Guía: Técnicas de siembra de medios de cultivo en Placa y Tubo

Taller N°5

DIRIGIDO A:
Alumnos de la carrera Técnico Superior en Química y Farmacia

PRE- REQUISITO:
No aplica

Autor: QF Ma Gabriela Sarrás Sarrás

DuocUC
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Taller N°5

INTRODUCCIÓN
La industria farmacéutica requiere controles estrictos en cuanto a la carga microbiana presente
en las materias primas (MP) como también, en los productos terminados (PT). De igual forma
debe asegurarse de que no exista contaminación en las áreas limpias y en los equipos y
materiales usados en la elaboración de productos químicos, cosméticos y farmacéuticos. Para
ello existen diversos controles que deben realizarse periódicamente antes, durante y después
de la elaboración de los preparados.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo
diferentes

Para poder observar el crecimiento, debemos lograr sembrar adecuadamente las cepas
bacterianas en el medio de cultivo, generando un ambiente propicio para su desarrollo.

Para lograr lo anterior, se definen las técnicas de siembra de un medio de cultivo.

(Métodos de inoculación)

Debemos tener en cuenta dos son los grandes pilares para un buen diagnóstico bacteriológico:

El primero es una buena toma de muestra, acción donde tiene una importancia fundamental,
el técnico de laboratorio clínico, el cual debe dominar a cabalidad, las normas para cada tipo
de muestra y dar cumplimiento de éstas

Lo segundo es: La correcta preparación de los medios de cultivos, ya que como se indica en
la presente guía, los microorganismos necesitan de numerosos factores para lograr un
desarrollo óptimo, condiciones que se le proporcionan con la preparación de un Medio de
Cultivo que cumpla con todas las normas técnicas, tanto de su preparación, esterilización y
almacenaje, labor que un técnico de laboratorio debe cumplir con gran responsabilidad.

Nunca debe olvidar un técnico en química y farmacia es el primer eslabón de esta gran
cadena, que termina en un buen control de proceso para poder sacar al mercado productos
con las cualidades básicas que todo producto farmacéutico debe tener: Calidad, Eficacia y
Seguridad.

OBJETIVOS GENERALES

Observar las diferentes técnicas de inoculación (siembra) en un medio de cultivo,

sólido y líquido.
Trabajar técnicas que son certificables en su calidad

REALIZADO POR:
Tecnólogo. Medico. (Especialidad Laboratorio Clínico).
Químico Farmacéutico

Autor: QF Ma Gabriela Sarrás Sarrás

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Taller N°5

DURACIÓN:
90 minutos

NUMERO DE ALUMNOS POR DOCENTE:

Máximo 10 alumnos

MARCO TEÓRICO

MEDIO DE CULTIVO: Conjunto de sustancias esenciales para el crecimiento y desarrollo

microbiano.

INÓCULO: Carga de microorganismos presentes es un sitio y momento determinado

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición

a los líquidos orgánicos del cuerpo humano.
Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona
a la que se añadirán otros ingredientes.

El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 4 grados C. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya

que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento

como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.

Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos
que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes

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.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo
Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta
de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las
bacterias Gram-positivas).

Aunque las tendencias actuales en microbiología clínica apuntan hacia el desarrollo de

métodos rápidos, independientes del crecimiento de los microorganismos, para determinar la
presencia de agentes infecciosos, el aislamiento y la identificación de los patógenos es aún el
“estándar” de oro para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. En base a lo anterior,
se hace indispensable el conocimiento de las diferentes técnicas y medios de cultivo para
lograr el aislamiento e identificación de microorganismos.

En esta práctica se utilizan diferentes medios de cultivo, así como diferentes técnicas de
inoculación.

Definición

Un medio de cultivo se refiere a aquel lugar en el espacio en el que se reúnen las

características necesarias para el crecimiento y desarrollo, en este caso microbiano. Las
sustancias necesarias para el crecimiento de los microorganismos pueden ser proporcionadas
por un sistema vivo (Ej. sangre) y uno in Vitro (ejemplo vitaminas).

Métodos de inoculación

Una vez conocido los medios de cultivo, hay que conocer los métodos de inoculación, los cuales
estarán ligados al objetivo de la inoculación.

A) Método de estriación: Se utiliza para aislar bacterias solas de un grupo. Se realiza de la

siguiente manera:

1. Se coloca el inóculo en el medio con un asa de aro, se desliza el asa sobre la superficie del
medio de cultivo en forma perpendicular una y otra vez hasta cubrir aproximadamente la
mitad de la superficie del agar en la caja de Petri, a esto se le denomina estriación No. 1.

2. Se esteriliza el asa, se espera a que se enfríe y se realiza la estriación No. 2 de igual forma
que la No. 1 pero en forma perpendicular a esta, iniciando en esta y cubriendo
aproximadamente otro cuarto de la superficie del agar.

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3. Esteriliza el asa y se espera que se enfríe, se realiza la estriación No. 3 empezando en la
dos y de forma perpendicular a ella y sin tocar la No. 1. Con este procedimiento se obtiene
en la estriación No. 3 aislar colonias individuales

B) Estriación masiva: Este procedimiento es para un crecimiento uniforme sobre toda la

superficie de agar. Se puede realizar con asa o con hisopo de algodón.

C) Siembra de medios en tubo en general, se utiliza el asa en punta en medios sólidos y

semisólidos por picadura y estriación del medio, ambas o una sola, o por agitación cuando
son caldos.

Aislamiento primario

Una vez obtenida la muestra clínica, para realizar el diagnóstico etiológico del agente
microbiano presente, es necesario sembrar (inocular) la muestra en medios de cultivo sólidos
(y eventualmente líquidos si se desea realizar un enrique-cimiento previo)

El objetivo de este paso es obtener colonias bacterianas aisladas. Se denomina colonia al

conjunto de bacterias que provienen de una misma célula madre y en los medios de cultivo
aparecen como acúmulos de miles de bacterias que pueden observarse a simple vista. Las
colonias aisladas se obtienen diseminando la muestra sobre la superficie del agar con ayuda
de un asa bacteriológica.

Las figuras siguientes muestran un esquema de cómo se disemina la muestra sobre la superficie
del agar y una fotografía de colonias aisladas sobre una placa de agar EMB luego de 24
horas de incubación a 37ºC.

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Colonias aislads en Agar sangre y Agar EMB

Duplicación bacteriana

En organismos multicelulares la multiplicación celular se traduce en aumento del tamaño del

individuo pero en organismos unicelulares el crecimiento se traduce en aumento del número de

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individuos. La duplicación bacteriana se produce por fisión binaria en la que la división del
ADN y la división celular se llevan a cabo simultáneamente.
El tiempo necesario para que se observen las colonias en un medio de cultivo adecuado y bajo
condiciones de temperatura y atmósfera correctas dependerá del tiempo de duplicación
celular de la bacteria en estudio. En la figura siguiente se esquematiza un proceso de
duplicación bacteriano.

A continuación se presentan ejemplos de tiempos de división y del tiempo mínimo que debe
esperarse para observar colonias en los medios de cultivo.

Escherichia cola - División: 20 minutos - Colonias: 24 horas

Clostridio botulinum - División: 35 minutos - Colonias: 48 horas
Micobacteria tuberculosis - División: 12 horas - Colonias: 30 días

Cinética del crecimiento bacteriano

Debido a que las bacterias se duplican en cada generación, la población bacteriana a través
del tiempo aumentará en forma exponencial de 2.

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Si se presenta el número de bacterias en función del tiempo, tendremos una curva exponencial
pero si representáramos el ciclo vital de un grupo de bacterias tendríamos cuatro fases (Ver
figura siguiente):

1. Fase de latencia: las bacterias se adaptan al medio en el que se encuentran, en este

período el número de células no varía. El tiempo de adaptación es variable para las
diferentes bacterias. En esta etapa, por ejemplo, las esporas bacterianas se transforman
en células vegetativas.

2. Fase exponencial: es aquí donde se inicia la multiplicación bacteriana, el número de

bacterias aumenta exponencialmente y es aquí donde se liberan las enzimas y toxinas.

3. Fase estacionaria: llega un momento en que existe una competencia por los nutrientes ya
que estos van disminuyendo en su concentración y las bacterias dejan de crecer. En este
período las bacterias esporuladas comienzan a esporular. Algunas bacterias mueren pero
otras se dividen por lo que el número de células se mantiene sin variaciones.

4. Fase de muerte: el número de bacterias comienza a disminuir debido a que las bacterias
que mueren supera al número de bacterias que se dividen.
En la práctica, este modelo de crecimiento bacteriano nos sirve para conocer cuánto tiempo
deberá ser incubado un medio de cultivo con el objeto de que las bacterias en estudio siempre
se encuentren en la fase de crecimiento exponencial, ya que es allí cuando se manifiestan
todas sus propiedades bioquímicas y patogénicas.

El Antibiograma

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos evalúan la capacidad de un fármaco

antibacteriano para inhibir in vitro el desarrollo bacteriano.
Esta capacidad puede determinarse por el método de dilución o por el método de difusión
Autor: QF Ma Gabriela Sarrás Sarrás
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Con esta sencilla y económica prueba podemos relacionar efectividad de un antibiótico frente
a determinado agente bacteriano, lo que se traduciría en mayores éxitos en la terapia
antimicrobiana y reducción de la resistencia bacteriana.

INSUMOS Y EQUIPOS NECESARIOS PARA EL TALLER

Sala de laboratorio clínico
Mechero Bunsen
Asa bacteriológica en punta.
Pipetas Pasteur estériles
Lápiz de Marcar
Pinzas metálicas
Autoclave
Canastillos de alambre
Agar agar
Tubos de ensayo estériles con tapón de algodón hidrófobo ( 2 por Alumno)
Tubo con agar nutritivo inclinado conteniendo cepa de Gram negativos.
Tubo con agar nutritivo inclinado conteniendo cepa de Gram positivos.
Tubo con medio de cultivo líquido conteniendo cepa de Gram negativo.
Una placa de Petri con Agar Mac. Conkey o agar Sangre por alumno
Un tubo agar en profundidad
Un tubo agar inclinado
Un tubo de TSI, LIA Y MIO sembrado sólo para demostración

Nota: Los medios para siembra, serán de simulación coordinados entre el docente y
el encargado de laboratorio

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Agar TSI Los diferentes resultados probables

Agar MIO Indol + Indol -

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DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

A.- SIEMBRA DE MEDIOS DE CULTIVOS

1- Siembre el medio de cultivo siguiendo la técnica operatoria

Técnica operatoria

Pasos:
1.- Durante el taller se deben sembrar las placas con medios de cultivo de agar Mac
Konkey, Agar Sangre y Agar TSI, con muestras de piel, secreciones corporales (sudor,
saliva), cabello, uñas, dientes, etc.

2.- Se deben seguir la técnica de siembra de estriación y siembra en profundidad.

3.- Una vez sembrado se debe rotular e incubar en estufa a 37 ªC por 24 hrs

NOTA

Rotule sus placas y tubos e incúbelos verificando la temperatura, anote sus observaciones

BIBLIOGRAFÍA

 Procedimiento y técnicas de Laboratorio. Microbiología Especial VolI. ISP.

 Tablas TLM ISP.

METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN
El taller será evaluado con una pauta de observación de actividades., cumplimiento de tarea
y la realización de preguntas.

INFORME:

Objetivo
Introducción
Desarrollo:

Responda el siguiente Cuestionario:

1.- En que situación se elige el caldo nutritivo en lugar del MC Solido

2.- Que MC mide Lactosa – y Lactosa + . y cuál es su fundamento. Explique
3,- Explique que se busca medir cuando se agregan indicadores coloreados.

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4.- ¿Por qué el medio Mac Conkey puede ser considerado un medio selectivo y diferencial?
¿Para el aislamiento de qué tipo de bacterias se lo emplea ? Anote la composición y diga qué
función cumple el rojo neutro.
5.- Explique con fundamento químico, porque se produce el cambio de color en el medio de
cultivo Mac. Conkey
6.- ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?
7. ¿Cuál es la fuente de carbono del medio Citrato de Simmons y del agar nutritivo? ¿Por qué
se considera al primero un medio diferencial y con respecto a qué?
8. Antes del agar-agar se utilizó otro componente para solidificar los medios de cultivo ¿de
qué componente se trata y qué inconvenientes presentaba su uso?
9. ¿Cuál es el medio de cultivo elegido para el aislamiento de Staphylococcus aureus? Diga la
composición y clasifíquelo de acuerdo a su origen, composición y consistencia.
10. ¿Cuál es el medio de cultivo que se emplea para el aislamiento de hongos y levaduras

Conclusión
Bibliografía

Autor: QF Ma Gabriela Sarrás Sarrás

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