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N°3 Noviembre 2011

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Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

CREATININA U.V. Método Enzimático U.V. para determinar creatinina

Liquid One Step en suero, plasma y orina.

GT Lab ha introducido un método enzimático U.V. para la determinación de creati-

nina en fluidos biológicos que, no emplea ácido pícrico en su composición.
Desde los trabajos de Jaffé hace más de 130 años (1), el uso del ácido pícrico para
la determinación de creatinina en líquidos biológicos ha sido ampliamente usado.
Jaffé había encontrado que la creatinina reaccionaba en medio fuertemente alcali-
no con ácido pícrico originando un compuesto (complejo de Janovski) de color rojo,
cuya concentración es directamente proporcional a la concentración de creatinina
en la muestra.
Este hallazgo permitió el desarrollo de un amplio abanico de determinaciones basa-
das en la formación de este complejo y su medición espectrofotométrica.
No obstante, no pocos son sus inconvenientes, tanto desde el punto de vista de su
especificidad como de cuestiones prácticas.
En efecto, existen muchas sustancias, además de la creatinina, que reaccionan con
el ácido pícrico en las condiciones de reacción habituales, las que se denominan
“sustancias Jaffé positivas”. Entre ellas podemos mencionar al ácido ascórbico, glu-
cosa, piruvato, acetona, proteínas, ácido acetoacético, ácido úrico y antibióticos
cefalosporinas.
Para evitar la interferencia de las proteínas se empleó inicialmente la desproteiniza-
ción de las muestras, lo cual resultaba engorroso y no impedía la interferencia de
otras sustancias Jaffé positivas no precipitables.
Se buscó superar estos inconvenientes estudiando la diferente velocidad de reac-
ción entre la creatinina y las otras sustancias Jaffé positivas. Así, se desarrollaron
diferentes variantes de métodos cinéticos con relativo éxito, ya que aun en estas
condiciones las interferencias suelen ser importantes.
Pero en cualquiera de las variantes en que se intentó superar el problema de la
inespecificidad intrínseca de la reacción de Jaffé, persistían los problemas prácticos,
principalmente el uso de un reactivo fuertemente alcalino y corrosivo y la presencia
del mismo ácido pícrico con su alto poder de tinción sobre los elementos del labo-
ratorio incluida la vestimenta del operador.
Estas limitaciones se hicieron aun más importante con el advenimiento del uso de
sistemas automatizados, a los que el laboratorista se resiste a deteriorar con el uso
de un reactivo tan agresivo.
Consecuentemente, la búsqueda de una alternativa enzimática que superara estos
cuestionamientos a los antiguos métodos químicos y que fuera compatible con el
uso de analizadores automáticos se hizo una necesidad.

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INTRODUCCIÓN
La creatinina es generada por el metabolismo a partir de la
creatina, en un mecanismo fundamental de provisión de ener-
gía muscular. Aproximadamente el 2% de la creatina corporal
es convertido en creatinina cada día, la que es excretada en
la orina.
La creatinina ha sido tomada como un indicador muy con-
fiable de la función renal. Cuando el riñón tiene algún tipo
de compromiso, el nivel sérico de creatinina aumenta, ad-
virtiendo sobre un mal funcionamiento incluso antes de que
el paciente reporte síntomas. Esto lleva a la conveniencia de
dosar creatinina en sangre y en orina dentro de la rutina del
laboratorio.
Los valores normales de creatinina son aproximadamente 0.5-
1.2 mg/dl. Individuos jóvenes o de edad media musculosos
pueden tener valores mayores, mientras los ancianos tienden
a tener valores menores. Por su lado, en la infancia la creatini-
nemia puede oscilar alrededor de 0.2 mg/dl, dependiendo del
desarrollo muscular. Pacientes con un solo riñón suelen tener
normalmente niveles de 1.8-1.9 mg/dl.
Niveles de 2.0 mg/dl en bebés y de 10.0 mg/dl en adultos
pueden indicar necesidad de diálisis. (3)
Ciertas drogas pueden provocar valores anormalmente altos
de creatinina, por lo que conviene consultar los trabajos de D.
Young (2), entre otros.
Los niveles de creatinina también aumentan después de cier-
tas ingestas, como carnes asadas.
Hay una gran variedad de patologías que producen hipercrea-
tininemia: anemia hemolítica autoinmune, leucemias, infarto
de miocardio, glomerulonefritis aguda posestreptocócica,
pielonefritis, falla renal, embolismo, trombosis, amiloidosis,
endocarditis bacteriana, hipertrofia prostática, diferentes car-
cinomas, diabetes, pre-eclampsia, falla hepática, leptospiro-
sis, etc,
Disminuciones de creatininemia se observan en anorexia ner-
viosa, eclampsia, hipertiroidismo y cirrosis.
Por su parte, la excreción de creatinina en orina es constante
durante el día y proporcional a la masa muscular, producién-
dose aumentos fisiológicos tras ingestión de alimentos que
aumentan su nivel sérico.
Las patologías que aumentan la creatininuria son acrome-
galia, gigantismo, hipotiroidismo, infección e hipertensión
renovascular. Disminución de creatininuria puede observarse
en una amplia variedad de patologías, como dermatomiosis
activa, enfermedades renales (antes del nivel final de fallo re-
nal), demencia tipo Alzhemier, esclerosis amiotrófica, anemia,
hipertiroidismo, leucemia, distrofia muscular, parálisis, pre-
eclampsia, distrofia muscular progresiva y malnutrición.
La concentración sérica de creatinina y la depuración (clea-
rance) de creatinina endógena (D.C.E.) son índices aceptados
de la velocidad
de filtración glomerular y son usados en el laboratorio clínico
para evaluar la función renal.
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PRINCIPIO
La determinación de creatinina por el método enzimático ul-
travioleta se basa en la siguiente reacción:
CDI
Creatinina + H2O ---------> N-metilhidantoína + NH3
GlDH
NH3 + 2-oxoglutarato + NADH ---------> glutamato + NAD+
La creatinina es hidrolizada por la Creatinin Deiminasa (CDI),
con producción de N-metihidantoína y amoníaco. Este, a su
vez, reacciona con el 2-oxoglutarato del medio por acción de
la glutamato dehidrogenasa (GlDH) con consumo de NADH,
produciendo NAD y glutamato. La disminución de lectura a
340 nm mide el descenso de concentración del NADH en el
medio, siendo éste directamente proporcional a la concentra-
ción de creatinina en la muestra. (4)
REACTIVOS PROVISTOS
R1: solución lista para usar.
R2: solución lista para usar.
Enzima 1: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R1.
Enzima 2: reactivo en polvo para disolver en el frasco de R2.
Estándar: solución lista para usar.
COMPOSICIÓN FINAL DE LOS COMPONENTES EN EL
MEDIO
GIDH……… 900 U/l Tris……… 50 mmol/l, pH = 8.2
CDI………… 1500 U/l 2-oxoglutarato de sodio.4.8 mmol/l
NADH…0.24 mmol/l Cloruro de magnesio… 3.0 mmol/l
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
DE TRABAJO
Conservación: Refrigerador (2-8º C). Proteger de la luz.
Estabilidad: 1 mes.
MUESTRA
Suero o plasma heparinizado o con EDTA: Debe separarse
dentro de los 30 minutos de extraída la muestra.
Orina: puede trabajarse con orina de 2 ó de 24 horas. Debe
recogerse en recipiente limpio y mantenerse en refrigerador.
Use el sobrenadante límpido. Diluya 1:50 con agua deioniza-
da libre de amonio, antes de ensayar.
Condiciones de conservación de las muestras
Refrigerador (2-8ºC): estable 24 horas.
Congelador (-20ºC): estable 3 meses.
Sustancias interferentes
No se han detectado interferencias por componentes usuales
de los líquidos biológicos objeto de ensayo. Se recomienda
la lectura del trabajo de D.S. Young mencionado en BIBLIO-
GRAFIA.
PROCEDIMIENTO
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Condiciones de reacción: En base a los datos de dicha tabla se obtuvieron las siguientes
Espectrofotómetro a 340 nm (Hg 334 ó 366 nm) ecuaciones de regresión:
Temperatura: 30-37ºC Contra GT Lab Jaffé Cinético:
PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO DE TRABAJO. Ecuación de regresión: y= 0,6759 x + 0,1682
En dos tubos marcados E (estándar) y D (desconocido) Coeficiente de correlación: 0,9863
agregue:
E D Contra método Jaffé cinético comercial origen nacional:
Ecuación de regresión: y= 0,6521 x + 0,2459
R1 de Traba jo 300µl 300µl
Coeficiente de correlación: 0,9842
Estándar 50µl ------
Muestra ------ 50µl Contra método enzimático UV comercial origen europeo:
Mezcle. Incube exactamente 5 minutos a 30° ó Ecuación de regresión: y= 1,0209 x - 0,0254
a 37°C y obtenga las lecturas finales E2 y D2 en Coeficiente de correlación: 0,9982
espectrofotómetro a 340nm.
b- Sensibilidad:
La sensibilidad en espectrofotómetro a 340 nm, leyendo en
CÁLCULOS cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es
Creatinina sérica (plasmática) aproximadamente 0,02 mg/dl.
D1 – D2 c- Especificidad:
------- x 2,0 = mg/dl creatinina Los métodos químicos habitualmente usados, basados en la
E1 – E2 reacción de Jaffé con picrato alcalino, dan reacción con otras
sustancias Jaffé positivas además de la creatinina.
Creatinina urinaria El método enzimático está libre de tal interferencia. En este
Muestra de 24 horas: método, el amoníaco endógeno es eliminado en la primer in-
D1 – D2 2,0 50 cubación, con lo que el método resulta específico para crea-
------- x ---- x ---- x diuresis (ml) = g creatinina/24 h tinina.
E1 – E2 1000 100 d- Linealidad:
La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer entre 0 y 10
D1 – D2 mg/dl (900 µmol/l).
------- x diuresis (l) = g creatinina/24 h e- Recuperación:
E1 – E2 La recuperación obtenida por agregado de cantidades cono-
cidas de creatinina a muestras biológicas estuvo entre el 99,0
Muestra de 2 horas: y el 103,1%, dentro del rango establecido en d-.
D1 – D2 2,0 50 f- Reproducibilidad:
------- x ---- x ---- x volumen (ml) x 12 = g creatinina/24 h Se procesaron pooles de muestras de personas caucásicas,
E1 – E2 1000 100 adultas, sin antecedentes de patologías que no fueran las
asociadas con valores anormales de creatinina. Las muestras
D1 – D2 se conservaron congeladas a -20ºC durante todo el tiempo
------- x volumen (l) x 12 = g creatinina/24 h entre ensayos. Los resultados para los estudios intra e interen-
E1 – E2 sayo se muestran en la TABLA II y en la TABLA III.
g- Inexactitud e Imprecisión:
Depuración de creatinina endógena El tratamiento estadístico de la inexactitud e imprecisión es-
g creatinina en orina/24 h tán desarrollados más arriba en “Comparación con otros mé-
DCE = ------------------------------- x 69,4 = ml/min todos” y en “Reproducibilidad”.
mg creatinina en suero/dl Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan
Para obtener los datos de concentración en unidades µmol/l, estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instruc-
multiplique el dato expresado en mg/dl por 88.5. ciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra,
uso de anticoagulante, etc.
EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DEL MÉTODO
a- Comparación con otros métodos: SUSTANCIAS DE REFERENCIA Y /O PATRO-
En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de NES EMPLEADOS
muestras contra reactivos comerciales aprobados por ANMAT, El Estádar empleado tiene trazabilidad al Standard Reference
tomados como referencia. Los resultados se muestran en la Material #909b (National Institute of Standards and Techno-
TABLA I, expresados en mg/dl de creatinina. Estos datos están logy, EEUU): suero humano liofilizado.
representados en los GRAFICOS 1 a 3.
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CONTROL DE CALIDAD VALORES DE REFERENCIA

Se recomienda procesar juntamente con las muestras, sueros Suero o plasma: 0.5-1.2 mg/dl
control normal y anormal para controlar el desempeño del Orina: 0.8-2.0 g/24 hs
ensayo. Se aconseja el uso de Qualiset Sueros Control Nivel 1 D.C.E.: 80-140 ml/min en adultos hasta 60 años
y 2 GT Lab (Códigos 602105 y 602205) Cada laboratorio debe determinar su propio rango de acuerdo
Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control a la población involucrada.
de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se
superan los límites de tolerancia aceptables.

USO EN AUTOMATIZACIÓN
La TABLA IV indica los parámetros a usar en la aplicación de la
técnica a instrumentos automatizados.
Están disponibles adaptaciones para diferentes auto analiza-
dores. Solicítelos a infoprofesional@gtlab.com.ar.

TABLA I
comparación con métodos como referencia (resultados expresados en mg/dl)

Muestra N° Creatinina Jaffe Método UV Enzimático Método Jaffe Cinéti- Método Enzimáti-
cinético GT Lab GT Lab En ensayo co Comercial Origen co UV Comercial
Nacional Origen Europeo

1 0,618 0,414 0,612 0,418

2 0,539 0,331 0,544 0,315
3 1,975 1,384 2,074 1,357
4 0,097 0,098 0,099 0,095
5 0,984 0,742 1,014 0,734
6 1,758 1,272 1,846 1,247
7 1,188 0,780 1,236 0,741
8 1,634 1,078 1,601 1,089
9 1,088 0,669 1,153 0,682
10 0,271 0,198 0,287 0,192
11 1,396 1,014 1,368 0,974
12 0,805 0,511 0,789 0,490
13 0,457 0,341 0,475 0,345
14 0,520 0,444 0,536 0,457
15 1,376 0,901 1,417 0,928
16 1,676 1,226 1,676 1,164
17 1,548 1,011 1,579 1,042
18 0,945 0,638 0,992 0,606
19 1,856 1,129 1,949 1,107
20 1,518 1,188 1,579 1,129
21 0,238 0,183 0,233 0,176

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TABLA II
Reproducibilidad intra ensayo

Estándar =0,106 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Muestra Lectura mg/dl Lectura mg/dl Lectura mg/dl

1 0,0653 1,23 0,2295 4,33 0,5292 0,5292

2 0,0657 1,24 0,2369 4,47 0,5272 0,5272
3 0,0682 1,29 0,2323 4,38 0,5217 0,5217
4 0,0711 1,34 0,2405 4,54 0,5252 0,5252
5 0,0673 1,27 0,2301 4,34 0,5069 0,5069
6 0,0717 1,35 0,2224 4,20 0,5037 0,5037
7 0,0681 1,28 0,2308 4,35 0,5058 0,5058
8 0,0714 1,35 0,2379 4,49 0,5133 0,5133
9 0,0666 1,26 0,2411 4,55 0,5371 0,5371
10 0,0668 1,26 0,2401 4,53 0,5190 0,5190

Promedio 1,29 4,42 9,79

SD mg/dl+ 0,045 0,115 0,212
C.V. %+ 3,5 2,6 2,2

TABLA III
Reproducibilidad inter ensayo

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Día Estandar Lectura mg/dl Lectura mg/dl Lectura mg/dl

1 0,0980 0,0666 1,36 0,2456 5,01 0,5013 10,23

2 0,1044 0,0664 1,27 0,2298 4,40 0,4970 9,52
3 0,1067 0,0682 1,28 0,2471 4,63 0,5008 9,39
4 0,0981 0,0703 1,43 0,2347 4,78 0,5024 10,24
5 0,1017 0,0653 1,28 0,2382 4,68 0,5014 9,86
6 0,1047 0,0704 1,34 0,2275 4,35 0,5013 9,58
7 0,1043 0,0684 1,31 0,2387 4,58 0,4965 9,52
8 0,1037 0,0657 1,27 0,2468 4,76 0,4958 9,56
9 0,0973 0,0688 1,41 0,2355 4,84 0,4913 10,10
10 0,1061 0,0658 1,24 0,2362 4,45 0,4949 9,33

Promedio 1,32 4,65 9,73

SD mg/dl + 0,065 0,210 0,347
C.V. %+ 4,9 4,5 3,6

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TABLA IV
Parámetros para automatización

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GRÁFICO I

GRÁFICO II

GRÁFICO III

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Referencias Biográficas

1- Jaffe M: Über den Niederschlag welchen Pikrinesäure in normalen Harn Erzeugt

und über eine neue Reaktion des Kreatinins. Z.Physiol.Chem. 10:391-400;1880
2- Young DS: Effects of disease on Clinical Lab. Tests. 4th Ed. AACC Press, 2001
3- Perrone RD, Madias NE, Levey AS: Serum creatinine as an index of renal
function; new insights into old concepts. Clin Chem 38:1933-53; 1992.
4- Sontagg O, Büttner J: Evaluation of an UV method for the determination of
creatinine compared with Ektachem 700 and Fuller’s earth method. Clin.Chem.
36/6:1179;1990.

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