LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA

GUÍA DE PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR - AÑO 2018

PARTE I: CLONADO, TRANSFORMACIÓN, PCR, qPCR

Problemas de clonado

1) Se desea clonar en el sitio EcoRI del pUC19 un fragmento de ADN de 800 pb cortado con la
misma enzima de restricción. Para esto se trata el vector con EcoRI y se realizan las reacciones de
ligación correspondientes. Los resultados de las transformaciones se indican a continuación:

i- mezcla de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa, vector cortado (100 ng) y el
inserto (300 ng): 967 colonias azules y 2 blancas.
ii- mezcla de ligación conteniendo buffer, enzima T4 ADN ligasa y sólo vector cortado (100 ng): 962
colonias azules.
iii- vector cortado (100 ng): 914 colonias azules.
iv- vector sin cortar (2 ng): 1200 colonias azules.
v- sin ADN: no se encontraron colonias.

En las placas de Petri (todas conteniendo ampicilina, IPTG y X-Gal) se sembraron 100 µL del mL total
de células transformadas.
a- Indicar qué controles representan los ítems ii-v y qué información se puede obtener de cada uno
de ellos.
b- Calcular la eficiencia de transformación.
c- ¿Por qué se obtuvieron tantas colonias azules en el ítem i?
d- Se realiza una minipreparación de plásmidos de una colonia azul y de una blanca obtenidas en la
transformación anterior. Los plásmidos son analizados mediante electroforesis en gel de agarosa,
obteniéndose el siguiente resultado:

Col. Col.
Patrón PM azul blanca

4500-

2200-
2000-

- ¿Cómo se explica que la diferencia en la migración de los plásmidos no sea 800 pb?
- ¿Cómo haría para estar seguro de que clonó el fragmento de ADN correcto?
2) Usted desea clonar un fragmento de ADN de 800 pb cortado en un extremo con la enzima BamHI
y en el otro con BglII. Con tal motivo, realiza una ligación del mismo con una determinada cantidad
de vector pUC19 cortado con la enzima BamHI, y transforma células competentes de E. coli con una
alícuota de la mezcla de ligación. Al observar las placas de Petri luego de incubarlas una noche a
37°C, Ud. descubre que algo no anduvo bien. Como Ud. no se da por vencido fácilmente, intenta
nuevamente el clonado, claro que con algunas modificaciones. Indique cuál, a su juicio, puede
haber sido el problema durante el primer intento, si el resultado obtenido fue: a) No se obtuvieron
colonias. b) Todas las colonias obtenidas eran azules. c) Todas las colonias obtenidas eran blancas.
También eran blancas todas las colonias obtenidas al utilizar para transformar una ligación control
en la que el inserto fue omitido. d) Ídem (c), otra alternativa. e) Se obtiene una gran cantidad de
colonias blancas; también en el control de transformación al que no se agrega ADN. f) No se
obtuvieron colonias. El control de transformación con plásmido no cortado dio una cantidad
adecuada de colonias azules.

3) Usted desea clonar un fragmento de 1 kb proveniente de digerir un clon de ADNc con las
enzimas SalI y BamHI. Para ello, efectuó reacciones de ligación utilizando el plásmido pBluescript
KS+ cortado con las mismas enzimas, seguidas de transformación de una cepa adecuada de E. coli,
según se describe:
i- la mitad de la reacción de ligación que contiene buffer, enzima T4 ADN ligasa, 100 ng de inserto y
20 ng de plásmido.
ii- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa y 20 ng de plásmido.
iii- 2 ng de plásmido sin cortar.
iv- sin ADN.
La mitad de cada transformación fue sembrada en medio LB con ampicilina, X-gal e IPTG.
Suponga que obtuvo una eficiencia de transformación de 0,9 106 UFC/g de ADN.
a- ¿Qué número de colonias blancas y azules obtendrá en cada placa si el corte con ambas enzimas
tuvo una eficiencia del 100 % y sólo un 1 % del vector utilizado en la reacción de ligación se ligó al
inserto?
b- Qué habría obtenido (no dé números, sólo indique presencia o ausencia de colonias azules o
blancas en cada placa) si:
b1. La reacción de ligación no funcionó.
b2. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pGEX-3X.
b3. Las células utilizadas para la transformación habían perdido el F’.
b4. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pUC119.
b5. El corte con las enzimas de restricción fue poco eficiente.

4) Para complementar una mutante en el gen birA de E. coli usted diseña una estrategia de clonado
en la cual se inserta la región codificante del gen birA en el sitio EcoRI del vector pBluescript SK.
Para ello efectúa la reacción de ligación con el vector e inserto digeridos con dicha enzima. A
continuación realiza las siguientes transformaciones con células competentes de E. coli:

i- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa, 400 ng de inserto y 40
ng del plásmido tratado previamente con la enzima fosfatasa alcalina (4 colonias azules y 136
colonias blancas).
ii- la mitad de una reacción de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa y 40 ng de
plásmido tratado con fosfatasa alcalina (5 colonias azules).
iii- ídem al anterior pero sin el tratamiento con fosfatasa alcalina (48 colonias azules).
iv- 10 ng de plásmido sin cortar (330 colonias azules).
v- sin ADN (no se obtienen colonias).

a- Explique qué indican los resultados y para qué se hace cada una de las placas.
b- Calcule la eficiencia de transformación.
c- Se eligieron 10 colonias blancas y se hizo minipreparación para obtener plásmidos. ¿Qué pasos le
faltaría seguir para corroborar que las colonias seleccionadas respondan a la inducción con IPTG?

5) El siguiente fragmento de 2000 pb codifica para un factor de transcripción humano. Se muestra

el mapa de restricción del mismo (descartar la presencia de otros sitios).

/·············2000pb················/
EcoRI SmaI NcoI EcoRI

ADN 200 1500 300

PROT. H2 N COOH 66kDa

Se desea obtener la proteína recombinante en E. coli como parte de un trabajo práctico. Los
alumnos deducen que al cortar el fragmento con EcoRI y ligarlo en el sitio correspondiente del
vector pUC9, previamente tratado con fosfatasa alcalina, la proteína queda en fase. Realizan
entonces los siguientes pasos:
Paso 1: Transformación de E. coli
i- Mezcla de ligación: vector cortado + inserto, 200 colonias blancas y 40 azules.
ii- Mezcla de ligación: vector cortado, 50 colonias azules.
iii- sin ADN, 0 colonias.

Paso 2: Chequeo del plásmido.

Se tomaron dos colonias blancas (1 y 2) y una azul, y se realizaron minipreparaciones de plásmidos.
Los vectores obtenidos fueron tratados con EcoRI, y visualizados en un gel de agarosa:

Colonia: Azul 1 2 PM
- 3000 pb

-2000 pb

Paso 3: Inducción de la proteína recombinante.

Se realiza el experimento de manera similar al TP, obteniéndose el siguiente esquema de Western
blot.
 /······Azul·····/·······1·······/······2········/ PM
IPTG: - + - + - +
-100 kDa

-70 kDa
-50 kDa

Responder:
a- ¿Qué control faltó realizar en el paso 1 y qué función cumple? ¿Hubiese sido de valor teniendo
en cuenta los resultados obtenidos?
b- En el Western blot se observó una banda presente en todas las calles. ¿Cómo podría explicar
estos resultados?
c- ¿Cómo explica las diferencias obtenidas entre las colonias 1 y 2?
d- ¿Qué modificación haría en el paso 2 para poder diferenciar entre las colonias 1 y 2?
Esquematice un gel de agarosa ilustrando los posibles resultados de su experimento.

Problemas de clonado en fase

1) Se desea expresar un gen de superóxido dismutasa (SOD) de plantas para aislar suficiente
cantidad de proteína, con el objeto de obtener anticuerpos mediante la inmunización de conejos.
Se dispone de un plásmido que contiene la secuencia de ~1 kb de dicho gen bajo el control de un
promotor de plantas (CaMV35S), insertada en los sitios EcoRI/PstI. Ud. desea expresar el gen bajo el
control de un promotor bacteriano, como una proteína de fusión a fin de poder purificarla.
A continuación se dan las secuencias de las regiones 5' y 3' del gen sod en donde están señalados
los sitios de restricción y se encuentran subrayados los codones de iniciación y terminación de la
traducción. El número entre paréntesis indica la posición de la base adyacente.

1kbp
Eco RI

5'
35SCaMV Sma I
Eco RI
3' Pst I
 EcoRI
5' AAA CCA GAT CGT GGG AAT TCA ATG ACT ATT (30) ....................

SmaI
(900) CCC GGG CTC CTG CTT CCG CGT GAA ATC CTG ATC CAG AAA GAT

CTG AAT TCG TAA CTG CAG CCC 3'

EcoRI PstI

a- En el laboratorio se dispone de vectores del tipo pGEX. Diseñe una estrategia de clonado para
expresar dicho gen en Escherichia coli y poder purificar la proteína de fusión.
b- Se realiza la transformación con la mezcla de ligación conteniendo pGEX más inserto, digeridos
con las enzimas de restricción que Ud. eligió. ¿De qué manera puede comprobar si las colonias
obtenidas en la transformación tienen el plásmido con inserto? Indique cuáles de las
construcciones obtenidas permitirán expresar la SOD. Exprese los tamaños de los fragmentos de
restricción con números aproximados.

2) Usted desea expresar el gen de la catalasa 2 de cebada como producto de fusión con
polihistidina. Para ello dispone de un ADNc de 1800 pb cuyos extremos presentan las siguientes
secuencias:

5' GGCTTAGATGGATCCCTGCAAGTTCTGC--------------- 1800 nt ------------------

-------------AGGTCGACGGTAACCGCAGCGCATATAAAAAA 3'

Los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación, respectivamente.

a- Diseñe una estrategia de clonado en un vector adecuado, sin emplear PCR.
b- ¿Qué controles debe efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado?

3) Usted desea producir la ferredoxina plastídica madura utilizando un vector de expresión que
permita su purificación en una única etapa por cromatografía de afinidad.
En el laboratorio donde Ud. trabaja se encuentran disponibles resinas de glutatión-agarosa y de
Ni2+-Sepharosa. El ADNc que Ud. posee está clonado en el vector pUC9 en el sitio único EcoRI. El
fragmento, de 542 pb en total, incluye una secuencia 5´ no codificante, un marco abierto de lectura
y un fragmento 3´ no codificante. Las secuencias relevantes se muestran a continuación:

1 11 21 31 41 51 61
5´···GAATTCATAT TGTTatggtt gggatccagt tcaaacctaa gtttagcctg cagcgcccaC TACTG
71 81 91 101 111
TGTCC CGGGTCGTAG GATCCTGTAG TCGTAGCGAG CTCCCATTGG CTACG--
511 521 531 541
------389 nt------ GTGACT GATGACTAGT CTAAATGTAC TGAATTGAAT TC···3'
Los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación respectivamente, y el
fragmento en minúsculas corresponde al péptido tránsito.
a- Diseñe una estrategia de clonado utilizando los vectores que usted conoce. No utilice
adaptadores ni PCR en la estrategia de clonado.
b- ¿Qué controles debería efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado?
c- ¿Qué controles debería efectuar para verificar que su clonado fue realizado correctamente para
obtener el producto deseado?

4) Se desea expresar el gen de ferredoxina de espinaca como producto de fusión con un hexámero
de histidinas. Se dispone de un vector que contiene el ADNc de ~500 pb y de los vectores de la serie
pQE30/31/32. Los sitios de corte para las enzimas de restricción presentes en el ADN que codifica
para la ferredoxina se muestran resaltados y los sitios de iniciación y terminación de la traducción
se encuentran subrayados. Además, el ADNc posee sitios internos para las enzimas SalI, PstI y KpnI.
Considere que no existen otros sitios de corte.

SacI
5' ......AGT CGA GCT CAG GCC ATG AAA GGG ........

SmaI HindIII
.........ATG CCC GGG GGT ATC GAG TAA AGC AAG CTT CCC... 3'

a- Realice el clonado en el vector adecuado para obtener la proteína unida a una cola de histidinas,
y esquematice la zona de unión.
b- ¿Qué características del vector pQE resultan interesantes para la expresión de proteínas
recombinantes?

5) La gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPN) es una enzima que se encuentra en tejidos de

plantas superiores y cuya secuencia se conoce en maíz y tabaco, entre otras plantas. Para investigar
la presencia de GAPN en trigo, se realizó un Southern blot con ADN genómico de trigo usando como
sonda un fragmento del gen gapN de maíz que contiene 200 nt de la porción 5'.
a- El Southern blot se realizó con ADN proveniente de hojas de trigo, digerido con EcoRI, BamHI y
HindIII, y la hibridización se realizó en condiciones tales que los genes con similitud de secuencia
pudieran ser detectados. La foto muestra el resultado obtenido en el Southern blot. ¿Qué
conclusión puede sacar del mismo?
b- Usando oligonucleótidos degenerados de una región altamente conservada de la enzima de maíz
se obtuvo por PCR un fragmento probable de gapN de trigo, con el cual se aisló el clon conteniendo
el ADNc de longitud completa y se secuenció. A continuación se muestra la secuencia de las
regiones 5’ y 3’ del ADNc gapN de trigo; donde se encuentran resaltados los sitios de inicio y
terminación de la traducción y las posiciones de los sitios de restricción para las enzimas que se
disponen en el laboratorio.

5’gcaatcccagatctttatggcggggacgggggtgttcgcggacgtgctgga (1421 nt)

taaacctcccatctccgtcctacaccatgggctgagcggatcccgattcacagccgtaatc 3’

BamHI: G´GATCC (1459)

BglII: A´GATCT (9)
EcoRI: G´AATTC (no posee)
HindIII: A´AGCTT (no posee)
SalI: G' TCGAC (300)

Proponga una estrategia para expresar la GAPN de trigo en el vector pET28 (a, b o c) con una cola
de histidina amino terminal, realizando el clonado sólo con las enzimas de restricción que están
disponibles (sin usar PCR, ni linkers).
c- ¿Cómo proseguiría el análisis de las bacterias transformadas con el plásmido diseñado para
asegurarse de que las mismas expresen GAPN?

Problemas de PCR

1) En un tubo adecuado para utilizar en un termociclador, usted posee ADN genómico que contiene
entre otras la siguiente secuencia (se expresa según la convención 5'-3’):

5730 ACGTTTGCACGGATCCGATT-------345 nt----------AAACAGTACG

TGCAAACGTGCCTAGGCTAA-----------------------TTTGTCATGC

6105 TAGTCACAC--------234 nt----------------------TAGCCCACACA

ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGT

6359 TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 nt----------

ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-----------------------

6821 AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTA-----70 nt-------CTG

TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCAT-----------------GAC

6930 CATGCATGCACCAATGGCCA----------------504 nt-------CCGGTCAC

GTACGTACGTGGTTACCGGT-----------------------------GGCCAGTG

7462 ACATGTGTCGCACGCACTACTA
TGTACACAGCGTGCGTGATGAT
El ADN se encuentra en una concentración de 0,1 ng/mL. Este tubo contiene además un buffer
adecuado para la Taq polimerasa, 2 mM Mg2+, dNTPs (400 µM c/u), 2U de Taq polimerasa y los
oligonucleótidos que se encuentran subrayados en la secuencia.
Usted realiza la amplificación con un programa que desnaturaliza a 94 °C por 1 minuto, anilla a 55
°C por 1 minuto y medio, y extiende a 72 °C por 2 minutos.
a- ¿Cuáles son los productos que obtendrá luego de 30 ciclos con este programa?
b- ¿Qué sucederá si cambia la temperatura de desnaturalización a 97 °C?
c- ¿Qué obtendrá si el tiempo de desnaturalización se extiende a 2 minutos?
d- ¿Qué productos y de qué tamaños obtendrá si la temperatura de anillado se eleva en 5 °C? ¿Y si
se eleva en 15 °C?
e- Ídem d si la temperatura se disminuye en 8 °C.
f- ¿Qué productos y de qué tamaño obtendrá si la elongación se extiende 1 min adicional?
g- ¿Qué productos obtendrá si la temperatura de elongación se aumenta en 5 °C?
h- ¿Qué condiciones debería utilizar si quisiera obtener todos los productos posibles?
En todos los casos indique los productos, sus tamaños y con qué oligonucleótidos se originarían.

2) La siguiente secuencia pertenece al gen citO, el cual es un regulador transcripcional que controla
la expresión de los genes del metabolismo de citrato en Enterococcus faecalis. Se desea amplificar la
secuencia completa del gen, para ello:

a- Diseñe los cebadores necesarios para poder amplificar el gen completo.

b- Indique el protocolo de amplificación que va a utilizar y el tamaño del producto amplificado.
c- Mencione los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción.

5’AGGAAGAATGTAACAGTGTTTTCAGAAAATGAGGACAAATTCATATTTATAGGAGAAGAACATGAATCCAAC
GGTTGAAGCAGTAAAACGGAACTTAGATTTAACCAGCAGTAAACCTCTAAAAATTTGTACCTACGAAGCCTTTA
AAAAAACCATTATTTTAGGGGATATTCCTGCGGGTGAACGGATTAACGAAAAAGAATTTTCCGAGCAATTAAAC
ATTAGTCGGACGCCCATTCGCTTTGCTTTACAAGAATTGGTCAAAGAACAATTGGTGGAACATATACCTATGGT
GGGTATCGTGGTTAAAGGGATTAGTATGAAAGATGCTTATGAAATTTATGATATTCGTAAATCTTTGGACACTT
TAGCAACCATTAAAGCCATGGAACTCATGACACCAGAAGATTTTGATGAATTGGAAGCCTTACTTCTCGAAGGA
GAACAATACAATAAAAATAACCAAGTAGATGACTTACTACAGAACTTTTCAGATTTTAATTCCTTTATTTATAC
TAAGAGTCAGATGCTACGTTTAAAAAAAATTGTGACTGATCTCCATGCTTACTTAATCTATTTCAGAGATATTG
CGATTCGTGCCTCAGAACGTCGTAGTATTGCCCTAGAAGAACATTGGTTAATTTTCCGCGGAATGAAAACAAAG
AATATTGACCAGATCACACTTTTAACCCATGAACATCTAAATCGTTCGCTTCAATTTATTTTGAAAGAAATGGA
ACGTCGGCAAATTGAATAAGAGAAAATTCTACTAGAAATGCAAAAAAGTACAAGAAGAAATCAT 3’

3) La siguiente secuencia obtenida por RT-PCR, corresponde a la región 5´no codificante del ADNc
del virus de la hepatitis C (VHC). Se desea desarrollar un protocolo de amplificación por PCR de
dicha secuencia que será utilizado para el diagnóstico de infección por VHC.

5´...GTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTAT.....180.......GC
CTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTCGTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCA..3´
a- Diseñe un par de cebadores adecuados (n  22) y un protocolo de PCR que permitan la
amplificación de la región de interés. Marque claramente en qué región hibridan los
oligonucleótidos diseñados y su TM.
b- Indique el tamaño del producto de amplificación obtenido y qué sistema utilizaría para
visualizarlo.
c- ¿Qué control diseñaría para evaluar la presencia de sustancias inhibitorias en la muestra de un
paciente a procesar?
d- Realice un esquema de las bandas que visualizaría en un gel (de las características especificadas
en el ítem b) en el que se corrieron las siguientes muestras:

calle 1: control negativo.

calle 2: control positivo.
calle 3: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con EDTA).
calle 4: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con heparina).
calle 5: marcador de tamaño molecular de tipo Ladder 100 pb.

4) La siguiente es la secuencia de un ARN mensajero que codifica para una proteína de Arabidopsis
thaliana. Usted obtuvo la secuencia a partir de una base de datos pero no cuenta con el clon que la
contiene (ni lo puede obtener) y le interesa hacer estudios de tipo Northern blot. La idea es
construir una sonda a partir de ARN mensajero total (ARNm) de flor, donde usted sabe que este gen
es expresado en niveles elevados y de donde fue aislada esta secuencia inicialmente.
a- Diseñe un juego de oligonucleótidos y un protocolo que le permita construir una sonda utilizando
la reacción en cadena de la polimerasa para estudiar la expresión del gen.
b- Indique las condiciones (programa de la PCR) en las cuales realizará la amplificación.
c- Se ha encontrado una mutante de esta proteína en donde el codón GCG que está subrayado se
convierte en ACA. ¿Qué oligonucleótidos diseñaría si Ud. quisiera diferenciar entre la secuencia
normal y la mutada por PCR? Escriba la secuencia en sentido 5’3’.

1 5’-TAAGACCGAGAGTTAAGGTCAGCTGTTGCGAAGTATACGGTTATTTAGGTAGTCTCAAG
60 ATTGCTCGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAAT
119 GGCCATACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACAGCAAGAG
178 TTCATGAAAAAGAGAAAGAAAGGGAAGTTACCCAGGGAGAAGCTCGGTCAACAATTGCT
237 CGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAATGGCCAT
296 ACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACTTGACCAGAAACAG
355 ATAAACAACTGGTTCATTAACCAACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

En todos los casos indique en la secuencia la región donde hibridarían sus oligonucleótidos.

5) Con el objetivo de investigar la relación antagónica entre la superóxido dismutasa mitocondrial

humana (Mn-SOD) y el TNF (tumor necrosis factor) se propone generar una sonda específica que
permita su detección en bibliotecas diferenciales.
La síntesis de la sonda requiere de una amplificación inicial in vitro, aislamiento y purificación del
amplificado y una posterior marca radioactiva utilizando la enzima T4 polinucleótido quinasa.
Sobre la secuencia del ADNc que se muestra más abajo:
a- Diseñe cebadores que permitan su amplificación in vitro utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa. Indique (subraye) la región de hibridación de los cebadores diseñados.
b- Diseñe un protocolo para su amplificación (reactivos, tiempos y temperaturas) y calcule el
tamaño del producto amplificado.
c- Describa cómo procedería para su aislamiento y qué reactivos utiliza para marcar
radiactivamente el fragmento.

ATGGCTTTCG AACTTCCCGC CCTTCCCTAT GCCCATGATG CCCTGGCTTC GCTGGGCATG

TCGAAGGAGA CGCTCGAGTA TCACCACGAC CTGCACCACA AGGCCTATGT CGACAACGGC
AACAAGCTGA TTGCGGGCAC CGAATGGGAA GGCAAGTCGG TCGAAGAGAT CGTCAAGGGC
ACCTATTGCG CCGGTGCCGT GGCGCAATCG GGGATCTTCA ACAATGCCTC GCAGCACTGG
AACCATGCGC AGTTCTGGGA AATGATGGGG CCGGGCGAAG ACAAGAAGAT GCCGGGCGCG
CTGGAAAAGG CGCTGGTGGA AAGCTTCGGT TCGGTCGCGA AGTTCAAGGA GGATTTCGCC
GCTGCGGGCG CGGGCCAGTT CGGCTCGGGC TGGGCCTGGC TGGTGAAAGA CAGCGATGGC
GCGCTGAAGA TCACCAAGAC CGAAAACGGC GTCAATCCGC TCTGCTTCGG GCAGACCGCG
CTTCTGGGCT GCGACGTCTG GGAGCACAGC TATTACATCG ACTTCCGCAA CAAGCGCCCG
GCTTACCTCA CGAACTTCCT CGACAAGCTG GTGAACTGGG AAAACGTCGC CTCGCGGATG TGA

6) Para la detección del virus del Herpes simplex (HSV) en su laboratorio han diseñado un par de
cebadores que permiten amplificar un fragmento del gen de la glicoproteína D. A continuación se
muestran subrayadas las regiones de anillado de los oligonucleótidos sobre la secuencia del gen.

GTAGGAATCGCAGCGCCAGCGGTTGCAAGGTAAGGCCCCGGCGCGCTCCTTCCTCCTTCTCTGCTGGTCTTTC
TTGGCAGAACACAGGTCACACACACTCTGGATCCCGGGGAAACTGAGTCAGGAGGGATGCAGGGCGGATGGCT
TAGTTCTGGACTATGATAGCTTTGTACCGAGTTCTAGCCAGATAGAAGGTTACCGGGAGCTGGGGAGCGTTGG
ATTTGCTGCTGGGCTGTGCCGGTGCCCAGAAGGCAGGACCTTGCAGAACCAGCCAGGTCCCTGGGAGACTGTC
AGACCCACCAACCTGGTGGCATTCGCAGAGCTGAGATGCATTGGAAATTGCCTTGGGCACATCCCCAAAGATC
AGGATGTCCCACCCCAGTCTGAAGGAGATAAAGTTGGGGGTAGGAGAGACGCAGATGCAAGTGATCAGTCTCA
GTCCCAGACATTGCCTTGCTCTGCGGGTAGGAATTCAGGATTCATTTTCCAGGGAAGTTCCTGACCTCTGAAT
GAGAGGGGCTGTGTAAGGCCAATGCCTGGGAGGAAGGCAAGGATGAGTAGAGGTGGGGGGAAACAAGTGTCAG
GAAGACTCAAAATCTTCCAGAGAAATTGTGCAGGGTCTTACAGATCTGTCCTCAAAGCCATGCAAATTGCCTT
CTTTGCAATGCATACAATGAGGTGTCTCTGGGGGTCAGAACTGGTTATTAGGGAACTTCTAGCCAGGACTGCT
AAATACGCGCTGTTGGCCCACCAGGCTCACCTATAGCCTTCCTTCAGTCTGG

a- Escriba los 2 oligonucleótidos en la forma correcta como para poder encargarlos al proveedor.
Calcule la TM de ambos y el tamaño del producto amplificado.
b- Para la correcta optimización de la detección del virus usted desea conocer la sensibilidad de la
técnica de PCR puesta a punto. ¿De qué manera propone estudiarla?
c- Una vez que finalizó la puesta a punto de la reacción de PCR, ¿qué controles cree conveniente
realizar para una detección confiable del virus en muestras biológicas humanas? ¿Qué pone en
evidencia con cada uno de ellos?
d- En una oportunidad descubre que aparece una banda del tamaño esperado en el control
negativo de la reacción de PCR, ¿cómo procedería a detectar el origen de esa contaminación? ¿Qué
medidas cree conveniente tomar para evitarla?

7) Usted desea comprobar si el gen biot se expresa en tejido hepático sometido a una droga
mutagénica. Utilizando un programa de computación usted realizó el diseño de cebadores para
amplificar un fragmento del ADNc de longitud entre 100 y 300 pb. La siguiente secuencia de ADN
genómico corresponde a una parte del gen biot que incluye un intrón (indicado en letra cursiva, de
282 pb) que abarca desde el nucleótido 2779 al 3061. Los cebadores diseñados por el programa se
encuentran subrayados en la secuencia y numerados del 1 al 6 entre paréntesis arriba de la
secuencia doble hebra del ADN.

2730 (1) (2) 2788

5´-ACGTTTGCACGGATCCGATTAAACAGTACGAGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCAT
3´-TGCAAACGTGCCTAGGCTAATTTGTCATGCTCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA

2797 3032 3045

TAGTCACAC--------234 pb---------------------TAGCCCACACATAG
ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGTATC

(3) 3075 3507

TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 pb------------AGAT
ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-------------------------TCTA

(4) 3571
AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTACTGTGGGCGGCTCTCAGATCATGCA
TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCATGACACCCGCCGAGAGTCTAGTACGT

(5) 3591 (6)

CATGCATGCACCAATGACCA----------------204 pb-------CCGGTCACCAT
GTACGTACGTGGTTACTGGT-----------------------------GGCCAGTGGTA

ACACGTGTCGCACGCACTACTA-3´
TGTGCACAGCGTGCGTGATGAT-5´

a- ¿Qué material de partida utilizaría para realizar el análisis de la expresión?

b- ¿Qué método utilizaría para medir la expresión del gen biot? Explique y justifique la
metodología.
c- ¿Qué controles son necesarios para la interpretación de los resultados de la expresión del gen
biot?
d- Escriba las secuencias de todos los oligonucleótidos y calcule las TM de los mismos.
e- ¿Qué par de cebadores elegiría y cuáles no? Considere todos los pares de cebadores posibles y
justifique su elección o no en cada caso.
f- Calcule el tamaño del fragmento amplificado con el par de cebadores elegidos y diseñe un
programa de PCR adecuado para llevar a cabo la reacción.
g- Si su muestra estuviera contaminada con ADN genómico, ¿los cebadores seleccionados le
servirían para distinguir esta contaminación? Justifique.
h- Proponga la amplificación de un producto que distinga tal situación.
Problemas de clonado en fase empleando PCR

1) La siguiente secuencia corresponde a una parte de la región codificante de una proteína

involucrada en la regulación del desarrollo en vegetales. Con el objetivo de hacer estudios
funcionales se desea clonar en el vector pGEX-3X la zona comprendida entre los aminoácidos 120 y
450 aproximadamente (nucleótidos 300 a 1350 aproximadamente). Por diversos motivos
(secuenciación, clonado de otra regiones, etc.) en su laboratorio se encuentran disponibles los
oligonucleótidos que se enumeran más abajo (éstos han sido diseñados con un sitio de restricción,
adecuado para el clonado, agregado en el extremo 5´, el cual se muestra subrayado y es en todos
los casos el mismo).
a- ¿Podría usar algún par de estos oligos para amplificar la región deseada? ¿Cuáles?
b- En caso afirmativo, ¿qué tamaño de producto se obtendría?
c- ¿Qué protocolo diseñaría para esta reacción de PCR? Indique tiempos y temperatura para cada
ciclo. Considere el cambio en TM cuando se comienza a amplificar el sitio de restricción agregado.
d- ¿Qué función cumple el MgCl2 en la reacción de PCR? ¿Qué efecto causa su ausencia? ¿Y su
exceso?

290 5’ AGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCATTCGTAAAGCTCCTGTAGCAGAGA----
3’ TCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTAAGCATTTCGAGGACATCGTCTCT----

---386 nt----AGAGTTCGTCGTGAGATTACTCGCATGTCCGACAGGGG---533 nt----

-------------TCTCAAGCAGCACTCTAATGAGCGTACAGGCTGTCCCC-------------

TTCGATCTAACACTCACGTCTTCACAGTCAGGTCTCGGGAACACTAGAGAT 3’
AAGCTAGATTGTGAGTGCAGAAGTGTCAGTCCAGAGCCCTTGTGATCTCTA 5’

Oligo 1 5´ GAATTCACATGCGAGTAATCTCACGA 3'

Oligo 2 5’ GAATTCAAGTGCAGAGTCAATGATC 3'
Oligo 3 5’ GAATTCGATTACTCGCATGTCCG 3’
Oligo 4 5’ GAATTCGGCTCTCAGATCATTCGT 3’
Oligo 5 5’ GAATTCGGAGCTTTACGAATGA 3'
Oligo 6 5’ GAATTCCACAGTCAGGTCTCGGGAA 3’
Oligo 7 5’GAATTCAGACCTGACTGTGAAGA 3'
Oligo 8 5’ GAATTCTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA 3’

2) Usted desea amplificar la región codificante de la siguiente secuencia para subclonarla luego en
un vector de expresión. Diseñe los oligonucleótidos (y escriba la secuencia de los mismos) para
realizar una PCR que permita introducir un sitio para el clonado del fragmento en el plásmido pGEX-
3X.
 Met
CAATCTACACATCTTTTATTCAG ATG GAT TTT CAT GGA TTT GCC TCG GTG
GAA CAT GCA CTG GAA CTA CGC CTT AGT ACA ACA TCA TCG GTG GCC
GAA AAC ACA ACG AAT CCC ATC AAG AAG CCT AGC CCG AGT TCT GAT
CAT TGT CTT GAA CCA TCT CTA ACT TTG GCT CTT TCT GGT GAT TCA
TGC GGT GGT TCG TCG TTC TCT ATC GCT AGT GCG AAG AGG GAA AGA
GAG GTT CCG AGT GAA GAA TCG GAG AGA GGA GGA GAG AAC ACT AGT
GGT GAA GAA GAT GAA GAT GGT GGT GTG AAT GGT AAG AAG AAA CTC
AGG TTA ACT AAA GCT CAA TCT GGA CTA TTA GAG GAA GCC TTC AAA
CTT CAC ACA ACT TTA AAC CCT AAA CAA AAG CAA GAG CTT GCA GCT
TGT TGA TAATTGATTTTATATGTGGATTATGTTGCATAAAATTTAAATCACTCAATG
TGCACAGCCCCACCCTTTTTTCAGAGTCATGGGCTTATCTAGTGGTGGAAGAAATAATG

3) Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a continuación (se
subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción).

HindIII
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG - 582 nt - ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC ATT 3’

Se debe obtener la proteína con todos los aminoácidos, y se la quiere purificar introduciendo una
cola de histidinas amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en el vector pET-28. En el
laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI. Los sitios de restricción para estas
enzimas no se encuentran en la secuencia codificante.

a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado
en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares.
b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede
purificarla.
c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

4) En su laboratorio desean clonar la enzima beta-lactamasa de Acinetobacter baumannii como

proteína recombinante en cepas de E. coli. La región codificante se encuentra detallada a
continuación (los codones de inicio y terminación están subrayados, en minúscula se encuentra
señalado el sitio de corte de la enzima BamHI, la secuencia no cuenta con ningún otro sitio de
corte).

GCGTGCTTAGGCAGGGCTAGATATTTCTTATTCGAAATTCAAGATGAAGCATTCTTCAGGACCAAAG
AGGggatccTCATCAGCAAAACGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGCTTCTTTACTCGCCTTTATCGGC
CCTCACTCAAGGATGTATTGTGGTTATGCGTTATATTCGCCTGTGTATTATCTCCCTGTTTCCCACC
CTGCCGCTG---------------------------------100pb--------------------
GCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTTCCCAGCCAGCGTCTTCGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCT
GCTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTTCTCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGG
ATTATCGTCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGA
ATTCCAAAG
Reactivos y materiales con los que cuenta en su laboratorio:
- Kit de pGEM-T Easy
- E. coli JM109 (endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36
proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK+)
- E. coli BL21 (DE3) pLysS (F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR))
- Enzimas de restricción: EcoRI, BamHI
- Reactivos para PCR: Taq polimerasa, dNTPs, MgCl2, etc.
- Cebadores que hibridan en las regiones resaltadas con negrita en la secuencia del gen.
- Vectores de la serie pET-28.

a- Primero realiza una amplificación de la región codificante utilizando los cebadores indicados en la
secuencia.
a1- ¿Cuál es el tamaño del producto amplificado?
a2- ¿Qué vector (de los que dispone) utilizaría para clonar el fragmento amplificado por PCR?
Justifique.
A continuación incuba vector e inserto en una mezcla de ligación, transforma una cepa de E. coli y
siembra sobre placas de LB-agar suplementadas con Amp e IPTG. Como resultado al día siguiente
observa que sólo hay colonias blancas en las placas (inclusive en el control positivo en el que
transformó las células con plásmido cerrado). No hubo desarrollo bacteriano en el control negativo.
a3- ¿Qué cepa de E. coli (de las que dispone) usó para este propósito? Justifique.
a4- ¿A qué se puede deber que no haya al menos algunas colonias azules?

b- Posteriormente, una vez solucionado el inconveniente de la transformación, procede al

subclonado del fragmento de interés en otro vector, liberándolo con la enzima EcoRI.
b1- ¿En qué vector de los disponibles lo clonaría para expresar la beta-lactamasa?
b2- ¿Qué cepa de E. coli usaría para la inducción de la expresión?
Cuando realiza la transformación de esta cepa con el vector de expresión conteniendo el inserto
obtiene numerosas colonias blancas en placas de LB-agar. Toma algunas de éstas, las inocula en
medio fresco e induce la expresión con un inductor apropiado. Al chequear en gel de poliacrilamida
el resultado de la expresión observa que en algunos casos no se logró la sobreexpresión de la
proteína.
b3- ¿A qué puede deberse esta falla? Explique cómo debería resolverla.

5) En el laboratorio donde Ud. trabaja se plantea estudiar la expresión de la proteína pilina de

Pseudomonas aeruginosa (codificada por el gen pilA) durante el proceso de infección de células
humanas. Para ello Ud. debe obtener anticuerpos específicos contra dicha proteína mediante
sobreexpresión del gen pilA en células de E. coli, purificación de la proteína recombinante a través
de un método cromatográfico y posterior inoculación en conejo. Diseñe una estrategia de clonado
que le permita llevar adelante este objetivo, teniendo en cuenta que las pilinas son normalmente
sintetizadas como precursores y posteriormente procesadas en su extremo amino-terminal por
endopeptidasas que remueven el péptido señal produciendo la proteína madura.
A continuación se muestra la secuencia del gen pilA de P. aeruginosa, en la cual se encuentra
subrayado el único sitio de restricción que posee (correspondiente a la enzima NheI).
ATGAAGTCGATGCGTCATCTCAACAAGCGTGTCCAGAAGGGTTTCACGCTGATCGAACTGATGATCG
TGGTCGCGATCGTCGGTATTCTGGCTGCGATTGCCATTCCGGCCTATCAGGACTACACGGTTCGTGC
ACGCGTGACGGAAGGTCTGTCGCTGGCTGCGCAAGCCAAGGCGCTGGTGTCGGAAAACGCTGCCAAT
GCACAGTCTGACCTGTCGGTGGGTTCGTCGGTGTTCACGCCCACCAAGAACGTTGCCAACTTGACGA
TTGCTGGTACGGGTACTGTTCCGGGTCAGATCACCGTCACCTATACGACGGCAGCTGGCGGCGGCAC
GCTGGCTCTGGTTCCGACTGCGGCTGGTACTGCACTGCCGGTTAGCTCGGCACCGTCGGGCCCGATC
ATGTGGACCTGCTACGCTCAGAATAAGGCTCAGGCTGCTAGCAGCGTTGCTCCGAGCGGTACGATGT
CGCTGGCAGCGAAGTATGTTCAGCAGAATGTCGCTAA

6) La siguiente es la secuencia del ADNc que codifica para una proteína que actúa como factor de
transcripción en plantas. Se encuentran subrayados los codones de iniciación y terminación de la
traducción.
a- Diseñe un par de oligonucleótidos que le permitan amplificar la secuencia codificante completa
para clonarla y expresarla en el vector pGEX-3X en los sitios BamHI y EcoRI.
b- Indique en qué región de la secuencia hibridan los oligonucleótidos diseñados y el tamaño que
tendrá el fragmento amplificado.
c- Indique las condiciones experimentales en las cuales va a hacer funcionar el termociclador.

1 5’-TGTAATATTT GTGGGGTAAA AGCCATGATT CAGATAATTG GGGCTTGCTG ATGGGTACCA

61 ACATAAAGGC ATGATTGAAC TCTCCACTCC TTTCTTTATA ATCCCTTCCA CACGCACTTC
121 TCCACTTCAT AGTCACAACT AGAGATGACG GTTCAAAAGG AAGATTTGGG CTTGAGTCTA
181 AGTTTGAGCT TCCCTCTCCT CTCCTCTTCT CCTTCCAGCC ACAACCCTCA GAAACCCTCT
241 TGGAACGACC CTATTTTCAC TTCTTCAGGT GAAGCTGGAT CATTCCTCCG CGGAATCGAT
301 GTGAACCGTT TACCTTCTGT GGTTGATTGC GAAGAGGAAG CAGGTGTTTC ATCTCCAAAC
361 AGCACGGTTT CTAGCGTCAG TGGAAAGCGC AGCGAGAGGG AAACCAATGG AGAAGAAAAC
421 GACACAGACA GAGCTTGTTC CAGAGGCATC ATCAGCGACG AAGAAGATGC TGAAACCTCT
481 AGAAAGAAAC TTAGACTCTC CAAAGATCAG TCAATTGTCC TGGAAGAGAG CTTCAAAGAA
541 CACAACACTC TTAACCCCAA GCAAAAGTTG GCACTGGCGA AACAGCTGGG TCTTCGAGCG
601 AGACAAGTGG AGGTGTGGTT CCAGAACAGA CGGAGGAAAA AAAAAAAA-3’

Problemas de real time PCR (Cuantificación absoluta)

1) En un estudio de cuantificación de carga viral de ADN de un virus por real-time PCR, se preparó
una curva estándar usando el plásmido pV48 que contiene el genoma del virus clonado en el vector
pGEM-T. La concentración del plásmido fue determinada espectrofotométricamente y expresada
en Nº de copias/mL. Se prepararon diluciones seriadas desde 1 x 1011 a 1 x 104 copias/mL. Se realizó
la qPCR de cada muestra por triplicado obteniendo los Ct promedio correspondientes (Tabla) para
generar la curva estándar. Mediante una regresión lineal de la misma, se obtuvo la ecuación a partir
de la cual se pueden cuantificar muestras desconocidas (Figura). Se corrieron dos muestras
incógnitas en la misma placa y se obtuvieron los Ct (Tabla).
a) Usando los datos que surgen de la curva estándar, ¿cuál es el Nº de copias de ADN del virus en
las muestras 1 y 2?
b) ¿Cuál es la eficiencia de la PCR que surge de esa curva? Mencione algunas causas que afectan la
eficiencia de la PCR.
 Estándar Log10 Ct 40
Nº copias/mL
2,86 x 1011 11,46 9,29 35
30
2,86 x 1010 10,46 12,97 25
9 Ct
2,86 x 10 9,46 17,89 20
15 y = -3,9667x + 54,753
2,86 x 108 8,46 21,53 R 2 = 0,9969
10
2,86 x 107 7,46 25,04 5
0
2,86 x 106 6,46 28,12
2 4 6 8 10 12
2,86 x 105 5,46 33,01 Log Nº copias iniciales/mL

2,86 x 104 4,46 37,69

Muestra 1 ¿? 29,25
Muestra 2 ¿? 37,24

2) La cuantificación por real-time PCR de ADN del virus de hepatitis B (HBV) es muy
importante en el diagnóstico y pronóstico de la infección. Con el fin de cuantificar en
forma absoluta ADN de HBV, se realizó una curva patrón usando como molde un
estándar biológico comercial, con el que se hicieron diluciones seriadas, y la cantidad
del mismo fue expresada en Unidades Internacionales/mL (UI, 1 UI equivale a 6 copias
del virus). Para la qPCR, se usaron oligonucleótidos específicos contra un segmento del
gen S que codifica para el antígeno de superficie, y una sonda específica Taqman. Junto
con los estándares se corrieron las muestras incógnitas, obteniendo los
correspondientes Ct (Tabla).

Concentración Ct 30

inicial estándar Log10 (promedio de

(UI/mL) triplicados) 25

10000000 7 10,81 20
1000000 6 13,99
Ct y = -3,474x + 34,975
100000 5 17,55 15
2
R = 0,9997
10000 4 21,01
10
1000 3 24,65
100 2 28,04 5
10 34,60
C (control sin 0
34,73 0 1 2 3 4 5 6 7 8
molde) Log cantidad inicial ADN virus (UI/mL)
Muestra 1 16,10
Muestra 2 17,13
Muestra 3 17,08
Muestra 4 15,00
a) Determine la concentración en UI/mL de las muestras incógnitas a partir de la curva estándar
b) La muestra estándar que contiene 10 UI/mL no se incluyó en la curva patrón. ¿Cuál fue el
motivo? Según los resultados obtenidos, ¿cuál sería el límite de detección para este ensayo?

3) Se dispone de un plásmido que tiene la secuencia del HBV clonada y cuyo peso molecular es de
3,8 kb. Se usará este plásmido para preparar la curva de calibración estándar necesaria en la
determinación de hepatitis B mediante cuantificación absoluta por qPCR. La concentración del
plásmido es de 10 ng/μL. La curva será realizada con concentraciones que van desde 10 9 a 102
copias/mL. ¿Qué cantidad de plásmido debo tomar para preparar la concentración equivalente a
109 copias?

4) En la figura se muestran gráficos de amplificación representativos de un experimento de real-

time PCR para investigar la presencia de la bacteria Legionella pneumofila. Se está probando la
eficiencia de un par de oligonucleótidos y el fluoróforo usado fue SYBR Green. Paralelamente, se
corrió el control sin molde (NTC, no-template control). Además, en la figura se muestra la línea que
corresponde al umbral (Threshold).
1) De acuerdo a lo observado, complete los cuadros en blanco con el Ct (threshold cycle)
aproximado para cada una de las determinaciones y fundamente el resultado obtenido.
2) Ud. no está conforme con el resultado del NTC ya que considera que arroja un alto valor de Ct.
¿Cómo comprueba la especificidad de la reacción y la eficiencia de los cebadores?

Edición 2018, confeccionado por los docentes del Área Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.

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