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Biochemical and molecular characterization of Trichoderma spp. antagonizing Phymatotrichopsis omnivora View project
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Resumen
Los insectos constituyen el grupo más diversificado y exitoso del reino animal. Por estar expuestos a una variedad
de ambientes y pathgenos, sus mecanismos de defensa deben ser eficientes. En este trabajo se describen los
principales componentes séricos responsables de la respuesta inmune humoral en los insectos: lectinas, lisozimas,
cecropinas, atacinas, diptericinas, proteinas inducibles y el sistema profenoloxidasa. Además se discuten las
perspectivas de investigación en este campo.
The insects are the more diversified and successful group of the animal kingdom. The insect defense mechanisms
must be efficient because the animals are exposed to different environments and pathogens. In this work are
described the most important serum components involved of the humoral immune response in #e insects: lectins,
lysozymes, cecropins, atacins, diptericins, inducible proteins and the prophenoloxidase system. In addition, the
research perspectives in insect immunology are discussed.
Cuadro 1.
Algunas especies de insectos de las cuales se han puriñcado lectinas.
cumplan con lamismafunción. Por otro lado, debidoaque sustancias extrañas, lisis o destrucción y factores de acti-
la mayoría de los insectos tiene una vida media corta, el vación celular. En algunos casos, se ha podido demostrar
concepto de memoria inmunológica no debe ser aplicable que tales factores son inducibles por un reto antigénico, e
en los períodos utilizados para los vertebrados. En general, incluso, establecer una respuesta inmune secundariasimi-
debe considerarse que el sistemainmune de los insectos es lar a la de los vertebrados, caracterizadapor una respuesta
capaz de responder a la presencia de material extraño a mayor y más rápida. En otros casos, los componentes
través de mecanismos que favorezcan la eliminación de involucrados están normalmente presentes en la hemolinfa,
este material y que permitan mantener la identidad bioló- por ejemplo, las lectinas y la fenoloxidasa, pero su partici-
gica del individuo. pación en los mecanismos de eliminación de patógenos es
En todos los seres vivos, la existencia de un óptimo indiscutible.
sistema inmune implica, además de un sistema celular, la Los estudios sobre la respuesta antibacteriana en la
participación de componenteshumorales capaces de reco- polillablanca(Galleriamellonella)(Stephens, 1959,Hink
nocer y10 interactuar directamente con la partícula extra- y Briggs, 1968) posiblemente fueron los primeros que
ña. Estarespuesta humoral facilita el acceso a sitios donde demostraron la importancia y contribución de los factores
las células no puedan acercarse rápidamente, pueden ser bioquímicos humorales en la inmunidad de los insectos.
portadores de la especificidad, pueden tener efectos direc- Posteriores experimentos con la polilla Hyalophora
tos sobre el patógeno (bacteriólisis, por ejemplo,) o parti- cecropia (Boman y Hultmark, 1987),llegaron ademostrar
cipar conjuntamente con las células efectoras. Este tipo de que la inoculación de bacterias induce en este insecto un
moléculas se ha descrito en insectosy comprendendiferen- estado de inmunidad caracterizado por la presencia de
tes actividades biológicas, tales como: reconocimiento de proteínas antibacterianas en su hemolinfa.
En el campo de lainmunologíade insectos los hallazgos Aunque las lectinas de algunos insectos han sido p r i -
no pueden ser generalizados, ya que debido a la diversidad ficadas, las diferenciasentre sus propiedades moleculares,
biológica de estos organismos, se espera una variación en especiñcidadesy origen o localizaciónson tan diversasque
los Mores y mecanismosde reconocimientoy de elimina- no han permitido hacer generalizaciones sobre su estruo
ción de los agentes extraños. Sin embargo, en algunos tura, especificidad, mecanismo, y otras propiedades que
casos esposible encontrar sustancias comunes asociadas a faciliten la comprensión del papel que estas proteínas
la respuesta inmune en todos los insectos estudiados; tal es tienen en el sistema de defensa (cuadro 1).
el caso de las lectinas o aglutininas. En otros casos, como
el de los Mores bactericidas, únicamente han sido estu-
diados en muy pocas especies de insectos, sin que llegue a
negarse la existencia en otros. Actuando separados o en
conjunto, los factores humorales de los insectos son los La lisozima fue el primer factor antibacterianopurificado
responsables de eliminar el material extrañoy de prevenir, de la hemolinfade los insectos (PowningyDavison, 1976),
en la mayoría de los casos, las infecciones. Acontinuación pero también se ha encontradoen otros órganos y células
revisaremos los principales componentesséricosdescritos deestosanimales, como son: el intestino (RibeiroyPereira,
en los insectos como participantes de la respuesta inmune 1984) y las células circulantes o hemocitos (Zachary y
humoral. Hofñnan, 1984; Lemos y Terra, 1991;Lemos et al, 1993;
Russell y Dunn, 1991). Las lisozimas de insectos muestran
gran similitud a las lisozimas de vertebrados en cuanto a
Lectinas contenido de aminoácidos. Mas aún, los residuos 'de
aminoácidos responsables de la actividad cataiítica y los
Las lectinas son proteínas divalentes o multivalentes que cuatro enlaces disuífúro son esencialmente idénticos en
pueden aglutinar células u otros materiales que tengan un ambos gmpm (Bornan y Hultmark, 1987). El hecho de
oligosacáridode complementariedad apropiada (Sharony encontrar a las lisozimas tan ampliamente distribuidas
Lis, 1972). Por definición, las lectinas se ligan entre las especies de insectos, ha favorecido a que los
específicamente a carbohidratos a través de uniones no aspectos evolutivos de esta enzima sean considerados
covalentes (Barondes, 1981). Estas proteínas han sido (Engstrom et al, 1985)y que se hayan establecido algunas
descritas de virus, bacterias, levaduras, plantas, comparaciones (cuadro 11).
invertebrados y vertebrados, ya sea como proteína libre o
como componente endógeno de membranas celulares La lisozima de la polilla Hyalophora cecropia es una
(Sharon y Lis, 1989).Para el caso de los invertebrados, los proteína de 120 aminoácidos (peso molecular 13.8 K&)
nombres de lectinas y aglutininas son utilizados indistin- que fueaislada durante la punñcación de las cecropinas A
tamente. La presencia de lectinas en invertebrados, inclu- y B (Hultmark et al, 1980). Normalmente, esta enzima se
yendo insectos, sus características, sus funciones y su encuentra en la hemolinfa de la larva de Hyalophora
posible participación en los mecanismos de defensa han cecropia,pero está ausente en la pupa. Sin embargo, la
sido revisados ampliamente (Renwrantz, 1983, 1986; producción de lisozima, tanto en las larvas como en las
Rogener y Uhlenbruck, 1984; RatclifTe, 1985; Olafsen, pupas puede ser inducida por la inoculación de óacterias
1988).
-.- - ,-
(Sun et al, 1991). La lisozima de Hyalophora cecropia
Aunque se ha demostrado la capacidad de las lectinas muestra acción bactericida solamente para unas cuantas
para aglutinar bacterias y precipitar glicoconjugados, es bacterias, por ejemplo: Bacillus megaterium,Micrococw
posible que este mecanisno no sea el mas importante in lutew y Escherichia coli D22. No obstante, otro tipo de
vivo. M á s bien, el papel de estas proteínas parece estar moléculas (cecropinas) es también activo contra estas
relacionado al reconocimiento de la partícula extrafía y a bacterias y no se ha encontrado una bacteria que sea
oicilitar su fagocitosis (opsonización). Las interacciones sensible a la lisozimay resistente a las cecropinas (Boman
entre las células circulantes (hemocito) y un cuerpo extra- y Hultmark, 1987). De este modo, es posible que la
ño están mediadas por receptores o componentesde super- principal función de la lisozima no sea matar a las bacte-
rias, sino remover el sáculo de mureína, permitiendo la
ficie de los fágocitos y las estructuras moleculares del
acción de cecropinas y atacinas. De esta manera se llega a
agenteextraño. En el caso de los macrót%gosde vertebrahs
se ha demostrado que las glicoproteínas tienen un papel establecer un eficiente trabajo sinérgico.
importante en la unión de bacteriasa estas células(Sharon,
1984). Es posible que, en el proceso de fagocitosis en los
invertebrados, las lectinas participen en forma similar Cecropmas
(Renwrantz, 1983; Sminiayvan der Knaap, 1987),aunque
otras fuerzas como hidrofobicidad, humectabilidad, Las cecropinas constituyen una familia de proteínas fuer-
interacción entre cargas y las propiedades fisicas de la temente básicas, con pesos moleculares alrededor de 4
sustancia extraíía, también influyan (Lackie, 1983). Kda, que pueden ser inducidas y tienen una potente
23
Tdptcos de Imstigacidn y Posgrado
Francisco Vurgas-Aibomsd o Oriegu-Rubio
Cuadro11
Comparación de las secuencias de aminoácidos de la lisozima humana y la de H. cecropia con la de pollo.
Humano
Polk
H. cecmpki
Humano
Pollo
H. CdCmpki
Humano
Pollo
H. cecmpki
II>
Humano
Polk
Humano
Polk
actividad antibacteriana. El nombre se debe a que fueron También de otros insectos se han aislado y estudiado
descritasporvezprimeraenlapolillaHyalophoracecropia, proteínas con características similares a las aisladas de
pero una actividad similar ha sido detectada en otros Hyalophora cecropia. En la palornillaAntheraeapemyi,
insectos, y también ha recibido otros nombres, como: la cecropinaD es el principal factor antibacteriano, aunque
sarcotoxina (Okaday Natori, 1985)y sapecina(Kuzuhara lasformas A y B están presentes en baja concentración (Qu
et al, 1990). et al, 1982). Algunas cecropinas similares a las formas A
La pupa deHyalophoracecropiac~ntiene tres cecropinas y B fueron aisiadas y secienciadas del gusano de Seda
principales A, B y D. Este mismo insecto tiene otros cuatro (Bombyxmori)(Monshimaetal, 1990;Sumida et al, 1992)
componentes antibacterianos menores, dos de los cuales y de la polilla del tabaco, Manduca sexta (Dickinson et al,
pueden ser precursores de cecropinas con una glicina 1988).En la mosca panteonera(Sarcophagaperegrina)se
adicional en el extremo C-terminal (Hultmarket al, 1982). han detectado cuatro proteínas, llamadas sarcotoxinas
La secuencia de aminoacidos de las cecropinas ha sido (Okada y Natori, 1985), que mantienen gran homología
comparada (Boman y Hultmark, 1987) y el alto grado de con las cecropinas (cuadro 111). De la hemolinfa de
homología entre las cecropinas A, B y D sugiere que ellas Sarcophagaperegrina, también se ha aislado otra proteí-
se presentan por duplicación de genes. Las cecropinas A y na, denominada sapecina, con actividad antibacteriana.
B son altamente activas contra algunas bacterias gram Esta molécula es un péptido de 40 residuos, no presenta
positivas ygram negativas, mientrasque la formaD mostró homología con las cecropinas, y contiene cuatro cisteínas
alta actividad únicamente contra Escherichia coli y esencialesparala actividadantibacteriana(Kuzuharaet al,
Acinetobacter calcoaceticus(Hultmarketal, 1982). Algu- 1990).
nas de las bacteriasprobadas son patógenas ocasionalesde
insectos, y otras (Xenorhabdus nematophilus y Bacillus
:thuringiensis), son patógenos obligados. Dos aspectos Atacinas
interesantes se desprenden de los resultados anteriores. El
primero es que Bacillus thuringiensis es utilizado para el Estas proteínas fueron inicialmente aisladas e identifíca-
control biológico de insectos y es totdmente resistente a das como la proteína inducible P5 (Boman y Hultmark,
todas las cecropinas; sin embargo, los protoplastos de esta 198l), sin que fuera detectada heterogeneidad o actividad
bacteria son sensibles a las cecropinas, lo que indica que la antibacteriana. Las atacinas fueron redescubiertas como
pared celularjuega un papel importante en la resistencia a unañaccionconactividadantibacterianaconpeso molecular
las cecropinas. El segundo es que Acinetobacter de 22 Kda (Hultmark et al, 1983) considerablemente más
calcoaceticus, el cual es resistente a muchos antibióticos, altoqueel de las cecropinas(4Kda). Subsecuentesestudios
sea sensible a las tres cecropinas (Bornan y Hultmark, revelaron la presencia de seis diferentes componentes (A-
1987). Por último, las cecropinas no tienen efectos en las F) que muestran reacción cruzada con el antisuero prepa-
líneas celulares de mamíferos o en levaduras, lo que las rado contra la proteínaP5.El estudiode las secuenciasN-
hace especíñcas para procariotes. terminales para cinco de las atacinas indican que tres &
Cuadro Iii
Comparación & la secuencia de aminoácidos de diferentes Cecropinas y otras proteínas antibacterianas aisladas de
la hemolinfa de diferentes insectos.
Y ksircéner p.nwae.
+ i d -te-
x gN-
-
EmuE.drripvrm*rhllIudermnCciq>hA
+ dmta&twmtrl*.L
pueda Dar-
ellas, las formas básicas, son idénticas; mientras que las secuenciadeaminoácidosindicaque las diptericinas cons-
otras dos son más ácidas y tienen una secuencialigeramen- tituyen una nueva £amilia de proteínas antibacterianas,
te diferente (Hultmark et al, 1983). Lo anterior ha perrili- diferentes de las cecropinas y atacinas (Keppi et al, 1986;
tido suponer que las atacinas son codiñcadas por dos genes Dimarcq et al, 1990). En dmófila, se ha demostrado que
diferentesúnicamentey que probablemente el origen& las la transcripción para la síntesisde estas proteínas se inicia
dos. poblaciones moleculares se haya establecido por dos horas después de la inoculación de bacterias (Wicker
duplicación de genes. et al, 1990).
El espectro antibacteriano de las atacinas es estrecho,
con buena actividad contra Escherichia coli y otras dos
bacterias más, aisladas del intestino de una larva de Otras protemas inducibles
Antheraeapernyi(Hultmarketal, 1983).Unestudio hecho
sobreel mecanismode acción de las atacinasenEscherichia En la pupa de Hyalophora cecropia se han encontrado
coli demostró que las dos principales atacinasactúan en la además otrosfactores como la hemolina (también llamada
membrana externa (Engstrom et al, 1984). Por lo anterior, proteína inmune P4) que puede ser inducida,junto con las
aparentemente en los insectos, las atacinas facilitan la cecropinas y las atacinas, por inyección de bacterias. La
proteína purifícada es un polipéptido de 48 K& con un
acción de cecropinasy lisozimas, de modo tal que estastres
proteínas trabajan en conjunto para la destrucción de punto isoeléctrico básico. Aunque no tiene actividad
antibacterianadirecta (Rasmuson y Boman, 1979) es una
bacterias. Atacinaso moléculas similarestambién han sido
de las primeras proteínas que se une a la superficie
aisladas de la polilla del tabaco (Manduca sexta) (Spies et
bacteriana (Sun et al, 1990), iniciando la respuesta inmu-
al, 1987)y de la mosca panteonera (Sarcophaga peregri-
ne. Una proteína similar se ha identificado en la polilladel
na) (Ando et al, 1987).
tabaco (Manduca sexta), la cual manifiesta cuatro
isoproteínas que varían por el grado de glicosilación
(Hulbert et al, 1985).
Un factor diferente se ha detectado en la cucaracha
Es una serie de proteínas antibacterianas inducibles, las americana (Periplaneta americana), organismo en el que
cuales fueron detectadas en la larva de mosca Phonnia ha sido posible inducir protección específica contra el
terranuvae. Aunque fue purifícada una proteína con peso veneno & víbora o de abeja (Karp, 1985; George et al,
molecular de 9 K& y un pI de 7.8, en total parece ser una 1987). Esta respuesta muestra semejanza con la respuesta
serie de siete proteínas relacionadas. La composición y inmune en vertebrados, tanto primaria como secundaria
Francisco Vargas-Alboresy Alfredo OHega-Rubio
El factor involucrado solamente se ha podido demostrar proteínas séricas se unen a los glucanos B1,3 y este
por electroforesis en geles de poliacrilamida, donde se complejo interacrúa con la superñcie de los hemocitos,
aprecia una modiñcación en los patrones proteicos. Aun- activandoalsistemaprofenoloxidasa(Yoshid 1986).
que se observanvariasalteracionescuantitativas,solamen-
te es consistente el incremento de una banda de 102 Kda.
Por cromatografiade filtración se demuestraque laprotei- Perspectivas de investigación
nainducidaenforma nativatieneun peso molecular de 600
Kda (George et al, 1987). Hasta el momento el conocimiento sobre los mecanismos
de defensa de los insectos permite asegurar la existenciade
un sistema de defensa humoral cuya respuesta puede ser
El sistema de profenoloxidasa inducida y que es lo sufícientemente efectiva para destruir
agentes extraños. Así, las nuevas líneas de investigación
Como parte de las reacciones de defensa en invertebrados incluyen: a) la descripción de sistemas inmunes en una
frecuentemente se observa meianización. La enzima mayor cantidad de especies, b) la profundización en los
involucrada en la síntesis del pigmento de melanina es la mecanismos de respuesta y la regulación del sistema
fenoloxidasa (Gdifenoloxígeno-óxidoreductasa), la cual inmune y, c) la búsqueda de factores que promuevan la
es capaz de oxidar los fenoles a quinonas, que posterior- supresión de la respuesta inmune en aquellos insectos
mente polimerizan en forma no enzimática a melanina. dañinos para el hombre. Esto último tiene importancia
Este pigmento, junto con sus intermediarios,tiene propie- para el control de plagas agrícolas y de vectores de enfer-
dades fungistáticas. La fenoloxidasa se ha detectado en la medades para el hombre y animales de interés comercial.
hemolinfa de artrópodos en forma de una proenzima Sin olvidar la existencia y participación de un sistema
inactiva(Ashida, 1971)llamadaprofenoloxidasa@roPO), celular, poder comprender el funcionamiento de los siste-
con peso molecular de 80 Kda y cuya activacióninvolucra mas inmunológicos en los insectos, el grupo más
la eliminación de un péptido de 5 Kda, aproximadamente diversificado de nuestro planeta, ayudaría a entender la
(Ashida y Dohke, 1980). razón de su éxito evolutivo y a consolidar un concepto
El sistema de la proPO de artrópodos, probablemente es unificador de la respuesta inmune en todos los animales y,
activado durante el reconocimiento de lo extraño (RatcliEe desde luego, la del hombre.
et al, 1985; Soderhall, 1982). Una vez activado el sistema
proPO, éste genera algunos factores que estimulan a los
hemocitos parala eliminación de material extraño(Leonard Agradecimientos
et al, 1985; RatcliEe et al, 1985).De este modo, además de
su papel en la melanización, el sistema de proPO es capaz Este trabajo fue desarrollado con el apoyo del Centro de
de estimularalgunas reaccionescelulares de defensa como Investigaciones de Baja California Sur, la Secretaría de
son: la fagocitosis, la formación de nódulos y la Programación y Presupuesto y el Consejo Nacional de
encapsulación(RatclBe et al, 1985), así como laadhesión Ciencia y Tecnología de México. Los autores queremos
y locomoción de hemocitos (Takle y Lackie, 1985). El agradecer la ayuda de Lolita Vázquez en la mecanograña
sistema proPO en los insectos es activado por proteasas de del trabajo.
serina (Leonard yet al, 1985; Yoshida y Ashida, 1986). A
su vez, estas proteasas de serina, que se encuentran en
forma inactiva en los hemocitos, pueden ser activadas por Referencias
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