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U.E.A: BIOLOGÍA MOLECULAR.

PROFESOR: LUIS GABRIEL CONTRERAS FERRAT

PRACTICA 2.
“CUANTIFICACION DE UNA PROTEINA.”

INTEGRANTES DEL EQUIPO:

 CABRERA RUFINO DIANA PATRICIA

 GARCIA OSORIO BENJAMÍN

 MORALES ARELLANO GONZALO

 PEÑA CAMPUZANO IRVIN LATUAN


INTRODUCCIÓN
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las
pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica.
Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de
nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa
aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y
laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha
permitido solventar estos dos inconvenientes.
La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del
todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases:
El método combina la reacción de iones de cobre con los enlaces peptídicos en un
medio alcalino (test de Biuret) con la oxidación de residuos aromáticos de las
proteínas. El método de Lowry es el más apropiado para concentraciones de
proteínas entre 0.01–1.0 mg/mL y se basa en la reacción del Cu+, producido por la
oxidación del los enlaces peptídicos, con el Reactivo de Folin-Ciocalteu (una
mezcla de Ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico en la reacción de Folin–
Ciocalteu).(F. Lottspeich,2016)
Está basado en la asociación de dos reacciones complementarias:

1. Reacción del Biuret: característica de grupos aminopeptídicos, con los que


el Cu(II) en medio alcalino forma enlaces de coordinación, originando
complejos de color violeta.

1. Reactivo de Folin-Ciocalteu: característica de grupos -OH reductores que,


junto con los complejos cuproprotéicos de la reacción del biuret, reducen el
reactivo de Folin, el cual vira a color azul oscuro.
El espectro de absorción del reactivo de Folin reducido presenta un máximo de
absorción a 750 nm y su intensidad es proporcional a la de proteínas que existe en
la muestra.
OBJETIVO
Obtener la concentración de proteínas usando muestras biológicas de las
fracciones de purificación de la lisozima.

Materiales
 Puntas para micropipetas.
 2 Celdas de 5 ml para espectrofotómetro.
 6 Tubos Eppendorf.
 5 Tubos de plástico o vidrio de 10 ml.
 1 Tubo de plástico de 50 ml.
 Espectrofotómetro.
 Micropipeta de P20 y P20.
Resultado 1 Resultado 2

Concentracion Concentracion Absorbanci


TUBOS (mg/ml) Absorbancia TUBOS (mg/ml) a
1 17.48839011 0.08 1 6.692409032 0.411
2 35.8177298 0.058 2 4.144630814 0.272
3 54.1470695 0.256 3 3.008211753 0.21
4 72.47640919 0.126 4 17.30509671 0.99
5 90.80574888 0.142 5 2.128403448 0.162
6 109.1350886 0.044 6 -0.437704109 0.022
7 127.4644283 0.04 7 4.40124157 0.286
8 145.793768 0.016 8 2.568307601 0.186
9 164.1231077 0.025 9 2.568307601 0.594
10 182.4524473 0.013 10 10.54157037 0.621
11 200.781787 0.048 11 3.723056001 0.249
12 219.1111267 0.047 12 1.743487315 0.141

RESULTADOS N°1
RESULTADOS N°2 0.3

1.2
0.25
1
f(x) = 0.05x + 0.1 0.2
R² = 0.81
0.8
Absorbancia
Absorbancia

0.15
0.6 Linear ()
Li near () f(x) = - 0x + 0.14
0.1 R² = 0.3
0.4

0.2 0.05

0 0
0 100 200 300
-5

5
15

Concentración (mg/ml Concentración (mg/ml)


DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
En esta práctica se llevó a cabo la cuantificación de proteínas y péptidos aplicando
el método de reactivo de Bradford.
En los resultados se obtuvieron 2 graficas. Al obtener la primer grafica se observó
que no era lineal, no cumplía con la curva patrón y por lo tanto no se obtuvo lo
esperado, por lo tanto se presenta error en dicha gráfica. En la segunda grafica se
observó que hay un mínimo error al compararla con la curva patrón, pero en si se
obtuvo lo deseado. Obteniendo un resultado muy diferente al que obtuvimos en la
primer gráfica.
Por último se mencionara que los errores ya observados en la gráfica 1 se
produjeron ya que al momento de pipetear dichos reactivos (H 2O y BSA) nos
equivocamos en las medidas ya establecidas. Por lo que puede ser un motivo de
dichos errores y otra posible opción fue que al leer nuestras muestras en el
espectrofotómetro se alteraban muy rápido los resultados. Y al darnos cuenta de
ello al hacer el procedimiento por duplicado tuvimos más cuidado en lo antes
mencionado.
CONCLUSIONES
Aplicando el método del (Reactivo de Bradford) se puede determinar la
concentración de proteínas en la Albúmina Borina Serica (BSA), que consiste en
el cambio de color del colorante azul-purpura en respuesta a diferentes
concentraciones de proteínas a una longitud de onda de 465 a 595 nm.
CUESTIONARIO
1.-¿Qué diferencia existe entre transmitancia y absorbancia? ¿Cuál es la
expresión matemática que relaciona estos dos conceptos? La transmitancia es la
cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo y
la absorbancia es cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una
parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa
dicho cuerpo. En conclusión la absorbancia se puede identificar como la cantidad
de luz que es absorbida por una muestra dada. Y la transmitancia puede ser
reconocido como la cantidad de luz que pasa a través de esa muestra.

2.-La relación entre absorbancias y concentración de proteínas ¿se mantiene


líneal aunque se incremente mucho la concentración? Haga un comentario al
respecto.
Sí, ya que si aumenta mucho la concentración también aumenta la absorbancia
por la relación proporcional existente entre ambas, esto quiere decir que cuando
haya un cambio en una la otra igual cambiara siguiendo un patrón.
3.- ¿Qué se puede deducir al comparar las actividades de la lisozima de la
Práctica 1 con las actividades específicas que se acaban de obtener? Quedaron
muy diferentes los resultados, los valores no tenían una proporcionalidad.
4. Si se utilizaran fracciones de proteína diferente a la lisozima que tuviera una
concentración inicial idéntica a las fracciones de lisozima ¿se obtendría un
resultado idéntico al aplicarles el método de Lowry? ¿por qué? ¿de qué
dependerían los resultados? No porqué al ser otra proteína tiene una
conformación diferente en cuanto a la cantidad de aminoácidos y también a la
forma de su estructura, seria de un pH diferente. Los resultados dependerían de
cuanta luz es absorbida por la proteína.
5.-¿Conoce otros métodos de medición de la concentración de proteínas?
Sí y son
– Absorción en el ultravioleta (280 nm)
Principio
La mayoría de las proteínas absorben en el UV a 280 nm. Debido básicamente a
grupos cromóforos de tirosina y triptofano. Si se considera que la cantidad de
estos dos aminoácidos es siempre constante la absorbancia debe ser proporcional
a la concentración de proteína.
Ventajas
Es el método más rápido: requiere de muy poca cantidad de proteína. El sulfato de
amonio no interfiere mientras que en la mayoría de los métodos si existe
interferencia. La muestra no se destruye y puede ser usada en otros análisis.
Limitaciones
Se puede hacer una corrección por presencia de ácidos nucleicos ya que estos
tienen absorción máxima a 260 nm. Si se conoce la relación de absorción de la
proteína a 280/260 nm es fácil distinguir la interferencia de ácidos nucleicos. Varía
la cantidad de aromáticos entre proteínas.
– Biuret
Principio
Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo
púrpura-violeta con sales de cobre en soluciones alcalinas. Es posible que el color
se desarrolle por la formación de un ión coordinado tetracúprico con dos grupos
-CO-NHadyacentes.
Ventajas
Es el método más simple para medir la proteína total. Muy pocas interferencias de
otros compuestos en el desarrollo del color.
Limitaciones
Se requiere de 20-40 mg de proteína. Existen varios pigmentos que absorben a
540mm de longitud de onda. La presencia de NH interfiere con la reacción. El
color es diferente para cada proteína. Interfieren lípidos e hidratos de carbono por
formación de complejos con el ion coordinado.
– Lowry
Principio
Se basa en el desarrollo de un color azul debido a: 1) Reacción de Biuret. 2)
Reducción del reactivo de fosfomolibdeno-volframato por aminoácidos como
tirosima y triptófano presentes en las proteínas.
Este método ha sido modificado muchas veces. La absorbencia se mide a 750 nm
(alta sensibilidad o a 500 nm (baja sensibilidad) para proteinas concentradas. Se
requiere de una curva patrón que es recomendable hacer con la misma proteína.
La sensibilidad va desde 0.2 ?g hasta 300 ?g.
Ventajas
Es el método más sensible 100 veces más sensible que el Biuret. Más omenos
rápido(1 h)
Limitaciones
Requiere de muchos cuidados en la estandarización ya que 1) la intensidad del
color varía entre proteínas. 2) El color no siempre es proporcional a la
concentración.
Existe interferencia de lípidos, sacarosa, amortiguadores del PH, monosacáridos y
hexosaminas ya que reaccionan con los reactivos de Lowry. Los sulfatos de
amonio, los sulfhidrilos y los fosfatos también interfieren en la determinación.
– Turbidimétrico
Principio
Las proteínas se pueden precipitar con ácido tricloroacético, ácido sulfosalicílico o
ferrocianuro de potasio en ácido acético. Se produce turbidez que puede ser
estandarizada a una temperatura, concentración y tiempo de reacción para
medirse a 600 nm. Se requiere de curva estándar. El intervalo recomendado va de
0.5 a 1.5 mg de proteína.
Ventajas
Es el método más rápido (10 a 15 min)
Limitaciones
Tiene muchas limitaciones ya que no todas las proteínas precipitan en la misma
forma en presencia de ácidos. Otras sustancias como los ácidos nucleicos
también precipitan en presencia de ácidos.
REFERENCIAS CONSULTADAS
Rhodes MB, Azari PR y Freney RE. 1958. Análisis, fractionation Andrés purification
of egg White proteins with cellulose action exchanger. The journal of Biological
Chemistry 339-402

BIBLIOGRAFÍAS
[1] Branden,C.,Tooze,J.,1999 Introdution to Protein Structure (2d ed.),Garland
pp.88-99
[2] Petsko,G.A. y Ringe, D. 2004. Protein Structure and Function. New Science
Press. pp. 123-135.
[3]Lucas Hernández Hernández y Claudio González Pérez. Introducción al análisis
instrumental. Editorial: Ariel. 1° edición. España. 2002. Página 55.

[4]http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html. Fecha de consulta:


17/06/2018

[5] Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. Fundamentos De Bioquimica/


Fundamental of Biochemistry. Editorial:Panamericana. 2° edición. País de
impresión: China. 2007. Página 100.

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