AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE SOLVENTES ORGANICOS (ETANOL)

8.1. INTRODUCCION El alcohol etílico (Etanol C2H5OH) se ha producido en grandes cantidades durante siglos. La
producción inicial está asociada a bebidas alcohólicas, pero actualmente, además de la enorme industria de bebidas, el
alcohol se produce en grandes cantidades como solvente industrial, antiséptico y como aditivo para la gasolina.
Debido al valor industrial que posee el etanol, surge un gran interés por la búsqueda de microorganismos productores
de etanol y a través de los años se han descubierto algunos como Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis, pero
actualmente Colombia no cuenta con muchas cepas autóctonas potencialmente productoras, lo que representa una
desventaja en las posibilidades de competencia e intervención en el desarrollo biotecnológico mundial (De Ley y Swings;
1977, Matiz; 1999).

NOTA: LOS ESTUDIANTES DEBEN TRAER UVAS, A PARTIR DE LAS CUALES SE AISLARAN CEPAS DE LEVADURAS
PRODUCTORAS DE ETANOL

8.2. OBJETIVOS Objetivo General Aislar y seleccionar cepas microbianas productoras de etanol Objetivo Específicos -
Determinar la presencia de levaduras en muestras de uva - Aislar microorganismos posibles productores de etanol -
Evaluar la tolerancia de las levaduras a diferentes concentraciones de etanol - Identificar los parámetros para
seleccionar una cepa optima en la producción de etanol

8.3. REACTIVOS Y MEDIOS - Colorantes de Gram - Aceite de inmersión - Agar Sabouraud - Agar Sabouraud con 3% de
etanol - Agar Sabouraud con 6% de etanol - Agar Sabouraud con 9% de etanol

8.4 MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO

8.4.1. Aislamiento: - Cajas de Petri con medio Sabouraud (2) - Pipeta pasteur esteriles (3) - Pipetas de vidrio estériles de
1ml (2) - Tubos de ensayo 13x100 mm con 4,5 ml de solución salina estéril (2)
- Pipeteador - Mortero
- Perlas de vidrio para homogenizar muestra.(9)
- Gaza
8.4.2. Tolerancia a etanol: - Cajas de Petri con medio Sabouraud con las siguientes concentraciones de etanol: 3%, 6% y
9% (2 cajas por cada concentración de etanol) - Tubos de ensayo 13x100 mm estériles (2) - Pipetas de vidrio de 1 ml
estéril (2) - Perlas de vidrio para homogenización de muestra (6)

8.5.EQUIPOS - Microscopio - Incubadora de 30°C - Balanza

8.6.MICROORGANISMOS A EVALUAR - Saccharomyces cerevisiae - Microorganismos aislados a partir de muestras

de uva

8.6.METODOLOGÍA

8.6.1.Preparación de medios de cultivo - Medio de cultivo Sabouraud: peptona 2% p/v, extracto de levadura 1% p/v,
glucosa 2% p/v, agar 2% p/v, pH final 5.0. - Medios de cultivo tolerancia a etanol: Sabouraud con 3%, 6% y 9% de etanol.
Adicionar etanol posterior al proceso de esterilización del medio.

8.6.2.Pruebas de pureza - Realice coloración de Gram de las muestras a investigar y determine la presencia de
levaduras. - Realice coloración de Gram de suspensión de Saccharomyces cerevisiae y determine pureza.

8.6.3. Siembra en superficie - Pese ó mida 10g de la muestra de uva a investigar. - Sin lavar la muestra de uvas,
colóquelas sobre el mortero y macere hasta obtener jugo. - Con una pipeta, pasteur tome jugo extraído y adiciónelo en
un tubo de ensayo con 4,5 ml de agua peptonada. (Dilución 10-1), a partir de este realice la dilución 10-2 - De cada
dilución 10-1 y 10-2 tome 0.1 ml y deposítelos en una caja de petri con medio Sabouraud
- Distribuya la muestra de manera homogénea con la espátula de vidrio ó rastrillo en la superficie de la caja. - Incube a
30oC por 48 horas. - Realice UFC x g/ml muestra para establecer la población inicial de la muestra analizada. - Realice
coloración de Gram de colonias aisladas reporte lo observado.

8.6.4 Pruebas de tolerancia a etanol:

- Tome 2 tubos 13x100mm con 4.5ml de agua peptonada al 0.1% p/v, estériles - Realice diluciones seriadas (10-1 y 10-2),
a partir de suspensión de Saccharomyces cerevisiae. - Tome las cajas de petri con medio Sabouraud a diferentes
concentraciones de etanol (3%, 6% y 9%), y realice siembras en superficie a partir de la dilución 10-2. - Incube a 30oC
por 48 horas. - Realice UFC x g/ml muestra para establecer la población en cada una de las diluciones sembradas en las
diferentes concentraciones de etanol. - Determine cuál es la concentración de etanol óptima de crecimiento, teniendo
en cuenta la tolerancia a etanol que se presenta en cada una de las diluciones, como resultado de los recuentos
realizados (UFC x g/ml).

8.7. RESULTADOS

8.7.1. Aislamiento
Tabla 1. Análisis preliminar de muestras
MUESTRA Coloración de Gram Coloración de Gram UFC x g/ml de muestra
(muestra) (aislamiento) analizada. Recuento inicial
UVAS

8.7.2. Tolerancia a etanol

Tabla 2. Determinación de tolerancia a etanol en las diferentes diluciones y concentraciones

DILUCIÓN Etanol 3% UFC x g/ml Etanol 6% UFC x g/ml Etanol 12% UFC x g/ml
Gram etanol 3% Gram etanol 6% Gram etanol 12%

No tolerante, tolerancia baja, tolerancia media, tolerancia máxima

8.8. REVISIÓN TEORICA DE COMPLEMENTACION

¿Cuál es la estructura específica en los microorganismos productores de etanol, que les proporcionan tolerancia a
grandes cantidades de etanol?
¿Cómo se presenta el mecanismo de inhibición a etanol y cómo se presenta la inhibición de crecimiento por exceso de
sustrato?
¿Cuál es la concentración de etanol y glucosa que debe soportar una cepa para ser considerada productora de etanol a
nivel industrial?.

BIBLIOGRAFIA

Scragg, A. 1996. Biotecnología para ingenieros: Sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Ed Limusa,

Hernandez, A., Alfaro ,I., Arrieta, R. Microbiologia Industrial. Ed UENED.

Transporte a través de membrana vito en:

http://www.utu.edu.uy/Escuelas/departamentos/canelones/vitivinicultura/Bioquimica%20Enol
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