LOS ANÁLISIS ÓMICOS INTEGRADOS REVELAN LOS

DETALLES DE LA ADAPTACIÓN METABÓLICA DE

CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM A LOS INHIBIDORES DE
CRECIMIENTO DERIVADOS DE LIGNOCELULOSA LIBERADOS
DURANTE LA DECONSTRUCCIÓN DEL PASTO VARILLA.
Integrated omics analyses reveal the details of metabolic adaptation of Clostridium thermocellum to lignocellulose-derived growth inhibitors
released during the deconstruction of switchgrass, Tobin J. Verbeke, Richard J. Giannone, Dawn M. Klingeman, Nancy L. Engle, Thomas
Rydzak, Adam M. Guss, Timothy J. Tschaplinski, Steven D. Brown, Robert L. Hettich and James G. Elkins, Journal: Scientific Reports, 2017,
Volume 7, Number 1 DOI: 10.1038/srep43355
ANTECEDENTES
 Pasto Varilla
• Hierba gramínea perenne, de estación cálida, dominante en América del Norte.
• Materia prima bioenergética de segunda generación:

Altos
Resistencia
rendimientos

Bajo
Tolerancia a la
requerimiento
sequía
de fertilizante

Potencial reemplazo del almidón

como biocombustible.
 Clostridium thermocellum
• Microbio celulolítico que
deconstruye eficientemente la
biomasa lignocelulósica en azúcares,
que se fermentan en etanol y otros
productos.
• Produce grandes complejos
enzimáticos extracelulares llamados
celulosomas.
• Candidato ideal para el
Bioprocesamiento Consolidado
(CBP).
Celulosoma

Repleto de enzimas activas en hidratos de carbono optimizadas

(CAZimas), dirige la conversión de celulosa a celodextrinas.

Las celodextrinas se descomponen en celobiosa y glucosa, que finalmente

es utilizada por el MO para generar energía a través de la fermentación a
etanol, ácido acético, ácido láctico, hidrógeno y / o dióxido de carbono.
La deconstrucción de la biomasa natural genera numerosos inhibidores
antimicrobianos y / o fenólicos que podrían impedir el proceso industrial.
Deconstrucción y conversión de pasto
varilla en etanol por C. thermocellum
• A medida que el MO convierte los azúcares liberados en una gran cantidad de
productos, debe evitar y / o mejorar los efectos, tanto de la inhibición del producto
como de los metabolitos citotóxicos derivados de la biomasa.
• Al integrar los datos obtenidos de tres plataformas ómicas, se detallaron los
mecanismos mediante los cuales C. thermocellum se adapta al entorno adverso
creado durante la deconstrucción lignocelulósica.

Metabolómica
Proteómica de
Microarrays basada en GC-
escopeta
MS
MÉTODOS
 Cultivo y muestreo
Se lavó varias veces Los medios MTC se burbujearon durante la
El pasto varilla se
con agua desionizada Se secó durante la noche con nitrógeno antes de la inoculación
pretrató con ácido
para eliminar los noche a 45 ° C. (10% v / v de inóculo) hasta un volumen final
sulfúrico diluido.
azúcares solubles. de 4 l.

Las muestras para Se tomaron muestras para El pH se controló a

La temperatura de
transcriptómica se metabolómica y proteómica a 7 en los
crecimiento se
recolectaron a las las 19, 43, 91 y 187 h fermentadores con
mantuvo a 58 ° C.
19 y 43 h. posteriores a la inoculación. NaOH (3 N).

El inóculo y las fermentaciones triplicadas de C. thermocellum

Los datos de Microarray y los detalles de la
plataforma se depositaron en la base de datos
NCBI Gene Expression Omnibus (GEO).
se realizaron en fermentadores de 5 l. Todos los recipientes
contenían 10 g / l (base en peso seco) de pasto varilla
pretratado como sustrato principal.
 Mediciones metabolómicas
Se pesaron gránulos de células
congeladas que contenían tanto microbio Las muestras se sonicaron durante 5 Las muestras se centrifugaron a 4500 rpm
como material vegetal en tubos de minutos (30 s encendidas, 30 s apagadas durante 20 minutos, y el sobrenadante se
centrífuga de 50 ml que contenían 10 ml con una amplitud del 30%) y se decantó en viales de centelleo y se
de etanol al 80%, y se añadieron 50 μl de mantuvieron en hielo. almacenó a -20 ° C.
sorbitol (0,01 g / ml) como patrón interno.

Los datos de metabolitos se expresaron

Después de 2 días, se inyectaron alícuotas
como el cambio de veces en relación con
de 1 μl en un cromatógrafo de gases-
el punto de tiempo de muestreo de 19 h
espectrómetro de masas (GC-MS). El
con diferencias significativas Se secó un mililitro por muestra, se
cuadrupolo estándar GC-MS se hizo
determinadas con las pruebas t de disolvió en 0,5 ml de acetonitrilo y se sililó
funcionar en el modo de ionización de
Student. Las diferencias significativas en para generar derivados de trimetilsililo.
impacto de electrones (70 eV),
el cambio veces entre los puntos de
dirigiéndose a 2,5 barridos de espectro
tiempo de muestreo también se
completo (50-650 Da) por segundo.
evaluaron con las pruebas t de Student.
Mediciones proteómicas
Se decantó el sobrenadante,
dejando un sedimento de 5
Se centrifugaron muestras El sedimento compuesto se
ml compuesto por biomasa Se congelaron rápidamente Las células se lisaron por
de fermentación de 50 ml a resuspendió en guanidina-
(Pasto Varilla), C. en nitrógeno líquido. disrupción.
8000 rpm durante 20 min . HCl 6 M, DTT 10 mM, y pH 8.
thermocellum y sustrato-
celulosomas unidos.

Antes del análisis semicuantitativo, los recuentos

Los recuentos normalizados de
proteínas individuales se evaluaron
estadísticamente a lo largo de
diferentes puntos de tiempo de
crecimiento utilizando valores de p
derivados del ANOVA de una vía.
espectrales se reequilibraron para distribuir 100 μg de péptidos trípticos
apropiadamente péptidos no únicos / compartidos cargados en una columna y Los lisados crudos
entre sus proteínas parentales potenciales y los analizados en el transcurso de resultantes se procesaron
valores de SpC en bruto se convirtieron en factores 24 h mediante adquisición para proteómica ascendente
de abundancia espectral normalizados (NSAF) para dependiente de datos en un basada en tripsina.
evaluar las diferencias cuantitativas entre los puntos espectrómetro de masas.
de tiempo.

El enriquecimiento funcional del La información de las vías metabólicas de C.

Las proteínas con valores de p <0.05 se
usaron para un análisis de agrupamiento
adicional. La agrupación C-media de las
proteínas se realizó para identificar
respuestas temporales comunes.
clúster individual se realizó con la
prueba exacta de Fisher para
generar una subred de términos
funcionales basados en
miembros superpuestos
utilizando un valor p <0.01.
Todos los espectros de masa
thermocellum se obtuvo de la base de datos
sin procesar para las
de la vía KEGG. Las mediciones de
mediciones del proteoma se
transcriptómica (19 y 43 h) y la predicción de
han depositado en el
regiones altamente expresadas del ADN se
repositorio de
integraron con los datos de proteómica y se
ProteomeXchange.
presentaron como un atlas del genoma.
RESULTADOS Y
DISCUSIONES
 Características de crecimiento microbiano en
switchgrass
• El ácido acético y el etanol fueron
los principales productos de
fermentación para C. thermocellum
de tipo silvestre.
• La producción de etanol es exclusiva
de C. thermocellum y por lo tanto,
es un indicador más específico del
crecimiento microbiano.
 Las tendencias para el ácido
acético y el etanol fueron
similares hasta 120 h después
de la inoculación.

Se encontró que la
concentración de ácido
acético era 0.6 g/l después de
139 h de crecimiento
microbiano, el etanol dejó de
acumularse después de 120 h.

El ácido acético aumentó de

≤0.075 g/l en el tiempo cero a
~ 0.7 g/l después de 187 h
El análisis metabólico indica la acumulación de metabolitos clave que
pueden ser inhibidores del crecimiento de C. thermocellum en la biomasa
lignocelulósica.
Acumulación de
metabolitos derivados de
hemicelulosa: xilobiosa,
xilosa, xilitol, arabinosa y
arabitol.
El xilitol exhibió la mayor
acumulación cuando el cultivo
alcanzó la fase estacionaria (~ 9
veces).
Muchos de los componentes
derivados de la
Evidencia de síntesis de
hemicelulosa y la lignina son
ácidos grasos.
inhibidores del crecimiento
microbiano.
El ácido isopalmítico (C16), el ácido
Compuestos citotóxicos. isosteárico (C18) y el ácido palmítico
palmítico (C32) aumentaron ~ 15 veces
Alcoholes de azúcar, como el
con la fase estacionaria.
arabitol, son inhibidores de
El ácido isoheptadecanoico ramificado
otros microbios, como T.
aumentó casi 21 veces.
accharolyticum.
Reestructuración de la
membrana celular para tolerar
Cepas silvestres de C. mejor las concentraciones
thermocellum no usan azúcares incrementadas de inhibidores
derivados de hemicelulosa. derivados de lignocelulosa que
afectan la fluidez de la
membrana.
El crecimiento de C. thermocellum en Sin la eliminación/bioconversión
switchgrass es un proceso activa de compuestos inhibidores y/o
complicado mediante el cual los la tolerancia incrementada:
glucanos derivados de la planta:

• Limitada producción efectiva de

• Alimentan el crecimiento microbiano biocombustibles, especialmente teniendo en
• Conducen a la deconstrucción de la cuenta el uso industrial planificado de
biomasa sustratos lignocelulósicos complejos tales
• Conduce a la acumulación de como switchgrass.
metabolitos inhibidores que afectan • Estudios han demostrado que es posible
negativamente el metabolismo generar cepas de C. Thermocellum con
tolerancia mejorada a sustratos
microbiano. lignocelulósicos complejos.
Los análisis proteómicos y transcriptómicos revelan detalles de la
regulación génica inducida por switchgrass.

Proteómica Transcriptómica

Se identificaron 1551
proteínas únicas que
representan ~ 50% de las
proteínas predichas en el
genoma de C. thermocellum
27405.
Se revelaron 435 genes con
Permitió comparaciones
expresión variada. (38 se
cuantitativas detalladas a lo
activaron, 397 se inhibieron
largo de las distintas fases
entre los puntos de tiempo
de crecimiento.
19 y 43 h.)

Identificación de las La respuesta del organismo

principales proteínas y vías a los metabolitos
implicadas en la lignocelulósicos liberados
bioconversión de las en el curso de la
celodextrinas a la energía y deconstrucción del
al etanol. switchgrass.
Es posible predecir regiones en el cromosoma que probablemente contengan genes que puedan ser
altamente expresados, basados en la accesibilidad de la cromatina

El análisis del genoma de C.

thermocellum ATCC 27405 reveló 29
regiones a lo largo del cromosoma
(color verde oscuro).

Regiones (A-F) contienen el conjunto

superior de genes expresados y sus
proteínas abundantes.

• La región B codifica CelK y CbhA, pertenecen a la

familia de glucósidos hidrolasa 9 y están
implicados en el procesamiento catabólico de
polisacáridos.
• La región F codifica CipA, OlpB y la glicoproteína
de superficie celular 2, que son proteínas de
anclaje de celulosomas no catalíticas esenciales.
• Las regiones A, C, D y E codifican diversos
productos proteicos, NADH deshidrogenasa, Es probable que estas regiones estén altamente expresadas en
ferredoxina, dominio de homología de la capa S,
proteínas ribosómicas, subunidad beta de la ARN la mayoría de las condiciones de crecimiento, pero obviamente
polimerasa dirigida por ADN y adenilato cinasas. pueden regularse en condiciones de crecimiento específicas.
Clustering de la abundancia de proteínas
muestra tendencias temporales y sus firmas
funcionales.
Usando la información del
El primer grupo consistía en
proteoma para una
Con una ANOVA se determinó proteínas que se expresaban
cuantificación relativa se
que 566 proteínas fueron durante la primera fase de
investigaron los patrones de
dependientes del tiempo y se crecimiento hasta decaer en la
abundancia de determinadas
agruparon en 4 clusters distintos. ultima parte de la fase
proteínas durante el crecimiento
exponencial (91hrs)
microbiano en el pasto varilla.

El segundo grupo consistió en El 3 grupo estaba formado por El cuarto grupo representaba a
proteínas que reducían su proteínas que incrementaban su las proteínas que incrementaban
abundancia a lo largo de todo el abundancia con respecto al dependiendo de la fase de
proceso de fermentación tiempo crecimiento.
1. Conformado por 2.-Proteínas 3. Proteínas de 4. Catabolismo de
proteínas relacionadas con la transporte y celulosa,
ribosomales, síntesis de metabolismo de modificación post
proteínas aminoácidos, con el carbohidratos y traduccional, divisón
relacionadas con la metabolismo de procesos catabólicos celular, sistemas de
traducción y acido 2- de polisacáridos. secreción
proteínas oxocarboxílico, bacterianos. Las
relacionadas con la glicólisis, proteínas principales
biogénesis de ribosomales. proteínas del cluster
ribosomas. 3 y 4 fueron
proteínas
celulosomales.
 enzimas
Una de las principales
El celulosoma

¿Qué hace?
Es un complejo 19 de las proteínas La xilanasa es crítica
proteico anclado a la del celulosoma en la fermentación
membrana por catalizaban con del pasto varilla, ya
medio de enzimas. exoglucanasa y que la mayoría de la
endoglucanasa para hemicelulosa
facilitar el acceso y proveniente de este
proceso de celulosa pasto esta
a pequeñas conformada por
celodextrinas que xilano (Xilosa +
pueden ser arabinosa)
importadas y
fermentadas.
Formación de ácidos grasos
CONCLUSIONES