UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

SANTO DOMINGO

PERÍODO : Octubre 2018 – Febrero 2019

ASIGNATURA : Cátedra Integradora de Bioquímica.

INTEGRANTES : Chávez Esteban, Dela Génesis,

Sarango Jordan, Verduga Ángela

NIVEL : Tercero

DOCENTE : Dr. Juan Neira

FECHA : 30/Enero/2019

TEMA : Obtención de caseína, reacción de Biuret y punto isoeléctrico

SANTO DOMINGO – ECUADOR

2019
 I. INTRODUCCIÓN

La leche es una sustancia la cual contiene un sin número de vitaminas entre las cuales
destacan la tiamina, riboflavina, ácido pantoténico, y vitaminas A, D Y K, También se
pueden encontrar minerales como, potasio sodio, calcio y fósforo. Las proteínas de la
leche se las puede clasificar de 2 maneras Cómo proteínas globulares y fibrosas, aunque
también se mantiene otra forma de clasificarlas como caseínas o también como proteínas
de suero. (upo.es, 2009)
Dentro de las proteínas globulares están Aquellas que tienen formas esferoidales y no
tienen ningún tipo de interacciones entre moléculas como son los puentes de hidrogeno
que a diferencia de las proteínas fibrosas son muy comunes y características de estas.
Existen tres tipos de proteínas inmersas en la leche: caseína, lacto albuminas y lacto
globulinas teniendo característica que todas estas son globulares. (genially, 2017)
La caseína es una proteína considerada conjugada que se encuentra en la leche es un tipo
de fosfoproteína que se encuentra cuándo se produce una acidificación en la leche dando
una formación de una masa blanca. Las fosfoproteínas son grupos de proteínas que están
enlazados a Sustancia con ácido fosfórico. Unidos también cerina treonina por un grupo
hidroxilo.
En proporción La caseína en la leche representa un porcentaje del 77 al 82% Y un 2.7 en
composición líquida. Para obtener la caseína se debe Reducir el pH Hasta que la caseína
precipite Es decir se tiene que llegar a su punto isoeléctrico el cual tiene un valor de 4.6
a temperatura ambiente.
La caseína tiene varias aplicaciones en la industria como la fabricación de pinturas
especiales en el apresto de tejidos también es muy usada en la clarificación de vinos, en
la elaboración de preparados farmacéuticos y a su vez en la fabricación de plásticos.
(upo.es, 2009)
Cómo objetivo en esta práctica de laboratorio se Tiene como primer. la extracción de la
Caseína A partir de la acidificación con ácido cítrico determinando así su. Isoeléctrico.

II. OBJETIVOS
Objetivo General

 Extraer la caseína de la leche Disminuyendo el pH de la muestra con ácido cítrico

Objetivos específicos

 Realizar la prueba de Biuret con una pequeña cantidad de la caseína extraída

anteriormente.
 Obtener el punto isoeléctrico de la caseína.
III. REVISIÓN DE LITERATURA

CASEÍNA

La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína)
presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur
o el queso). En la leche, se encuentra asociada al calcio (fosfato de calcio), formando
agregados que se denominan micelas de caseína.

Las proteínas de la leche se dividen en tres grupos: Las caseínas, las proteínas del
lactosuero y las que forman parte de la membrana del glóbulo graso. Estas últimas
representan solamente del orden del 1% del total de la proteína de la leche.

Las caseínas son las principales proteínas de la leche. Se sintetizan exclusivamente en la

glándula mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor parte formando agregados
multimoleculares conocidos como “micelas de caseína”. En la leche de vaca, la caseína
representa alrededor del 80% del total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro
de leche. En la leche humana la presencia de proteínas del lactosuero es mucho mayor,
de tal forma que las caseínas son solamente del orden de la mitad de las proteínas totales,
entre 5 y 8 gramos por litro. (Calvo, s.f.)

Estructura de las moléculas de caseína

Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño

mediano (unos 200 aminoácidos, siendo algo menor la caseína κ) contar con pocos tramos
con estructura secundaria organizada, debido a la presencia de abundantes restos de
prolina, y tener unidos covalentemente grupos fosfato a algunos de los restos de serina, y
muy ocasionalmente a restos de treonina. La falta de organización de las moléculas de
caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido cristalizarse para llevar a
cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.

Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es
que las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico (a temperatura
ambiente).
Desde el punto de vista de la estructura, en la leche bovina (y en la mayoría de las leches
de otras especies) existen cuatro caseínas, conocidas como αs1, αs2, (la S del subfijo indica
que son “sensibles” al calcio, es decir, que pueden precipitar al asociarse con él) β y κ.
Las llamadas “caseínas γ” son simplemente fragmentos de la caseína β producidos por
proteolisis por la plasmina. Todas las caseínas tienen variantes genéticas, producidas por
sustitución de aminoácidos y en algunos casos por selección.

Existen diferencias en la proporción que representa cada tipo en el total de las caseínas.
De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el contenido
de caseína κ que representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las de la
leche de vaca y el 26% de las de la leche humana. (Calvo, s.f.)
Proceso industrial de obtención de caseína
Coagulación
La caseína se obtiene coagulando leche descremada con ácido clorhídrico diluido, así se
imita la acidificación espontánea. Los coágulos se decantan, se lavan con agua, se desecan
y finalmente se muelen. Cuando coagula con renina, es llamada paracaseína, y cuando
coagula a través de la reducción del pH es llamada caseína ácida. Cuando no está
coagulada se le llama caseinógeno. En la leche de vaca, la caseína representa alrededor
del 80% del total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por litro de leche. En la leche
humana la presencia de proteínas del lactosuero es mucho mayor, de tal forma que las
caseínas son solamente del orden de la mitad de las proteínas totales, entre 5 y 8 gramos
por litro (Ecuared, 2018).
Diagrama de flujo
Reacción de Biuret

El reactivo de Biuret es muy usado para la determinación Cadenas de péptido de

proteínas, compuestos con 2 o más en enlaces peptídicos en sustancias en composición
desconocida. La reacción que se realiza la producen los péptidos y las proteínas, pero no
los aminoácidos ya que van en fusión de los enlaces peptídicos Qué se destruye a liberarse
los aminoácidos. Cuando una proteína está expuesta al contacto con un concentrado álcali
se forma una sustancia denominada Biuret. (Domínguez, 2016)
El reactivo de Biuret en su estructura está compuesto por hidróxido de potasio y sulfato
cúprico, junto con tartrato de sodio y potasio. Para verificar los resultados este reactivo
nos da cambios de color azul o violeta cuando está en presencia de proteínas y a una
coloración rosa cuándo se combina con polipéptido de cadena corta.

Punto isoeléctrico
El punto isoeléctrico es el pH en el cual el número de cargas positivas es igual al número
de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto
isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero. En los aminoácidos los grupos ionizables
pertenecen a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos. Los puntos isoeléctricos
suministran información ventajosa para inferir sobre la conducta de los aminoácidos y
proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas moléculas tiene
importantes consecuencias sobre la solubilidad ("EcuRed", 2019).
Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las
restantes condiciones persisten iguales. Esto se da porque los iones dipolares no muestran
carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH ("EcuRed", 2019).
El valor de la carga depende del punto isoeléctrico y del pH
El pH determina la carga de la biomolécula;
 Cuando el pH sea más bajo que el pI de una molécula, ésta tendrá carga positiva.
 Cuando el pH sea más alto que el pI de una molécula, ésta tendrá carga negativa.
IV. Materiales y Metodología. -

4.1 Materiales
Reactivos
- Sulfato de cobre
- Citrato sódico
- Carbonato de sodio
- Ácido acético
- Etanol
- Hidróxido de sodio
Insumos
- Vaso de precipitación de 250 mL
- Tubo de ensayo
- Varilla de vidrio
- Gotero
- Embudo
- Pipeta aforada
Equipos
- Balanza
- Baño María
- Plato agitador (Hot Plate)
Muestra
- Leche
- Clara de huevo
4.2 Procedimiento
Obtención de caseína (Solución de caseína)
 Colocar 100 mL de leche en un vaso de precipitación.
 Proceda a acidificar con ácido cítrico al 10%, adicionando hasta que se corte
totalmente.
 Colocar la leche cortada en tubos de ensayo.
 Colocarlos en la centrifuga para separar el suero.
 Eliminar el suero.
 Lavar el sedimento adicionando agua destilada al precipitado para eliminar
residuos de lactosa y ácido.
 Dar una lavada rápida en etanol y descarte el etanol.
 Vuelva a adicionar etanol y agite.
 Elimine el etanol en la centrifuga.
 Colocar en un vaso el sedimento de caseína lavado.
 Disolver con NaOH 0.1 N (Hasta disolver completamente la caseína).
 Llevar a 100 mL con agua destilada.
Prueba de Biuret (Solución de caseína)
 Colocar una pequeña cantidad de solución de caseína (10 mL) en un vaso de
precipitación.
 Adicionar 1 mL de reactivo de Biuret.
 Observar el resultado, la coloración violeta porque existe la presencia de proteína.
Obtención del punto isoeléctrico de caseína
 Al resto de solución de caseína con el electro pH – metro colocado.
 Adicione gota a gota ácido acético 1N. Hasta que se precipite la caseína.
 En ese momento se tendrá el pH isoeléctrico de la caseína, pH 4.6.
 Disolver el precipitado formado, adicionando poco a poco NaOH 1N y se
obtendrá nuevamente la solución de caseína.

V. RESULTADOS

Obtención de caseína
Durante la primera prueba se observó la separación de fases al agregar limón a la solución,
tanto en la muestra de leche comercial y leche ordeñada de granja. En la imagen 1 se
detalla la formación del precipitado color blanquecino.

Fig. 1. Obtención de caseína en leche comercial y ordeñada.

Prueba de Biuret
Tras la centrífuga de la leche y la adición del reactivo Biuret, la solución se tornó de
color azul con un ligero tono violeta en la parte inferior del tubo de ensayo, que por
simple inspección se determinó como una prueba positiva.
 Fig.2. Prueba de Biuret positiva, con precencia de pellet violeta.

Obtención del punto isoeléctrico de la caseína

La solución caseína formó un precipitado, el cual varío según la muestra, como se observa
en la figura 3, el precipitado de la leche comercial es más espeso por lo contrario del de
leche de granja, sin embargo, en ambos casos resultó una prueba positiva. Para la solución
caseína de leche comercial el pH obtenido fue 5,23.

Fig. 3. Precipitado blanco de solución caseína en leche comercial y ordeñada.

Adicionalmente se calculó el rendimiento de la caseína para lo cual se utilizó la
siguiente formula:
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥100
𝐺 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎
6𝑔
= 100𝑔 𝑥100
 = 6%

VI. DISCUSIÓN

La leche es una emulsión, una suspensión coloidal que presenta proteínas solubles,
minerales, vitaminas y otros componentes. Una parte del calcio y del magnesio presentes,
forman con la caseína un complejo que, junto con las demás proteínas libres, se
encuentran bajo la forma de una suspensión coloidal, formando micelas, además, es la
proteína presente en mayor proporción en la leche (en torno al 3%) (Berobide, n.d.). Si se
añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza, es
decir, los grupos fosfato se protonan y la proteína neutra precipita es por este motivo que
se observó el precipitado blanquecino de la imagen 1 (Miller, 2001).

Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se
encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier
ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente. Se conoce que las
proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico, se encuentran en el equilibrio las
cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para
ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. La propiedad
característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada
como sal cálcica (Miller, 2001). Aunque el pH obtenido fue 5, 23 en la leche de granja
esto se puede justificar debido a que la leche comercial pierde ciertas propiedades que la
leche de granja.

La reacción de Biuret se basó en la formación de la coloración violeta, debido a la

presencia de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones
no compartidos del nitrógeno que está presente en los enlaces peptídicos presentando la
mayor absorción a 540 nm. Cuando una proteína se pone en contacto con NaOH o KOH
concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Esta reacción en sí se
usa para la identificación de proteínas a través del reactivo de Biuret (contiene hidróxido
potásico (KOH), sulfato cúprico (CuSO4) y tartrato de sodio y potasio) (Llerena, 2014).
Al realizarla en la leche entera comercial se pudo observar que dio positiva para esta
reacción.
VII. CONCLUSIONES
 La caseína se puede separar de la leche mediante un proceso de acidificación
(limón o ácido acético) para el cual sabemos que es un conjunto heterogéneo de
aminoácidos.
 La caseína se separa únicamente cuando tiene un pH 4.6, en donde se muestra la
acidez de la leche, y por ende precipitan las caseínas.

VIII. RECOMENDACIONES

 Para separar la caseína de forma correcta se debe realizar con horas de

anticipación la acidificación de la leche, puesto que es importante el tiempo que
esta se tarda y también depende de la calidad. De la leche y la cantidad de ácido
presente en la muestra.

Bibliografía
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http://academic.uprm.edu/~jvelezg/labmoleculas.pdf

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genially. (30 de Agosto de 2017). EXTRACCIÓN DE CASEÍNA-BIOQUÍMICA. Obtenido de

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Miller D.D. (2001). Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley,
México