Proteasas

PROTEASAS
Prof. Andrés R. Alcántara.

Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
1
Enzimas que catalizan procesos
reversibles de hidrólisis de diferentes
sustratos
9Nomenclatura según el Enzyme Commission (E.C.)
E.C.3.X.Y.Z
Tipo de enzimas: Tipo de sustrato

Hidrolasas sobre el que actúan
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 2

3.1 Sobre ésteres
3.2 Glicosidasas (rompen enlaces glicosídicos)
3.3 Sobre éteres
3.4 Peptidasas (rompen enlaces peptídicos)
3.5 Sobre otros enlaces C-N no peptídicos
3.6 Sobre anhidridos de ácido
3.7 Sobre enlaces C-C
3.8 Sobre enlaces C-X
3.9 Sobre enlaces P-N
3.10 Sobre enlaces S-N
3.11 Sobre enlaces C-P
3.12 Sobre enlaces S-S
3.13 Sobre enlaces C-S

E.C.3.4.-.- Acting on peptide bonds (peptide hydrolases).
There are 1582 PDB entries in enzyme class E.C.3.4.-.-
E.C.3.4.11.- Aminopeptidases. [ 46 PDB entries ]

E.C.3.4.13.- Dipeptidases. [ 8 PDB entries ]
E.C.3.4.14.- Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases. [ 4 PDB
entries ]
E.C.3.4.15.- Peptidyl-dipeptidases. [ 3 PDB entries ]
E.C.3.4.16.- Serine-type carboxypeptidases. [ 27 PDB entries ]
E.C.3.4.17.- Metallocarboxypeptidases. [ 35 PDB entries ]
E.C.3.4.18.- Cysteine-type carboxypeptidases. [ 1 PDB entry ]
E.C.3.4.19.- Omega peptidases. [ 6 PDB entries ]
E.C.3.4.21.- Serine endopeptidases. [ 780 PDB entries ]
E.C.3.4.22.- Cysteine endopeptidases. [ 122 PDB entries ]
E.C.3.4.23.- Aspartic endopeptidases. [ 338 PDB entries ]
E.C.3.4.24.- Metalloendopeptidases. [ 196 PDB entries ]
E.C.3.4.25.- Threonine endopeptidases. [ 2 PDB entries ]
E.C.3.4.99.- Endopeptidases of unknown catalytic mechanism. [ 14 PDB
entries ]

LAS MÁS IMPORTANTES EN BIOCATÁLISIS
1. SERIN PROTEASAS
2. ASPARTIL PROTESASA
3. METALOPROTEASAS
4. CISTEIN PROTEASAS
DENTRO DE ELLAS, LAS SERIN PROTEASAS SON LAS MÁS USADAS:

SE SUBDIVIDEN EN:
GRUPO A:
Tripsina
Quimotripsina
Elastasa
Trombina
GRUPO B:
Subtilisina
Los miembros de cada grupo tienen un ancestro común,

Los grupos A y B se han hecho similares a través de un proceso de evolución
convergente

Identidad de secuencia redspecto a la tripsina pancreática de mamíferos.
Fish trypsin 69%
Bacterial trypsin 43%
Mammalian chymotrypsin 50%
Mammalian elastase 48%
Fungal elastase 26%
Mammalian plasma thrombin 38%
Bacterial subtilisin 0%

LAS PROTEASAS DIFIEREN EN SU ESPECIFICIDAD
S2 S'1
O R2 O R'1 O
H H H
N N N
N N
H H
R3 O R1 O R'2
SUBSITIO S3 S1 S'2
HIDROLISIS

S1-S’1

Prsentan un centro de especificaidad
distinto del centro catalítico.
Reconocen las cadenas laterales antes de
la ruptura.
Quimotripsina: aromáticos o voluminosos
z Phe, Tyr, Trp, Leu, Met
Tripsina: grandes, y con carga positiva.
z Lys, Arg
Elastasa: pequeños, hidrofóbicos
Ala

O
O
H H
N N
N N
H H
NH HN NH HN
His O His O
O O
O O Ser O O H Ser
H O O
N Asp N N H
Asp H N
HN
-
R2HN C O
HN (Glu) O
(Glu) O O
HN
HN O
R2HN INTERMEDIO
O C O O
TETRAÉDRICO #1 R1
HN
R1 HN
HO H2O
C O
R2HN O
R1 C O O 2
R NH2
R1
O
O
H
N H
N N
H N
H
NH HN
His O NH HN
His O
O
O
O O H Ser
O O Ser
O
Asp N N H O
Asp H N N
- HN O
HO C O
(Glu) HN
HN O (Glu) O
HN O C O
O R1 H O
O
INTERMEDIO HN ENZIMA ACILADA R1
TETRAÉDRICO #2 H HN
O
O

Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 1

PASO 2

PASO 3

PASO 4

PASO 5

PASO 6

PASO 7

Estructuras cristalográficas
Varias enzimas nativas:

Tripsina, quimotripsina, elastasa…
Proteínas pequeñas (15-34 kD), alta resolución (1-2Å)
Varios complejos:
Enzima-Producto (análogos), eg:
L-formamil-L-Trp embebido en la quimotripsina
Enzima-Inhibidores
Enzima-Acilada
Condiciones
sustratos no naturales que deacilen lentamente:
Indolilacriloil-quimotripsina @ pH4
Carbobenzoxi-Ala-elastasa @ -55°C

Catalisis: Enlaces de H del bolsillo oxianionico
2 enlaces de H con NH193, NH195.

El enlace NH195 es más largi en los
complejos enzima-sustrato o enzima
producto.(3.6Å)
Carbonilo trigonal
Se acorta cuando el carbonilo
piramidaliza
carbon Æ tetrahedral
C==O Æ C—O¯
Favoreciendo el estado de
transición.

Evidencias que implican los enlaces de H en el oxianión
Thioester substrates less reactive

Longer / weaker H-bonds
Perhaps other effects?
Zymogen (inactive) precursors
Gly193 points away
Main chain H-bonds being used
Design for rigidity?

S2 S'1
Otros enlaces de H del esqueleto peolipeptídico.
O R2 O R' 1 O
H H H
N N N
Los tres resíduos antes del enlace que se corta (S1, N
H
N
H
S2, S3) están unidos por enlaces de H a la enzima
R3 O R1 O R' 2
Se forma un a modo de “complejo enzima sustrato tipo S3 S1 S'2
lámina beta) HIDROLISIS
CO214 con NHR1 Catalytic triad

NH216 con COR3. Asp102 His57 Ser195 cleaved bond
CO216 con NHR3.
R2 oxyanion hole
Se mantiene una estructura rígida
R1
substrate peptide (in specificity
pocket)
215
R3 227 189
216
226
Residues important
Non-specific for specificity
H-bonding to
backbone

Triada catalítica
¾El Nε del resíduo His57 actúa

como una base
¾La protonación de la histidina
es vital
¾No – proton stabilized on Nδ by
Asp102.
¾La atraccion del Hδ por el
Asp102 aumenta su pKa.
¾ Si se transfiere por completo,
existe un relé de carga.
¾ Cuando se devuelve el protón
Hε,, el Asp102 devuelve el Hδ:
¾Asp102/His57: buffer protónico

SINTESIS de AMIDAS
O
R3 NH 2
R1 + R2 OH
HN R3
O
HIDROLASE
R1 ORGANIC SOLVENT
O R2
O
+ R2 OH
R1
R3 NH NH2
HN NH R3
NH2 LIPASE
NH2 NH-Acyl
Acyl Donor +
R R R

SÍNTESIS PEPTÍDICA
La síntesis peptídica catalizada por enzimas se puede llevar a cabo de tres
maneras: AMIDACÍON (reverso de la hidrólisis), TRANSPEPTIDACIÓN (menos
frecuente) y AMINOLISIS DE ESTERES.

CONTROL TERMODINÁMICO: en condiciones fisiológicas (entornos acuosos) el
equilibrio está muy desplazado hacia la proteólisis. Por tanto, hemos de “tirar”
del equilibrio en sentido de la síntesis:
¾Usar algún reactivo en exceso
¾Eliminar los productos:

¾ PÉPTIDO
¾ formacion de un
derivado insoluble
por complejación.
¾ Extracción del
producto con un
cosolvente
inmiscible.
¾ AGUA
¾ Evaporación en
contínuo
¾ Disminución de aw
usando un
cosolvente miscible.

CONTROL CINÉTICO: la aminólisis de ésteres supone un proceso
irreveresible donde dos nucleófilos (agua y amina) compiten por el intermedio
acil-enzima.



EJEMPLO 1:
SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UNA ENCEFALINA

EJEMPLO 2: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met- o Leu-ENCEFALINA

EJEMPLO 3: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met-ENCEFALINA

EJEMPLO 4: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UN UNDECAPÉPTIDO

EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
SÍNTESIS PEPTÍDICA:
ESTEREO y REGIOSELECTIVA
X
NH O
X O
OH
NH2 NH O termolisina NH2 NH
+ HO +
OH
O OMe O OMe O OMe
O
(D,L)-fenilalaninato Ácido aspártico (D)-fenilalaninato α-aspartamo
de metilo (N-protegido) de metilo (N-protegido)
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido

X
NH O
X O
OH
+ HO +
OH
O OMe O OMe O OMe
O

X
NH O
X O
OH
+ HO +
OH
O OMe O OMe O OMe
O
Principal problema en la síntesis química: formación del β−aspartamo (AMARGO), que

habría que separar.
VENTAJAS DEL PROCESO ENZIMÁTICO:

•No se produce nada del isómero beta (100 % REGIOSELECCIÓN)
•La enzima es completamente enantioselectiva (se puede partir del ester racémico)
•La reacción tiene lugar en medio acuoso, en condiciones suaves.
•La termolisina se obtiene de Bacillus proteoliticus, un microorganismo termófilo aislado en
una fuente termal (Rokko Hot Spring) en Japón, por lo que puede trabajar hasta 60ºC.
Al ser un equilibrio hay que eliminar los productos para desplazarlo. Se añade exceso de
fenilaninato de metilo (inocuo para la enzima), por lo que se forma el carboxilato del alfa-
aspartamo, que precipita en el medio de reacción, y se aisla facilmente.

The global market volume for this peptide sweetener, with a sweetening
power about 200 times that of sucrose, has been estimated at 14,000–
15,000 tons in 2003 (Ajinomoto 2003).

PROTEASAS PARA LA OBTENCIÓN DE
INSULINA
Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro.

Secuencia identificada por Sanger en 1955.
Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el
tratamiento de la diabetes mellitus (aprox. 5% población
occidental).
Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)
Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:
1. Extracción de páncreas humano
2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales
3. Conversión de insulina porcina en humana
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados
genéticamente
3. Conversión de insulina porcina en humana
Cadena A
Cadena B
Proteasa de Achromobacter lyticus

4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo
Nordisk)
Obtenida a través de fermentación

Pro-insulina de células de S. cerevisiae modificadas
genéticamente
Ester de la insulina humana

4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas
genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)

Pro-Arg -insulina
Conversión: sobre 70 %.
Reactor tipo batch
Mono/di-Arg -insulina

Insulina humana

4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas
genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst Marion
Roussel)
Pre-pro-Arginsulina

Insulina humana

1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
O O O
subtilisina
OEt ONa + OEt
EtO (R) EtO (S)
EtO
O O O
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO

O O O
subtilisin
OEt ONa + OEt
EtO (R) EtO (S)
EtO
O O O
20% emulsion en 30 mM
NaHCO3 acuoso en un sistema
bifásico con tolueno HCl Separación
&
Extracción
O O
OH OEt
EtO (R) EtO (S)
O O
Sintón para la obtención de Secado del tolueno

inhibidores de colagenasa &
(osteoartritis) NaOEt / Δ
O
OEt
EtO
O Rend. global: 87%

Azul: enantiómero convertido

Rojo: enantiómero no convertido

Peptidomiméticos inhibidores
de renina





Compañía: PGG Industries, USA
Utilidad: sintón para la obtención de LY333531, un

inhibidor de la protein Kinasa C

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PROTEASAS

Prof. Andrés R. Alcántara.

Tipo de enzimas: Tipo de sustrato

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 2

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 3

E.C.3.4.11.- Aminopeptidases. [ 46 PDB entries ]

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 4

DENTRO DE ELLAS, LAS SERIN PROTEASAS SON LAS MÁS USADAS:

Los miembros de cada grupo tienen un ancestro común,

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 5

Fish trypsin 69%

Bacterial trypsin 43%

Mammalian chymotrypsin 50%

Mammalian elastase 48%

Fungal elastase 26%

Mammalian plasma thrombin 38%

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 6

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 7

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 8

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 9

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Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 16

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Varias enzimas nativas:

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2 enlaces de H con NH193, NH195.

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 19

Thioester substrates less reactive

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 20

Se forma un a modo de “complejo enzima sustrato tipo S3 S1 S'2

lámina beta) HIDROLISIS

CO214 con NHR1 Catalytic triad

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¾El Nε del resíduo His57 actúa

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¾Eliminar los productos:

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Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido

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Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 37

Principal problema en la síntesis química: formación del β−aspartamo (AMARGO), que

VENTAJAS DEL PROCESO ENZIMÁTICO:

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Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 39

Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro.

Proteasa de Achromobacter lyticus

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 41

Obtenida a través de fermentación

Ester de la insulina humana