anomalías que originen cada uno de estos medios de cultivo y denotar que diferencias entre ellos se
pueden presentar
● Diferenciar el comportamiento de la luz UV y la luz visible con respecto a su función de restaurador
● Identificar como la sensibilidad de E.coli con respecto a la penicilina y a la enzima 𝜷-galactosidasa,
puede llegara influenciar los factores de mutación en la bacteria
 3. Diagrama de flujo de la práctica

Figura 2. ​Metodología trabajada experimentalmente en la práctica

4.Resultados y discusión

El crecimiento de microorganismos bacterianos no se puede estudiar individualmente debido a su diminuto

tamaño con respecto a lo posible que se puede observar por el ser humano por lo tanto es necesario recurrir a
medios nutritivos artificiales donde se desarrollan y se producen grandes poblaciones con medios ricos en
proteínas ya sean en medio líquido o sólido con adiciones de agar como se evidencia en el caso de este
experimento donde se proporciona un medio de LB proporcionando los nutrientes necesarios para el desarrollo
óptimo.
La determinación de la tasa de mutación de E.coli se ve influenciado desde sus inicios de incubación y
crecimiento previo del cultivo en el medio de LB, por ejemplo se puede ver influenciado por diferentes factores
físicos y químicos debido a en algunos casos ya que la temperatura puede influenciar la reducción de la
velocidad de las reacciones bioquímicas y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan
de ser fluidos cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular (Garzón, 2007). Pero debido a
que el crecimiento dado experimente se realizó alrededor de los 37ºC se dice que se realizó cercano al punto de
operación óptima en un medio rico y complejo como lo es el LB sin producir muerte celular rápidamente.
Por otra parte, se puede afectar de manera muy general el riesgo de contaminación a la hora de realizar las
respectivas siembras, diluciones e incubación debido a que experimentalmente se presenta cierta humedad
relativa del aire influyendo directamente sobre la actividad de agua del cultivo ya que la combinación entre la
humedad relativa y temperatura afecta el gas de la atmósfera.
A continuación se presenta la cantidad de colonias presentadas en los cultivos finales de E.coli en agar LB
suplementado con penicilina (Tabla 1 y 2) y agar MacConkey (Tabla 3 y 4), también la unidad formadora de
colonias con respecto al volumen de la muestra sembrada representada por la ​ecuación 1, ​donde en algunos
casos la cantidad de colonias supera las 300 unidades, siendo un rango óptimo y medible de 30 hasta 300, por lo
tanto se calculó el UFC/mL máximo con cantidad de 300 variando el volumen de la siembra en cada cultivo o
caja petri.

# de colonias por placa * el f actor de dilución*

U F C/mL = mL de la muestra sembrada
*Factor de dilución = inverso de la disolución
Ecuación 1

Tabla 1. ​Resultados para los cultivos de E. coli en agar LB suplementado con penicilina expuesto a la luz
visible.
Volumen de siembra y disolución Cantidad UFC /mL

0,1 ml sin diluir >300 3000

0,1 ml X10-2 >300 300000

Promedio 151500

Tabla 2. ​Resultados para los cultivos de E. coli en agar LB suplementado con penicilina expuesto a la radiación
UV.
Concentración Cantidad UFC /mL

0,1 ml sin diluir >300 3000

0,1 ml X10-4 >300 30000000

Promedio 1,50E+07

Consiguiente a esto en el mismo medio de cultivo de agar MacConkey se llevó a cabo el sembrado de muestras
de E.coli sometidas a radiación UV, sin embargo en este caso se contaba con medio LB el cual ​contiene peptona
de caseína y extracto de levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo
de la mayoría de los microorganismos ("CALDO LURIA (Luria Bertani LB)", 2017).En este caso el E coli se
mezcló con sulfato de magnesio 0,1M y se vio sometido a luz UV durante 50 segundos como se puede apreciar
mejor este proceso en la sección 3, consecuente a esto se tomaron 15 ml y se llevaron a dos beaker con lb, uno
cubierto con aluminio y el otros sin cubrir, dando los resultados que se muestran a continuación.

Tabla 3. ​Resultados para los cultivos procedentes de la mezcla de E.coli con sulfato de magnesio 0,1M en medio
LB cubierto con aluminio y sembrado en agar MacConkey
Volumen de siembra y disolución Cantidad UFC /mL

0,1 ml sin diluir >300 3000

 0,1 ml X10-4 52 5200000

0,1 ml X10-6 0 0

Promedio 1734333,33

Tabla 4. ​Resultados para los cultivos procedentes de la mezcla de E.coli con sulfato de magnesio 0,1M en medio
LB sin cubrir con aluminio y sembrado en agar MacConkey
Concentración Cantidad UFC /mL

0,1 ml sin diluir >300 (completo total) 3,00E+03

0,1 ml X10-4 >300 3,00E+07

0,1 ml X10-5 12 1,20E+07

0,1 ml X10-6 108 1,08E+09

0,1 ml X10-8 1 1,00E+09

Promedio 4,24E+08

Con respecto a la cantidad presente en cada uno de los dos erlenmeyer se logra observar una gran similitud entre
estos dos, ya que en ambos ocurre el mismo efecto y es que a medida que las concentraciones se encuentran más
diluidas menos presencia de número de colonias presentes en el agar MacConkey, sin embargo este
procedimiento de diluciones en serie cuentan con un objetivo final el cual es el de encontrar la concentración
ideal para las disoluciones con el fin de de determinar el UFC (unidad formadora de colonias ), la cual se encarga
de la cuantificación de los organismos presentes en la muestras, con respecto a la bacteria a estudiar se tiene que
está según lo reportado en la teoría cuenta con un conteo de placas de forma líneas las cuales se encuentra en el
rango de 30-300 CFU (unidad de formación de colonia) y por lo tanto para garantizar que esto ocurra se debe
diluir la mezcla como se mencionó anteriormente, en este caso el la determinación de UFC se realizará por el
método de vertido en placa (Dotterrer & Breed, 1916). En el caso de la práctica se nota que el cálculo de UFC
para las dos pruebas fue bastante alto esto debido a que muchas de las muestras se salieron del rango permitido
entre 30-300 CFU para la cantidad de colonias.

Ahora bien con respecto al medio de cultivo agar MacConkey se utiliza generalmente para bacilos y bacterias
Gram negativos y por ello este es un medio selectivo y diferencial para bacterias, y generalmente se diferencia
sobre la base de la fermentación de la lactosa, su funcionamiento parte de el cristal violeta y las sales biliares las
cuales inhiben el crecimiento de organismos Gram positivos, lo cual hace posible la selección y el aislamiento de
bacterias Gram negativas (Cindy, 2013). ahora bien este sirve principalmente como un indicador visual de pH,
y de este forma genera la distinción entre las bacterias Gram negativas que pueden fermentar la lactosa (lac+) y
las que no pueden (lac-), y según los resultados obtenidos se ilustra que se trabajo con bacterias (lac +), debido a
que estas tienen la consecuencia que hace que baje el pH de 7,1 a ​± 0,2 y esto se ilustró en la práctica debido a
que aparecieron colonias rosadas rojas que son consecuencia de la reducción del pH (Calderon, 2016).
A continuación se muestran los cálculos y resultados dados por los medios originales ya sea en agar LB o
MacConkey y de esta manera se determinan los valores promedios de UFC/mL de cada uno para la
determinación de la tasa de mutación de ​E.coli.​

Tabla 5. ​Resultados para los cultivos de E. coli en el medio original de LB

Concentración Cantidad UFC /mL

0,1 mL 0 0

1 mL >300 300

Promedio 150

Tabla 6. ​Resultados para los cultivos de E. coli en el medio original de MacConkey

Volumen de siembra y disolución Cantidad UFC /mL

0,1X10-8 mL 0 0

1 mL >300 300

0,1 mL >300 3000

1 X10-8 10 1,00E+09

Promedio 2,50E+08

Por lo tanto a partir de los cálculos realizados anteriormente con respecto a UFC/mL promedio con respecto al
medio original en agar de LB y MacConkey y el valor dado en cada caso mostrado anteriormente, se dice la tasa
de mutación se da mediante la siguiente ecuación con los siguientes resultados:

U F C /mL medio prom

T asa de mutación : U F C/mL medio original prom
Ecuación 2

Tabla 7. ​Resultados de la tasa de mutación para los cultivos de E. coli

Medio Tasa de mutación

LB-luz visible 1010

LB-UV 100000

MacConkey-con aluminio 6,937x10-3

MacConkey-sin aluminio 1,696

De acuerdo a los datos obtenidos según la tabla 4 de la tasa de mutación del microorganismo de E.coli se puede
decir que se presentó mayor contenido de mutación y presencia de colonias en el medio de agar LB, esto se debe
posiblemente a que es donde tiene el contacto inicial con el microorganismo, siempre y cuando teniendo en
cuenta que los cálculos realizados son basados en algunos casos en la cantidad máxima de colonias contables
(300 unidades) ya que en varios casos como se evidenciaron anteriormente las colonias se presentaban por
encima de las unidades máximas.

La tasa de mutación de la E.coli depende de la sensibilidad de la bacteria a la penicilina y a la producción de

𝛃-galactosidasa ya que según estudios realizados esta especie de bacteria en específica posee cierta resistencia a
los antibióticos betalactámicos ya que está se da a través de la pérdida de la sensibilidad ante un antibiótico al
que se era originalmente susceptible, indicando una aparición en un cambio permanente en el material genético
del microorganismo, dado el caso se puede decir que este tipo de resistencia puede ser adquirida a medida que se
manifiesta el antibiótico en el microorganismo batería (​García, C. 2014)​.

5.Conclusiones

Para lograr obtener el UFC es necesario realizar diferentes disoluciones con el fin de encontrar la concentración
óptima sin embargo en el caso de la práctica se nota que el cálculo de UFC para las dos pruebas fue bastante alto
esto debido a que muchas de las muestras se salieron del rango permitido entre 30-300 CFU para la cantidad de
colonias., ahora bien con respecto a la siembra en agar MacConkey se observa que la bacteria sembrada
corresponde a (lac +), debido ​a que aparecieron colonias rosadas rojas que son consecuencia de la reducción del
pH que presenta este tipo de bacterias y por parte del agar LB se dice que las colonias eran muy difíciles de
identificar debido que estas se presentaron de manera casi translúcida y transparente además de esto en su gran
mayoría se presentaron gran cantidad de colonias en donde no se podía realizar el conteo de manera individual lo
cual se asume una aproximación de colonias mayor a 300.

Se diferenció el comportamiento del microorganismo bacteriano en el comportamiento en cuanto a la luz visible

y a la radiación UV ya que en ausencia a la luz visible es donde se producen los fotoproductos o los daños dados
por la luz UV.

Se identificó que a mayor número de mutaciones del microorganismo bacteriano dado, en este caso E. coli, la
sensibilidad con respecto a los antibióticos con respecto a la luz UV aumenta, donde este indica el proceso de
separación en el ADN.

Se calcularon las diferentes tasas de mutaciones en los diferentes medios de cultivo, donde se puede decir que el
medio de agar MacConkey presenta menor número de mutaciones por lo tanto tiene mayor resistencia a los
antibióticos betalactámicos.

6.Bibliografía

CALDO LURIA (Luria Bertani LB).(2017).Consultado en

http://www.probiotel.com/products/reactivos/caldo-luria-luria-bernati-lb/

Dotterrer,W., Breed,R.(1916).The Number Of colonies allowable on satisfactory agar plate. Geneva,New York
Agricultural Experiment Station
Cindi, A.(2013) Great Adventures in the microbiology(7 ed,pp 175-176).Pearson Custom Publishing

Lamikanra, O.,Kueneman,D., Ukuku,D (2206).Effect of processing under ultraviolet light on the shelf life of
fresh-cut cantaloupe melon (1st. ed).The institute of food technologists. consultado en
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2621.2005.tb08301.x

Simopoulos,A.(1995).Plants in human nutrition,Basel:Karger

Garzón, A. (2007). ​Evaluación de la cinética de crecimiento para Escherichia coli [Ebook] (p. 2). Bogota D.C.
Retrieved from ​http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis133.pdf

Cardona, Y. (2014). ​PRINCIPALES MECANISMOS DE REPARACIÓN DE DAÑOS EN LA MOLÉCULA DE

ADN [Ebook] (pp. 2-4). Retrieved from
https://www.researchgate.net/publication/282815419_Principales_mecanismos_de_reparacion_de_danos_en_la_
molecula_de_ADN

Calderon, R., & Rojas, D. (2016). ​CONSIDERACIÓN BÁSICA SOBRE LA SEGURIDAD MICROBIOLÓGICA
DE LOS JUGOS DE NARANJA EXPENDIDOS EN LOS ALREDEDORES DE LA UNIVERSIDAD
POLITÉCNICA SALESIANA-SEDE QUITO, [Ebook]. Retrieved from
http://www.redalyc.org/jatsRepo/4760/476051824007/html/index.html

Garcia, C. (2014). ​Resistencia antibiótica de Escherichia coli [Ebook]. Retrieved from

http://www.repositorio.usac.edu.gt/2069/1/06_3665.pdf