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PREGUNTA CIENTÍFICA
HIPÓTESIS
Si la familia Commelinaceae contiene compuestos químicos de estructura
flavónica e hidroxicumarínica que se caracterizan por ser bactericidas y
antiinflamatorias entonces la especie Rhoeo discolor L. Hér Hance presenta
algún tipo de estos compuestos con esta acción terapéutica.
OBJETIVOS
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos del maguey morado
(Rhoeo discolor L. Hér Hance) sobre diferentes agentes causales de
enfermedades sobre humanos.
Página
1. Resumen 1
2. Abstract 2
3. Introducción 3
4. Antecedentes 6
4.1. Estudios fitoquímicos 6
4.2. Familia commelinaceae 6
4.3. Estudios quimiotaxonómico 9
4.4. Rhoeo discolor L. Hér Hance 12
4.5. Los flavonoides, cumarinas y quinonas 14
4.6. Flavonoides y quinonas biológicamente activas 15
4.7. Cumarinas biológicamente activas 20
4.8. Estudios microbiológicos 23
4.9. Microorganismos patógenos utilizados en las pruebas antimicrobianas 24
4.9.1. Familia enterobacteriaceae 24
4.9.2. El género Escherichia 25
4.9.3. El género Shigella 28
4.9.4. El género Salmonella 29
4.10. Crecimiento, sobrevivencia y muerte de los microorganismos 31
4.10.1. Crecimiento 31
4.10.2. Crecimiento exponencial 32
4.10.3. Curva de crecimiento 33
4.11. Aplicación de los agentes quimioterapéuticos 35
4.12. Mecanismo de resistencia a los antibióticos 36
5. Materiales y métodos 37
5.1. Recolección y preparación de la materia prima 37
5.2. Materiales para estudio fitoquímico 37
5.2.1. Cromatografía en capa delgada 37
5.2.2. Cromatografía en columna 37
5.2.3. Cromatografía en capa preparativa 38
5.2.4. Equipo para análisis espectroscópicos 38
5.2.5. Agentes reveladores 38
5.3. Material para estudios microbiológicos 39
5.4. Metodología para estudios fitoquímicos de metabolitos 39
5.4.1. Identificación de familias de metabolitos 39
5.4.2. Alcaloides 39
5.4.3. Flavonoides 39
5.4.4. Saponinas 39
5.4.5. Antraquinonas 39
5.4.6. Lactonas 39
6. Resultados 60
6.1. Estudio fitoquímico 60
6.1.1. Identificación de metabolitos secundarios en los extractos de 60
Rhoeo discolor
6.1.2. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno del 60
compuesto EacEtC1
6.1.3. Espectrometría de masas del compuesto de estructura cumarínica 62
(acet2)
6.1.4. Espectroscopia infrarroja del compuesto cumarínico (acet2) 63
6.1.5. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno del 64
compuesto cumarínico (acet2)
6.1.6. Espectroscopia infrarroja de la cumarina acetilada 66
6.1.7. Espectrometria de masas de la cumarina metilada 68
6.1.8. Espectroscopia infrarroja del compuesto metilado 68
6.1.9. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de hidrógeno de 69
la cumarina metilada
6.2. Estudio microbiológico 71
7. Discusión 89
8. Bibliografía 93
RESUMEN
Por otro lado, por estudio fitoquímico de esta especies descubrió la presencia
de los compuestos cloruro de sodio, cloruro de potasio, ácido hexadecanoico, ácido
9,12-octadiecanoico, hidrocarburos saturados (ceras), carotenos, γ-sitosterol, β-
sitosterol, estigmasterol y un compuesto importante de estructura cumarínica
hidroxilada 4-(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H-furan-2- ona) que podría ser la
responsable de la acción antiinflamatoria y bactericida.
1
ABSTRACT
2
Actividad antimicrobiana y elucidación estructural de los
metabolitos presentes en “maguey morado” (Rhoeo discolor L.
Hér Hance)
4. INTRODUCCIÓN
3
La especie mencionada es conocida desde la llegada de los españoles y ha
sido recomendada para el tratamiento de enfermedades de tipo gastrointestinales
(gastritis, úlceras, infecciones, inflamaciones y cáncer del aparato digestivo).
La planta “maguey morado” (Rhoeo discolor L. Hér Hance) es miembro de la
familia commelinaceae y varias especies de esta familia son investigadas por
presentar importantes aplicaciones medicinales como antiinflamatorios e infecciones
del aparato digestivo (Martínez, 1959).
Sin embargo, a la fecha no existe información científica y existe un total
desconocimiento de la presencia de compuestos químicos con posibles propiedades
medicinales y por lo mismo es de suma importancia realizar investigación fitoquímica
que lleve a la elucidación estructural de los metabolitos presentes en esta especie y a
demostrar su efecto sobre ciertos microorganismos patógenos en la salud humana.
En este trabajo se generó información sobre el conocimiento químico de la
planta medicinal conocida vulgarmente como “maguey morado” (Rhoeo discolor
L.Hér Hance) ; una de las especies más utilizadas en las comunidades indígenas del
estado de Veracruz.
4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
PREGUNTA CIENTÍFICA
HIPÓTESIS
Si la familia Commelinaceae contiene compuetos químicos de estructura
flavónica e hidroxicumarínica que se caracterizan por ser bactericidas y
antiinflamatorias, entonces la especie Rhoeo discolor L. Hér Hance presenta algun
tipo de estos compuestos con esta acción terapéutica.
OBJETIVOS
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos del maguey morado (Rhoeo
discolor L. Hér Hance) sobre diferentes agentes causales de enfermedades en
humanos.
Identificar la estructura química de los metabolitos secundarios presentes en Rhoeo
discolor L. Hér Hance, responsables de la actividad antimicrobiana.
5
2. ANTECEDENTES
6
Son plantas sin tallos o con tallos articulados aéreos suculentos, de hojas
alternas, aplastadas, enteras, con vaina basal cerrada. Tallos subterráneos con raíces
adventicias fibrosas u ocasionalmente huecas y tuberosas.
Las inflorescencias, por lo general, son cimosas dispuestas o bien en el
extremo de los tallos o en las axilas de las hojas; flores bisexuales, generalmente
regulares, a veces irregulares; periantio compuesto de 2 verticilos de 3 piezas, el
extremo generalmente con 3 sépalos verdes imbricados, el interno con 3 pétalos
libres, casi siempre de igual tamaño.
En algunas especies, los pétalos están soldados en un tubo, mientras que
raramente aparece uno de ellos reducido en tamaño; estambres con dos verticilos
trímeros, a veces uno de ellos formado por estaminodios (en un género sólo un
estambre funcional y ningún estaminodio), con filamentos normalmente libres y a
veces adornados de pelos de colores vivos, con anteras de dehiscencia por poro
apical; ovario súpero, con 3 carpelos soldados, con 3 cavidades, rara vez 2, cada
carpelo con 1 a varios óvulos ortótropos de placentación axilar; estilo único
terminado, o bien en una cabezuela estigmática aplastada o en 3 ramas estismáticas.
Fruto en cápsula de pared delgada, aunque alguna vez puede ser carnoso e
indehiscente; semillas con superficie rugosa o acanalada, cubiertas por un arilo con
abundante endospermo farinoso y embrión situado bajo una estructura discal
(embriotegio) de la cubierta seminal (Heywood, 1985).
7
Cuadro 1. Algunos géneros de la familia Commelinaceae y su localización en los
diferentes continentes.
8
(Hutchinson, 1979; Heywood, 1985; Gentry, 1993).
Los géneros utilizados como plantas de jardín, invernaderos e interiores son:
9
Aunque la familia Commelinaceae es muy numerosa, se han realizado estudios
fitoquímicos detallados que caracterizan metabolitos secundarios de sus géneros
aunque algunos de estos no han sido objeto de investigación química como es el caso
de Rhoeo discolor.
Algunos géneros de esta familia son utilizadas como planta de ornato, debido a
los colores intensos que presentan en sus hojas y flores como es el caso de los
géneros Zebrina y Commelina. Esto mismo ha sido motivo para que algunos
investigadores estudiaran los pigmentos de estas especies, como es el caso de la
investigación fitoquímica realizada a Zebrina pendula, de la cual se aislaron e
identificaron algunos metabolitos contenidos en los pétalos de sus flores y que
presentaron la estructura de 3-O-(6-0-(2,5-di-O-cafeil-L-Arabinofuranosil)-β-D-
Glucopiranosil)-3,7-di-O-(6-O-Cafeil-β-D-Glucopiranosil) Cianidina (Idaka et al., 1987).
3-O(6-0-(2,5-di-O-cafeil-L-arabinofuranosil)-β-D-glucopiranosil)-3,7-di-O-(6-O-cafeil-β-D-
glucopiranosil)cianidina.
10
Otro grupo de investigadores japoneses encabezados por Goto Toshio,
realizaron estudios fitoquímicos a Commelina comunis de la cual identificaron en los
pétalos de sus flores el compuesto 3-O-(6-O-(trans-p-cumaroil)B-D-glucosil-5-O-(6-O-
Malon-β D-lucosyl) Delfinidina (Goto-Toshio et al., 1983).
Isoflavocommelitina
11
Otras de la plantas estudiadas de esta misma familia es Cyanotis vaga, de la
cual se logró aislar un nuevo compuesto de tipo Phytoecdysona al cual denominaron
commisterona (Santos et al., 1970).
Por estudio fitoquímico de la planta Forrestia mollissima se aisló del extracto
de butanol un compuesto muy interesante que mostró actividad depresiva en el
sistema nervioso central. Este compuesto fue denominado ecdisterona (Tandon et al.,
1982).
Uno de los géneros más estudiados por atribuirle propiedades medicinales es
el género Commelina. Así, Commelina undulata fue estudiada por Sharma et al., y de
esta planta lograron identificar los compuestos; 2-heneicosanona, n-octacosanol, β β-
sitosterol, β-D-glucósido de sitosterol y un triterpeno caracterizado como acetato de
dammar-12, 25-dieno (Sharma et al., 1982).
Otra especie del mismo género, Commelina comunis fue estudiada por Goto
demostraron que la coloración azul de los pétalos de sus flores se debía a la
presencia del compuesto malonilawobaina es decir al 3-O-(6-O-(trans-P-cumaroil) β-
D-glucosil-5-O-(6-O-malonil-β -D-glucosil) delfidina (Goto Tosió et al., 1983).
Este mismo grupo de investigadores, dirigido por Goto y Kondo Tadao han
realizado numerosos estudios a distintos géneros de la familia Commelinaceae,
dentro de los que se encuentran Zebrina pendula, Rhoeo spathacea y Setcreasa
purpurea y de estas plantas aislaron antocianinas acetiladas. El método de separación
de estos pigmentos fue cromatografía líquida de alta eficiencia (Idaka et al., 1987).
Estos investigadores publican en 1987 la estructura de una antocianina aislada
de Zebrina pendula y la denominan zebrinina y correspondió a la estructura 3-O-(6-O
(2,5-di-O-caffeil-L-arabinofuranosil-B-D-glucopiranosil)-7-3-di-O-(6-O-caffeil-β-D-
glucopiranosil) cianidina (Idaka et al., 1987).
También se han realizado estudios fitoquímicos al género Zebrina para
comprobar el origen de su coloración y la estabilidad del mismo, demostrando que el
excepcional color se debe a las antocianinas presentes (Brouillard, 1981).
En la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia de Colombia se
investigó la actividad antiviral y antitumoral de nueve especies de plantas
12
medicinales de Colombia y dentro de estas, se encontraba Callisia grasilis de la
familia Commelinaceae y encontraron que esta planta presentaba actividad
antiherpética (Galvis et al., 1999).
2.4. Rhoeo discolor L. Hér Hance
13
En la República Mexicana, el género Rhoeo ha sido localizado en los siguientes
estados: Chiapas, Puebla, Tabasco, Yucatán, Quintana Roo y Veracruz (Del Amo,
1979; Martínez, 1979) (Fig.2).
14
2.5. Los Flavonoides, cumarinas y quinonas
Los flavonoides son metabolitos secundarios que se encuentran en las plantas
y en algunos insectos y que le confieren a los organismos vivos una gran variedad de
colores. Estos compuestos estan formados por un anillo bencénico (anillo A), una
cadena lactónica que puede estar abierta o cerrada y otro anillo bencénico (anillo B)
tanto el anillo A como el B pueden contener uno o varios grupos o sustituyentes,
preferentemente grupos hidroxilos, metoxilos o cadenas alifáticas (Ikan, 1969). Esta
gran familia de compuestos químicos se subdivide en subfamilias que presentan
cierta variedad en su estructura base, por ejemplo, flavonas, flavanonas, flavonoles,
isoflavonas, catequinas, leucoantocianinas, antocianinas, auronas y chalconas
(Nakanishi, 1975).
B
O
A
cadena lactónica
O
Estructura flavónica
15
recomendación de preparar las plantas medicinales en forma de té
(Venkataraman, 1955; Harborne, 1975).
La investigación fitoquímica de plantas que contiene este tipo de metabolitos
no se puede realizar aplicando una regla general , ya que, debido a la gran variedad
de ellos y por su variable solubilidad es muy difícil proponer las extracciones con un
determinado disolvente, y por esta razón es recomendable iniciar el proceso de
investigación a partir de disolventes apolares y proseguir aumentando la polaridad de
los mismos con otros tipos de disolventes, hasta obtener una mejor resolución en el
proceso de aislamiento.
Otra observación importante para el estudio de estos compuestos es realizar
el experimento utilizando plantas frescas para evitar la descomposición de algunos
metabolitos que son muy sensibles a la acción de la luz y del aire, cuando su proceso
enzimático ha cambiado.
16
Otros investigadores también realizaron estudios con el compuesto diosmina el
cual presentaba efectividad moderada desinflamatoria en los edemas (Tarayre y
Lauressergues, 1975).
Es tal importancia de estos compuestos químicos, que Kyogoku y su grupo,
aislaron una nueva flavonona de la planta Sophora angustifolia y patentaron dicho
compuesto como agente terapéutico en el tratamiento de úlceras digestivas. Este
compuesto fue caracterizado como 2’, 4’, 7-trihidroxi-5-metoxi-8-(5-hidroxi-5-metil-2-
isoprofenilhexil)-flavanona (Kyogoku et al.,1974).
Otro compuesto de estructura muy relacionada al anterior, la 3, 4’, 7-trihidroxi-
3-O-di-D-hexuronato también fue reportada como biológicamente activo contra las
úlceras (Rossler et al., 1974).
El mismo grupo de investigadores descubrieron que los compuestos de tipo
chalcona (compuestos derivados de flavonoides) presentaban actividad contra úlceras
estomacales. Ellos estudiaron una serie de compuestos de isoprenilchalconas como
inhibidoras de úlceras pépticas (Kyogoku et al., 1974).
En otra investigación realizada a Helichrysum odoratissiumn (Asteraceae) se
encontró que el compuesto 3-O-metilquercetina exhibía importante actividad
antimicrobiana y este resultado comprobaba la acción medicinal de esta planta, que
es muy utilizada en el sureste de África para aliviar dolores abdominales y contra
infecciones de heridas. En este mismo trabajo se publica el aislamiento de otro
compuesto, que corresponde a la 3, 5- dihidroxi-6, 7, 8-trimetoxiflavona, pero este no
presenta actividad antimicrobiana (Puyvelde et al., 1989).
Nuevamente los flavonoides presentes en algunas plantas son los causantes de
la acción farmacológica, como es el caso de Kalanchoe gracilis (Crassulaceae) que es
un vegetal muy utilizado en Taiwán para el tratamiento de lesiones de heridas y
como antiinflamatoria. De la parte aérea de esta planta se aislaron nueve flavonoides
y una cumarina, dentro de los que se encuentran quercetina, kaempferol, glucósido
de quercetina, glucósido de kaempferol, glucósido de cianidina, diglucósido de
pelargonidina, leucocianidina y kaempferol cumaroil arabinósido. La presencia de
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estos metabolitos le confieren a la planta una marcada acción farmacológica (Chiung
et al., 1989).
En la India utilizan la planta medicinal Verbascum thapsus (Scrophulariaceae)
para el tratamiento de enfermedades inflamatorias; así también, como antiviral, de
esta planta aislaron un nuevo triglicósido de luteolina determinando su estructura por
espectroscopía. En este trabajo reportaron la identificación del compuesto
mencionado que corresponde a un derivado flavonoide, pero no realizaron estudios
de su acción farmacológica (Mehrotra et al., 1989).
Otra planta estudiada fitoquímicamente por sus propiedades antimicrobianas y
citotóxicas es Hypericum drummondii (Hypericaceae), de ésta, los extractos
hexánicos mostraron importante actividad contra las bacterias gram-positiva,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Mycobacterium smegmatis. De esta planta
se aislaron cuatro nuevos compuestos de tipo Rottlerina (drummondinas A, B, C y F)
la actividades antimicrobianas de estos compuestos fueron comparables y aún mayor
que lo demostrados por la estreptomicina (Jayasuriya y McChesney, 1989). Es
importante hacer notar que esta planta ha sido utilizada para el tratamiento de
tumores.
En la Península Ibérica fabrican un extracto de Prunus spinosa (Rosaceae),
utilizado en medicina tradicional con el nombre de “Pacharan” y recomendado como
agente antihipertensivo, antiespasmódico y antiinflamatorio. El estudio fitoquímico
condujo al aislamiento de heteróxidos de flavonol (quercetina y kaempferol) y las
cumarinas aesculetina, umbelliferona y escopoletina. Estos metabolitos mostraron
propiedades antitóxicas, antiespasmolíticas, antiinflamatorias y diuréticas (Crespo y
Fernández, 1992).
Otra especie de la misma familia, Waldsteinia fragarioides (Rosaceae), fue
estudiada por Abou-Karam y Thomas Shier por sus propiedades antivirales y
encontraron que los extractos polares de ésta mostraban un alto nivel de actividad
antiviral y que el componente activo es glicósido de flavonoide, isoquercitrina (3, 3’,
4’, 5, 7-pentahidroxiflavona-3-β-O-glucósido) (Abou-Karam et al., 1992).
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Las leguminosas, también contienen compuestos de tipo preniflavonas que son
considerados como antiinflamatorios, antialérgicos y antihepatotóxicos e inclusive son
reconocidos en la industria farmacéutica. Kajiyama et al., (1992), aislaron de las
raìces de Glycyrrhiza inflata (Leguminoceae), dos nuevas preniflavonas, licoflavonas B
y C junto con dos flavonas licoflavona A y 4, 7-dihidroxiflavona. Así también de otras
especies como la G uralensis y la G. glabra aislaron el principio dulcificante
glycyrrhizina. Este compuesto es comúnmente encontrado como uno de los
ingredientes en la medicina tradicional China y ha sido considerado como
antiinflamatorio y antialérgico, así también, se ha utilizado para el tratamiento de
úlceras gástricas por lo que se considera de segura eficacia farmacéutica (Kajiyama
et al.,1992).
Se han realizado diferentes estudios fitoquímicos y farmacéuticos de plantas
que se utilizan en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales o de úlceras
pépticas y la gran mayoría de los resultados de estos trabajos descubren la presencia
en estos vegetales de compuestos de tipo flavónico o quinónicos como por ejemplo,
los estudios realizados a Linaria japónica (Scrophulariaceae) que es una hierba
perenne utilizada como purgativa y diurética, de la cual se aislaron 5 glicósidos de
flavonoides y que es muy posible que la acción terapéutica de este vegetal se deba a
estos compuestos (Osuka, 1992).
Varias especies del género Chromolaena (Compositae), son utilizadas en
medicina tradicional de Sudamérica y se ha descubierto que en este género abundan
metabolitos potencialmente activos principalmente flavonoides y terpenoides dentro
de los que se encuentran umbelliferona, 5, 7-dihidroxi-8, 4’-dimetoxiflavona y ácido
parametoxibenzoico (Amaro, 1993).
En otro género de esta misma familia, Tanacetum microphyllum (Compositae)
se encontraron flavonoides con propiedades antiinflamatorias y fueron reconocidos
como 5, 7, 3’-trihidroxi-3, 6, 4’-trimetoxiflavona (centaureidina) y 5, 3’-dihidroxi-4’-
metoxi-7-carbometoxiflavonol. Esta planta es reconocida en España y utilizada en el
tratamiento de enfermedades inflamatorias y para enfermedades en el aparato
digestivo (Abad et al., 1993).
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De la familia Moraceae, también se han aislado compuestos de tipo
prenilflavonas, los cuales ya se habían mencionado anteriormente por sus
propiedades medicinales. Chien-Chih Chen y cols., estudiaron a Artocarpus altilis y
aislaron tres nuevas prenilflavonas y publicaron las estructuras de estos metabolitos
pero no realizaron estudios en ese trabajo de sus propiedades terapéuticas (Chien-
Chih Chen et al., 1993).
Los extractos etanólicos de Patalostemum purpureum (Fabaceae), mostraron
actividad antimicrobiana contra las bacterias Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Trichophyton mentagrophytes, Myobacterium intracellulare, Crptococcus neoformans
y Candida albicans. En este trabajo se reporta el aislamiento del compuesto
petalostemumol como el constituyente activo (Hufford et al., 1993).
Los compuestos afromocina y soiasaponina fueron aislados de Wistaria
brachybotrys y estos demostraron un remarcado efecto inhibitorio en la formación de
tumores, es por eso, que ciertas partes de los tallos de esta planta son utilizados en
la medicina tradicional japonesa para el tratamiento de cáncer gástrico (Konoshima et
al.,1992).
En la búsqueda de nuevos compuestos antitumorales citotóxicos de origen
natural, el grupo de Leping Li encontró ocho compuestos citotóxicos en el extracto
clorofórmico de Amorpha fruticosa (Leguminoceae) la mayoría de estos compuestos
son derivados de rotenoides e isoflavonas entre los que se encuentran afrormocina,
8-metilretucina, amorfigenina, dalpanol y tephrosina algunos de estos compuestos
mostraron propiedad citotóxica extremadamente potente (Leping Li et al., 1993).
La investigación de los flavonoides se ha extendido también hasta la búsqueda
de agentes antisida y una de las plantas estudiadas con este propósito por Chang-Qi
Hu y cols., es el Chrysantemum morifoliu (Asteraceae). Este grupo de investigadores
aislaró un principio activo antiVIH, la acacetina 7-O-β-D-galactopiranósido además de
otros siete flavonoides relacionados y también encontraron que una flavona conocida
como crisina puede ser el compuesto más prometedor para este tipo de actividad. Así
mismo, descubrieron que flavonoides con grupos hidroxilos en el carbono 5 y 7 y un
doble enlace en el carbono 2-3 incrementan más la potencia de inhibición en VIH.
20
También publican que la presencia de sustituyentes hidroxilos y halógenos en el anillo
B incrementan la toxicidad pero decrece la actividad (Chan Qi Hu et al., 1994).
21
Diferentes grupos de investigadores han abordado estas investigaciones por ejemplo
(Cody et al., 1986; Cody et al., 1988; Das, 1989; Middleton, 1994).
El valor medicinal de estos compuestos es muy amplio, de tal manera que,
también se ha encontrado que el uso de compuestos flavónicos en la alimentación
reduce el riesgo de enfermedades coronarias hasta en un 68% (Hertog et al., 1993).
Aunque el mecanismo de acción de estos compuestos anticarcinogénicos no se
conocen con exactitud si se ha descubierto que es debido a diferentes procesos como
alteraciones enzimáticas (Nair et al., 1991).
La actividad biológica de las cumarinas como anticarcinogénica se debe a la
posición del grupo carbonilo y conjugación con el doble enlace en el anillo lactónico,
desarrollando así, un dipolo que ayuda a la orientación y acoplamiento de la molécula
en un ambiente biológico apropiado (Nair et al., 1991).
Se ha demostrado que la presencia de un grupo metilo en el anillo cumarínico
tiene un efecto en la actividad biológica, así por ejemplo, el grupo metilo en el
carbono número 3 provoca un cambio en la carga parcial negativa en el átomo de
oxígeno del carbonilo y si este grupo metilo se localiza en la posición 4 podría reducir
la carga y por lo tanto reducir la fuerza de la actividad biológica (Nair et al., 1991).
La relación tan notoria de los grupos carbonilos y los dobles enlaces
conjugados en los compuestos cumarínicos y flavonicos con respecto a la actividad
anticancerígena y antioxidante ha motivado a otros investigadores para proseguir con
la investigación química de estos compuestos, un ejemplo claro de estos estudios es
el realizado a la quercetina que es un flavonoide presente en muchas plantas
comestibles, y así, científicos como Magregor demostraron la acción mutagénica del
compuesto (Malavielle, 1996) y la acción antimutagénica del mismo (Malavielle et al.,
1996).
Actualmente, se está experimentando el efecto anticarcinogénesis del
mencionado compuesto en la carcinogénesis de cervicouterino en ratones y los
resultados son altamente satisfactorios (Sarmishtha et al., 2000). El efecto
anticarcinogénico de este compuesto es atribuido a sus propiedades antiooxidantes.
22
En México se estan realizando investigaciones de flavonoides y cumarinas in
vitro para comprobar la citotoxicidad y propiedades anticancerígenas. Este grupo
conformado por la Universidad Autónoma de México realizó el estudio del efecto de
cinco flavonoides naturales y concluyó que los mecanismos anticarcinogénicos podría
deberse a la incorporación de timidina y que este puede suprimir la síntesis de ADN
(Sánchez et al., 2001). Diversas investigaciones anteriores mostraron que los
flavonoides o cumarinas inhiben las células de tumores por un mecanismo de
glicólisis aeróbico bloqueando la membrana de Na+ y K+ -ATPasa (Suolina et al.,
1975; Belt et al., 1979).
Los investigadores Chang y Geahlen (1992) de la escuela de farmacia y
ciencias farmacéuticas de la Universidad Puerdue han realizaron un trabajo muy
completo sobre el mecanismo de acción de los agentes químicos antitumorales
descubriendo que esta acción anticancerígena es debido a la inhibición de la
prtoteína-tirosinaquinasa ocasionado por aquellos compuestos o metabolitos que
presentan funciones lactónicas o carbonílicas como es el caso de los flavonoides
cumarinas y quinonas.
Así, también, los estudios realizados por Patrick, Laurin a dos series de
cumarinas sustituídas demuestran la inhibición del ADN girasa y por lo mismo su
potente acción antibacteriana en este trabajo, estos investigadores presentan los
resultados de inhibición para Escherichia coli causada por los compuestos
novobiocina, clorobiocina y aminocumarinas y concluyeron que las cumarinas
presentan características de antibiótico y preservan la inhibición de ADN girasa y sus
propiedades antibacteriales (Laurin et al., 1999).
Es de suma importancia concluir en base a todos los estudios fitoquímicos y
farmacológicos comentados en las anteriores citas bibliográficas la acción de
terapéutica de las plantas medicinales utilizadas como bactericidas, antiinflamatorios
y anticancerígenos se atribuye a la presencia en ellas, de metabolitos que presentan
anillos aromáticos y lactónicos como en las cumarinas, quinonas y otros derivados,
así también, coincidentemente las frutas y vegetales que presentan mayor colorido
tienen una mejor acción terapéutica para este tipo de alteraciones en el organismo.
23
Por otro lado, Rhoeo discolor L. Hér Hance es miembro de la familia
commelinaceae que se caracteriza por su contenido de estos metabolitos. Entonces
es muy probable que la acción terapéutica empíricamente atribuída se deba a la
presencia de compuestos de tipo lactónico.
Desde hace miles de años se ha tratado a los enfermos por medio de hierbas,
cortezas y otros brebajes. Hubo poca sistematización en la práctica médica hasta los
experimentos de Paul Erhlinch en 1909, que permitieron la creación de un agente
quimioterápico que destruyese selectivamente espiroquetas sin dañar en forma
importante las células del huésped. Esta “bala mágica” recibió varios nombres:
asfernamina, salvarsán y 606, y se utilizó durantes años en el tratamiento fructífero
de la sífilis (Lían et al., 1974; Murray et al., 1995).
Desde 1953 pudo contarse con otros agentes quimioterápicos más. La mayor
parte de ellos fueron sintetizados originalmente después de búsquedas extensas e
incansables entre los productos secundarios del metabolismo producidos por plantas,
bacterias y hongos. Se ha aislado un número impresionante de estos antibióticos y se
ha definido su acción en muy diversos tipos celulares.
Los primeros ensayos para cuantificar la potencia antibacteriana de una
sustancia fueron realizados por Fleming en 1924, al evaluar el efecto de diferentes
antisépticos, y en 1929 estableció el principio de la prueba de susceptibilidad por
difusión en agar al depositar el agente antibacteriano en un orificio cilíndrico hecho
en el agar y midiendo su potencia según el diámetro del halo de inhibición del
crecimiento del organismo (Lain et al., 1974)
Los estudios de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales fue
descrita en la década pasada. Maruzzella y Henry estudiaron la actividad
antimicrobiana de algunos perfumes aceitosos útiles comercialmente (Maruzzellla y
Henry, 1958). Golbole y Pendse (1960) examinaron la actividad antimicrobiana de los
extractos de agua fría de hojas, raíz, cáscara de los frutos y la planta entera de
24
algunas hierbas medicinales. Tucakov (1961), Kliewe y Hathmacher (1938), Okazaki
y Oshima (1953) y Bhargave y Chauhan (1968) Sreened demostraron los efectos
antimicrobianos de un número de cultivos esenciales.
La actividad antimicrobiana fue precisa en términos de las zonas inhibitorias
aparentemente alrededor de los discos de papel filtro.
Bauer et al., (1966) publicaron los criterios unificadores de la prueba por difusión en
agar o antibiograma y posteriormente otros expertos han establecido las normas de
las diversas técnicas usadas en la determinación de la susceptibilidad que les han
dado mayor precisión y reproductibilidad (Barry, et al.,1970; Ericsson et al., 1971
Barry, et al., 1973; Sherris, 1971).
25
las que el sustrato se incorpora junto con un sistema indicador que pone de
manifiesto su degradación en presencia de un metabolito específico.
Existen diferentes clasificaciones de la familia Enterobacteriaceae, todas
basadas en los mismos principios básicos. La de Edwards y Ewing consiste en un
sistema de clasificación en tribus que se apoya en resultados de pruebas bioquímicas
(Ewing, 1984). Otro es el sistema propuesto en el Manual de Bacteriología
Sistemática de Bergey (1984), que no maneja tribus y agrupa los géneros con base al
por ciento de similitud en el DNA; ésta técnica no es empleada debido a que es poco
práctica. Farmer, en 1985, integró ambos criterios y los ajustó a una nueva propuesta
(Jawet, 1992; Koneman, 1990; Rivera, 1995).
26
con plásmidos. Más habitualmente están involucrados los serogrupos 06, 08, 025,
0111, 0119 y 0142 (Krieg, 1984).
Las cepas enteroinvasivas son capaces de entrar en las células epiteliales
intestinales y producir una diarrea inflamatoria similar a la causada por especies de
Shigella. Estas cepas pueden sospecharse cuando se observa sangre, moco y
neutrófilos segmentados en frotis fecales. Más a menudo se trata de los serogrupos
028, 0112, 0115, 0124, 0136, 0143, 0145 y 0147.
La colitis hemorrágica es un síndrome reconocido hace poco, probablemente
secundario a daño de células endoteliales vasculares, lo que produce una diarrea
hemorrágica en humanos. El cuadro diarréico se presenta con deposiciones acuosas
con un rango de leves hasta profusas y sanguinolentas, sin leucocitos en las
heces, lo cual establece la diferencia con la shigelosis y la disenteria por Escherichia
coli enteroinvasiva.
Se han demostrado efectos de citotoxinas en células Vero y Hela similares a
los producidos por la toxina de Shigella dysenteriae. El seroptipo principal es
0157:H7, aunque intervienen otros como 026:H11, 0111:H8 y 0104:H21.
La Escherichia coli también es uno de los microorganismos comunes
involucrados en sepsis por gram negativos y shock inducido por endotoxinas. Las
infecciones urinarias y de heridas, la neumonía en pacientes inmunosuprimidos
hospitalizados y la meningitis en neonatos son otras infecciones comunes causadas
por Escherichia coli.
Es un bacilo corto gram negativo móvil, se le puede aislar de secreciones de
heridas, de la orina y el excremento. Produce de manera típica pruebas positivas al
rojo de metilo y el indol además de descarboxilación de lisina y fermentación de
manitol al igual que gas a partir de la glucosa, acidificación del medio KIA ó TSI y
negativamente a las pruebas de Vogues Proskauer, Citrato Simmons, ácido sulfúrico,
ureasa y fenilalanina.
En medios de cultivo de 24 h a 37C produce hemólisis alfa en agar sangre,
observándose colonias grandes redondas planas de color grisáceas de aspecto poco
mucoide (no viscosas). En medio de EMB (eosina azul de metileno), son
27
fermentadoras de lactosa con colonias grandes redondas lisas de aspecto verdosas
con brillo metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida.
En el medio de XLD (xilosa, lisina, desoxicolato). Escherichia coli degrada la xilosa,
lactosa y sacarosa con producción de ácido en donde las colonias son amarillas y
opacas con un halo de precipitación de color claro alrededor de las colonias. En el
caso del medio de Mac Conkey hay fermentación de lactosa positiva con colonias
grandes de color rosadas a rojas, no son mucoides y pueden rodearse de un halo
de precipitación opaco debido al descenso del pH provocado por las sales biliares
presentes en el medio, en el caso del medio de S S (Salmonella-Shigella). Hay
fermentación de lactosa con desarrollo de colonias pequeñas que van del color rosa
al rojo, en el medio Verde Brillante las bacterias fermentan la lactosa y desarrollan
colonias de color amarillas opacas rodeadas de un halo amarillento después de 24 h
de incubación a 37C (Koneman et al., 1999)
La E. blattae, recuperada del tubo digestivo de cucarachas, es indol-negativa
y no fermenta lactosa. No se ha asociado con infecciones en humanos.
Escherichia vulneris, E. hermannii y E. fergusoni recientemente han recibido
designaciones de especie dentro del género Escherichia. E. vulneris tiene una alta
propensión a causar infecciones en heridas humanas, en particular en brazos y
piernas. No produce indol a partir de triptófano y carece de actividad de ornitina
decaboxilasa.
Si bien se ha recuperado E. hermanni de heridas y muestras respiratorias humanas,
y con menos frecuencia de muestras de heces, sangre y líquido cefalorraquídeo, no
se piensa que cause infecciones. Desde un punto de vista bioquímico, es similar a E.
coli, excepto porque produce un pigmento amarillo.
La Escherichia fergusonii se he recuperado de sangre, materia fecal y orina;
sin embargo, no se ha establecido su significado clínico (Jawetz, 1992; Koneman,
1990; Rivera, 1995).
28
2.9.3. El género Shigella
El hombre es el reservorio natural del género, específicamente las vías
intestinales, hay cuatro especies de importancia clínica: Shigella dysenteriae, S.
flexneri, S. boydii, y S. sonnei, dicha clasificación se basa en las diferentes
reacciones serológicas y bioquímicas en donde la principal enfermedad que
ocasionan es la disentería bacilar, la severidad de la enfermedad que produce difieren
para cada especie. Filogenéticamente, el género está estrechamente relacionado con
E. coli, sin embargo es mucho menos activo.
Shigella, es un bacilo Gram negativo delgado, inmóvil, no esporulado. En
cultivos jóvenes pueden presentarse formas cocobacilares. Son microorganismos
anaerobios facultativos, pero crecen mejor en aerobiosis. Forman colonias redondas,
convexas, transparentes, de bordes enteros, que alcanzan un diámetro de cerca de 2
mm en 24 h. Pueden reconocerse generalmente en los medios diferenciales por su
incapacidad para fermentar la lactosa, permaneciendo por lo tanto incoloras,
mientras que las colonias de los fermentadores de la lactosa forman colonias
cromógenas.
Todas las Shigellas fermentan la glucosa pero no la lactosa, lo que las
distingue de otras enterobacterias, forman ácido a partir de los carbohidratos, pero
rara vez producen gas de sustancias fermentables, no utilizan el citrato como fuente
de carbono. Solamente Shigella sonnei descarboxila la ornitina y Shigella dysenteriae
es la única que no fermenta manitol y no produce lisina descarboxilasa (Prescott et
al., 2000).
Se puede aislar a partir de muestras infectadas de excremento (con sangre y
moco), hisopos rectales ó hisopados de úlceras, en los frotis se observan leucocitos
fecales y eritrocitos la mayoría de las veces. En los medios de cultivo de EMB y
Mac Conkey (medios diferenciales), las colonias son incoloras debido a la falta de
fermentación de lactosa, lo mismo sucede en los medios de S.S., XLD y verde
brillante sólo que las colonias que desarrollan son de color rosa pálido transparentes
y rodeadas de un halo rojo brillante.
29
El hábitat natural de los bacilos de la disentería es el intestino grueso del
hombre donde pueden causar disentería bacilar. Las infecciones por Shigella
prácticamente están siempre limitadas al sistema digestivo; la invasión al torrente
circulatorio es muy rara. Las Shigellas son muy contagiosas: la dosis infectiva es de
menos de 200 microorganismos (en tanto que para las Salmonellas es de 105 a 108
microorganismos) (Jawetz, 1992; Koneman, 1990; Rivera, 1995).
30
Las Salmonellas son bacilos gram negativos, no esporulados, de longitud
variable. La mayoría de las especies son móviles merced a flagelos perítricos. Las
Salmonellas crecen fácilmente en los medios de cultivo ordinarios pero no fermentan
la lactosa o sucrosa. A partir de la glucosa y la manosa, producen ácidos y en
ocasiones gas. Tienden a producir H2S en agar TSI o en agar de Kliger, da positiva la
prueba de rojo de metilo y negativa la de Vogues Proskauer, no produce indol. Es
catalasa positivo y oxidasa negativo y reduce los nitratos a nitritos. En el medio de
EMB y Mac Conkey las colonias que desarrollan son no fermentadoras de lactosa,
incoloras transparentes observándose del mismo color que el medio de cultivo, lo
mismo sucede en los medios de S.S. y XLD y en el caso del medio verde brillante
dichos microorganismos desarrollan colonias de color rosa pálido, transparentes y
rodeadas de un halo rojo brillante.
Sobreviven en forma libre en agua durante largos períodos. Las Salmonellas
son resistentes a la congelación en agua y a ciertos agentes químicos, por ejemplo, el
verde brillante, el tetrationato sódico y el deoxicolato sódico, tales compuestos
inhiben a los bacilos coliformes y son, por lo tanto, útiles para el aislamiento de
Salmonellas a partir de heces.
Salmonella typhi y quizá Salmonella paratyphi A y Salmonella schottmülleri
(inicialmente llamada Salmonella paratyphi B) son las más infecciosas para el humano
y la infección con estos microorganismos implica el contagio de una fuente humana.
Sin embargo, la gran mayoría de las Salmonellas son particularmente patógenas en
animales que constituyen el reservorio para la infección en humanos. Entre los
animales implicados están aves de corral, puercos, roedores, ganado, mascotas
(desde tortugas hasta loros) y muchos otros. Los microorganismos casi siempre
penetran por la vía bucal, por lo general con alimentos y bebidas contaminados. La
dosis infecciosa media es de 105 – 108 microorganismos para producir
manifestaciones de infección clínica(Jawetz, 1992; Koneman, 1990; Rivera, 1995).
31
2.10. Crecimiento, supervivencia y muerte de los microorganismos
2.10.1. crecimiento
La multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento; en
microorganismos unicelulares, la multiplicación conduce a un aumento en el número
de individuos dando lugar a una población o cultivo.
El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular
(número de células viables por unidad de volumen de cultivo) o de concentración de
la biomasa (peso seco de las células por unidad de volumen de cultivo). Estos dos
parámetros no siempre son equivalentes, debido a que el promedio de peso seco de
la célula varía en las distintas etapas de la historia del cultivo. Ni tampoco tiene la
misma importancia: en estudios de genética microbiana o de inactivación de las
células, la cantidad importante es la concentración celular: en estudios de bioquímica
o nutrición microbiana, la cantidad importante es la concentración de la biomasa
(Bernar et.al., 1973).
32
2.10.2. Crecimiento exponencial
Constante de crecimiento
La rapidez de crecimiento de las células no limitado por los nutrimentos, es de
primer orden. Medida en gramos de biomasa producidos por hora, es el producto de
la constante de velocidad de crecimiento, k y la concentración de la biomasa B:
dB / dt = Kb (1)
K= Bdt / dB (2)
La constante de velocidad de crecimiento de 4.3 h-1, una de las más elevadas que se
han registrado, significa que cada gramo de células produce 4.3 g de células por hora
durante este periodo del crecimiento. Los microorganismos de crecimiento lento
–1
pueden tener constantes hasta de 0.02h nada más. Con esta constante, cada
gramo de células en el cultivo producirá 0.02 g de células por hora.
La integración de la ecuación (1) dará como resultado:
33
2.10.3. Curva de crecimiento
Si se inocula un medio líquido con células microbianas, tomadas de un cultivo
que previamente ha crecido hasta la saturación, en el cual periódicamente se ha
determinado el número de células viables, por mililitro, y trazado una gráfica de
él, generalmente se obtiene una curva del tipo que se muestra en el Cuadro 2
(Fig. 3).
Selección
de la
curva Fase Velocidad de crecimiento
A Rezago Cero
B Aceleración Creciente
C Exponencial Constante
D De retardo Decreciente
E Estacionaria máxima Cero
F Declinación Negativa (muerte)
34
Fase de rezago (A)
Representa un periodo durante el cual las células empobrecidas en metabolitos
y enzimas como resultado de las condiciones desfavorables producidas al final del
cultivo previo, se adaptan a su nuevo ambiente. Se forman enzimas y metabolitos
intermediarios que se acumulan hasta alcanzar concentraciones que permiten que el
crecimiento se reinicie.
Si las células se toman de un medio enteramente diferente, ocurre que son
genéticamente incapaces de crecer en el nuevo medio. Puede ocurrir una fase de
rezago, que representa el periodo necesario para que unas cuantas mutantes del
inóculo se multipliquen suficientemente y se manifieste un aumento en el número de
células.
Fase exponencial(C)
Durante la fase exponencial, de la cual ya se han descrito los aspectos
matemáticos, las células se encuentran en una fase sostenida. Se sintetiza nuevo
material celular a velocidad constante, pero éste es en sí catalítico y la masa aumenta
en forma exponencial. Esto continúa hasta que sucede una de dos cosas: que uno o
más nutrimentos del medio se agoten, o que se acumulen productos tóxicos e
inhiban el crecimiento. Para los microorganismos aerobios, el nutrimiento que se
vuelve limitante es generalmente el oxígeno: cuando la concentración celular pasa de
aproximadamente 1x107 por ml (en el caso de las bacterias), la velocidad de
crecimiento decrece. Cuando la concentración bacteriana alcanza 4 a 5 x 109 /ml, la
velocidad de difusión del oxígeno no puede satisfacer las demandas aún en un medio
aireado, y el crecimiento disminuye progresivamente.
Fase estacionaria máxima (E)
Finalmente, el agotamiento de los nutrimentos o la acumulación de productos
tóxicos hace que el crecimiento cese por completo. Hay una pérdida lenta de células
por muerte, lo cual es compensado exactamente por la formación de nuevas células,
a través de crecimiento y división. Cuando este fenómeno se presenta, el número
total de células aumenta lentamente, aunque la cuenta de células viables permanece
constante.
35
Fase de declinación (fase de muerte, F)
La velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.
Frecuentemente, después de que la mayoría de las células han muerto, la velocidad
de mortalidad disminuye en forma drástica, de tal manera que un pequeño número
de sobrevivientes pueden persistir en el cultivo por meses o aun años. En algunos
casos esta persistencia puede indicar recambio celular, creciendo una cuantas células
que mueren y se lisan (Koneman et al., 1999).
36
estándar. En una caja petri usual pueden disponerse seis cilindros sin que se
superpongan las zonas de inhibición.
Los discos se colocan sobre la superficie del medio de cultivo en agar
uniformemente inoculado con la bacteria de prueba. Hay diversas variedades de este
esquema, incluyendo las piezas de papel de filtro en forma de cresta de gallo que
tienen las proyecciones impregnadas con diferentes substancias, las piezas circulares
con proyecciones impregnadas hacia el centro, etc. En todo caso, suelen utilizarse
dos concentraciones de las substancias antibacterianas, una concentración “alta” y
“baja”. La concentración “alta” se intenta que se aproxime a las concentraciones
sanguíneas máximas que pueden alcanzarse de la substancia, aunque esto no
siempre resulta cierto.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
37
3.1. Recolección y preparación de la materia prima
38
haciendo seguimiento de las fracciones obtenidas por CCD (Anwar, 1963; Ruppel et.
al., 1971).
39
3.3. Material para estudios microbiológicos
Para los estudios microbiológicos, se utilizaron elespectrofotómetro Spectronic 20 , un
Lector de microplacas Spectramax 190, y un leofilizador Labconco Frezone 4.5 así
como, los medios de cultivo: Caldo nutritivo, agar nutritivo, agar McConkey, agar
Hektoen, agar mueller Hinton.
40
3.4.3. Flavonoides
Para determinar la presencia de flavonoides y compuestos afines se preparó
una disolución alcohólica del extracto, a la cual se adicionó un trozo de Mg y HCl,
observándose una coloración rojiza en caso positivo; sin embargo, la variación en el
color puede conducir a apreciaciones falsas (Shinoda, 1928; Caggiano et.al, 1963)
3.4.4. Saponinas
La presencia de saponinas y sapogeninas se averiguó con la prueba de la
espuma,propuesta por Marini-Bettolo, 1928, que consiste en depositar una pequeña
cantidad del extracto en un tubo de ensaye con agua y agitar vigorosamente, la
formación de espuma en la disolución indica prueba positiva. Los taninos pueden
presentar coloración (incluso precipitación) azul, azul-negra, verde o azul verde
cuando se adiciona a una alícuota del extracto, FeCl3 (Cain et.al., 1961)
3.4.5. Antraquinonas
La presencia de antraquinonas libres se determinó agregando una pequeña
cantidad de extracto en un tubo de ensaye conteniendo benceno, se agitó
vigorosamente, se filtró y al filtrado se le adicionó una disolución de amoníaco y
posteriormente se volvió a agitar, la aparición de color rosa, rojo o violeta en la fase
amoniacal, indica la presencia de estos compuestos (Egon, 1969).
3.4.6. Lactonas
Las lactonas se investigaron mediante la preparación de un extracto
clorofórmico, el cual se extrajo con EtOH se diluyó con un volúmen igual de una
disolución acuosa de acetato de plomo, posteriormente se eliminó el EtOH y el agua,
el residuo se extrajo con CHCl3; nuevamente se eliminó el disolvente, y de este
residuo se preparó para espectroscopía Infrarroja, en donde las absorciones a 1740-
1790 cm-1 son características de -lactonas y la intensidad indica su concentración
(Domínguez, 1973). Una vez separadas, se pueden emplear las pruebas de Legal
(color rosa) Legal, Baljet (naranja o rojo oscuro) y Tollens (Fritz, 1978)
41
3.5.1. Prooceso fitoquímicos
La planta Rhoeo discolor (maguey morado), peso = 935.4 g , fue separada en
tallos y hojas, cortada finamente, sometiéndose a procesos de extracción a
temperatura ambiente (técnica de maceración). Primeramente, se utilizó acetato de
etilo como disolvente el cual se repitió varias veces, hasta agotamiento de la
extracción de los metabolitos, obtiendo así, 2.150 g de extracto. Posteriormente el
residuo de la planta o marco se sometió por varios días a proceso de extracción con
metanol y de esta manera se obtuvieron 3.905 g de extracto metanólico (Fig.4)
Rhoeo discolor
935.4 g de tallo
Rhoeo discolor
Extracción con
acetato de etilo
Solución de Marco
acetato de etilo
Extracción
con metanol
Extracto acetato de etilo
Rhoeo discolor (2.1501 g) Solución Metanólica
42
3.1.1. Extracto acetato de etilo de tallos de Rhoeo discolor (tallo)
El extracto acetato de etilo (EAcEtRd) obtenido, presentó color ámbar, olor
característico y aspecto terroso, (2.1501 g). De este, se tomaron pequeñas
cantidades para pruebas de precipitación, de solubilidad utilizando distintos
disolventes, obteniendo así, con hexano una parte insoluble, a las que se asignó la
clave EHI (1.8823 g) y otra soluble con clave ESI (0.2678 g). La parte insoluble EHI
fue lavada repetidas veces con acetona fría obteniendo dos fases: la soluble EAcS
(1.6320 g) y la insoluble EAcl (0.2501 g) que también fue lavada con metanol,
separando un polvo de color gris claro (impurezas). La fase soluble en acetona se
concentró y se lavó repetidas veces con eter etílico, obteniendo un extracto etílico
que se clasificó como EAcSEE (0.8397 g). A esta parte se le realizó cromatografía en
capa delgada (ccd) con polaridad hexano-acetona 6:4 v/v observando una buena
separación de metabolitos, por lo que se procedió a realizar la cromatografía en
columna con sílica gel fina, malla 230-400 iniciando el proceso con hexano y
aumentando polaridad progresivamente con acetona, hasta la polaridad 4:6 v/v
hexano-acetona obteniendo de esta manera 104 fracciones.
A todas estas fracciones, por separado, se les realizaron pruebas de
precipitación, cristalización y cromatografía en capa delgada,y de esta manera, se
observó que las fracciones 1 al 47 estaban constituídas por una mezcla compleja de
metabolitos de donde se obtuvieron 0.058 g. Las pruebas de identificación para estos
metabolitos fueron por medio de agentes reveladores y luz ultravioleta utilizando
cromatografía de sílica en capa fina y como eluyentes una mezcla de hexano-acetona
8/2 v/v así como, solución de cloruro de cobalto al 10+%.
Las fracciones 48 al 67 fueron analizadas por CCD utilizando como eluyente
hexano-acetona 5/5 v/v observando en luz ultravioleta (uv) un compuesto azul
fluorescente. Como todas estas fracciones presentaban el mismo compuesto, se
procedió a reunirlas y por proceso de cristalización se obtuvieron 0.2204 g de un
compuesto de color blanco que presentó p.f. 224o –227o C asignándole a éste la
clave EAcEtC2.
43
Las fracciones 68 al 104 también analizadas por cromatografía en capa
delgada con una polaridad de 4:6 v/v hexano-acetona, presentaban similitud, es
decir, se observó una mezcla de compuestos con distintos valores de Rf. Por esta
razón se juntaron, dando así 0.145 g de mezcla.
Los otros metabolitos de este extracto se quedaron como residuo en la
columna cromatográfica por lo que fueron barridos primero con acetona y
posteriormente con metanol, obteniendo así, 0.116 g de una mezcla de compuestos
que fueron analizadas por los procedimientos antes mencionados y sin embargo, no
se logró la separación de ellos (Fig. 5).
EAcI
EacS (1.6320 g)
Columna cromatográfica
44
Por otro lado, el extracto EHS se trató con acetona fría, logrando así,
precipitar 0.243 g de un compuesto blanco de aspecto ceroso que al analizarse por
ccd y utilizando la mezcla de disolventes hexano/acetato de etilo 8:2 v/v y revelado
con solución de cloruro de cobalto al 10% presentó un compuesto con valor de Rf =
0.70. Este compuesto, presentó coloración rosa y por estudios en RMN, mostró
señales características de hidrocarburo saturado (ceras).
Las aguas madres de este compuesto, se evaporaron, produciendo así 0.2436
g de una mezcla de metabolitos que fueron analizados por cromatografía en capa
delgada con polaridad hexano-acetato de etilo 8:2 v/v observando buena resolución
por lo que, se procedió a correr una columna cromatográfica, utilizando como
adsorbente una arcilla denominada tonsil, esto es con el propósito de eliminar la
presencia de clorofila en ese extracto. En esta columna se obtuvieron 34 fracciones y
los barridos de acetato de etilo y metanol. Todas las fracciones y los
barridos fueron analizados por cromatografía en capa delgada con distintos
disolventes y cada una de ellas fueron lavadas y recristalizadas por separado.
Como resultado del estudio en esta nueva columna de las fracciones 1 al 15
(0.0114 g) se obtuvieron de una mezcla de metabolitos que no fue posible separar
con ninguna mezcla de eluyentes.
De las fracciones 16 al 25, se observó por cromatografía en capa delgada, una
mancha de color vino de Rf= 0.362 utilizando benceno-acetona 9/1 v/v. Todas estas
fracciones fueron reunidas y el producto fue recristalizado con metanol logrando así
0.010 g de cristales en forma de agujas de color blanco con punto de fusión de 130 -
135ºC asignándole la clave EacEtC1. Este compuesto fue purificado para su posterior
estudio en espectroscopia.
De las otras fracciones, de la 26 a la 34, sólo se obtuvieron 0.010 g de una
mezcla de metabolitos que debido a la mínima cantidad no fue posible procesarla
para su separación.
La fracción barrida con acetato de etilo produjo 0.0406 g de mezcla de
metabolitos; mientras que la fracción con metanol proporcionó 0.1476 g de
45
metabolitos, pero debido a las mínimas cantidades obtenidas y a la presencia
abundante de clorofila no fue posible estudiarla (Fig. 6).
Soluble EHS
(0.2676 g)
46
De la parte soluble del alcohol etílico (2.3847 g), se tomaron 0.300 g para la
reacción de acetilación (sin piridina) no logrando resultados satisfactorios. La muestra
restante (2.0847 g) fue procesada por cromatografía en columna utilizando como
adsorbente tonsil y como eluyente hexano-acetato de etilo aumentando la cantidad
de acetato de etilo hasta llegar a una polaridad de 5:5 v/v obteniendo así, 207
fracciones, más la muestra de barridos.
Todas las fracciones fueron analizadas por cromatografía en capa delgada
(ccd) con distintas mezclas de disolventes y de esta manera las fracciones
equivalentes se juntaron haciendo tres bloques, más los barridos. Los bloques fueron
tratados nuevamente por lavados, cristalización y cromatografía.
Al primer bloque de las fracciones 1 al 95 (0.2520 g) se le realizó
cromatografía en capa delgada (ccd) utilizando como eluyente una mezcla de
hexano acetato de etilo 8:2 v/v observando compuestos difíciles de separar debido a
sus condiciones en Rf.
El segundo bloque del 95 al 109 fue analizado por cromatografía en capa
delgada utilizando disolventes hexano-acetato de etilo 8:2 v/v, observando una
mancha color vino y una mancha indefinida de las cuales, por lavado y
recristalización, se logró obtener cristales en forma de agujas blancas que
presentaron Rf de 0.35 en mezcla de benceno-acetona 9:1 v/v, su punto de fusión
fue 135-137 C. Estos cristales pesaron 0.0258 g. Este compuesto fue purificado por
repetidas cristalizaciones y ya puro, se procedió a clasificarlo como EMC3 para su
posterior estudio espectroscópico.
Al tercer bloque de 110 al 207 (0.2520 g) se le realizó una cromatografía en
capa delgada con polaridad de hexano-acetato de etilo 7:3 v/v, observándose
compuestos difíciles de separar debido a sus condiciones en Rf.
A los barridos con acetato de etilo (0.200 g) y metanol (0.3087 g) se les
realizó una cromatografía en capa delgada con polaridad hexano-acetato de etilo 5:5
v/v observando metabolitos sobrepuestos y una mancha indefinida de color verde
(clorofila) no logrando su separación por métodos conocidos (Fig. 7).
47
EMRDv (3.9065 g)
EMIEOH EMSEOH
(1.5218 g) (2.3847 g)
Lavado con
metanol
(0.300 g) para la
reacción de
acetilación
Mezcla de impurezas Compuestos
insolubles
(inorgánicos) Columna
No resultó cromatográfica
con tonsil
Figura 7. Estudio fitoquímico del extracto metanólico del tallo de Rhoeo d. L Hér
Hance
48
de HCl, enseguida se le agrega bicarbonato de sodio al 10% (10 ml) y se lava
nuevamente con agua destilada hasta alcanzar un pH neutro, secando la fase
orgánica sobre sulfato de sodio anhídro. El disolvente se evapora obteniéndose de
esta manera 15 mg de pequeños cristales incoloros, con punto de fusión 169-170 C.
4. 1. 4. Metilación del compuesto EacEtC2
A 30 mg de muestra seca de EacEtC2, se le agrega 15 ml de acetona y se
calienta bajo reflujo durante 2 h con 1 ml de disulfato de dimetilo, en presencia de
200 mg de carbonato de sodio anhídro, terminada la reacción, se filtró para eliminar
el carbonato, se extrajo con acetato de etilo y se lavó repetidas veces con una
solución de NaOH a fin de eliminar el sulfato de dimetilo sobrante y posteriormente
se lavó con agua fría hasta un pH neutro, secando la capa orgánica con sulfato de
sodio anhídro. El disolventes se evaporó obteniéndose de esta manera 10 mg de
pequeños cristales color blanco de punto de fusión 166-167C
En este capítulo se presentan los resultados del estudio químico del extracto
de acetato de etilo de tallos de Rhoeo discolor. Esta extracción fue la que presentó
mejores resultados en cuanto a contenido de metabolitos. El proceso detallado ya se
discutió anteriormente. De este extracto, se lograron separar e identificar dos
metabolitos secundarios: EacEtC1 y EacEtC2. El primero de ellos de naturaleza
esteroidal y el segundo de naturaleza cumarínica, éste último compuesto presentó
fluorescencia intensa a la luz ultravioleta, así también, dio pruebas positivas para
cumarinas revelando con diferentes agentes cromogénicos. Además, por estudios en
espectroscopía de resonancia magnética nuclear de hidrógeno, mostró una serie de
señales características para compuestos aromáticos y algunas de ellas de tipo
cumarínico. Como las señales mostradas en el espectro de RMN no proporcionaban
mayor información, se tuvo que recurrir a la formación de compuestos derivados,
preferentemente sometiéndolos a reacciones de acetilación y metilación para que de
esta forma se pudiera inferir la presencia de grupos hidroxilos en la molécula.
Posteriormente se describe la discusión e interpretación de los espectros de
ambos metabolitos que llevaron a la identificación de las estructuras químicas.
49
Del extracto metanólico, por procedimientos ya descritos se pudo aislar e
identificar, el compuesto EMC3. Este compuesto fue analizado en cromatografía de
capa fina, dando positivo a la prueba de esteroles. Los resultados de espectroscopía
se discuten posteriormente.
Hojas (1400 g)
50
Como se puede observar, en los diagramas de extracción no se indica la
cantidad de extractos obtenidos, debido a que el proceso no se realizó hasta
agotamiento total de metabolitos. De la misma forma 1200 g, de tallo fresco se
dividieron en dos porciones. La primera de 700 g se extrajeron por maceración con
hexano y posteriormente acetato de etilo. Por otro lado, otra porción de 500 g se
extrajeron con agua destilada (Fig. 9).
Tallo (700 g)
Figura 9. Esquema del rendimiento de extracción del tallo del maguey morado.
51
Cuadro 3. Cantidades de extractos obtenidos de la parte aérea de Rhoeo discolor
52
inclinado con medio de cultivo agar soya tripticaseína. Se determinaron
periódicamente la pureza de las cepas bacterianas identificándolas por medio de
morfología colonial, aislándolas por estría cruzada en agar EMB, McConckey, SS
(Salmonella-Shigella), por morfología microscópica y pruebas bioquímicas
específicas (TSI, SIM, Citrato de Simmons, Caldo Urea y Kliger) (Jawetz, 1992;
Koneman, 1990; Rivera, 1995).
Técnicas de dilución
En las técnicas de dilución el antibiótico se diluye progresivamente en un
medio de cultivo líquido (caldo) o sólido (agar). Cuando se emplea un medio líquido,
el antibiótico se coloca en el primer tubo y se diluye en forma seriada en varios de
ellos, al final se tendrá una cantidad progresivamente menor del antibiótico con un
rango de concentraciones que simularán a aquellas que se alcanzarían en suero,
tejidos o líquidos orgánicos. Una serie típica de tubos tendría concentraciones de 64,
32, 16, 8, 4, 2, 1 y 0.5 ug/ml. Después de sembrar cada tubo con el mismo inóculo
(105 a 106 bacterias/ml), se incuban durante 18 a 24 h a 35oC y se observan
buscando la concentración más baja que inhibió el crecimiento.
Técnicas de difusión en agar o antibiograma
La técnica de difusión en agar también conocida como de difusión en disco,
antibiograma o “Kirby-Bauer” es la más utilizada en los laboratorios de microbiología
clínica. El medio de Barry et al., (1970) es otra buena alternativa aunque menos
popular por ser un procedimiento más laborioso.
53
Esta técnica es, en esencia, el resultado de la interacción de tres elementos:
el antibiótico depositado en un reservorio, generalmente un disco de papel filtro; un
microorganismo el cual será inhibido o no por el antibiótico, y un medio sólido
(agar) que servirá como apoyo al crecimiento de la bacteria y de difusión del
antibiótico. El comportamiento de estos tres elementos a su vez estará determinado
por las condiciones de incubación: temperatura, concentración de bióxido de carbono
y tiempo de incubación.
Al depositar el disco con el antibiótico sobre el agar ya uniformemente
inoculado se establece una competencia entre el antibiótico que difunde a través del
medio y el microorganismo que comienza a crecer. Si este es susceptible habrá un
halo de inhibición que se extenderá hasta un límite dado por la concentración
alcanzada por el antibiótico en ese punto (concentración crítica). Por lo que el
diámetro de la zona de inhibición indicará el grado de susceptibilidad del organismo al
antibiótico cuando éste queda como única variable del sistema. A mayor zona de
inhibición mayor será la susceptibilidad del organismo y, en consecuencia es
necesario una mayor cantidad del antibiótico, para inhibir su crecimiento.
Categorías de susceptibilidad
El International Collaborative Study Group on Antimicrobial Susceptibillity
Testing de la Organización Mundial de la Salud (Ericsson, 1971) recomienda cuatro
categorías de susceptibilidad:
Categoría 1: incluye a las bacterias con el grado de susceptibilidad que la respuesta
in vivo es probable en infecciones sistémicas moderadas a severas cuando se tratan
con la dosis habitual de un antimicrobiano. Estos organismos se consideran como
susceptibles.
Categoría 2: Incluye la susceptibilidad in vitro que hace probable la respuesta in vivo
en infecciones sistémicas cuando el antibiótico se usa en dosis mayores o cercanas a
la toxicidad.
Categoría 3: Comprende ciertos grados de susceptibilidad en los que la respuesta in
vivo es probable cuando se tratan infecciones localizadas en sitios donde el
antibiótico puede ser concentrado por procesos fisiológicos o por aplicación local. Un
54
ejemplo sería el tratamiento correcto de infecciones urinarias por Proteus con
penicilina G que resultaría inadecuado para tratar al mismo organismo alojado en una
válvula cardiaca.
Categoría 4: Incluye organismos cuya susceptibilidad hace la respuesta in vivo
improbable. Son organismos considerados como resistentes.
Las categorías 2 y 3 corresponden a la susceptibilidad intermedia, como se informa
tradicionalmente, que además de las implicaciones clínicas antes señaladas sirve para
evitar discrepancias significativas que resulten de errores técnicos no controlables.
55
procurando que la distribución fuera homogénea. Se incubó a 37ºC por 18 h, esto fue
hecho por duplicado.
Del cultivo bacteriano en crecimiento, se tomaron alícuotas cada media hora.
Se leyó la densidad óptica de cada una de ellas, se realizaron diluciones, éstas se
inocularon en agar nutritivo y se incubaron a 37ºC por 18 h, todo esto fue llevado a
cabo hasta que la densidad óptica del cultivo bacteriano fue constante.
Después del período de incubación, se realizó un recuento de colonias de las
placas inoculadas con anterioridad. Las placas en donde el número de colonias era
menor de 30 y mayor de 300 fueron descartadas para motivo de recuento.
Finalmente se construyó una gráfica, en donde el eje de las abcisas
correspondió a los diferentes períodos de tiempo en el que se tomaron las muestras
del cultivo bacteriano en crecimiento y el eje de las ordenadas correspondió al
logaritmo de la densidad óptica del cultivo bacteriano a ese lapso de tiempo. La
densidad óptica se correlacionó con el número de bacterias existentes a esa
densidad. Esto se llevó a cabo multiplicando el factor de dilución por el número de
colonias, obtenidas mediante el recuento. El resultado se expresó como UFC/ml.
Las curvas de crecimiento de población bacteriana se realizaron para cada una
de las cepas bacterianas. El experimento se condujo por triplicado y fue repetido al
doble. La actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor se determinó
por medio del método de difusión en disco y el método de dilución en caldo.
56
se hicieron diluciones tomando 0.5 ml de la solución madre y llevándola a un
volúmen de 0.5 ml de disolvente, se hicieron siete diluciones, lo anterior se realizó
para cada uno de los extractos.
Preparación de los discos
Se utilizó papel filtro Whatman No. 42, al cual se le hicieron lavados con
solventes, hexano y cloroformo, esto con el fin de eliminar impurezas. Después de
esto se hicieron los discos, utilizando una perforadora, con un diámetro de 6 mm y
se esterilizaron. Estos fueron colocados sobre soportes metálicos (agujas
entomológicas), previamente estériles, los cuales fueron fijados a través de una base
de unicel cubierta de papel aluminio.
Mediante una micropipeta con puntas estériles, se adicionaron a cada disco 20
ul de las diluciones de los extractos y se dejaron secar. De la solución madre se
tomaron alícuotas de 20 ul, se dejaron secar y después de esto se repitió la operación
hasta obtener la concentración deseada, que en éste caso fue de 20, 40 y
60 ul (Cuadro 4).
Solución madre 20 16
800 40 32
60 48
Diluciones
400 20 8
200 20 4
100 20 2
50 20 1
25 20 0.50
12.5 20 0.25
6.25 20 0.12
57
3.5.6. Determinación de la actividad antimicrobiana
Se utilizaron cajas petri de 9 X 1 cm, en las que se vertieron 15 ml de agar
nutritivo. Se preparó el inóculo, tomando 4 ml de una suspensión bacteriana
incubada por 18 h, la cual se agregó a un matraz conteniendo 50 ml de caldo
nutritivo, mismo que se incubó a 37ºC hasta obtener una densidad óptica de 0.55,
momento en el cual se tomaron alícuotas correspondientes a 1x105, 1x106 y 6x106
UFC/ml (el dato que corresponde al número de bacterias a cierta densidad óptica se
conoce por la curva de crecimiento poblacional de cada bacteria, descrita con
anterioridad).
Las alícuotas fueron colocadas en tubos de ensaye los cuales contenían 5 ml
de agar nutritivo, enseguida fue vertido homogéneamente su contenido en las cajas
de petri. Inmediatamente fueron depositados los discos con el apoyo de una pinza
estéril, presionándolos ligeramente para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar. Se colocaron 6 discos en cada caja, los cuales contenían diferente
concentración de extracto además de un disco control con contenido de las
soluciones empleadas como diluyentes.
Para prevenir una sobreposición de las zonas de inhibición, la distribución de
los discos fue con un límite no menor de 20 mm entre cada uno y de 15 mm en
relación con el borde de la placa.
Las cajas se incubaron de forma invertida a 37ºC durante 18 h, al término de
éste se analizaron los resultados obtenidos, en donde la presencia de un halo de
inhibición representa una prueba positiva de la actividad del extracto sobre el
crecimiento bacteriano. Los diámetros de las zonas de inhibición se midieron por la
parte posterior de la placa con una regla graduada en milímetros, utilizando una
fuente de luz brillante.
3.5.7. Determinación de la susceptibilidad a los antibióticos
Con el fin de obtener un marco de referencia a cerca de la resistencia o
sensibilidad de las bacterias objeto de estudio, se realizaron antibiogramas utilizando
multidiscos combinados conteniendo antibióticos para bacterias Gram(-) (Sanofi
58
Pasteur) mediante el método de difusión en discos, descrito anteriormente. Los
experimentos se condujeron por duplicado y fueron repetidos al doble (Fig. 10).
Antibiogramas
EacEtRd, EclHRd, EacTRd, EetHRd y
EAcHRd
Salmonella enteritidis
Determinación de actividad antimicrobiana
Shigella flexneri
de los extractos de Rhoeo discolor Escherichia coli
mediante el método de difusión en disco y
el método de dilución en caldo.
Desarrollo de curvas de
crecimiento poblacional
59
medio de cultivo y las concentraciones de los extractos. Los controles utilizados
fueron los tres inóculos de bacteria en medio de cultivo sin extracto y un blanco
conteniendo medio de cultivo. Para determinar si los diluyentes utilizados para la
preparación de las concentraciones de extractos ejercían efecto sobre la viabilidad
de los microorganismos, se inocularon 20, 40, 60 y 100 ul de diluyente en tubos de
ensaye conteniendo caldo nutritivo (1 ml) y los diferentes inóculos de bacterias. Se
incubaron los tubos a 37ºC por 18 h.
Después del período de incubación fueron tomados 50 ul de cada uno de los
tubos de ensaye y se colocaron en los pozos de una microplaca. Se leyó la
densidad óptica (DO) de cada una de las muestras a 560 nm en un Lector de
microplaca (Spectramax 190). Para el caso de las muestras que contenían las
diferentes concentraciones de extracto con bacteria fue utilizado un blanco con las
respectivas concentraciones de cada uno de los mismos. Los experimentos se
condujeron por duplicado y fueron repetidos al doble.
Los datos se analizaron estadísticamente empleando las pruebas de Duncan,
Kewman-Keuls, LSD, Scheffe, Tukey HSD y Unequal NHSD al nivel del 5%.
Los extractos se conservaron en recipientes de vidrio, debidamente cubiertos y
protegidos de la luz, manteniéndose en refrigeración (4ºC) durante la realización del
trabajo.
60
4. RESULTADOS
61
De 2.40 a 0.60 ppm se observa una serie de señales características para
hidrógenos de metilos y metilenos, en donde sobresalen las señales simples intensas
de 0.5 a 1 ppm y que son características para hidrógenos que pertenecen a grupos
metilos (Fig. 11).
Figura 11. Espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno a 270 Mhz del
compuesto estigmastero.l
62
H3C
CH 3 CH 3
CH 3 CH 3
C2H5
HO
β-sitosterol
63
Espectroscopia infrarroja del compuesto cumarínico (acet2)
cm-1
64
ppm una señal pequeña ancha que el valor de su integral indica la presencia de
grupos hidroxilos (Figs. 14 y 15).
1
Figura 15. Ampliación del espectro de RMN en la zona aromática del
compuesto cumarínico (500 Mhz) en donde se observa las señales de los hidrógenos
aromáticos.
65
La multiplicidad de estas señales se distingue claramente en la ampliación de
la zona aromática 1,2,4-trisustituído y corresponden a los hidrógenos de un anillo
bencénico en base a las constantes de acoplamiento.
El espectro de 1H RMN de la furanona muestra una señal en 6.93 ppm
se distingue una señal doble que se asigna al proton (hidrógeno) localizado en el
carbon número 6´ (H-6´) con una constante de acoplamiento (J=8.3 Hz) cuyo valor
permite concluir que tiene un hidrógeno en posición orto.
Este hidrógeno (H-6´) muestra un acoplamiento con el hidrógeno H-3´en posición
para, cuyo valor es menor a 1HZ por lo que no se logra observar en el espectro. Así
también, en 7.25 ppm se observa una señal doble de dobles que se asigna al proton
H-5´ y que es debida al acoplamiento en meta (J=2.1 Hz) con H-3´ y además, se
logra observar la constante de acoplamiento (J) orto (J=8.3 Hz) por su interacción
con H-6´.
En este mismo espectro, aproximadamente en 7.33 ppm, se observa una señal
doble asignada a H-3´ debido al acoplamiento meta con H-5´.
Así, aproximadamente en 6.30 ppm, se observa una señal simple que por el
valor de su integral corresponde a un proton (H) y se asigna al hidrógeno en posición
número 3, y por lo tanto, al proton vinílico que se cree que esta desplazado a campo
bajo por la influencia del grupo carbonilo vecino a él.
En 6.53 ppm, se observa también una señal simple que integra para proton y
corresponde a H-5 que se encuentra unido a un carbono que soporta a su vez a un
grupo hidroxilo, por lo que se desplaza a campo bajo.
La señal simple localizada a 3.00 ppm que se observa en el espectro de la
figura se ha asignado a los protones pertenecientes a los grupos hidroxilos presentes
en la molécula.
Así, por toda la información obtenida por 'H RMN se propone la estructura de
un metabolito secundario que presenta un anillo lactónico y un anillo bencénico
trisustituídos con tres grupos hidroxilos.
Para confirmar presencia de los tres grupos hidroxilos se procedió, a realizar
reacciones químicas con estos grupos hidroxilos, es decir, se efectúo una reacción de
66
acetilación para obtener la formación del derivado acetilado. Obteniéndose el
derivado triacetilado como se demuestra por el espectro de masas en donde se
observa un ión molecular M+ m/z = 334 (Fig. 16).
67
Figura 17. Espectro de infrarrojo del compuesto acetilado en el que se
observa la desaparición en 3300cm-1.
El espectro de 'H RMN de este derivado acetilado muestra las nuevas señales
de acetato en una señal a 2.18 ppm que integra para tres protones (hidrógenos) asi
como una señal simple intensa en 2.33 ppm que es debida a seis protones
(hidrógenos) ocasionada por dos grupos acetilos (Fig. 18).
68
Espectroscopía de la cumarina metilada
69
1
cm-
70
Figura 21. Espectro de 'H RMN del compuesto cumarínico metilado en el que se
observa dos señales intensas de 3.55 a 3.95 ppm debido a los nuevos grupos metilos
presentes en la estructura.
HO AcO
O Anh. ácetico O
O O
HO MeO
O (CH3)2SO4 , NaHCO3 O
O O
71
4.2. Estudio microbiológico
Estos resultados de las pruebas de susceptibilidad antibiótica, indicaron que
tres de los doce antibióticos empleados presentaron mayor eficacia (cefatoxima,
ceftriaxoma y trimetroprin-sulfametoxasol), ya que las tres bacterias presentaron
sensibilidad hacia ellos.
Se escogió a la cefatoxima como el antibiótico de referencia, tomando como
marco los halos de inhibición formados sobre las bacterias en estudio, esto permitió
designar las características de actividad de los extractos.
Las bacterias empleadas mostraron una diferencia de susceptibilidades a
los antibióticos, por lo que, en este trabajo se emplearon bacterias multirresistentes y
esto permitió comprobar la actividad de los extractos sobre bacterias con diversos
grados de susceptibilidad a los antibióticos (Cuadro 5).
Concentraci Cepas
Antibiotico ón (mcg)
72
Los resultados de la determinación de la actividad antimicrobiana de los
extractos de Rhoeo discolor sobre las bacterias estudiadas a diferentes
concentraciones; mostraron que el extracto EAcEtTRd presentó mayor actividad,
en comparación con los demás extractos, ya que inhibió a todas las bacterias en
la mayoría de las diferentes concentraciones bacterianas probadas. El extracto
EEtHRd mostró efecto antimicrobiano sobre las tres cepas bacterianas sólo a la
concentración de 1x105 ufc/ml. Los extractos EClHRd y EAcHRd mostraron
actividad sobre Salmonella enteritidis y Shigella flexneri a la concentración de
1x105 ufc/ml. El extracto EAcTRd presentó efecto sobre Shigella flexneri a 1x105
ufc/ml.
Shigella flexneri mostró mayor susceptibilidad a los extractos probados al ser
inhibida por todos ellos. La concentración bacteriana a la cual se presentó ésta
inhibición fue de 1x105 ufc/ml. Solo el extracto EAcEtTRd mostró efecto
antimicrobiano a las tres concentraciones bacterianas.
Salmonella enteritidis presentó susceptibilidad, pero en menor grado, ya que
fue inhibida por cuatro de los extractos probados. EClHRd, EEtHRd, EAcHRd y
EAcEtTRd inhibieron a la bacteria a la concentración de 1x105 ufc/ml, el extracto
EAcEtTRd lo hizo también a 1x106 ufc/ml.
Escherichia coli mostró menor susceptibilidad a los extractos probados, fue
inhibido sólo por el extracto EAcEtTRd a la concentración de 1x105 ufc/ml y por
el extracto EEtHRd a 1x106 ufc/ml (Cuadro 6).
73
Cuadro 6. Actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor a diferentes
concentraciones
Bacteria (UFC/ml) Acetato Acuoso Clorofórm Etanólico Acuoso de
de etilo de tallo ico de de hoja hoja
Tallo Hoja
1x105 + - + + +
Salmonella 1x106 + - - - -
enteritidis 6x106 - - - - -
1x105 + + + + +
Shigella 1x106 + - - - -
l
flexneri 6x106 + - - - -
1x105 - - - + -
Escherichia 1x106 + - - - -
coli 6x106 - - - - -
(+) Presencia de halos de inhibición
( - ) Ausencia de halos de inhibición
La actividad antibacteriana de los extractos de Rhoeo discolor a las
concentraciones experimentales probadas sobre Escherichia coli. (Cuadro 6)
Los extractos EEtTRd y EAcEtTRd mostraron una actividad baja, ésta sólo
se presentó a altas concentraciones del extracto. La mínima concentración de
extracto a la cual Escherichia coli, fue inhibida de 16 mg/ml para ambos extractos
(Fig. 22).
74
Figura 22. Actividad antibacteriana de extractos clorofórmico de hoja y acetato
de etilo de tallo de Rhoeo discolor sobre Escherichia coli.
75
Figura 24. Actividad antimicrobiana del extracto clorofórmico de hoja en
diferentes concentraciones sobre Salmonella enteritidis
76
El extracto EAcHRd mostró una actividad alta a partir de la concentración de
16 mg/ml -y presentó una actividad baja a 8mg/ml correspondiendo ésta a la mínima
concentración de extracto que inhibió el crecimiento de la bacteria. Este extracto fue
el único que presentó una actividad alta hacia Salmonella enteritidis, en relación a los
demás extractos evaluados (Cuadro 7) Fig. 26.
77
Cuadro 7. Actividad antimicrobiana de extractos de Rhoeo discolor sobre
Salmonella enteritidis.
Concentración Extractos Soluciones Diluciones (mg/ml)
por disco madres (mg/ml)
(UFC/ml) 48 32 16 8 4 1 0.50 0.25
0.12
5
1 x 10 EacEtRd + + + + - - - - -
EacTRd - - - - - - - - -
EclHRd + + - - - - - - -
EEtHRd ++ + - - - - - - -
EAcHRd +++ +++ + - - - - -
+++
6
1 x 10 EacEtRd + + + - - - - - -
EacTRd - - - - - - - - -
EclHRd - - - - - - - - -
EEtHRd - - - - - - - - -
EAcHRd - - - - - - - - -
6
6 x 10 EacEtRd - - - - - - - - -
EacTRd - - - - - - - - -
EclHRd - - - - - - - - -
EetHRd - - - - - - - - -
EacHRd - - - - - - - - -
La actividad antibacteriana de los extractos se clasificó como sigue:
Actividad: diámetro de la zona de inhibición
Alta (+++) 23-17 mm
Media (++) 16-12
Baja (+) 11-7
Sin actividad (-) -
78
Figura 27. Actividad antimicrobiana del extracto acetato de etilo tallo sobre
Salmonella enteritidis.
A la concentración bacteriana de 1 x 105 ufc/ml, el extracto EAcTRd presentó
una actividad baja, la mínima concentración de extracto que inhibió el crecimiento de
Shigella flexneri fue de 8 mg/ml (cuadro 8).
79
Cuadro 8 . Actividad antimicrobiana de los extractos de Rhoeo discolor sobre Shigella
flexneri.
Concentración Extractos Soluciones madres Diluciones (mg/ml)
por disco (mg/ml)
(UFC/ml) 48 32 16 8 4 1 0.50 0.25
0.12
5
1 x 10 EacEtRd +++ +++ +++ ++ ++ + - - -
EacTRd + + + + - - - - -
EclHRd + + + - - - - - -
EEtHRd ++ + + - - - - - -
EAcHRd +++ +++ ++ - - - - - -
6
1 x 10 EacEtRd ++ ++ + - - - - - -
EacTRd - - - - - - - - -
EclHRd - - - - - - - - -
EEtHRd - - - - - - - - -
EAcHRd - - - - - - - - -
6
6 x 10 EacEtRd +++ ++ ++ + - - - - -
EacTRd - - - + - - - - -
EclHRd - - - - - - - - -
EetHRd - - - - - - - - -
EacHRd - - - - - - - - -
La actividad antimicrobiana de los extractos, se clasificó, con base al diámetro de la zona de
inhibición, como sigue:
Actividad: Diámetro de la zona de inhibición
Alta (+++) 23-17 mm
Media (++) 16-12
Baja (+) 11-7
Sin actividad (-) -
80
Figura 28. Actividad antimicrobiana de los extracto acuosos de hoja y tallo de Rhoeo
discolor sobre Shigella flexneri.
81
extracto la que inhibió el crecimiento de Shigella flexneri. En 6 x 106 ufc/ml, el
extracto mostró una actividad media para 16 mg/ml en adelante y presentó una
actividad baja a las concentraciones de 8 mg/ml y 4 mg/ml, ésta última fue la mínima
cantidad de extracto que inhibió el crecimiento de Shigella flexneri (Fig. 29).
82
Los resultados mostraron que la actividad de los extractos parece estar
relacionada con la concentración bacteriana. Tal es el caso de los extractos EAcTRd,
EClHRd, EEtHRd y EacHRd, los cuales sólo presentaron actividad (que varió desde
una actividad baja hasta una alta) a la concentración de 1x105 UFC/ml. Sin embargo
el extracto EAcEtTRd ejerció actividad sobre las bacterias estudiadas en la mayoría de
las diferentes concentraciones utilizadas.
Los extractos EAcEtTRd, EAcTRd y EAcHRd presentaron actividad
antibacteriana a menores concentraciones en comparación con los extractos EClHRd y
EEtHRd.
El efecto de los extractos en la disminución del crecimiento bacteriano de
Shigella flexneri se muestra en el Cuadro 9 (Fig. 30)
Cuadro 8. Efecto de los extractos de Rhoeo discolor sobre el crecimiento de
Shigella flexneri.
Concentración Shigella flexneri
de los
1x105UFC/ml 1x106UFC/ml 6x106UFC/ml
extractos
Control 0.086 Control 0.105 0.003 Control 0.118
(mg/ml)
0.002 0.001
EClHRd
16 0.069 ± 000 0.057 ± 003 0.055 ± 0.000
32 0.286 ± 0.001 0.074 ± 026 0.444 ± 0.015
48 0.064 ± 0.014 0.226 ± 0.060 0.063 ± 0.005
80 0.619 ± 0.001 0.249 ± 0.063 0.814 ± 0.006
EAcHRd
16l 0.090 ± 000 0.071 ± 0.001 0.074 ± 0.002
32 0.074 ± 004 0.061 ± 0.003 0.060 ± 000
48 0.066 ± 000 0.047 ± 000 0.034 ± 000
80 0.032 ± 000 0.059 ± 0.021 0.066 ± 000
EetHRd
16 0.078 ± 000 0.081± 000 0.075 ± 000
32 0.025 ± 00* 0.024 ± 000* 0.021 ± 000*
48 0.017 ± 002* 0.023 ± 004* 0.020 ± 0.006*
80 0.004 ± 000* 0.022 ± 0.002* 0.039 ± 004*
EAcEtTRd
16 0.213 ± 000 0.224 ± 000 0.221 ± 002
32 0.035 ± 001 0.060 ± 002 0.055 ± 000
48 0.072 ± 000 0.109 ± 0.002 0.051 ± 000
80 0.065 ± 000 0.097 ± 001 0.014 ± 0.014
83
EAcTRd
16mg/ml 0.044 ± 000 0.045 ± 000 0.040 ± 000
32mg/ml 0.061 ± 000 0.045 ± 000 0.041 ± 002
48mg/ml 0.052 ± 000 0.088 ± 007 0.048 ± 000
80mg/ml 0.117 ± 001 0.076 ± 000 0.078 ± 001
* Valores seguidos por un asterisco son significativamente diferentes del control. Los resultados son
los valores principales y la desviación estándar de las densidades ópticas leídas a 560 nm.
Figura 30. Efecto del extracto etanólico del tallo de Rhoeo discolor sobre el
crecimiento de Shigella flexneri.
84
Para Escherichia coli sólo el extracto EEtHRd, a las concentraciones de 48 y 80
mg/ml, ejerció una reducción significativa en el crecimiento de la bacteria a la
concentración de 6x106 UFC/ml (Cuadro 10).
EClHRd
16 0.047 ± 0.002 0.053 ± 001 0.051 ± 0.008
32 0.057 ± 004 0.050 ± 005 0.019 ± 001
48 0.079 ± 026 0.019 ± 009 0.032 ± 001
80 0.077 ± 026 0.177 ± 045 0.035 ± 004
EAcHRd
16l 0.099 ± 002 0.051 ± 009 0.160 ± 002
32 0.67 ± 001 0.169 ± 012 0.116 ± 022
48 0.049 ± 012 0.198 ± 016 0.147 ± 007
80 0.090 ± 012 0.080 ± 040
EetHRd
16 0.059 ± 008 0.052 ± 007 0.058 ± 002
32 0.049 ± 021 0.018 ± 002 0.050 ± 002
48 0.014 ± 002 0.095 ± 009 0.008 ± 0.021*
80 0.061 ± 014 0.009 ± 0.02*
EAcEtTRd
16 0.037 ± 0.007 0.027 ± 0.005 0.304 ± 0.004
32 0.041 ± 0.007 0.054 ± 0.005 0.263 ± 0.173
48 0.057 ± 0.005 0.046 ± 0.016 0.336 ± 0.003
80 0.051 ± 0.013 0.054 ± 0.005 0.446 ± 0.005
EAcTRd
16mg/ml 0.047 ± 0.002 0.039 ± 0.001 0.143 ± 0.008
32mg/ml 0.057 ± 0.004 0.301 ± 0.004 0.116 ± 0.014
48mg/ml 0.079 ± 0.039 0.031 ± 0.004 0.147 ± 0.009
80mg/ml 0.107 ± 0.20 0.665 ± 0.190 0.108 ± 0.004
* Valores seguidos por un asterisco son significativamente diferentes del control.
85
Los resultados son los valores principales y la desviación estándar de las
densidades ópticas leídas a 560 nm (Fig. 31)
Figura 31. Efecto del extracto etanólico del tallo de Rhoeo discolor sobre el
crecimiento de Escherichia coli.
Figura 31. Efecto del extracto etanólico del tallo deRhoeo discolor sobre el
crecimiento de Escherichia coli
86
Cuadro 10. Efecto de los extractos de Rhoeo discolor sobre el crecimiento de
Salmonella enteritidis.
EClHRd
16 0.128 ± 0.31 0.020 ± 0.007 0.016 ± 0.000*
32 0.094 ± 0.071 0.060 ± 0.025 0.006 ± 0.000*
48 0.051 ± 0.003 0.046 ± 0.004 0.011 ± 0.000*
80 0.128 ± 0.019 0.029 ± 0.009 0.004 ± 0.000*
EAcHRd
16l 0.020 ± 0.025 0.04 ± 0.005 0.006 ± 0.004*
32 0.046 ± 0.004 0.190 ± 0.038 0.005 ± 0.003*
48 0.029 ± 0.009 0.182 ± 0.048 0.017 ± 0.014*
80 0.079 ± 0.002 0.019 ± 0.018*
EetHRd
16 0.048 ± 0.05 0.022 ± 0.014 0.030 ± 0.009
32 0.190 ± 0.38 0.013 ± 0.004* 0.060 ± 0.006
48 0.182 ± 0.048 0.013 ± 0.002* 0.031 ± 0.015
80 0.070 ± 0.002 0.013 ± 0.006 0.031 ± 0.027
EAcEtTRd
16 0.114 ± 0.019 0.040 ± 0.002 0.033 ± 0.000
32 0.090 ± 0.006 0.040 ± 0.002 0.027 ± 0.000
48 0.189 ± 0.006 0.036 ± 0.008 0.025 ± 0.003
80 0.143 ± 0.049 0.129 ± 0.043 0.015 ± 0.000
EAcTRd
16 0.149 ± 0.064 0.154 ± 0.052 0.107 ± 0.000
32 0.192 ± 0.027 0.152 ± 0.017 0.020 ± 0.002
48 0.205 ± 0.135 0.193 ± 0.054 0.031 ± 0.009
80 0.197 ± 0.094 0.224 ± 0.057 0.034 ± 0.003
87
Densidades ópticas de Salmonella entiritidis después de 18 h de incubación a 37
A= control de la bacteria a la concentración de 1x106 ufc/ml.
A1=densidad óptica de la bacteria con extracto etanòlico.
B= control de la bacteria a la concentración de 6x106 ufc/ml
B1= densidad óptica de la bacteria con extracto clorofórmico
B2= densidad óptica de la bacteria con extracto acuoso
Figura 32. Efecto de los extractos etanólico de tallo, acuoso y clorofòrmico de hoja
sobre el crecimiento de Salmonella enteritidis.
88
5. DISCUSIÓN
89
de células/ml, se tendría una visión más clara de la efectividad que ejercen los
extractos sobre los cultivos bacterianos.
A partir de los datos obtenidos de las Figs. 30, 31 y 32, correspondientes al
crecimiento poblacional de los cultivos, se tomó como punto inicial la densidad óptica
del control de la bacteria, ésta correspondió a cierto número de células/ml y se
comparó con el número de células /ml que correspondería al valor significativo de la
densidad óptica de la bacteria probada.
Con base en la relación anterior, se observó una reducción considerable del número
de células/ml y se expresó en porcentaje este número.
Las bacterias presentaron una reducción aproximada del 80% de células /ml.
Este porcentaje involucró sólo los valores significativos de las densidades ópticas de
los cultivos bacterianos que han sido mencionados con anterioridad.
El efecto de los extractos sobre crecimiento de las bacterias se aprecia màs
claramente en las Figs. 30, 31 y 32, en las cuales se presentan las densidades
ópticas, que fueron significativas con relación a sus controles.
Todo lo anterior permitió concluir que los extractos EEtHRd, EAcHRd y EClHRd
presentaron un efecto bactericida sobre los patógenos empleados para este estudio a
diferente concentración bacteriana.
La actividad antibacteriana de los extractos parece estar relacionada con el
tipo y el número de bacterias utilizadas, por ejemplo, para Escherichia coli el extracto
EEtHRd ejerció una disminución significativa del crecimiento a la concentración de
6x106UFC/ml, pero su efecto inhibitorio cesó a bajas concentraciones.
El mismo efecto fue observado en Salmonella enteritidis, con los extractos
EAcHRd y EClHRd a la misma concentración de bacteria, y además de que la
reducción del crecimiento no fue significativa en ocasiones se vio incrementada.
Sin embargo, el extracto EEtHRd ejerció una reducción en el crecimiento de Shigella
flexneri a todas las concentraciones bacterianas.
Sería de gran utilidad, realizar más investigaciones, utilizando otros
microorganismos patógenos, principalmente con Helicobacter pilori causante de
problemas digestivos, es decir, con enfermedades inflamatorias y carcinogénicas.
90
También se tiene que continuar con la valoración de la acción bactericida para cada
uno de los metabolitos aislados de los extractos, aunque parece ser que se
encuentran mayormente en el extracto de acetato de etilo, por ser éste el que mayor
inhibición presentó.
Esta observación es importante ya que el estudio fitoquímico realizado hasta
ahora, indica que casualmente en este extracto se presenta el compuesto cumarínico
y analizando la bibliografía química antes mencionadas y visualizando una posible
estructura del compuesto, éste cumple con todos los requisitos para presentar acción
bactericida, antiinflamatoria y anticancerígena, es decir, es un compuesto aromático
que presenta un anillo lactónico con doble enlace conjugado y con la presencia de
varios grupos hidroxilos que le confieren mayor solubilidad en disolventes polares
como el alcohol o agua.
Ahora bien, se llegó a estos resultados de estructura, analizando por
cromatografía los extractos que indicaron la presencia de varios metabolitos, por
ejemplo, en la técnica de capa fina y utilizando luz ultravioleta como agente
revelador se pudo detectar la presencia de un compuesto de fluorescencia intensa
que es muy característico para compuestos que tienen dobles enlaces conjugados
con anillos lactónicos y con aromáticos, como es el caso de las cumarinas.
En este mismo proceso cromatográfico y utilizando solución de cloruro de
cobalto como agente revelador se comprobó la presencia de dos compuestos de
estructura esteroidal, además de otros, como caroteno, clorofila e hidrocarburos
saturados (ceras). Estos datos fueron confirmados por el análisis en cromatografía de
gases.
Ahora bien, el compuesto cumarínico aislado del extracto de acetato de etilo,
fue analizado por espectrometría de masas y dio un ión molecular de 208 m/z, que
correspondería a una fórmula de C10H8O5 (Fig. 12). Esta fórmula llevaría a una gran
cantidad de compuestos, pero, los resultados de espectroscopÍa infrarroja se detectó
la presencia de grupos hidroxilos y grupo carbonilo en la molécula (Fig. 13).
Sin embargo, los resultados de 1H RMN proporcionaron mayor información del
compuesto y se llegó a la conclusión que efectivamente este compuesto contiene
91
varios grupos hidroxilos y un anillo aromático así como, un grupo carbonilo conjugado
(Figs. 14 y 15). Pero se desconocía el número de grupos hidroxilos y la posición de
ellos, por lo que se realizaron reacciones de acetilación y metilación para así, tener
mayor información sobre la estructura.
Después de haber estudiado las reacciones de acetilación y metilación
(teóricamente) y obtener los resultados experimentalmente de estas reacciones para
cada uno de los compuestos anteriores así como, haber analizado los espectros de
masas y de 1H RMN de los mismos, se llegó a la conclusión de que el compuesto4-
(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H-furan-2-ona es el de mayor probabilidad en cuanto a
su estructura.
HO
O
O
HO OH
4-(2,4-dihidroxi-fenil)-5-hidroxi-5H-furan-2- ona
92
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106
107
Estos resultados llevaron a cinco tipos de estructuras posibles, como se
muestran:
1 2 3
HO
O O
O O
O
OH
HO OH HO OH O O
II. 4-(2,4-dihidroxi-fenil-)3-hidroxi-3H-furan-2-ona
108
4. 5
OH OH
HO
O
O
HO O O HO OH
109
110
a)
111
DIAGRAMA GENERAL DEL ESTUDIO FITOQUÌMICO DE Rhoeo discolor
(parte aèrea)
Extracción con
acetato de etilo
Marco
Sol.acetato
de etilo Extracción con metanol
Sol. metanólica
EAcEtRd
2(5H)-furanona-5-hidroxi-4-(2´, 4´-dihidroxifenil)
(estructura propuesta tentativamente)
OH
O
HO OH CRECIMIENTO BACTERIANO
112
El crecimiento es un componente esencial de la función microbiana, ya que
toda célula viva tiene un período finito de vida en la naturaleza y las especies sólo se
mantienen como resultado del crecimiento constante.
El crecimiento microbiano ocurre generalmente por medio de la división
celular. Los microorganismos se desarrollan principalmente como poblaciones de
células y es importante distinguir entre el crecimiento de una célula individual y el
crecimiento de una población. El crecimiento celular es el resultado de un aumento
en el tamaño de las células, seguido de su división. El crecimiento de una población
es el resultado de un aumento en la cantidad de células. La mayor parte de los
estudios sobre crecimiento en microbiología se refieren a las poblaciones más que a
las células individuales Boyd- Hoerl 1983, Carpenter P.1984 , Mota A. , 1995) .
Las poblaciones microbianas presentan un tipo característico de patrón de
crecimiento llamado crecimiento exponencial. Este es un modelo de aumento de
población donde la cantidad de células se duplica durante cada unidad de período
de tiempo. El crecimiento exponencial se observa claramente construyendo una
gráfica de la cantidad de células a varios períodos de tiempo sobre una gráfica
semilogarítmica, en la cual uno de los ejes corresponde al logaritmo del número de
bacterias y el otro eje al tiempo en escala aritmética. Este procedimiento da una
curva simétrica y tiene la ventaja no solo de disminuir los errores de recuento, sino
también que mientras los microorganismos se multiplican en forma exponencial los
puntos caen sobre una línea recta (, Boyd- Hoerl, 1983. Mota A. , 1995) Fig. 3.
113
1 0 0 0
1 0 0
1 0
Logaritmo del 1
nùmero de 1 3 5 7 9 1 1 1 3
organismos
Tiempo (horas)
114
115