Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.
net/publication/44441142
Estudio ﬁsiológico de la producción de acido cítrico por el mutante Fal A. 3. 0 de

Asperqillus niger 11414 cultivado en un medio no convencional / Félix Andueza
Leal.
Article
Source: OAI
CITATIONS READS
0 93
1 author:
Felix Andueza
University Central del Ecuador (Ecuador), University of the Andes (Venezuela)
60 PUBLICATIONS 17 CITATIONS
SEE PROFILE
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
Chemical and microbiological study of microbial biodiversity or mineral hot springs of Ecuador View project
All content following this page was uploaded by Felix Andueza on 30 October 2016.
The user has requested enhancement of the downloaded file.

Andueza Leal Felix Daniel
Estudio fisiológico de la producción de acido cítrico por el mutante Fal A. 3. 0 de Asperqillus niger
11414 cultivado en un medio no convencional
Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biología Molecular. 1991. p. 218
Venezuela
Disponible en:
http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33841&type=ArchivoDocumento
&view=pdf&docu=27044&col=5
¿Cómo citar?
FACUL rAí) DE ClEJiCiri'~~
DEPARTAMENTO DE 810LQG1A
ESTUDIO FISIOLOGICO DE LA PROGUCCION DE AC!GO CITRICO
EN UN MEDIO NO CONVENCIONAL
TRABAJO ESPECIAL DE G~AGD PRESENTADO ANTE .

LH
_,,
ILUSTF:E
L I CE-·K.' I f~DO EN B :: DL_C·E: {~
FELIX DANIEL ANOUEZA LEAL
COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TITULO DE
MAGISTER SCIENliARUM EN BlOLOGIA MOLECULAR OPCION
FEPNENTACI ONr.::f"
El presente trabajo fué realizado en

el Laboratorio de Fermentaciones de
Ja Facultad de Ciencias~ bajo la di-
r~cción del Doctor José Antonio Sán-
!'"lEF: TIJf-f ~ 19'-:.1

C A P I T U L O I QP80l
C65A5
1.-INTRODUCCION
La creciente demanda de alimentos, medicinas, sustancias
orgánicas de interés industrial y otros bi7nes de consumo, ha
dado origen a nuevas áreas de investigación. De maner.a
especial, la producción de alimentos, de antibióticos y de
diversos metabolitos asl como la utilización de los recursos
naturales renovables, ha adquirido gran importancia tanto en
e 1 campo de la Ciencia COI'f'O en e 1 de ¡;a economia y en e 1'

aspecto social. Es u~ hecpo que los logros y avances en
estas á¡-eas tienen un efec¡to di¡-ecto, y en ocasiones
inmediato, sobre los diferrntes grupos que componen la
población.
Desde hace miles de a~os el hombre ha utilizado los
métodos biológicos para producir y conservar sus alimentos y,
también, para obtener productos que le han ayudado a mejorar
su salud. Sin saber lo, ha utiliz'ado un recurso renovable que
no solo proporciona un bienestar económico si no que,
además, en muchos casos, le ayuda a salvar la vida. Este
recurso renovable son los microorganismos.
Los principios de la microbiologia industrial fueron
establecidos cuando Pasteur, a mediados del siglo pasado,

demostró indiscutiblemente que la fermentación alcohólica era
producida por levaduras <Prescott, 1962}. Desde ese momento
hasta la segunda Guerra Mundial se desarrollaron muchos
procesos industria les de fermentación. Fundamentalmente ·las
fermentaciones alcohólicas y la producción de ácidos acético
y citrico <Aiba, 1972).
Los procesos clásicos, utilizados durante ese periodo
fueron el cultivo sumergido anaeróbico y el cultivo en
superficie aeróbico <Prescott, 1962). Sin embargo, debido a
la necesidad apremiante de producción de antibióticos durante
la I I Guerra Mundial, hubo que utilizar· un proceso industrial
más rápido y eficiente que los comunmente utilizados.·Este
fue el cultivo sumergido aeróbico en tanques agitados
<Peppler, 1979).
En los af'ros cuarenta y cincuenta se lograron grandes
avances tecnológicos en el cultivo microbiano, y se
desarrolló el fermentador agitado con controles automáticos
<Aiba, 1972>. La mayoria de los procesos utilizados en esa
época eran aeróbicos y operaban de manera discontinua.
Durante las décadas de los sesenta y setenta, se
establecieron los procesos de cultivo continuo <Peppler,
1979>, los métodos de inmovilización celular <Chibata, 1974>,
las técnicas de mejoramientó genético de cepas microbianas

~3)
por ingenier ia genética y la utilización de desechos
agroindustriales como sustratos de las fermentaciones
(Quin-t:-ero, 1980). Todos estos avances han abierto nuevos
campos para la producción industrial de sustancias org~micas
de origen microbiano.
Desde un punto de vista tecnológico~ para un pafs con
las condiciones socieconómicas de Venezuela (abundancia de
mano de obra barata y de recursos naturales renovables y
recursos económicos 1 imitados> , los problemas pueden ser
atacados empleando técnicas y métodos microbiológicos
adecuados. Entre esos problemas resaltan los de producción de
alimentos para animales, medicamentos, sustancias orgánicas
de uso industrial, además de los relacionados con la
utilización de recursos naturales renovables.
En Venezuela, como consecuencia de la mala implemen-
tación de las políticas del estado, se han creado problemas
que nos han conducido a una dificil situación económica y
social. Se hace, asf, necesario que se adelanten investigacio-
nes y se desarrollen tecnologías que puedan traducirse en
aplicaciones prácticas para resolver la crisis económica que
vive el pafs.
La recuperación económica sólo seré1 posible si se toma
en cuenta, en su verdadera dimensión, el papel fundamental
que juega la Ciencia y la Tecnología en el bienestar y
desarrolo económico de una nación.

(4)
Uno de los campos de investigación que puede contribuir
a mejorar la situación de nuestra economía, es el desarrollo
de metodologías y técnicas de fermentación q~e permitan la
producción de sustancias orgánicas de origen microbiano, de
interés tanto para la industria de los alimentos como para la
industria farmaceótica.
Los microorganismos producen una gran diversidad de
sustancias orgánicas: Antibióticos, aminoácidos, écidos
orgánicos, endulcorantes, enzimas, proteínas, polisácaridos,
antioxidantes, vitaminas y saborizan.tes. Estos son algunos
ejemplos de la extensa variedad de productos que sintetizan
los microorganismos y que son utilizados por la industria
alimenticia y farmaceótica <Tabla# 1 ).
Con excepción del etanol y una parte de ácido acético,
Venezuela importa la totalidad de las sustancias orgánicas de
origen microbiano utilizadas por las diferentes industrias
<Tabla # 2>. El país no las produce a pesar de que se cuenta

con los recursos humanos y físicos para su elaboración. La
producción nacional de algunas de estas sustancias, además de
satifacer la demanda existen te, representaría un
significativo ahorro de divisas, una fuente de nuevos empleos
y, de una manera direct~, podría influir en la disminución de
los precios de muchos artículos de consumo diario.

(5)
TABLA # 1 PRODUCTOS OUIMICOS DE ORIGEN MICROBIANO
AMINOACIDOS
Acido Glutámico Metionina Lisina Asparagina

•
Acido Aspartico Triptofano Serina Fenilalanina
VITAMINAS
Acido Fólico Niacina Tiamina Coba lamina
Vitamina K Vi tam in a B ua
ENZIMAS
Alfa-Ami lasa Celulasa Renina Proteasas
Invertasa Lacasas Lipasas glucoamilasas
ANTIBIOTICOS
Cefalosporina· Teb-aciclina Penicilina Estreptomicina
ACIDOS ORGANICOS
Cítrico . 't-~co
A ce FumJrico Málico
<Prescott, 1966 y Peppler, 1979}

( 6)
TABLA # 2 SUSTANCIAS DF ORIGEN MICROBIANO IMPORTADAS
POR VENEZUELA
ACIDO ACETICO ACIDO SUCCINICO ACIDO FUMARICO
ACIDO LACTICO ACIDO CITRICO ACIDO MALICO
GLUCONATO GLICINA GLUTAMATO
LIS! NA METIONINA VITAMINA ·B1
VITAMINA Be VITAMINA B6 VITANINA B1e
PENICILINA ESTREPT0!'-1 I C I NA PROTEASAS
PAPAINA ALFA-AMI LASA GLUCOAMILASAS
RENINA LIPASAS INVERTASA
<Anuario de estadística del Instituto de comercio
Exterior de Venezuela, 1988)

\ 1}
En la tabla 3 se observan los volúmenes y valores de
las importaciones de productos derivados del metabolismo
microbiano, realizadas por Venezuela durante el año 1988.
Resalta la magnitud de esas importaciones y la importancia
económica que tendría su producción en el pais.
Dentro del grupo de sustancias mencionadas se encuentra
el ácido cítrico. Este es el ácido orgánico más utilizado en
la industria de los productos alimenticios y farmacéuticos.
Su buen sabor y la facilidad con que es asimilado ha
favorecido su utilización como ingrediente para la obtención
y mantenimiento de un pH adecuado. También se ha empleado
para hacer resaltar el sabor de una e>:tensa variedad de
productos destinados a la dieta humana.
Recientemente se ha convertido en una materia prima
importante para usos industriales de carácter general con
muchas aplicaciones variadas y cada dia mayores <Lockwood,
1979).
Los procedimientos que se han utilizado para la
produce ión de 1 ácido e í tr ico a ni ve 1 industria 1 por vi a
microbiana, han sido básicamente dos:
1.- Fermentación en superficie.
2.- Fermentación sumergida.'

TABLA # 3. SUSTANCIAS DE ORIGEN MICROBIANO IMPORTADAS POR
VENEZUELA EN EL AÑO 1988
1988 1988 1990

PRODUCTO VOLUMEN VALOR VALOR VALOR
( Kgr > ( $ ) < Bs· ACTUAL
< Bs >
Ac ido Acético 1.631.502 1.148.000 23.719.443 57.400.000
Ac ido Succ in'ico 1.651 4.146 140.571 207.300
Acido Fumárico 101.279 159.;086 2.631.865 7.954.300
Ac ido Láctico 70.303 130 .12q 2.562.027 6.506.000
Ac ido C:i tr ico 4.387.950 7.674.959 154.907.136 383.747.950
Gluconato 79.009 279.904 4.731.604 13.995.200
Glicina 66.094 256.263 5.274.654 12.813.150
Glutamato 2.094.757 3.142.592 67.266.923 157 • 129 • 600
Lisina 387.003 1.306.805 26.523.112 65.340.250
Metionina <* > 3.393.348 10.110.334 198.762.740 505.516.700
Vitamina B1 7.637 250.935 5.394.145 12.546.750
Vitamina Ba 30.060 1.332.361 28.575.882 66.180.050
Vitamina B.., 11.312 447.806 9.319.811 22.390.300
Vitamina B1a 21.349 1.011.441 22.911.901 50.572.050
Penicilina 97.217 12.000.000 ~67.757.475 600.000.000
Estreptomicina 14.484 548.159 10.665.036 27.407.950
Proteasas 1.005 5.255 183.128 . 262.750
Papaína 12.137 174.630 4.895.595 8.731.500
Alfa- Amilasa 55.711 1.256.253 26.484.969 62.812.650
CuaJo ( Renina 76 8.124 89.362 406.200
Preparaciones
Enzimaticas para 116.730 258.329 6.633.974 12.916.450
Curtición
Total 12.570.614 43.285.669 869.431.353 2.164.283.450
(*) El 80 "•
h de J
or~gen 1 -
qu1m1co.
<Anuario Estadistica del Instituto de Comercio E>:terior de

Venezuela, 1988>
En ambos procesos se utilizan cepas del hongo
Asperqillus niger, seleccionadas por procedimientos que las
industrias fabricantes guardan en secreto. Por otra parte, el
sustrato empleado en este tipo de fermentación debe tener un
alto contenido de azúcares, sobre todo sacarosa. Por ello se
ha empleado la melaza de caRa de azúcar. <Shu, P. 1948;
Ram~krishnan, C., 1954; Sánchez, A., 1964; Patarau, J., 1969;
Schierholt, J., 1977; Kristiansen, B., 1978; Lockwood, L.,
1979; Sodeck, · G., 1981; Je\-neje, K., 1982; Xu, D., 1989 y Xu,
D., 1989 >.
A pesar de que las bases del proceso de fermentación del
ácido cítrico sun conocidas, todavía no existe una teoría que
explique el mecanismo de acumulación de este ácido por parte
del hongo <Rohr, Mn, 1981; Xu, D., 1989 y Schreferl, G.,
1989).
Las industrias de 1 é1c ido e 1 tr ico sufren pérdidas
ocasionales por fermentaciones bajas o poco productivas.
Estas pérdidas pueden ser debidas a degeneración de los
conidios <Kubicek, 1977 y Lockwood, 1979>, a la presencia de
impurezas metálicas en los sustJ~atos, utilizados como medio
de cultivos, que se han reportado como inhibidores de la
fermentación cítrica <Clark, D., 1966; Choudhary, G., 1966;
Sánc:hez, A., 1970; Kubicek, C.~ 1977; Kubicek, C., 1979;
Kisser, M., 1980; Meixner, O., 1985; Hockertz, S., 1987 y
Dawson, M., 1989}. Otra posibilidad es la utilización de

\.LUJ
cepas del hongo Aspergillus niger con una alteración poco
eficiente de los mecanismos de regulación de las vias
metabólicas implicadas en la producción del ácido <Gardner,
J., 1956; Trumpy, H., 1963; Sánchez, A., 1969; Hannan, M.,
1975; Das, A., 1978; Kubicek, C., 1978; Zehentgruber, O.,
1980; Legisa, M., 1981; Kirimura, K., 1988 y Schreferl, 6.,

1989).
En Venezuela no existen en la actualidad industrias que
se dediquen a la producción de ácido cítrico. Sin embargo,
hay grupos económicos interesados en establecer una planta
productora de ácido cítrico <Empresa Ron Santa Teresa C.A.,
comunicación personal).
Hasta la fecha el mercado de ácido cítrico en Venezuela
se ha venido supliendo mediante las importaciones que
realizan diferentes firmas ubicadas en el pais. Ellas se
encargan de proveer a las distintas industrias del ácido que
utilizan. La demanda está dada por los requerimie:ntos que
hacen las diferentes industrias embotelladoras de bebidas
gaseosas y fábricas de caramelos, jugos de frutas, alimentos
concentrados para niños, jaleas, frutas en almibar,
mermeladas y productos farmacológicos. El mayor consumo del
ácido cítrico es efectuado por las embotelladoras de bebidas
carbónicas y las fábricas de caramelos y de jugos.

tll)
De acuerdo al Anuario Estadistica del Instituto de
Comercio Exterior de Venezuela, correspondiente a los afias
1986, 1987 y 1988, el volúmen y valor de las importaciones
correspondientes al ácido citrico· han venido creciendo <Tabla
# 4>. Durante el aNo 1988 fue de 4.387.950 Kgr por un valor
de 383.747.950 Bs <Tabla# 4>. Esta importación representa,
por una parte, una elevada fuga de divisas y, por la otra,
refleja la existencia de un mercado insatifecho con una gran
demanda por ese producto.
Todo esto, unido al hecho de que existe en Venezuela
una mano de obra barata, disponibilidad de materia prima
nacional derivada de la industria azucarera, recursos
energéticos baratos , recursos humanos especializados y una
.capacidad técnica elevada, nos lleva a pensar en la
factibilidad que tiene en estos momentos la instalación en
Venezuela de una planta productora.de ácido citrico.
En este sentido el laboratorio de Fermentaciones de la
ULA está en capacidad de, utilizando su infraestructura, desa
rrollar soluciones que tiendan a hacer menor la dependencia y
mediante la creación de técnicas para producir ácido citrico
competitivamente, contribuir a solucionar la actual crisis
económica. Asi, nos hemos propuesto obtener una cepa mutante
de Aspergillus niger que sea hiperproductora de ácido citri-
co, capaz de crecer en medios con altas concentraciones de

(12)
TABLA # 4. VOLUMEN Y VALOR DE LAS IMPORTACIONES DE ACIDO CITRICO

REALIZADAS POR VENEZUELA DURANTE
LOS A~OS 1986-1987 Y 1988
At~iO 1986
PAIS VOLUMEN VALOR VALOR VALOR ACTUAL

<t<g) {$) <Bs> <Bs >
ALEMANIA 129.629 3.180.279 23.889.309 152.653.390

BELGICA 10.548 14.820 111.148 711 .360
COLOMBIA 1.141.368 1.917.087 14.378.186 92.020.176
E.U. 8.158 126.153 946.145 391 .584
MEXICO 702.469 896.141 6.728.735 43.014.768
TOTAL
1 .982.172 6.134.480 46.053.523 288.691.278
A~m 1987

<t<g) ($) '{as> <Bs>
ALEMANIA 21 .435 ·43.654 569.785 2.095.392
AUSTRIA 3.158 6.570 95.266 315.360
BELGICA 36.432 57.603 835.245 2.764.944
COLOMBIA 2.202.474 3.670.017 .51. 994.061 176.160.810
E .U. 29.698 51 .070 879.050 2.451.360
ITALIA 54.519 93.050. 2.842.484 4.466.400
JAPON 831 1.992 28.889 95.616
MEXICO 609.227 796.889 11.366.569 38.250.672
INGLATERRA 2.640 5.675 82.289 272.400
TOTAL
2.960.414 4.726.520 68.693.638 227.682.954
A~O 1988

(J<g) ($) <Bs > <Bs>
ALEMANIA 10.905 22.311 428.370 1.070.928
BELGICA 5.080 9.392 272.126 450.816
COLOMBIA 3.506.333 5.831.843 132.468.870 279.928.464
E.U. 14.190 30.534 623.990 1.465.632
FRANCIA 4 49 1.544 2.352
ITALIA 146.628 237.960 3.537.574 11.422.080
MEXICO 693.550 915.077 18.061.345 43.923.696
PAISES BAJOS 10.200 17.510 253.896 840.480
INGLATERRA 208 8.363 242.311 401.424
SUIZA 852 1. 920 44.160 94.160
TOTAL
f 4.387.950 7.074.959 155.938.487 389.550.032
<Anuario Estadistica del instituto de Comercio E>: ter ior de

Venezuela, 1986, 1987 y 1988)
{13)
azúcares y de resistir altas concentraciones de iones
metélicos.
Por otra parte, trataremos de obtener información sobre
las sustancias estimuladoras de la fermentación citrica que
se han venido reportando en la literatura. Todo ello con
miras a producir a mediano plazo el écido citrico a nivel de
una planta piloto.

\14)
2.-ANTECEDENTES
I.- Características Fisicogufmicas.
El ácido cítrico (del latin citrus, limón> es un ácido
orgánico tr ica¡-boxi lico <2-hidroxi-1 ,2 ,3-propanot.r icarbox{-
lico) que toma su nombre de los frutos o sustancias que lo
contienen.
Su formula molecular es C6 He07 y el peso molecular es
de 192,12 dalton. Tiene dos formas estables: ácido cítrico
monohidratado y ácido cítrico anhidro (Kirk, 1979).
Es un ácido orgánico fuerte, tal como lo indican sus
constantes de disociación CKd1 = 8.2 x 10-4 , Kda= 1.77 x
10-~ y Kds= 3.9 x 10-•>. Forma sales neutras: dos sales
diferentes monoalcalinas y otras dos también diferentes,
dialcalinas. Su isómero estructural es el ácido isocitrico
<U liman, 1964 > •
El ácido cítrico cristaliza de soluciones acuosas frias
en forma de monohidrato. Los cristales son incoloros y
_translúcidos pertenecientes al sistema ortorómbico. Es
estable en el aire de humedad normal. Su densidad es de 1.54
g/ml y se funde enb-e 135 y 152 °C <Ullman, 1964>.

La forma anhidra de este écido cristaliza de soluciones
acuosas concentradas y calientes a apro>:imadamente 36.3 °C.
Los cristales anhídridos son traslúcidos e incoloros y
pertenecen a la clase holoédrica del sistema monoclfnico. La
temperatura de fusión de esta forma es de 153 °C, siendo la
densidad de 1.66 g/ml. Es ópticamente inactivo <Ullman, 1964)
De las propiedade~ fisicoquimicas antes· mencionadas
resultan de interés~ para la fermentación del écido citrico,
las relacionadas con las temperaturas de cristalización. El
hecho de que el écido citrico cristalice de soluciones
acuosas en fria, p.ermitiria una disminución en los costos de
produce ión •
II.- Origen en la naturaleza.
Este ácido abunda en la naturaleza. Es.tá muy e>:tendido
en los Reinos Vegetal y Animal. Se encuentra en considerable
cantidad en los limones, limas, naranjas y toronjas. El jugo
del limón <Citrus medica>, lo contiene en una concentración
del 6 al 8 Y. (Ullman, 1964).
Se encuentra también en las ciruelas y en la remolacha
y acompaña al ácido málico en las cerezas, frambuesas y
fresas y al écido tartárico en el fruto del tamarindo. Como
ácido libre o como sal se encuentra en las semillas y en los

~16)
jugos de una gran variedad de flores y plantas CUllman,
1964).
El ácido cítrico es un componente importante de los
tejidos y liquidas de los animales. En la leche se
encuentran cantidades variables de ácido cítrico (de 0.106 %
al 0.182 %>.La constitución individual de las vacas, según
sus razas, parece ser el factor más importante de esa
variación <Kirk, 1979).
El contenido de citrato de calcio en la leche es
importante, ya que es el sustrato del cual Streptococcus
citrovm-us elabora diacetilos y acetil-metil-carbinol e'n los
productos lácteos, confiriéndoles un sabor rancio <Suplee G.,
1921).
El ión citrato existe normalmente en la sangre y en la
orina y es sintetizado y oxidado en procesos metabólicos
normales del organismo animal. El suero de la sangrB humana
con tiene a pro>~ imadamen te 25 g /1 , y dial- iamen te se e >:cr e tan ,
en la orina de los seres humanos~ alrededor de 0.5 gramos
del ácido <Wes t, E. , 1969} •
E1 ácido e i tr ico, así , es una sustancia de suma
importancia en la naturaleza en donde desempeña funciones muy
diversas e importantes.
{17)
III.- Utilización en la industria.
Es el ácido orgánico más utilizado en el campo de los
productos alimenticios y farmacéuticos. Es empleado en la
elaboración de bebidas gaseosas para impartirles un sabor
agrio que neutraliza la dulzura del azócar y hace resaltar el
sabor, desarrollando la acidulación apropiada. Además, ayuda
a proteger el producto contra el deterioro. Inactiva los
vestigios de metales, actuando como quelante de iones, que
puedan causar la turbidez del liquido y deteriorar su color y
sabor <U llman, 19'62 >.
El 15 % de los citratos que se producen en los Estados
Unidos de Norteamerica, se utilizan en la fabricación de
bebidas gaseosas. Como este ácido es un ingrediente natural
de todas las frutas cítricas, todas las bebidas que tienen
estos sabores se acidifican con este ácido. Las bebidas
gaseosas de naranja, limón y lima contienen 7.5 gramos de
ácido citrico por litro de jarabe concentrado· <Ullman, 1962>.
En promedio, la cantidad, en gramos, de ácido citrico
por litro de producto terminado, utilizados en Venezuela por
las industrias de las gaseosas, son los siguientes:
1.- Colas rojas 0.36016
2.- Naranja 0.87515

3.- Limón 0.34850
4.- Otros 1.56190
También, la industria productora de jugos de frutas
representa otro sector importante dentro del consumo de ácido
citrico que es, en promedio, de 1 gramo por litro de producto
terminado <Fudeco, 1970).
En la industria.vinicola el ácido cítrico sirve para
impedir el enturbiamiento, ajustar el pH y evitar la
oxidación <Lockwood, 1979).
En la industria de la confitería, es empleado como
acidulante en la preparación de jaleas, mermeladas, conservas
y alimentos concentrados para niños. Se utiliza en unión de
sales de sodio para producir el pH óptimo adecuado requerido
en la formación de geles <Beuehat, 1978>. El ácido cítrico
que consume esta industria en Venezuela asciende a 3
Kilogramo por cada tonelada métrica del producto final
<Fudeco, 1970).
En la elaboración de caramelos, bombones y chiclets el
~cido cítrico también es utilizado como acidulante. En el
caso de los caramelos, se emplea solo para los sabores
correspondientes a frutas cítricas, el resto de la producción
no consume ácido. El consumo de ácido cítrico en los sabores

(19)
que lo utilizan es de 0.020 gramos por kilog¡-amo de producto
terminado <Fudeco, 1970>.
También se utiliza en la fabricación de helados y
sorbetes como acidulante, emulsivo y estabilizador. Se agrega
para formar los sabores de frutas cítricas tales como: piña,
naranja, limón, mandarina etc. El resto de los sabores como
coco, mantecado, chocolate etc, no lo utilizan • La relación
insumo-producto es de 76 gramos de ácido cítrico por cada 130
l<i logramos de producto terminado <Fudec.o, 1970 >.
Muchos productos alimenticios, como los hechos a base
de gelatina, exigen el ajuste correcto del pH para su
preparación y uso. En estos casos el ácido cítrico es un
ingrediente perfecto para lograr la acidez adecuada. En otros
productos como salsas y entremeses, el ácido cítrico se
utiliza para resaltar el sabor y, a la vez, servir como
acidulante CSalvat, 1967>.
En la fabricación y maduraciqn de productos lácteos,
como los quesos, el ácido cí.trico, junto con su sal ;de sodio,
se emplea como emulsiyo y estabilizador. Ello impide la
formación de grumos en la leche y cremas <K ir k , R • , 1 979 > •

l~OJ
El ácido citrico también se emplea en la preparación de
frutas congeladas. Uno de sus usos es neutralizar los
residuos de lejia que permanecen después de las operaciones
de pelado del producto <que de otro modo destruirían el ácido
a.scórbico >.
Se utiliza también para proteger al ácido ascórbico
secuestrando los vestigios de metales y reduciendo el pH para
inactivar las oxidasas. El ácido cítrico se agrega a muchas
frutas para evitar cambios de color y sabor debidos a la
oxidación <Fudeco, 1'l70).
En la industria de los aceites y grasas, se emplea como
antioxidante sinél-g ico para inhibir e1 desarrollo de la
ranciedad y el oscurecimiento de los productos <Lockwood,
1979).
Para evitar que el p~scado y los camarones en aceite se
decoloren se sumergen en una mezcla de ácido cítrico y
ascórbico. También se emplea como agente inhibidor en la
fabricación de grasas animales, oleomar-garinas y mantecas de
cerdo fundidas, diluido al 20 K, en una proporción de 50 ml
de ácido por cada kilogramo de producto terminado <Ullmam,
1964).
En la industria Farmaceótica el ácido cítrico encuentra
un érea de amplia aplicación. El ácido libre se emplea en los

(21)
preparados farmaceó~icos como acidulante y para mejorar el
sabor de los jarabes, soluciones y elixires en general
Administrado en inyecciones intravenosas acorta el
tiempo de coagulación de la sangre pero, " in vi tro" , es
utilizado comunmente como anticoagulante ya que precipita los
iones calcio. Los citratos son empleados en las transfusiones
sanguineas. Son, asi, rápidamente metabolizados, por lo
general completamente, y pueden servir como fuente de energía
<UNCTAD-GATT, 1972>.
Se le utiliza ampliamente, junto al bicarbonato de

o
sodio, para la elaboración de polvos y tabletas esferve-
centes que, cuando se les añade agua, liberan anhídrido
carbónico <UNCTAD-GATT, 1972).
Las sales del ácido cítrico, tales como los citratos de
calcio y de magnesio son utilizadas como medicamentos
purgantes. También sirven como aromatizantes, agentes
inhibidores para estabilizar el ácido ascórbico y disolventes
en preparados farmaceúticos como los e xpec ter antes,
as tr in gen tes, antisépticos y productos contra el sudor
<UNCTAD-GATT, 1972>.
Dentro de la industria de los cosméticos el ácido
cítrico es utilizado como acidulante en las preparaciones
astringentes para la piel, lociones para el cabello, champóes

{22)
y pomadas. Debido a sus propiedades quelantes, el ácido
cítrico tambien es u ti 1 izado en la fabricación de
acondicionadores y enjuagues para e·l cabello.< Lockwood, L.,
1979 ).
Es una materia prima importan te para usos industria les
de carácter general. El ácido y su sal diamónica no oxidan
mucho los metales, pero disuelven fácilmente los compuestos
metálicos y se emplean para limpiar y pulir metales • Un
ejemplo es el pulido electrolítico del acero inoxidable y la
eliminación del herrumbe y las incrustaciones en el hierro y
en el acero <l<irk, R., 1979).
Se utiliza, asimismo, para limpiar las tuber 1 as, por
ejemplo, de las centrales eléctricas. El poder quelante del
ácido cítrico evita que la capa de óxido al disolverse se
vuelva a precipitar durante las operaciones de limpieza y
en juague <K ü- k , R • , 1 979 > •
El ácido cítrico, por intermedio de su grupo hidroxilo
alcohólico, forma iones metálicos complejos solubles en
liquidas acuosos neutros o alcalinos. Esta propiedad se
emplea en ciertas soluciones no ferrosas de galvanoplastia y
en el tratamiento y acondicionamiento de aguas industriales.
El cib-ato de sodio se utiliza industrialmente en el
tratamiento de las aguas de caldera para evitar incrustaciones

y de pl-otección como agente de tamponamiento. <Ullman, 1964 >.
Debido a la naturaleza polibésica del écido citrico, se
emplea como materia prima en la preparación de resinas
alquidólicas y vinilicas <Cloruro de vinilo y cloruro de
venilideno, entre otros) <Ullman, 1964).
Esteres del ácido e :1 tr ico, preparados por
esterificación de los grupos carboxilicos y a veces por
acilación del grupo hidroxilo alcohólico, como el trietilico,
el acetiltrietíli¿o, el tri-n-butilic~ y acetil-n-butilico,se
utilizan como plastificantes en la fabricación de resinas,
plásticos, sustancias adhesivas y revestimientos protectores
C1< ir k , R • , 1 979 > •
El ácido citrico se agrega en los revestimientos
cerámicos, que resisten altas temperatw-as, para romper el
gel de la barbulina de esmalte y facilitar su aplicación.
Esto es necesario a causa de la adición de óxidos
refractarios. En los plásticos celulósicos, el ácido citrico
es utilizado como una sustancia estabilizadora <Kirk, R.,
1979).
En la preparación de pinturas, lacas, tintas y en el
plateado y grabado de indianas, el ácido citrico tiene un uso
muy importante como mordiente <t<irk, R., 1979).

(24)
Los citratos de sodio entran en la composición de los
detergentes para mejorarlos. Este uso todav:!a no est~ muy
extendido aunque se espera que en el futuro adquiera gran
importancia como sustituto de los fosfatos. Estos fosfatos se
consideran una de las principales causas de la contaminación
del agua debido a su lerrta biodegradabilidad ya que son
nutrientes para cierto tipo de algas y se acumulan en las
cadenas alimenticias, mientras que los citratos son
completamente biodegradables <Lockwood, 1979).
El elevado costo relativo de los .. citratos y su bajo
grado de eficacia por unidad de detergente son en la
actualidad los obstéculos que se oponen a su utilización en
esta érea. Si fuera posible disminuir el precio de los
citratos, al aumentar, por ejemplo, la producción en los
paises en desarrollo, su uso en los detergentes ofrecería un
futuro muy prometedor <UNCTAD-GATT, 1972) •
En la industria fotogréfica, el écido citrico es
utilizado para ajustar el pH de las 1 soluciones adherentes
para el papel, como componente de las emulsiones de las
placas de impresión y como fijador y estabilizador <Woodward,
R • , 1 950 y Ya bu 1a , Y • , 1 972 ) •
En la industria- petrolet-a, ha sido empleado, por su
acción quelante, en los procesos de recuperación y reacti-
vación de pozos. En los pozos viejos desgastados, los poros

{25}
de la fachada de arena comienzan a taparse y a travarse por
acción del hierro. El écido citrico actúa en estos casos como
quelante de los iones hierro, ayudando a destapar y
prevenir el retapado de los poros <Loe kwood, L., 1979;
Johansen, P., 1957; Biles, J., 1967 y Pf izer, 1961).
Por última, el écido cítrico ha sido utilizado en la
agricultura como agente quelante de elementos metélicos.
Estos están presentes en soluciones de macronu trien tes
utilizados por los agricultores para suplir la deficiencia de
los suelos de elementos tales comq el zinc, cabl-e,
magnesio y manganeso Allinson, J., 1957 y Wingosen, J.,
1975 ).
Como hemos podido ver, el ácido cítrico es una sustancia
con una gran variedad de aplicaciones, cuya utilización esta
muy extendida en la industria de los alimentos, así como en
la industria farmaceutica y en la industria en general.
·IV.- Producción por via microbiana y recuperación.
El écido cítrico fue aislado por primera vez por Scheele
en el año de 1789 a partir del jugo del limón. Grimaux y
Adams en el año de 1880 lo sintetizaron a partir del
glicerol.
Wehmer en 1893 fue el primero en describir el ácido
e i tr ico como un producto de la fe1-men tac ión por hongos. Dos
de estos, que clasificó como Citromyces .Qflefferianus y
Citromyce glaber <Clas~ficados por Thom (1926) como
Penicilium>, producían el ~cido a partir de soluciones de
sacarosa que contenían carbonato de calcio. Más tarde, Wehmer
<1902) dio a conocer la fOl-ma:::: ión de ácido e i tr ico· por
Penicillium luteum y r1ucor pir:h.forl!1is.
En 1917 Currie, del departRmento de Agricultura de los
Estados Unidos, ~ublicó los resultados de una importante
investigación sobre la producción de ácido cítrico por una
variedad de Aspergillus niger. Doelger y Prescott en 1934,
é:orrobor a ron los resu 1 tados de Curr ie. Otro paso impOI- tan te
en e 1 desarrollo de la fermentación citrica fue el
reconocimiento por Molliard (1922) de la acumulación de ácido
ci tr ico cultivos de A. niqer bajo condiciones
deficientes ·en nutrientes.
En 1910 fue establecida en Alsace, Francia, una planta
que operó durante 10 años, para pt-oduc ir . étc ido e i tr ico
siguiendo el método pi-opuesto por Wehmer <l"lial, 1975). Esta
planta representó el punto de partida del desarrolló de la
moderna tecnología de las fermentaciones •

(27)
Alemania.fue el primer país en poner en marcha la
fermentación de ácido cítrico a escala comercial. En 1923,
New York vio eJ nacimiento de la primera plaAta productora de
ácido cítrico en los Estados Unidos de Norteamerica <Patarau,
J . ' 1969).
Antes del año 1920, el ácido cítrico se obtenía
únicamente por extración y aislamien.to de los jugos de frutas
cítricas, principalmente del jugo del limón, en forma de
citrato de calcio. En 1922, Italia tenía el 90 Y. de la
producción mundial de citrato de calcio·empleado para obtener
ácido cítrico. El mercado, en esos años, era controlado por
un cértel bajo el dominio del gobierno italiano que mantenía
i6s precios del ácido bastante elevados. La introdución en
1923 de los procesos de fermentación en la elaboración del
éc ido e í tr ico ~ logró romper· el poder de 1 monopo 1 io ita 1 iano
y con ello se logró la caída de los precios <Patarau, J.,

1969 y Lockwood, L., 1979>~
En la actualidad, la mayor parte del ácido cítrico se
obtiene por vía de la fermentación microbiana. A~nque una
pequeña parte aún se produce por exh-acción a partir del jugo
de las frutas citt-icas, sobre todo en paises como Mé>~ico,
India, Italia <Sicilia>. y algunas naciones suramericanas
<Lockwood, L., 1979>.

. \. c. o)
La manufactura de ácido citrico en E.U. y Europa es de
alrededo~ de 210.000.000 libras anuales. Japón produce cerca
de 10.000.000 de libras y unas 20.000.000 d~ libras Brasil,
Israel, México, Colombia y Argentina CLockwood, L., 1979>.
Los principales productores de ácido citrico del mundo son:
Estados Unidos, Austria, Belgi¿a, Irlanda, Francia, Italia,
Japón, Paises bajos, Reino Unido, Repúlica Federal Alemana,
Checoslovaquia, Polonia y Rusia. En el ambito Latinoamericano
solo Al-gentina, Brasil y Colombia produjeron ácido citrico,
con un total de 440.000 libras por afio <UNCTAD-GATT, 1972>
El precio del ácido citrico en el mercado internacional
para el afio 1988, osciló entre 1.65 y 2.25 Dólares
USA/Kilogramo <Anuario estadístico del ICE de Venezuela,
1989).
El desarrollo de la fermentación del ácido citrico puede
ser dividido en tres fases históricas. La primera, durante
la cual la fermentación era realizada por varias cepas de
Penicillium en medios superficiales con la adición de un
agente neutral izan te, fue in ic; iada con los trabajos de
f.oJehemer < 1893).
La segunda fase corresponde a la fermentación en
superficie utilizando cepas del hongo Aspergillus niger, que
se inició con los trabajos de Currie (1917). En esta fase se
puede incluir tambien el proceso Koyi desarrollado por los

japoneses.
La terce1-a fase~ que corresponde a la fermentación
sume¡- g id a , comienza con los trabajos de Perquin <1938) y
De esta manera, los procesos que se han
utilizado para la producción microbiana de ~cido cítrico son:
1.- El pl-oceso l<oyí japonés de fermentación semisólida.
2.- La fermentación en cultivos supe¡-f i.c ia les.

'J
.Jo - La fermentación en cultivos. sume1-g idos.
En el proceso l<oyi japonés, se utilizan cepas especiales
de Aspergillus niger que producen ácido cítrico luego de
crecer en un medio sólido rico en almidón. El medio de
fermentación empleado por este método, en un princioio, fue
el afrecho de trigo. Posteriormente fue re~mplazado por el
residuo sólido que permanece despues dP la extración del
almidón de las patatas dulces (Loe k~>'mod ~ 1979). Las.
condiciones de fermentación en este proceso son muy similares
a las empleadas para la producción de amilasas y proteasas de
Aspergillus orvzae (Lockwood, 19'79).
Antes de la esterilización, el pH del afJ-echo es
ajustado entre 4 y 5. El contenirlo de humedad del medio se

( 30)
debe ajustar entre el 70 y el 80 %. Luego de la esteriliza -
e ión, e 1 medio es enf1- iado a 30 °e y se inocula con esporas

de Aspergillus niger.
El almidón originalmente presente en el afrecho es saca-
rificado por la amilasas de ~iqer. El afrecho luego de
inoculado es colocado en bandejas de aluminio con una
profundidad de 3 a 5 cm. Después de 8 dias de fermentación, a
una tempel-a tura de 28 o e' . la masa fermentada' denominada
l<oy i, se recolecta y se coloca en un recipiente en donde se
prensa y se extrae el écido cítrico con .~gua <Loe k..-Jood, L.'
1979).
En la figura # 1 se presenta el diagrama de flujo para
este proceso.
2.- Producción por fermentación en cultivos superficiales.
La producción de écido cítrico por el proceso de
cultivos superficiales esté basada en el método ideado por
Scheele en el aRo 1789. Este proceso fue el pl- imero en ser
utilizado a escala indus b- ia 1 para la producción de écido
cítrico por métodos microbiológicos <Prescott, S., 1962>.
En este proceso se ha empleada· una gran variedad de
hongos tales como: A~.pergillLtS níge1-, A. cl~vatus, Penicillium1
luteum, Penicillium citrinum, :. . :i"l.: :u:.: c: .:o: : .:. l-_ _.o"'-=i.:..r-=~ formes , Us lutina
FIGURA # 1. DIA_GRAMA DE FLLJ,JO DE L.A PRODUCCION DE AC!DO
CITRICO POR EL METODD KDYt.
~tilo
·crre.co
Segun Peppler~ 1979.

~32)
vulgaris y otras esp~cies de Mucor. Sin embargo. solo las
e epas de ._A-''-'"'----'-l!..i~L han dado buenos resultados a escala
industJ-ia] (p¡-escott, S., 1962).
Muchas sustancias orq~nicas, e] 1 eis azúcares
principalmente, han sido utilizadas como medio de cultivo.
Por lo general los mayores rendimientos se han obtenido a
partir de saca l-osa V fruc tos.;\. En las fermentaciones
industriales se prefiere la sacarosa y 1~ glucosa
técnico y, en segundo la maltosa v las melazas de
remolacha y de caRa de azúcar <Prescott~ S., 1962).
De acuerdo a las investigaciones realizadas oor 1'1a llea
(1950>, el sustrato, cuando se trata de melazas y de glucosa
de grado técnico, debe sufrir un pretratamiento con el fin de
· disminuil- la cantidad de iones metálicos que ejercen un
efecto inhibitorio sobre la acumulación de ;~,c ido e i b- :l.co.
Este autor propone oara el nretrata~iento de ..1 as me •le\.:. as, lma

~
combinación de sustancias que ayudan a eljminar, por
adsorción, el e>:ceso de iones metólicos indeseados. Las
sustancias empleadas son: Carbonato de c=tlcio, sil ica
coloidal. fosfato almidón y ferrocianuro de
potasio. El t~atamiento preferido oor las industrias aue aún
utilizan es te método. es el de] ferrocianuro de potasio
(Lockwood. L •• 1979).
En el método de cultivo superficial descrito por Faith
<1965>, el sustrato <melaza de remolacha con 52% de azúcares
o melaza de caRa de azúcar con 57 % de azúcares) es colocado
en recipientes mezcladores donde se aRade -~cido sulfúrico
diluido para ajustar el pH entre 5.5 y 6.5. También se
agregan macronutrientes como fósforo, potasio y nitrógeno en
forma de sales ácidas.
La mezcla se esteriliza con vapor a presión durante 30
minutos y luego se diluye con agua hasta obtener· una
concentración de azúcar entre 15 y 20 r.. E~ medio de cultivo,
luego de diluido, es colocado en bandejas de aluminio o acero
inoxidable <25 x 33 cm y 5 cm de profundidad). Estas bandejas
se· apilan en cámaras de fermentación cerradas y estériles
provistas de dispositivos para regular y controlar la
temperatura, la humedad y la circulación del aire.
El medio, luego de ser esterilizado, es enfriado a 30-C
e inoculado con esporas del hongo Aspergillus niqer de una
variedad especial que las compaRias mantienen en secreto. Las
esporas germinan·luego de 24 horas de incubación, y sigue el
proceso de fermentación que dura entre 8 y 12 dias.
A medida que la fermentación avanza~ aumenta el grado
de acidez de la solución. El pH desciende alrededor de 2 al
terminar la fermentación y el contenido de ácido oscila~ en
ese momento, enb-e 10 y un 20 ~1.. La temperatura de la

solución durante la fermentación se mantiene entre 28 y 3o~c.
Por lo general se hace circular aire purificado por la camara
de fermentación y la humedad relativa se mantiene entre un 40
y un 60 Y..
El diagrama de flujo para este proceso se esquematiza
en la figura # 2.
3.- Producción por fermentación sumergida.
Los primeros esfuerzo~ para producir ácido cítrico por
métodos de cultivo sumergido, fracasaron. Los rendimientos
conseguidos por este método fueron inferiores.a los obtenidos
por métodos de cultivo superficial y, en ocasiones, se
produjo ácido glucónico a expensas del ácido cítrico.
Wehmer (1912) intentó producirlo a partir de una
solucción de sacarosa con cal y con paso de aire estéril a
su través. El ácido citrico se obtenía como citrato cálcico,
pero la conversión era baja. Resultados similares obtuvo
Elving <1919> quien hacía crecer el _hongo sumergido mediante
aereación.
En 1926, Bleyer dio a conocer un proceso en el cual se
producía écido cítrico en tanques abastecidos de aire y con
agitación mecánica ocasional.

FIGURA # 2. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PRODUCCION DE ACIDO
CITRICO POR CULTIVO EN SUPERFICIE.
'")f~E,~o
CMIO"'
. - - - - tK.Wft')O
Segun Reigel, 1974.

Schreyer <1928>, descubrió que la agitación mecánica
continua y la aereación aumentan la producción total de écido
por Asoergillus fumaricus Esta producción resultó ser
superior a la del testigo obtenida mediante el método de
cultivo superficial.
Thies en 1930 obtiene resultados similares. Amelug
( 1930) investigó la producción de écido citrico por
Aspergillus iaponicus, en cultivos sumergido y con aereación,
partiendo de sacarosa. Aunque se obtuvieron buenos
rendimientos por este método no fueron tan altos como los
conseguidos por el viejo método de cultivo en superficie.
En 1933 Kluyver y Perquin, describen el uso de cultivos
en agitadores para el estudio de las fermentaciones
sumergidas a pequeRa escala. Hasta este tiempo las
fermentaciones sumergidas requerian de grande~ equipos y de

' \~ .
compresores de aire. Perquin <1938> utilizo est'a":'., técnica
para estudiar la producción de écidos orgánicos a~e~cala de
laboratorio, particularmente el caso de la producción de.
écido cib-ico y aplicó en su!:. estudios los conceptos
propuestos por Molliard <1922), de limitacion en la fuente
de fosfato. Parece ser que ni Molliard ni Perquin
reconocieron el papel que juega la presencia de trazas
metélicas en la fermentación sumergida del ácido citrico •

-~ 3'/)
El método de cultivo sumergido sólo se ha empleado con
éxito en los últimos afias, primero por Szucs (1944) y después
por Karow y Waksman (1947>. En el procedimiento de Szucs los
micelios de A. niger, nacidos de las esporas, se hacen crecer
a 28 °C, durante 3 a 4 dias, en una solución de crecimiento
nutritiva y estéril. Después de los 4 dias de propagación, se
separan los micelios <en forma de " pellets" >, se lavan y se
introducen en un medio de fermentación. De esta manera
podemos distinguir, en la producción de ácido citrico por
fermentación, dos fases, una de crecimiento y otra de
producción.
El medio de producción que contiene azócares, sales y
·ápro>;imadamente 5 gramos de micelio por litro de medio, es
agitado a 30 ac mientras a través del liquido se hace pasar
o>:igeno o aire. Se emplea por minuto, una concentración de 50
ml de gas por cada 100 ml de medio. Luego de 4 dias de
fermentación, entre el 70 y el 75% del azúcar es convertido
en ácido e i tr ico.
De acuerdo con las investigaciones llevadas a cabo por
Karow <1947>, la producción se facilita utiliz.ando 2 grs de
úrea y 50 mg de fosfato por litro de medio. El rendimiento
con este método está entre 67 y 85 Y., en comparación con 60
y 75 r. obtenido con el método de cultivo superficial.

\.JO)
El diagt-ama de flujo para este proceso se esquematiza en
la figura # 3.
La ecuación general que describe la fermentación citrica
por parte del hongo A. niqer es la siguien·te:
e H o + ------------ e H o + H O
De acuerdo a Gaden <1954>, la fermentación del ácido
citrico corresponde a una fermentación tipo II, donde la
formación del producto está relacionac;t.a indir.ectaínente con la
utilización de los carbohidratos. Las curvas de productividad
y productividad especifica muestran un desfase entre la
·sintesis del ácido y el consumo del carbohidrato.· Los máximos
no coinciden en su posición relativa con respecto al tiempo
<Atkinson, 1974>. La mayoria de los autores que han trabajado
con la fermentación del ácido citrico, ·han tratado de
eticontrar una razón única que explique la acumulación de
ácido citrico por el hongo A. niger. Esto les ha llevado ·al
fracaso, pues no consideran que cada fase de la fermentación
depende de la anterior. De po.co. sirve mantener las
condiciones óptimas del cultivo durante la acidogénesis si
primero no ha sido inducida la .alteración del metabolismo del
hongo durante el desarrollo de sus esporas <Kubicek, 1981).
Entre los facto¡-es más impOI-tantes involucrados en la
fermentación del ácido citrico tenemos: El tipo de organismo

FIGURA # 3. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PRODUCCION DE ACIDO
CITRICO POR CULTIVO SUMERGIDO.
•..
.
Segun Peppler, 1979.

t40)
utilizado, las relaciones adecuadas entre los distintos
constituyentes del medio (en especial la cantidad de 'iones
metálicos presentes>, el pH, el abastecimiento de oxigeno, la
temperatura y la adición de sustancias estimuladoras de la
fermentación.
Resumiendo podemos decir que dentro de los métodos
existentes para la producción de ácido citrico por
fermentación microbiana, el proceso de cultivos sum~rgidos es
el método que proporciona mejores·rendimientos • Es por ello
que este método será utilizado en nuestro trabajo.
·V.- Recupera e ión de 1 á e ido e i tr ico.
La recuperación del ácido citrico, a partir de los
medios de cultivo, luego del proceso de fermentación, es
similar en todos los procesos de producción de ácido citrico.
El liquido fermentado se pasa a unos depósitos de
decantación donde permanece por algunas horas. Los" pellets"
del hongo o la capa de mi~elio se dejan escurrir o se prensan
para recuperar parte del liquido fermentado.
La solución, una vez clarificada. pasa de los depósitos
de decantación a los de .precipitación, equipados con
agitadores, donde se calienta a una temperatura entre 80 y 90

t41J
.,e. El ácido oxálico presente se separa por precipitación
preferencial agregando al medio una pequeRa cantidad de
lechada de cal. PosteriOJ-mente al liquido residual se le
aRade lentamente una parte de lechada de cal pm- cada dos
partes de liquido, durante una hora, mientras la temperatura
se eleva a cerca de 95.,C. El citrato de calcio precipitado se
filtra al vacio y el filtrado se elimina como desecho.
La masa de citrato de calcio pasa a unos recipientes en
donde se realiza la acidificación con i!.1cido sulfúrico
diluido. A continuación se filtra o~teniéndose un precipitado
de sulfato de calcio y un filtrado de ácido citrico diluido.
Seguidamente la solucción se decolora tratándola con
carbón activado. Desde el purificador, el liquido pasa a un
evaporador de vacio donde se concentra. A continuación pasa
al cristalizador donde, al enfriarse. el ácido citrico
cristaliza en forma de monohidrato.
Los residuos solubles y la biomasa del proceso,
contienen nutrientes que pueden utilizarse como alimento para
animales y para fertilización agr i.cola. La Asociación
Americana de Control de Alimentos (AAFCOl, considera a los
residuos sólidos y liquidas de la fermentación cítrica como
aceptables para la alimentación animal CAAFCO, 1977). También
el micelio fóngico de esta fermentación se ha utilizado, con

(42)
muy buenos resultados~ con~ fertilizante y acondicionador del
suelo (Deroo, M., 1975).
En resumén, el proceso de recuperación del ácido citrico
implica, en primer lugar, la filtración de la masa fúngica,
luego el calentamiento a 90 e del sobrenadante de la
filtración con cal, seguido de una filtración para separar el
citrato de calcio formado. Por óltimo, este se acidula con
ácido sulfúrico concentrado, para obtener ácido citrico en
solución, que se concentra y se cristaliza en fria.
VI.- Microorqani~mo~ utilizados.
A partir de la investigaciones históricas de Wehmer
(1893), se ha demostrado que existe un gran número de hongos
capaces de producir ácldo citrico. Algunos dan bajos
rendimientos, otros producen sustancias indeseables y
otros, a causa de las caracteristicas inestables de su
cultivo, no resultan satisfactorios para su empleo a escala
comercial CGardner, J., 1956; Prescott, S., 1962; Clark, D.,
1963; Perlman, D., 1966; Das. A., 1969; Beuehat, L., 1978 y
Benuzzi, D., 1986).
Se ha empleado, con buenos resultados, una gran cantidad
de hongos y levaduras (Tabla# 5), entre los que destacan
Asperoillus niqer y, últimamente! la levadura §. lipolytical

{43)
TABLA # 5. MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO CITRICO
Aspergillus clavatus Aspergillus fumaricus
Aspergillus japonicus Aspergillus luteum
Aspergillus niger Aspergillus oryzae
Aspergillus wenttii Mucor piriformis
Paecilomyces aivaricatum Penicillum citricum
Pen ic i llum lu teu.m Saccharomycopsis lypolitica
Ustulina vulgaris Candida lypolitica
<Prescott, 1962 y Lockwood, 1979)

~44) .
<Treton, B., 1978) •
Tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial,
las cepas de Aspergillus niger han·dado generalmente los
mejores resultados. Este hongo produce grandes rendimientos,
posee características bioquímicas uniformes, se cultiva
fácilmente y produce cantidades mínimas de sustancias
secundarias (Prescott, 1962>.
El hongo Aspergillus niger es un miembro de la Familia
de los Eurovtiaceae, Sub-clase Plectomycetidae y Clase

Ascomycete <Alexopoulos, E., 1979). Esta familia incluye
muchos géneros, la mayoría de los cuales posee un
Cleistotecium bien desarrollado con un peridio definido.
Actualmente se admite que las especies más importantes de
·Aspergillus son Deuteromycetes, llamados también Hongos
Imperfectos, ya que aún no se les ha descubierto el estado
sexual <Alexopoulos, E., 1979>.
Roper y Fennell (1965) reportan alrededor de 200
especies y un gran número de variedades. El género esta
ampliamente distribuido en la naturaleza. Se les consigue
desde las r·egiones árticas hasta el trópico. El aire, al
igual que el suelo, contiene conidias de estos organismos
<Alexopulos, 1979>.
~45)
Los Aspergillus son capaces de utilizar como alimento
una enorme variedad de sustancias. Gracias al gran n(1mero de
enzimas que poseen, pueden metabolizar diversas fuentes de
carbono y de nitrógeno <Alexopulos, 1979>. Debido a su gran
actividad enzimática este Género es empleado en varios
procesos industriales. Ademas del ácido citrico, este hongo
produce una gran cantidad de ácidos y de sustancias quimicas
Preparaciones enzimáticas de· alfa-amilasas y proteasas
alcálinas y ácidas son elaboradas comercialmente utilizando
cepas de estos hongos <Alexopulos, 1979).
Algunas especies de Aspergillus producen sustancias
tóxicas llamadas mycotoxinas. La més importante de es la
aflatoxina. Otras como, ~spergillus fumigatus y. Aspergillus
flavus son patógenas para el hombre causando un grupo de
enfermedades que se conocen genéricamente con el nombre de
aspergillosis <Rippon, 1977>.
Las colonias de Asperg.illus ·presentan colores como el
negro, marrón, amarillo y verde. El color de la colonia es
uno de los criterios utilizad~~ para su identificación
, <Alexopoulos, 1979).
Pocas son las investigaciones que se han realizado sobre
la morfologia del hongo A. niger durante la fe1·mentaci6n
citrica <Clark, 1966).

( 46)
Schweiger <1961> ha descrito el tipo de morfologia que
presentan las celulas de A. niger productoras de ácido
citrico. Las hitas forman una especie de esférulas pequehas
denominadas "Pellets", constituidas principalmente por fila-
mentas cortos y ensanchados, con abundantes clamidoesporas.
Recientemente se ha reportado que en medios deficientes
en manganeso, A. niger forma esférulas pequeffas además de que
la germinación es deficiente <Kisser, 1980 y Hockertz, 1987).
Las esférulas ~armadas pm- la~.. hitas de A. niger,
muestran similitud. con la morfologia tipo levaduriforme
encontrada en algunos hongos dimórficos (Legisa, 1981>. Esta
morfologia, luego de 24 horas de incubación, producen unas
pequetfas protube•-anc ias sobre su superficie, que
posteriormente se desarrollan formando micelios <Legisa,

1981).
Estudios de microscopia electrónica han detectado la
presencia, en el citoplasma de las hifas que forman las
esferulas, de unas vesiculas gran~es a las que se han
atribuido funciones e>:cretoras <Legisa, 1981). No esta aún
claro si estas vesiculas se forman a. partir de vesiculas más
pequetfas. por un incremento en tamaffo, o bien si se originan
por la fusión de varias vesiculas.

\'"TI/
Diversos investigadores se han ocupado de la obtención
de mutantes de Aspergillus niger para la producción de ácido
citrico a nivel de laboratorio y a nivel industrial. En
general se han utilizado mutágenos como la luz ultravioleta o
los rayos X <Garner, 1956, James, 1956, Swanson, 1962,
Millis, 1963, Trumpy, 1963 y Sánchez, 1969). También se han
obtenido cepas productoras de ácido citrico por irradiación
con rayos gamma <Hannan, 1972, Hannan, 1976 y _Islam, 1986).
Desde que el ciclo parasexual en A. niger fue
descubierto <Pontecorvo, 1953>, los fenómenos de heterocario-
sis y poliploidia han sido investigados para aplicarlos como
herramienta en la obtención.de mutantes superproductores de
ácido citrico. Muchas de estas investigaciones se han
dirigido hacia la hibridación entre mutantes auxótrofos <Das,
1978).
Ultimamente se ha utilizado el método de fusión de
protoplastos para obtener cepas diploides de A. niger que
exhiban una alta productividad, en la formación de ácido
citrico, respecto a la cepa parental <Kirimura, 1986 y
Kir imura, 1988 >.
En otro sentido, Perlman (1949) encontró que las esporas·
jóvenes de A. niger son mejores que las viejas para la
producción del ácido citrico por fermentación.

(48)
De acuerdo a lo dicho anteriormente, el microorganismo
más utilizado para la producción de ácido citrico es el hongo
A!tll€~ r·.9...:i..Lh.:I..?__T.J.j._g_§r.:_. Cepas mu tan tes de este organismo,
obten idas pOl- irradiación con luz ultravioleta, han sido
utilizadas a nivel indus b- .i.:\ l . Las carac ter isticas
principales de estos mutantes son: su crecimiento en forma
de esférulas y su resistencia a altas concentraciones de
iones metálicos.
La .influencie"\ de la composición del medio de
espOl-ulac: ión en
ha sido estudiada por Shu y Johnson <1947). Estos autores
establecieron que un incremento en la concentraciones de
zinc, nitrato de amonio y fosfato de potasio en el medio de
espor-ulación, p¡-ocluc:e un cif.;~sce.,nso t;.>n la velocidad de
formación de las esporas.
Un incremento de las concentraciones de manganeso hasta
9.3 mg/1 y de extracto de malta hasta 1.5 g/1 favorece la
formación abundante de esporas en 48 horas en lugar de las 68
hol-as que tardan en formarse cuando no ~e utilizan esas
concentraciones (Shu y Johnson, 1947).
El med1o de Shu y Johnson (1947) es el medio que en la
actualidad se emplea para obtener esporas de

(49)
destinadas a producir ác1do citr1co tanto a nivel de planta
pi loto ccHno a nivel l.ndu!:; tria 1 ~Loe k\l'mod, 19'79).
Muchas ~ustanc1as orgánicas se han utilizado para la
producción de ácido citrico por fermentación. Entre ellas los
compuestos de 2, 3, '+, 5, 6,. 7 y U..~ ;;~tomos de car·bono~ pl-in -
cipalmente azúcares~ pueden ser fermentados para producir
i:kido citT1CO CPrescott~ 1962). Por lo general los mayores
rendimientos se han obten1do con sacarosa y fructosa. Para
las fermentaciones industriales se prefieren la sacarosa y la
glucosa de grado técnico, y~ en segundo lugar~ la maltosa y
las melazas de remolacha y dP caha de azúcar <Prescott~
1962) .
El rendimiento molar de la fer·mt-m tac ión e i.b- ica. ~
la producción de ácido citrico, se incrementa
cuando la conc~ntración inicial de azócar se incrementa y
solo ciertos carbohidratos son buenos como fuente de carbono
para la acumulación de ácido citrico (Bernhauer~ 1928~ ShLI,
1948 y Hossain, 1984).
Una 1nterpretación general de estas observaciones es que
solo las fuentes de carbono que permiten un buen crecimiento
de A • ..!l.illf-"1'". son las que a~:;;egu¡-an una velocidad catabólica
adecuada para producir un sobreflujo del ácido <Kubiceck,
1986) •
(50)
Los resultados reportados por Xu y col. ( 1989)
demuestran que el tipo y la concentración de la fuente de
carbono tienen un efecto muy importante sobre la producción
de C::-\c: ido e: i b- ico por B-.~·-··!:Ü.9.~U::.. Es tos in ves tigado¡-es set'fa lan
que la maltosa y la sacarosa son mejores fuentes de carbono
para la producción de ácido citrico que la glucosa y la
fructosa. Estos resultados son similares a los reportados por
Gupta y col. (1976) y Hossain (1984).
Ad ic ion a lmfm te al tipo de la
concentrac:ción del azúcar tiene también un efecto importante
en la producción de ácido citrico Xu y col. ( 1989)
deter-minaron que por debajo del 2,5 .. no hay producción de

"" '
··ácido citrico. La se inicia i:\ altas
concentracciones de azócar siendo la óptima del 10 %.
% de sacarosa y su
posterior transferencia a un medio con
induce la acumulación de ácido citrico. Sin embargo, si el
precultivo se realiza en un medio con 14 % de sacarosa y
luego se transfiere a un medio de igual concentración, no se
induce la producción del ácido (Xu, 1989).

{51)
Es tos resu 1 tados ind ic'an que las· a 1 tas caneen trae iones
de ciertas fuentes de carbono son requeridas para obtener
altos rendimientos en las fermentaciones c:!tricas, ya que
inducen una apropiado desbalance metabólico <Xu, 1989).
La melaza de caña de azúcar es una excelente materia
prima para la producción de ácido citrico, puesto que
contiene una gran cantidad de azúcares, es de fácil
disponibilidad y de relativo bajo precio <Clark, 1966;
Mar ier, 1960 y Heinr ich, 1982).
Sin embargo, se ha sef,·a lado que las me lazas de caFta de
azúcar no son muy adecuadas para la producción industrial de
ácido citrico <Shiga, 1953>, excepto cuando se someten
previamente a un proceso de clarificación y tratamiento
adecuado <Saha, 1953; Shiga, 1953; Owen, 1955; Shukla, 1956 y
Sánchez, 1966).
Está bien es~ablecido que la fermentación citrica en el
medio de melaza es afectada por la presencia de algunos iones
metálicos y se han desarrollado varias técnicas para eliminar
estas sustancias inhibitorias <Marier, 1960>.
El principal problema surge con trazas de metales como
la melaza de
caña de azúcar. Varias de ellos se han reportado como

inhibidores de la acumulación de 1 e i trato. <Heinr ich, 1982 y
Aibas, 1982). Por otro lado, algunos inhibidores no metálicos
también disminuyen la producción de ácido cítrico en un medio
de melaza de caña <Singh, 1981).
Todas estas observaciones han llevado a la investigación
y busqueda de nuevas técnicas de pretl-atamiento de la melaza
de caña de azúcar con el fin de aumentar la producción del
ácido.
Kundu en 1984, ·encuentra que cuando se somete la melaza
~ una cromatografía de filtración en gel Sephadex G-10, se
separan 4 fracciones:
1.- Pre-disácarida.
2.- Disácar ida
3.- monosacárida
4.- Post-Azúcar.
Al ensayar la fracción predisacárida se observó que es
la parte que más inhibe la producción de. ácido cítrico < 36 %
de inhibición). En esta fracción se encuentran las sustancias
de bajo peso molecular tales como iones metálicos, sustancias
inorgánicas y sustancias orgánicas. La fracción post-azúcar
induce una inhibición del 12 % en la producción del ácido.
Según Kundu (1984) los compuestos inhibidores, presentes en
esta fracción, son sustancias orgánicas de elevado peso
molecular. Según esto, la poca produce ión de ácido e 1 tr ico

en medio de melaza de caRa de azócar es debida a la presencia
de inhibidores tanto org~nicos como inorg~nicos <Kundu,
1984).
Se han reportado diversos métodos de tratamiento para
lograr que se produzcan cantidades adecuadas de ~cido cítrico
en medios con melazas de caña de azúcar. Entre estos métodos
tenemos: Pretratamiento con ferricianuro de potasio <Clark,
1966; Horitsu, 1966; Chandhary, 1966 y S~nchez, 1970) y con

resinas de intercambio ionice <Tomlinson, 1950 y Naguchi,
1961>,
Kundu <1984) desarrolló un método de pretratamiento de
las melazas para eliminar tanto los inhibidores org~nicos
como los inorg~nicos. Este método combina tratamientos con
fosfato tricalcico y ~cido clorhídrico y fraccionamiento con
Sephadex como el descrito arriba.
Otro problema prá~tico que se presenta con la
utilización de medios que no estan definidos químicamente,
como la melaza de la caña de azúcar,,es que la composición
varia con el tiempo, el lugar, el proceso de fabricación y la
forma de almacenamiento <S~nchez, J.; 1984)
·se ha establecido que los requerimientos nutricionales
para e 1 cree imien to deA:..;:..:•=--_n.:.;.;:i::.:g:..:e::.r.:... incluyen cantidades muy
pequeñas de 4 elementos metálicos: Zinc, hierro, cobre y

\. :JLt)
manganeso <Tomlinson, 1950). Raulin (1869) encontró que el
Zinc y el hierro son esenciales para el crecimiento de ~.
niger. Estas observaciones fueron confirmadas por Steinberg
(1919).
Bertrand y Javi 11 ie,- (1911) demostraron que,
adicionalmente a estos dos elementos, el manganeso también
era requerido. Bartels y col. <1927) fueron los primeros en
indicar la necesidad del cobre y Wolf y Emmerie (1930>
confirmaron estos resultados. Steimberg (1935) encontró que
los cuatro elementos antes mencionados <Zinc, cobre, hierro y
manganeso> eran necesarios para el. desarrollo del hongo en
medios de bajo ·pH, pero que este bajo pH no se lograba si el
manganeso estaba presente en cantidades óptimas para su
crecimiento. Parges (1932) y Shu y Johnson (1948) emplearon
Zinc y hierro, obteniendo una alta producción de ácido
citrico y reportaron que el manganeso y el cobre son
inhibidores de la produce iqn de ácido e i tr ico.
Shu y Johnson <1948) encontraron que el · manganeso
causaba una disminución en la producción de citrato. La
eliminación por intercambio iónico de estos iones indeseables
fue demostrada por Woodward y col. <1949>.
El uso de los iones cupricos como antagonista del hierro
fue descubierta por Schweiger (1961). Bruchman ( 1961)
encontró que, en presencia de cobre, la enzima aconitasa es

inhibida. El rango de iones cúpricos requeridos que se debe
aF.adil- al medio de producción varia entre 0,1 a 50 mg/1, lo
cual depende de la cantidad de hierro presente en el cultivo
CSchweiger, 196,>.
Las evidencias experimentales han demostrado que la
excesiva cantidad de los iones metálicos interfiere con la
acumulación de ácido cítrico CParges, 1932; Bernhauer, 1941;
Per lman, 1946; Shu y johnson, 194a; tomlinson y col., 1950 y
Bruchman, 1961) •
Clark <1962) describió un proceso en el cual se utiliza
ferr~cianuro de potasio para eliminar los iones metálicos. La
·metodología de exclusion por intercambio ionice o la
precipitación con ferricianuro de potasio son, probablemente,
los únicos métodos prácticos de purificar los medios de
cultivo a ser utilizados en la producción de ácido cítrico
(Loe kwood, 1979).
De acuerdo con Kubicek y col. <1977>, bajo condiciones
de limitación de nutrientes inorgánicos y en presencia de
manganeso, e 1 hongo tiende a desv·iar su metabo 1 ismo hacia
varias reacciones biosintéticas colaterales. La deficiencia
en manganeso bloquea tales reacciones dando como consecuencia
una sobreproducción de ácido. Solo cuando la concentración de
manganeso es menor de 0,02 mM, se acumula el ácido citr~co en
grandes cantidades CRohr, 1983).

(56)
Recientemente ha sido presentada una explicación

bioquimica del efecto del ·manganeso en la fermentación
citrica. Su deficiencia produciria un incremento en la
velocidad de recambio de las proteínas, lo que se podria
traducir en un aumento de la concentración intracelular de
NH~· <Kubicek, 1979 y Ma, 1985>. El nivel intracelular de
NH~· es capaz de ·contrarrestar la inhibición de la
fosfofructokinasa por el citrato <Habison, 1979 y Habison,
1983>. Esto garantiza una alta velocidad de hidrólisis de la
glucosa a traves de la Via Fructosa difosfato, necesaria para
la acumulación de ácido citrico <Rohr, 1983). De acuerdo a
este modelo , se requiere una deficiencia en manganeso para
eliminar la regulación de la glucólisis por el citrato
(Schrefer 1, 1986).
Se ha observado que la deficiencia de este ión en &·

niger va acompa~ada por un número de eventos fisiológicos
tales como: cambios en la sintesis de lipidos y en la
composición de la membrana y de la pared cel~lar, incremento
en la degradación de proteínas, en desarrollo anormal de la
célula y en .la inhibición de. la esporulación y reducción de
las actividades de las enzimas del ciclo de Krebs <Shu,
1947;Tomlinson, 1949; Perlman, 1960; Detroy, 1961; Barnett,
1966; C lar k, 1966; ,Kubicek, 1977; Or thofer , 1979; Kisser,
1980 y Ma , 1985 > •

(57)
Ademés del carbono, hidrógeno~ oxigeno y trazas de los
iones metélicos presentes en el medio de cultivo, se
necesitan otras sustancias nutritivas para la fermentación
citrica. Entre ellas: nib-ógeno, fósforo y azufre <Prescott,
1962).
La fuente de nitrógeno es apo¡-tada por sales
nitrogenadas. Las més empleadas son: nitrato de amonio,
sulfato de amonio~ ni b-ato de sodio y ni trato de potasio
<Prescott, 1962).
De acue¡-do a Porges ( 1932), es mejor e 1 ni b-ato de sodio
al 0,4 %' que el nitrato de amonio o el sulfato de amonio.
·Butkewitsch y Gaewskapa <1935) emplearon el nitrato de
potasio a una concentración del 0,35 % con buenos resultados.
Los laboratorios Miles han reportado una mejora en la
produce ión de éc ido e i tr ico por A. n iqer cuando se af,ade
amonio, en forma de hidróxido de amonio o carbonato de
amonio, durante la fermentación <Miles, 1962>. De hecho, la
producción comercial de ácido cítrico por fermentación
sumergida ocurre bajo condiciones de limitacion de nitrógeno
<Prescott, 1962) •
En 1938, Perquin reportó que la acumulación de ácido
cítrico ocurre bajo condiciones de deficiencia en fosfato

{58}
<Shu, 1948). Este concepto fue utilizado por Szucs en un
método patentado en 1944. Kl-istiansen y col. ( 1978)'
estudiaron el efecto de las limitaciones de fosfato sobre la
producción de ácido cítrico en cultivos en quimiostatos.
Estos autores reportaron que era producida una menor cantidad
de ácido e í tr ico, durante los estados de 1 imitación en
fosfato, en campal-ación con la obtenida durante los estados
de limitación en nib-ógeno. También hacen nota,- que el exceso
de nitrógeno -es e1 factor más impar tan te, mé1s aún que la
perdida de fosfato, para la sobreproducción de ácido cítrico
<Kristiansen y col.~ 1978).
Experimentos realizados en fermentaciones por carga,
bajo condiciones de 1 imi tac ion de fosfato, muestran que la
producción de ácido cítrico esta inversamente relacionada con
el exceso de la concentración de nitrógeno <Dawson, 1989). De
esta manera estos trabajos han demostrado que, bajo·
condiciones de limitación en fosfato, la producción de ~1cido
cítrico por A. nioer está, pt-obablemente sujeta a una
represión catabólica por nitrógeno <Dawson, 1989).
Resumiendo podemos decir que en la composición de los
medios utilizados en la fermentación del ácido cítrico, son
importantes: el tipo de azúcar utilizado, siendo el más
adecuado la sacarosa a altas concentraciones <10 al 14%>, la

concentración de iones metálicos como el zinc~ hierro, cobre
y manganeso, donde la concentración del manganeso es la· más
critica para la producción de ácido cítrico <Menor de 0,02
mM). Y, por ú 1 timo, la produce ión de ácido e í tr ico se lleva a
cabo bajo condiciones de limitación en nitrógeno y fosfato.
También hay que señalar que se ha utilizado la melaza como
·~teria prima para la producción de ácido cítrico, aunque es
necesario someterla a un tratamiento previo para eliminar los
diferentes inhibidores que contiene. Los tratamientos con
ferrelcianuro de potasio y con de resinas intercambio iónico,
son los más empleados.
VIII.- Condiciones de cultivo.
El mantenimiento de un pH favorable es un factor que se
debe tener en mente, durante la fermentación cítrica. Currie
(1917) demostró que regulando el pH y la concentración de las
sales inorgánicas, se puede variar considerablemente la
proporción de ácido cítrico y oxálico producida.
Cuando el pH es bajo se fqvorece la producción de ácido
cítrico y se suprime la producción de oxálico y, también, se
reduce al mínimo el peligro de contaminación. En general los
hongos que producen una mayor cantidad de ácido cítrico
toleran mejor los valores bajos de pH inicial <Prescott,
1962).
( 60)
Currie <1917> empleó ácido clorhidrico para ajustar el
pH inicial entre 3,4 y 4,0. Doelger y Prescott <1946)
recomiendan el empleo de este mismo ácido y descubren que el
intervalo de pH más satisfactorio durante la fermentación,
es de 1 ,8 a 2 ,O. Desde e 1 punto de vista de la produce ión de·
ácido citrico, se descubrió que los ácidos sulfúrico, nitrico
y acético eran inferiores· al ácido clorhidrico CPrescott,
1962).
La temperatura es otro factor que se debe tener en
cuenta durante. el proceso de ~.a fermentación citrica y
dependerá, en parte, del organismo y de las condiciones de
fermentación. Generalmente se emplean temperaturas entre 25 a
35°C. CLockwood, 1979>.
De acuerdo a Doelger y Prescott (1934>, el intervalo
óptimo de temperatura está entre 26 y 30 ac. La cantidad de
ácido citrico producido aumenta con la temperatura entre ea y
30 oC. Por encima de esta ultima disminuye la producción,
aunque se observa un aumento en la acidez total por formación
de ácido oxálico <Doelger, 1934).
Aspergillus niger produce ácido citrico a traves del
metabolismo aérobico del sustrato carbonado. De esta manera
el o>dgeno es también un parámetro importante de este

\blJ
proceso <Woold, 1976 >. Se ha observado que la producción
industria 1 de diversos metabolitos por los hongos
filamentosos es suceptible de ser regulada por la tensión de
oxigeno disuelto <TOD> en el medio <Bull y col., 1975>. En el
caso de la producción de ácido cítrico, la influencia d~l
oxígeno ha sido bien establecida, aunque las bases
metabólicas del proceso no se tienen muy claras <Shu, 1953;
Clark, 1961; Khan, 1973 y Kubicek, 1980).
Dado que la mayoría de los productos metabólicos son
producidos por células diferenciadas, es evidente que la
tensión critica de oxígeno di.suelto, necesaria para el
crecimiento, es diferente a la requerida para la formación
del producto <Bull y col., 1975).
Kubicek <1980>, realizó investigaciones con el fin de en
tender el mecanismo de control del oxígeno sobre la acumula-
ción del ácido cítrico. Este investigador encontró que la ten
sión crítica de oxígeno disuelto, para el intercambio de
gases por A. niger, era de alrededor de 21 y 26 milibares
para las fases de crecimiento y producción, respectivamente.
Además observó que pequer1os cambios, en e1 tiempo, en la
tensión de oxígeno disuelto producen un cambio irreversible
en la velocidad de formación del producto <Kubicek, 1980).
Los trabajos de este autor, han demostrado claramente que la
acumulación de éc ido e :1. tr ico es favorecida por un incremento

en la tensión de oxigeno disuelto en el medio de
fermentación. La aereación, en la fermentación sumergida del
ácido citrico, debe ser continua. El aire se burbujea a
~avés de la solución a una velocidad de 0,5 a 1,5 volúmenes
de aire por volúmen de medio <vvm> CLockood, 1979).
Por último, diferentes autores han reportado el efecto
estimulante de diversas sustancias químicas sobre el
desarrollo de la fermentación citrica por A. niqer. Estas
sustancias, dependiendo de su efecto, son agregadas al medio
de cultivo a un tiempo determinado, obteniéndose un
incremento en la producción del ácido <Gerhardt, 1946;
Waller, 1946; Perlman, 1946; Bernhauer, 194!; Clement, 1952;
Maftin, 1952; Moyer, 1953; Shiga, 1953; Leopold, 1954;
Morrinson, 1954; Martín, 1955; Steel, 1955; Owen, 1955;
Schweiger, 1961; Puente, 1962; Millis, 1963; Akiyama, 1972;
Tr~ton, 1978; Lockwood, 1979; Bhatt, 1980; Manonmani, 1987 y
Roukas, 1987).
El ferrocianuro de potasio es una de esas sustancias
estimulantes CGerhardt, 1946; Clement, 1952; Martin, 1955 y
Clark, 1966). La cantidad utilizada depende de la
composición del medio de cultivo. Clement (1952>, agregó de
0,6 a o,a gramos de ferrocianuro por litro de medio de
melaza de caña de azúcar. Para el mismo medio, Steel y col.
<1955), utilizan concentraciones entre 0,5 y 0,6 g/1.

Martín <1955), realizó un estudio del efecto del
ferrocianuro sobre el crecimiento y la producción de ácido
cítrico por A. niger. Encontró que una concentración inferior
a 1 ppm de ferrocianuro inhibe el desarrollo del hongo en un
medio sintético simple. Observó, además, que tal inhibición
se podía eliminar incrementando la cantidad de hierro y zinc.
Basado en sus estudios, este autor postuló que el
ferrocianuro desempeña, al menos, dos funciones importantes
en el tratamiento de los medios de cultivo. La primera seria
la eliminación de oligoelementos que estimulan el crecimiento
pero no la producción de ácido. La segunda estaría
'relacionada con la actuación directa como inhibidor del
crecimiento del hongo.
Los alcoholes son otro tipo de sustancias que también se
han reportado como estimulantes de la fermentación cítrica
<Moyer, 1953; Bhatt, 1979 y Manonmani, 1987>. Moyer <1953)'
estudió el efecto de varios alcoholes sobre. la producción de
ácido cítrico. Los alcoholes metílico y etílico, a una
concentración entre 1 y 3 Y., y el alcohol isopropílico a una
concentracipn hasta del 2 %, incrementan la producción de
ácido cítrico, a partir de glucosa, por A. niqer.
Uno de los efectos de los alcoholes parece consistir, en
incrementar los niveles de tolerancia al manganeso, hierro y
zin~, muy por encima de los ne¿esarios para el crecimiento
del micelio. Ello permitiría la utilización de materia prima

(64)
bruta con altos contenidos de íónes metálicos <Moyer, 1953).
De acuerdo a Bhatt <1979>, la razón para el aumento en
la producción de ácido cí tr'íco al agregar etanol, puede ser
un efecto del alcohol sobre el metabolismo. Este autor opina
que el alcohol puede ser degradado hasta acetíl- CoA,
coenzíma que juega un papel muy importante en el cíe lo de
Krebs. Por otra parte, al ser utilizado como fuente de
carbono aportaría un incremento en el flujo de compuestos
carbonados a través del ciclo de Krebs <Bhatt, 1979 y
Manonman i , 1987 > •
Se ha reportado que el monofluoracetato de sodio es Lf(l
estimulante de la fermentación cítrica <Morrínson, 1954;
Akiyama, 1972; Tabuchi, 1974; Manonmani, 1987). Esta sal de
sodio se tiene como inhibídor competitivo en la oxidación del
acetato (Questel, 1985>. El fluoracetato, por acción de la
citrato sintetasa, es transformado en fluorcítrato, que
inhibe a la enzima aconitasa <Morrinson, 1954 y Triton,
1978).
Las grasas y los aceites son otro tipo de sustancias que
actuan como estimulantes de la fermentación cítrica <Millis,
1963; Bhatt, 1980 y Manonmani, 1987). Las grasas se
hídrolizan dando lugar a glicerol y ácidos grasos. El
glicerol entra al ciclo de K~ebs vía la Glucólisis y los
ácidos grasos lo hacen en el ciclo de Krebs por intermedio

del acetil- CoA <Millis, 1963).
Los ácidos grasos con menos de 15 átomos de carbono
inhiben el crecimiento y la producción de ácido cítrico por
A. niger. Los aceites naturales con un alto contenido de
ácidos grasos insaturados y. el ácido oleico <2% v/v),
incremen·tan la producción de ácido citrico en un 20 % aproxi-
madamente <Mi 11 is, 1963).
El reciclaje de biomasa durante el ,-eemplazo del medio
de cultivo en el proceso de fermentación citrica, ha sido
estudiado por varios autores. Se ha encontrado que ese
procedimiento es más complicado en las técnicas de cultivo
sumergido que en las de cultivo superficial <Al-Obaide, 1979;
Heinrích, 1981 y Heinrich, 1982). Al-Obaidi <1979), demostró
la posibilidad de utilizar repetidamente el micelio de
Aspergillus niger para la producción, en cultivo sumergido,
de ácido cítrico. Para recuperar las células utilizó una
técnica de u 1 traf i 1 trae ión.
La aplicación de las células inmovilizadas podria evitar
la utilización de técnicas sofisticadas como la
ultrafiltración. El primer paso en este sentido fue dado por
Anderson y col. en 1980 quienes utilizaron un fermentador de

\00}
disco para producir ácido. Desde entonces se han reportado
diversas técnicas por diferentes autores <Vaija, 1982;
Eikmeir, 1984; Horitzu, 1985 y Tsay, 1987>. Sin embargo, este
tipo de técnica no se ha utilizado en la producción de
citrato, debido a que es necesaria una gran inversión de
capital <Loockwood, 1979).
De acuerdo con lo an ter iormen te, las
condiciones óptimas para la fermentación·del ácido cítrico
son: pH inicial entre 3.4 y 5.5; temperatura de fermentación
entre 25 y 35 °C; tasa de aereación entre 0,5 y 1,5.vvm y la
adición de sutancias estimulantes de la fermentación tales
como ferrocianuro de potasio, metano! y ácidos grasos. El
método de reciclaje de biomasa no ha sido implementado en la
industria debido a altos costos de inversión.
IX.- Bioquímica y regulación de la biosíntesis del ácido
e í tr ico.
La producción fermentativa de ácido e: í tr ico por
Aspergillus niger es, desde el punto de vista comercial, uno
de los ejemplos más utilizados de sobreflujo metabólico
<Smith, J., 1974>.
Varios autores han tratado de e>:plicar el mecanismo de
acumulación del ácido cítrico por parte del hongo y se han

(67)
elaborado una gran variedad de hipótesis. Sin embargo,
ninguno de los mecanismos propuestos ha sido capaz de
explicar todos los hechos observados.
Maze y col. <1904) sugirieron que e1 ácido e :1. tr ico
aparece como producto de un metabolismo respiratorio
incompleto. En una teoría expuesta por Buchner y citada por
Prescott, (1962>, el ácido parasacaridico desempeñaría un
pape 1 impar tan te como in tel-med iar io duran te la formación de 1
ácido cítrico. El azúcar, de acuerdo con esta teoría, se
escinde a ácido parasacarínico, que a su vez produce ácido
ci tr ico <Prescott, 1962). Según Herzog <1 909 ) , ser :1 a
necesaria una reacción de condensación para explicar la
formación de ácido e i tr ico a par ti¡- de es tos compuestos.
Euler ( 1909) ha sugerido que .a partir del azúcar se
forma ácido pirúvico que, a su vez, se desdobla en
acetaldehido y anhídrido carbónico. Durante el proceso se
condensarian 3 moléculas de acetaldehido y el producto se
oxidaria a ácido e i tr ico. De acuerdo con esta teoría, el
rendimiento máximo que se podria obtener se¡-:{a del 71 %. Pero
los resultados prácticos que se han obtenido contradicen esta
suposición, pues se han logrado rendimientos cercanos al 85 %
( We 11 s, 1936) •
En 1919, Raistrick sugirió que la hexosa se escinde a
ácido alfa-gama-dicetoadfpico que posteriormente podria
hidrolizarse a ácido acético y oxalacético. Estas dos
sustancias se combinarían para formar ácido cftrico. El ácido
oxálico podrfa proceder, de acuerdo con esta teoria, de la
escisión del ácido oxalacético y de la oxidación del ácido
acético. Aunque esto explicaría los grandes rendimientos
observados en la fermentación e i tr ica, no e>:p 1 ica la
producción de este ácido a partir de otras sustancias. A no
ser que se suponga que~ en cada caso, se sintetiza una hexosa
que sirva de fuente de átomos de carbonos <Prescott, 1962>.
En 1924, Butkewitsch propuso un esquema en el que la
glucosa se oxidaba directamente a ácido citrico. La glucosa
pasaria, en primer lugar, a ácido glucónico que, a su vez, se
transformaría en ácido glucLtl-ónico. El autor supone que este
.
último ácido sufre una condensación aldólica intramolecular
para formar un anillo de 5 átomos de carbono. La ruptura del
anillo, seguida de oxidación, conduciría a la formación de
ácido e i tr ico.
Wehmer (1925>, en vista de que el gluconato cálcico es
fermentado por A. niqer a ácido cítrico, sugirió la
posibilidad de que la glucosa, luego de transformarse en
ácido g luc ón ico, se convierta en á e ido e i tr ico y es te,
posteriormente, en ácido oxálico y anhídrido carbónico.

( 69)
En la teoria propuesta por Frainzen y col. (1925>, el
principal producto intermedio de la fermentación citrica
seria el ácido sacárico. Este se transformaría en
beta-gama-dicetoadipico y .luego, por un proceso de
transposición bencilica, daria ácido citrico. Challenger y
col. (1927> confirmaron esta teoria utilizando medios con
glucosa que habian sido fermentados por A. niger. Cuando se
empleó gluconato cálcico también se produjeron ácidos
sacárico y citrico. Bernhaur (1934>, sin embargo, basándose
en sus trabajos con un gran número de hongos no cree que el
ácido sacárico sea un producto intermediario en la
fermentación citr·ica.
Chrzaszcz y col. <1930) elaboraron un esquema para
explicar la formación del ácido citrico en base a la
capacidad de ciertos hongos de producir ácido e i tr ic·o , junto
con los ácidos succ in ico, fumár ico y málico, a partir de
ácido acético y etanol. Según este modelo dos moléculas de
ácido acético se deshidrogenarian, dando lugar a una molécula
de ácido succinico, que a su vez, por pérdida de hidrógeno,
pasaría a formar ácido fumárico. Este se convertiría en ácido
málico por adición de una molécula de agua. Posteriormente
una molécula de ácido málico se combinaria con otra de ácido
acético, con pérdida de.hidrógeno para formar ácido citrico.

( 70)
Posteriormente se sugirió que las etapas iniciales en la
producción de écido cítrico a partir de azúcares eran
similares a las de la fermentación alcohólica. De ser cierta
esta suposición, el rendimiento m~tximo de ácido citrico a'
partir de glucosa no seria superior al 71 % y la relación de
peso de ácido citrico al de dioxido de carbono no seria
superior a 1,45:1 <Wells, 1936). Sin embargo, Wells y col.,
(1936) han demostrado de forma definitiva, por medio de
experimentos con balances de carbono, que pueden obtenerse
rendimientos considerablemente mayores del 71 % a partir de
glucosa y que se ex~ede también la relación del 1,45:1.
Bernhauer y col, (1932) postularon que el ácido acético
y el etanol se formarían a partir de azúcares metabolizados
por hongos en la forma que indica el esquema de Neuberg para
la producción de etanol por las levaduras <Prescott, 1962>.
El ácido a~ético se convertiría en ácido citrico a través del
ácido aconitico. Sin embargo, ésta teoria no es aceptable
porque, según ese esquema~ el rendimiento máximo de ácido
cítrico no puede ser superior al 71 %. Además, el ácido
aconitico no ha sido aislado de fermentaciones fúngicas,
aunque, Aspergillus itaconicus produce ácidos itacónico,
citrico y glucónico a partir de sacarosa y fructosa <We lis,
1936).
( 71)
En 1935 Emde propuso un esquema para explicar la
conversión de la sacarosa en ácido citrico por intermedio del
ácido quinico. Este ácido, de acuerdo a el esquema de· este
autor, podr i a ser o>: idado a á e ido e i tr ico por e 1 ácido
periódico y el rendimiento máximo seria del 56 %. Tampoco
este modelo resulta aceptable si se admite lo postulado por
We 11 s ( 1 936 ) •
En 1935, Gudlet, propuso un esquema en donde la glucosa
podia escindirse directamente en una molécula de ácido
succinico y otra de ~cetaldehido. Este esquema puede explicar
los grandes rendimientos obtenidos a partir del azúcar
consumido ya que no se hace intervenir en el proceso ninguna
decarboxilación. Sin embargo, se ha demostrado que no hay una
relación directa entre el consumo de ácido acético y la
'acumulación de ácido citrico siend6, por otro lado, el ácido
oxálico la sustancia principalmente producida en la
conversión del ácido acético CButkewitsch, 1934>.
Ciusa y col., <1939) demostraron que la adición de ácido
málico o glicólico, o una mezcla de ambos, a soluciones
nutritivas de azúcar, ajustadas a un pH de 3.5, aumenta el
rend im ien to de 1 ácido e i tr ico producido por A. n iger • Con
base en estos resultados, Ciusa y col., (1939) postularon que
la última fase de las reacciones intermedias en la
fermentación citrica podia ser una condensación de los ácidos
málico y glicólico.
(72)
Recientes investigaciones han aportado información
acerca de la relación entre el ciclo de Krebs y la formación
del ácido cítrico por A. niger <Kubicek, 1980>. Lewis y col.
(1951) utilizando como indicador ácido acético marcado
radioactivamente, sUgirieron que el écido cítrico se forma
como un producto del desbordamiento del ciclo de Krebs al
funcionar defectuosamente.
Diversos investigadores han demostrado la presencia de
las enzimas del ciclo de Krebs, así como las del ciclo del
glioxalato durante la fermentación cítrica por A. niger
<Martin, 1954; Ramakrishran, 1954; Ramakrishran, 1955; La
~auze, 1966 y Ahmed, 1972>. En la figura# 4 puede observarse
un diagrama simplificado del ciclo de Krebs.
La hipótesis de que el ácido cítrico se forma por
condensación de un compuestos dicarbonado. con otro
tetracarbonado ha sido aceptada por la mayor parte de
científicos <Prescott, 1962>. El compuesto dicarbonado
participante se sabe que es el acetato. El compuesto
tetracarbonado, un ácido dicarbo>d lico, se puede formar por
condensación de dos compuestos dicarbonados o de un
tricarbonado con otro monocarbonado. Esta teoría esta apoyada
por investigaciones realizadas con isótopos radioactivos
<Foster, 1950; Martin, 1950; Martin, 1951; Lewis, 1951;
Mosbach, 1952 y Bomstein, 1952>.

(73)
F I G UR A 4
o11
CH~-C-COOH
~~--_,....,,....A_CJ....:..DO:......::...,PiaUVlCO
OESIUOHOCENASA
PI HU VICA
J::ilNTt:TASA CITRICA f
Co A.$H
ACJDO CIS-ACONITICO
,....
f ACONIT ASA J t,...H.O
.;
~Ha-CooH
fH-COOH
HO-CH-COOH
;.._----,.~~~ I80CJftiCO
Dt:~HJDtWGENASA NAO.
lSOCITRICA
• NADH+H•
~Ha.-•c:oow
CH-C~
~-COOH
ACIDO Ql'*l QIUCCDaCO
ACIOO e•Ci:TOOL.UTARJCO
DIAGRAMA DEL CICLO DE KREBS
<Lehn inge¡- ~ 1.978)

( 74)
En 1954, Shu y col., utilizando un medio con glucosa
marcada con carbono 14 como unica fuente de carbono,
estudiaron el mecanismo de formación del ácido citrico en ~
niger, llegando a las siguientes conclusiones:
1.- Entre el 37 y el 40% del ácido citrico formado es
producido a partir de un ácido dicarboxilico reciclado de 4
átomos de carbono.
2.- El 40 % del ácido carboxilico se forma por
condensación de 2 compuestos de 2 átomos de carbono y el 60 %
por condensación de un compuesto de un átomo de carbono con
otro de 3 átomos de carbono.
3.- El 78 Y. de la glucosa se metaboliza de acuerdo al
esquema de. Emden-Meyerhof y, el resto, por un mecanismo en
el que participa el ácido pirúvico marcado en el carbono
carboxilo.
Otros investigadores, sin embargo no han observado el
reciclaje observado por Shu CBomstein, 1952 y Cleland, 1954).
Ramakrishnan y col., (1955>, han atribuido la acumulación de
ácido citrico por A. niqer~ a la pérdida de las actividades
aconitasa e isocitrato deshidrogenasa. Mattey <1977>, postula
que la habilidad de A. niger para acumular ácido citrico es
el resultado de, por lo menos, tres procesos relacionados con
la concentración de citrato. Uno seria que la velocidad de
formación del citrato, a partir de los precursores de la
glucólisis estaria regulada por la fosfofructokinasa. Otro

(75)
involucra a la acumulación de citrato regulada por el grado
de inhibición de la isocitrato deshidrogenasa. Finalmente,
otro proceso estaría relacionado con la velocidad de
transporte del ácido hacia ·el exterior celular, así como con
la velocidad de entrada, ambos regulados por el pH e>~terno
<Mattey, 1977>. Un diagrama de este modelo se presenta en la
figura # 5.
Rohr y t<ubicek ( 1981 ) ' desarro liaron un modelo
bioquímico para tratar de explicar los hechos observados
durante la fermentación cítrica. Estos autores postulan que
un desbalance en las condiciones de crecimiento, causadas por
una severa limitación de iones manganeso, nitrógeno o
fosfato, conduce a un aumento en el reservorio intracelular
de amonio • Esto se manifiesta en forma de una defectuosa
síntesis proteica <Rohr, 1981). Este reservorio de amonio es
capaz de contrarestar por retroalimentación la inhibición de
la enzima fosfofructokinasa, por el citrato y el ATP. Esto
produciría un sobreflujo de metabolitos en la vía Glucolítica
y, de esta manera, se obtendría una sobreproducción de ácido
cítrico <Rohr, 1981>.
Meixner (1985) ha propuesto un modelo en el que trata de
explicar la sobreproducción de ácido cítrico por A. niger.
Este autor postula que, como consecuencia de un incremento en
la actividad piruvato carboxilasa, se produce un aumento en

(76)
Figura. 5. Regulación de la producción de étcido cítrico.
l1EJ)ÍO CaTOPl~ti~ t1 a1oCow 1) lit iAo.
6luc.o\"' _ _.6\u'Ol" ~?.auu~to ..._....facuv•to

,0 í~
'• ft(Eli \. Co A J
· Aci~o ' .- _CiT~(I~~~
l \\'~~aT•~
CtTit,f.O • CtlltBTO
..• ···-·•
CJ
c,1e~To
ooci1tf\olo ...-
lQ•' ,1
1
1
ct- c.•lo6\u,~oATo _.e,at061"l"a"To ·
(M a t te y , 1 977 )
(77)
el reservorio de o>:alacetato. Puesto que el oxalacetato se ha
reportado como inhibidor de la enzima alfa-cetoglutarato
deshidrogenasa <Ma, 1981>, se produciría una ~nterrupción del
ciclo de Krebs. Como consec~encia, el ciclo no operaría, y se
acumularián varios intermediarios <Ma, 1981).
Se sabe que el citrato inhibe su propio catabolismo
pero no es capaz de disminuir los suministros de acetil- CoA
o de oxalacetato en la glucolisis. Por otra parte la afinidad
por sus sustratos de las enzimas succinato, fumarato y malato
deshidrogenasas, desplazan el equilibrio hacia la formación
del citrato. Como consecuencia de ambos procesos el ácido
cítrico podría ser acumulado en una cantidad apreciable
<Meixner, 1985). Un diagrama de este modelo se observa en la
figura # 6.
Hockertz y col. <1987 >, por su parte, han postulado que
una. disminución en la síntesis del ADN es un factor
determinante en la acumulación del ~cido cítrico por ~
niger. Estos investigadores observaron una actividad
nu¿leótido reductasa disminuida cuan~o el hongo se cultiva
bajo condiciones deficientes en Manganeso. Condición esta que
es un prerequisito para que se incremente la producción de
ácido e í tr ico <Kubicek '· 1977 >. Como resultado de esa. baja
actividad reductasa, la sintésis del ADN disminuye. Hockertz
( 1989)' por último, postula que un desbalance de los
compuestos celulares, tales como el ADN y las pro.te:ínas, es.

(78)
Figura. 6. Regulación de la producción de ácido cítrico.
l
~TAll
<Mei>:ner, 198~ >

(79)
una de las causas que explicarían la producción de ácido
ci tr ico pol- A. niger.
Es importante hacer notar que muy poco interés ha sido
atribuido al hecho de cómo es regulada la biosintesis del
ácido citrico. A diferencia de otros ácidos orgánicos
(fumárico e itacónico> que son sintetizados por hongos, el
ácido citrico es un importante regulador intracelular del
metabolismo en muchos tejidos y microorganismos <Goodwin,
1968).
De esta manera, cualquier explicación del mecanismo de
acumúlación del ácido citrico debe implicar:
1.- Qué mecanismos de regulación por retroalimentación,
causados por el citrato, están en operación y cómo se obvian.
2.- Qué mecanismos causan la acumulación del ácido.
X.- Los problemas y las soluciones.
Los problemas asociados con la producción de ácido
citrico por fermentación, como hemos visto, son variados y
numerosos y han originado un gran número de investigaciOnes•

\~U)
En general, los pasos principales para el desarrollo de
un proceso fermentativo exitoso, cuyo fin sea la obtención de
un metabolito determinado, son :
1.- Selección de una cepa microbiana.
2.- Modificación de la estructura genética del
microorganismo.
3.- Determinación de sus requerimientos óptimos
nu tr ic ion a les.
4.- ··Establecimiento de los parámetros óptimos de
pr-oduce ión •
De acuerdo a este esquema, en el presente trabajo se
realizará .'-'" estudio que incluya esas etapas. Al abordar el
problema de la producción de ácido citrico de una manera
global entendemos que podemos lograr conclusiones valederas
sobre la fermentación de 1 ácido e i trice por A. n ige,-.
Nuestro trabajo, asi, pretende lograr una técnica de
producción de ácido citrico adaptada~ nuestra realidad.
En este sentido, ·presentaremos, sucesivamente:

\ I:Sl)
1.-Busqueda y selección de una cepa de fr. niger super-
productora de ácido cítrico.
2.·-Mutagénesis de esa cepa y selección de un mutante
superproductor de ácido cítrico.
' 3 .-Produce ión de ácido e i tr ico, por el mutan tes
seleccionado, en diferentes medios de cultivo, y bajo
condiciones óptimas de fermentación.
4.-Determinación del efecto estimulante o inhibitorio de
diversas sustancias sobre la fermentación ci trica.
S.-Estudio de los problemas del reciclaje de la biomasa
durante la fermentación.
6.-Estudio de costo del proceso de fermentación
propuesto.
l82J
C A P I T U L O 2
HIPOTESIS Y OBJETIVOS.
1 .- Hipótesis.
1.1.- La producción y acumulación de ácido cítrico por
Asperg i llus niger, debe de estar relacionada con la
alteración de los mecanismos de control enzimáticos y con los
procesos de permeabilidad celular , que regulan la actividad
de una o de todas las siguientes enzimas fosfofructokinasa,
piruvato kinasa, piruvato carbo>:i lasa, isoci trato
deshidrogenasa, deshidrogenasa málica, citrato sintetasa,
alfa-cetogluta.-ato deshidrogenasa y la 2-oxalglutarato
deshidrogenasa.( Saz, H., 1953; Ramakrishnan, C., 1954; La
Nauze, J., 1965; Ng, A., 1973; Boliva¡-, F., 1975; Bolívar,
F., 1975; Mattey, M., 1977; l<ubicek, C., 1978; Habison, A.,
1979; Or thofer, R. , 1979; Kubice k, C., 1980; Zehen tgruber,
O., 1980; Kisser, M., 1980; Rohr, M., 1981; Meixner, O.,
1985; Arts, E., 1987; Purohit, H., 1988; Dawson, M., 1988;
Xu, O., 1989 y Schrefer 1, G., 1989 ) •
La mayoría de estas enzimas son constitutivas. Esto nos
conduce a pensar en la posibilidad de obtener mutantes de
regulación del hongo Aspergillus niger, que obvien los
mecanismos de control enzimáticos y puedan producir y
acumular el ácido cítrico. Estos mutantes se podrían obtener

lt:S3)
sometiendo a las células del hongo a una mutagénesis por
procedimientos clásicos. Los mutan tes serian · aislados
utilizando métodos de selección adecuados.
1.2.- Diversos autores han observado que sustancias como
el metano! y el ferrocianuro de potasio, estimulan la
acumulación y excreción del ácido citrico por Aspergillus
niger <Martín, S., 1952; Moyer, A., 1953; Nieman, C., 1954;
Mi 11 is, N. , 1963; Webb, F. , 1966; La Nau ze ~ J •, 1966;
Horitsu, H., 1966; Patarau, J., 1969; Sánchez, A., 1970;
Reigel, E., 1974; Treton, B., 1978; Sodeck, G., 1981;
Jerneje, K., 1982; Kundu, S., 1984; Islam, M., 1986; Roukas,
T. , 1987; Manonman i , H. , 1987; Xu , D • , 1989 ; Xu , D. , 1989 y
Honecker, S., 1989 ).
A pesar de que se han realizados muchos trabajos para
tratar de explicar el efecto estimulador de esas sustancias
en la fermentación del ácido citrico, todavia no se tiene
una e>:plicación satifactoria para este hecho. Por otra
parte, se ignora si, utilizando varias de estas sustancias de
modo simultáneo, se podria lograr un efecto sinérgico que
aumente la producción del ácido. Dependiendo de la fase del
crecimiento donde actúa cada sustancia estimulante, podria
ser posible determinar las concentraciones a utilizar bien
sea sola o combinada, para lograr la estimulación de la
producción de ácido citrico. E igualmente el tiempo óptimo,
duran te la fermentación , en e 1 que deben ·ser aj=1ad idas.

(84)
1.3.- Los sustratos utilizados para la producción de
ácido c:ítrico necesitan un procesamiento previo con el fin de
eliminar una serie de sustancias inhibidoras.(Perlman, D.,
1946; Shu , P. , 1948; Mar tin, S., 1952; Gardner, J., 1956;
Clark, D., 1961; Trumpy, H., 1962; Clark, D., 1~3; Sénchez,
A., 1964; Choudhary, Q., 1966; Clark, D., 1966; Horitsu, H.,
1966; Sénchez, A., 1969; Patarau, J., 1969 ; Sánc hez , A. ,
1969; Sénchez, A., 1970; Reigel, E., 1974; Kristiansen, B.,
1978; Jerneje, K., 1982; Kundu, S., 1984; Islam, M., 1986;
Roul<as, T. , 1987; Manonman i, H. , 1987 y Xu, D. , 1989 >
Creemos que disponiendo de una cepa adecuada y
conociendo las proporciones óptimas de las sustancias
estimuladoras, además del tiempo adecuado para su adición, se
podr:ía utilizar el azócar morena y/o la melaza de caRa de
azócar para la producción de écido c:ítrico. Se estudiaría,
asi, la posibilidad de no tratar previamente al sustrato,
como actualmente se hace, para disminuir costos de
produce ión •
1.4.- La fermentación del ácido citrico, de acuerdo con
la e lasi f icac ión de Gaden <1954>, corresponde a una
fermentación del tipo II, en donde la fase de crecimiento y
la de producción estan desfasadas en el tiempo <Atkinson,
1974>. Teniendo en cuenta lo dicho anteriormente, creemos
que seria posible reutilizar la biomasa fúngica de un cultivo
en otros cultivos sucesivos.

(85)
2.- OBJETIVOS
2.1.- Obtener a través de un proceso mutagénico por

f
pasos, una cepa· mutante de Aspergillus niger superproductora
de ácido cítrico.
2.2.- Seleccionar y caracterizar cepas mutantes de
Asperq i llus niger superproductoras de ácido e:{ tr ico,
resistentes a altas presiones osmóticas y que puedan
desarrollarse en presencia de altas concentraciones de iones
metá 1 icos.
2.3.- Caracterizar y cuantificar, a nivel de fermentador
de· 10 litros, en medios de cultivos con distintos tipos de
sacarosa como fuente de carbono, la producción de ácido
'e í tr ico por los mutan tes seleccionados.
2.4 .- Estud ial- e 1 efecto que tienen, sabl-e la fermen-
tac ión de 1 ácido e í tr ico en e 1 medio seleccionado, sus tan e ias
tales como metano! y ferrocianuro de potasio.
2.5.- Determinar la posibilidad de reciclar la biomasa
durante las operaciones de fermentación.
2.6.- Precisar la factibilidad económica de la
fermentación cítrica.
(86)
C A P I T U L O III
MATERIALES Y METODOS
A.- MATERIALES
A.l.- Material biológico
La cepa parental del hongo Aspergillus niger, utilizada
.en el presente trabajo, fue obtenida de la American Type
Collection culture <ATCC, 1984> y está identific~da con el
numero 11414.
La cepa se mantuvo en cutfas de medio agar papa-de>:trosa.
Estas cut'las se incubaron a una temperatura de 30 ac durante 4
dias. Finalizado este tiempo se guardaron bajo refrigeración
a 10 oc . Las cut'las se repicaron cada seis meses.
A.2.- Medios de cultivo.
A.2.1.- Medio de mantenimiento y repique de las cepas
Para el mantenimiento y repique de las cepas se utilizó
el medio Agar Papa-Dextrosa <Difco) que fue esterilizado a
120 ac y 15 PSI durante 20 minutos.

( 87)
A.2.2.- Medio de aislamiento de las cepas mutantes.
El aislamiento de las colonias de A. niger, luego del
proceso de mutagénesis, se realizó en C:ajas de Petri con
medio Agar-Papa-Dextrosa <Difco). El medio fue esterilizado a
120~c y 1~ PSI durante 20 minutos •
A.2.3.-Medios de selección de mutantes Superproductores
de.ácido citrico.
La selección de las colonias mutantes del hongo A. niger
superproductoras de ácido citrico se realizó en los medios
propuestos por James, (1956) y Kubicek, <1978>, modificados
por nosob-os en cuanto al tipo de azúcar utilizado. La
composición y caracteristicas de estos medios es la
s igu ien te :
Medio de James modificado.
Sacarosa <Azúcar morena comercial) ••••••••• 22,40 g/1

11
KHePO.... • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • O ,25
NH4t"0 3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ·• • • • • • • • • • • • • • • • 2 , 25 ..
MgSO- 7 HQO •••••••••••••••••.•••••••••••••. 0,25 g/1
Agua 1,00 1
Agar 15 ,oo g/1
pH • • 5,00
.Azul de bromocresol al 0,4% en etanol al 96% 100 ml/1
Medio de Kubicek modificado
Sacarosa <Azúcar morena comercial) ••••••• 140,00 g/1
7 HaO. 1,10 ..
KHQPO ........ . o' 15 11
CaCla 2 HaO • ••••••••••••••••••••••••••••• • 0,55 11
NaCl. o' 15 11
2,50 11
1 ,oo· 1
Agar 15,00 g/1
pH • ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4,50
Ambos medios fueron es ter i 1 izados a y 15 PSI

·durante 20 minutos.
A.2.4.- Medio de Caracterización.
Para la caracterización de las colonias mutan tes del
hongo A. niger se utilizaron los siguientes medios:

(89)
Medio Czapek's Dox
Sacarosa 30,00 g/1
NaNO :a 3,00 ..
Mgso... 0,50 ..
KaPO ... 1,00 ..
KCl 0,50 ..
Feso... 0,01 ..
Agar 15,00 ..
Agua 1,00 1
Medio Agar-Papa-Dextrosa <Di feo) <ver aparte A .2 .1 >.
Medio de esporulación <S~nchez, A., 1970>
Sacarosa • . . ...... . .. . . . .. . . . . . . . ... . . . . . .. 0,25 %
Extracto de carne ••••••••••••••••••••••••• 1,00 ..

NaCl. 0,50 ..
Agar. 1,50 ..
Agua. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 100 ,00 m1
Todos los medios empleados fueron esterilizados a 120 °C
y 15 PSI durante 20 minutos.

\ 90)
2.5.- Medio de germinación y formación de esférulas.
Como medio para la germinación de las esporas y su
subs igu ien te transformación en esférulas se utilizó el
propuesto por Benuzzii (1989>, cuya composición es la
siguiente:
Medio de Benuzzi.
Sacarosa •••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15,00%
KH P 0'1 • • • • • • • •. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • O , O1 ••
1
NH~ NO_:} • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • O, 20 ••
MgSO"f ••••••••••••••••. •.•..................... 0,03 "
Ext. de Levadura •• ~........................... 0,20 11
F eC 13 •••••••••••••••••• ,; • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • O , 00 1 ••
cuso'f • ~ • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • •.• • • • • • • o ,ooa 11
Agua ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 100,00 ml
pH. • • • • . • • • • • • . • • • • • • • . • • . • • • • • . • • • • . • • • • • . • • 5 ,00
E 1 medio fue es tel- i 1 izado a 120 °C y 15 PSI duran te 20
minutos.
A.2.6.-Medios de producción de ácido cítrico.
Para la producción de ácido citrico se utilizaron los
siguientes medios:
(91)
Medio I
Sacarosa <Azúcar refinada comercial) 14,000 y.
NH-1 NO~ •••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,250 ..

KH.z.PO._, •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,100 ..
MgSO!.f ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,025 ..
Feso ... ......................... . 0,010 11
ZnSO'i •••••••••••••••••••••••••• 0,002 ..

CuSO"í 0,005 ..
Agua 100,00 ml
pH .......................................... 4,50
Medio I I
Sacarosa <Azúcar no refinada comercial) ••••••• 14,000 Y.
NH"i NOa •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,250 11,
KH ¿PO.._ •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,100 ..

MgS0 11 • 0,025 ..
Feso........................................... . 0,010 ..
ZnSO"f. 0,002 11
CuSO'i. 0,005 ..
Agua 100,00 ml
pH 4,50
(92)
Medio III
Melaza de caRa de azúcar ••••••••••••••••••.• 25 ml
NHLtN03 •••••••••••••••••••••••••••••••••••• ,. •• 0,250 %
KH, PO.., ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,100"
Mg so..., ••••.••.••••.•••..•....•••...•.......•.• 0,025 "
FeSOy •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 0,010 "
ZnSOii ••••••••••••••••••••••••••.••••••••••••• 0,002 "
cuso.., •.....••..•..••..•..•.•.••.•••.••.••••.. 0.005 "
AgL\a •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 100,00 ml
pH 4,50
La melaza utilizada procedia del Central Azúcarero El
Palmar, Edo. Aragua con un contenido de azúcar del 56%.
Los medios I, II y III se esterilizaron a 1200 C y 15
PSI durante 20 minutos.
A.3.- Equipos
Las pruebas de fermentación se realizaron en un
fermentador LKB modelo 1601, con un volúmen de trabajo de 10
litros. El aparato esta provisto de un control automático
para regular la temperatura, asi como de dispositivos para
determinar el grado de agitación y de aireación. El sistema
se representa en la fig. # 7.
• --------Motor del sistema
antiespuma.nte
sonda anti-
espumante ~---Tapa
•tt"~M~:-;-----_Helice para elimi-

naci6n de espuma
--:------- Helices para agita-

ci6n
Rompe molinos
Entrada de ·
aire r---.:aBase
Sistema de toma de
muestras
Resistencia
-----ll--+a Sistema de control
para calenta- ~----
de temperatura
to
~-L:~~=::::::::::::::::::::::::::.,__ sistema de refrige-
( U<B, 1976 J ci6n
(94)
A.4.- REACTIVOS
Los reactivos químicos utilizados fueron de grado
anal f tico.
B.- METODOS
B.l.- Técnicas analíticas
B.l.l.- Azúcares totale~
Los azúcares totales se determinaron por el método de la
Antrona <Scott y col, 1953). Se basa en la acción
hidrolizante y deshidratante del écido sulfúrico sobre los
hidratos de carbono. El ácido cataliza la hidrólisis de los
enlaces glicosfdicos de los po 1 isac áridos, y la
deshidratación a furfural <en las pentosas> o hidroxime-
tilfurfural <en las hexosas) de los monosécaridos resul-
tantes. Los furfurales se condensan con Antrona, dando un
producto coloreado que es dosado por colorimetría a 625 nm.
Se realizó una curva patrón con soluciones de sacarosa
de concentración conocida. Cuando la concentración de azúcar
en la muestra fue muy elevada se diluyó con agua destilada.

(95)
B.1.2.- Determinación del coptenido de é!cido citrico
El écido citrico se determinó siguiendo el procedimiento
propuesto por Hartford, (1962>. El método se basa en la
reacción de Furth y Harmann <1935>, en la cual el écido
citrico forma un complejo coloreado en presencia de piridina
y anhidrido acético. La intensidad de color del complejo que
se forma se dosa por colorimetria a 435 nm. El método es
sensible en un rango de concenb-ación de t.,cido citrico de 5 a
200 microgramos.
Se elaboró una curva de ca 1 ibrac ión u ti 1 izando

• soluciones de diferentes concentraciones de écido citrico
anhidro.
B.1.3.- Determinación del peso seco y húmedo de la
biomasa.
Para determinar el peso seco de la biomasa fóngica se
tomaron 100 ml del cultivo y se filtraron por succión sobre
papel de filtro Whatman # 1 prepesado. El residuo sólido de
la filtración se lavó 2 veces con 50 ml de agua destilada y
se colocó posteriormente en una estufa a 85 ° C durante 12
horas. Finalizado este tiempo se pesó y despues de restar el
peso .del papel de filtro se obtuvo el peso seco. En los casos
en donde se determino el peso húmedo de la biomasa se utilizó
el mismo procedimiento excepto el paso de secado.

(96)
B.1.4.- Cromatografía del écido cítrico.
Con el fin de verificar la naturaleza del écido
producido durante las pruebas de fermentación~ se realizó una
cromatografía en papel de. las distintas muestras tomadas
durante el proceso.
Se siguió la metodología propuesta por Lugs y Overell
(1947), que utiliza como solvente de corrida una mezcla de
butanol-écido fórmico-agua (4:1:5>, a temperatura ambiente.
Para revelar los cromatogramas se utilizó una solucción que
contenia 1 X de xilosa y ctnilina en metano l . Los
cromatogramas, luego de revelados, se secaron en una estufa a
lOS 0
e por 10 minutos.
En las corridas se utilizaron como patrones muestras de
écidos cítrico, aspértico, glutémico y o>:élico.
B.l.S. E>:tracción del écido c:f.b-ico del medio de cultivo
Para extraer el écido cítrico del medio de cultivo,
luego de separada la masa fungica por filtración, se utilizó
el método descrito por J<ü-k y col. <1979). Este método consta
de dos etapas.
En la primera el écido cítrico~ presente en el 1 iquido
fermentado, es precipitado en forma de citrato de calcio.

(97)
Esto se realiza tratando el liquido de la fermentación con
cal en una proporción de 1 parte de cal por cada dos partes
de 1 iquido fermentado. La reacción se efec tua a 90 o C con
agitación. El citrato de calcio obtenido se separa, por
filtración, de la solucción tratada.
En la segunda etapa el citrato de calcio es tratado con
una cantidad equivalente de ~cido sulfl.1rico concentrado. La /
reacción se efectua en fria durante 12 horas. Posteriormente
se separa, por decantación, el ~cido citrico obtenido.
La solucción diluida de ~cido cftrico, se concentra en
un rotavapor y, posteriormente, se induce la cristalización
en trio. De esta manera se obtiene cristales de ~cido cftrico
hidratado.
B.2.- Curva de sobrevivencia y mutaqénesis con luz ul-
travioleta.
Para realizar esta experiencia se utilizó como parental
la cepa ATCC 11414 de Aspergillus niger. El hongo fue
mantenido en cuRas de Agar-Papa-Dextrosa. El mutagéno
utilizado fue luz ultravioleta <luz U.V.> de onda corta. Como
primer paso de esta e>: per. ienc ia se realizó una curva de
sobrevivencia. La finalidad fue establecer el tiempo de
irradiación con luz u.v. que produce en b-e el 95 al 99 Y. de
mor ta 1 idad. Este es el p01-cen taje reportado para la obteflción

(98)
de mutantes superproductores de metabolitos secundarios
<Andueza, 1986 >.
B.2.1.- Curva de sobrevivencia.
Para realizar la curva de sobrevivencia se siguió ·la
metodologia propuesta por James y col. (1956) y Scherferl y
col. (1986). A partir de cuñas de Agar-Papa-Dextrosa con 4

días de incubación, se recolectaron las esporas producidas
por A. niger mediante lavado de las cuñas con 5 ml de agua
estéril que contenia 0,8 % de Tween 80. Las cuñas se agitaron
vigorosamente durante 10 minutos con el fin de evitar la
formación de cumulos de esporas.
El número de esporas presentes en la suspensión, se
determinó por conteo directo en'el hematocimetro de Neubauer
modificado <Andueza, 1986). Simultáneamente se realizaron
diluciones de una suspensión ajustada a una concentración de
2 x to 6 esporas/ml, diluyendo con agua· es tér i 1 para obtener

L ~3 ··~ -tá
valores de 10- , 10 , 10 y 10 y se sembró en cajas eón
agar-papa-dextrosa. Ello con el fin de determinar el número
de esporas viables presentes en la suspensión. Las colonias
resultantes, representativas de las esporas viables fueron
contadas en cada placa. Todas las experiencias se realizaron
por triplicado.
Se colocaron 5 ml de la suspensión concentrada de
esporas (2 X
'
10 esporas/ml > en una caja de Petr i abierta. En-
cima de la placa de Petr i y a una distancia de 12 cm, se
colocó una lampara de luz ultravioleta de onda corta
<Minerallight, modelo UVSL 25>. La irradiación de la
suspensión de esporas se realizó en un cuarto oscuro, a
temperatura ambiente, durante 30 minutos.
Se tomaron muestras de 0,5 ml de las esporas tratadas a
los O, 5, 10, 15, y 30 minutos de exposición. Las muestras se
guardaron en frie durante 12 horas, en tubos recubiertos de
papel aluminio, con el fin de eliminar el riesgo de
inactivación de las mutaciones por la luz.
-3
Para cada muestra se hicieron diluciones 10-· , 10~z. y 10
··en agua estéril. De cada dilución, asi como de la muestra sin
diluir, se sembro 0,1 ml en cajas de medio
agar-papa-dextrosa. Las cajas sembradas se incubaron a 30° C
durante ó día. ·Al cabo de este tiempo se contaron las
colonias y se construyó una gráfica de sobrevivencia.
B.2.2.- Mutagénesis.
Para la obtención de las colonias mutantes superproduc-
toras de ácido e 1 tr ico de A. niger, se siguió el
procedimiento descritó por James y col. (1956> y Scherferl y
col. <1986>, aplicado durante 2 ciclos de mutagénesis.

(lOO)
Se utilizó un tiempo de 20 minutos pal-a 1a ü-r ad iac ión
con lu.z U.V. A este tiempo <ver figura 10) se obtiene un 3 %
de sobrevivencia. Las condiciones de la mutagénesis fueron
similares a las utilizadas en la curva de sobrevivencia.
Luego del tratamiento, 5 ml de la suspensión de esporas
irradiadas se colocaron en un tubo de ensayo recubierto con
papel de aluminio donde permanecieron durante 12 horas a 10 e

Posteriormente la suspensión se diluyó en agua estéril (10 ,
10 y 10 >,se sembraron en cajas de medio agar-papa-dextrosa
con el fin de dejar expresar las mutaciones y se incubaron a
30 e durante 6 dias.
Las colonias sobrevivientes se reaislaron en cajas de
medio agar-papa-dextrosa, mediante siembra con palillos
estériles en una proporción de 10 colonias por caja.
Se seleccionaron, como se indica en la sección B.3, las
colonias superproductoras de ácido citrico. Una vez precisada
la capacidad de superproducción de cada colonia, se realizó
un nuevo proceso de mutagénesis con luz U.V. de las colonias
que resultaron con una mayor capacidad de producción de ácido
citrico, a nivel de caja de Petri, respecto a la parental.
Las condiciones de esta mutagénesis fueron las mismas
descritas para la primera mutagénesis

(101)
B.3.- Selección de los mutantes superproductores de
ácido e i tr ico.
Para seleccionar los mutantes superproductores de ácido
citrico se siguieron las metodologías descritas por James y
col. <1956) y Rohr y col. (1979). Ambos métodos se basan en
el crecimiento de colonias, a partir de una espora de....a.:_
niger en un disco de papel de filtro impregnado con el medio
de selección.
En el caso del método descrito por James y col., las
colonias superproductoras de ácido citrico se detectan por la
producción de un halo de decoloración alrededor de la
colonia. Esta decoloración es el viraje del indicador
ácido-base presente en el medio-de selección. Por su parte,
en el método descrito por Rohr y col. la colonia
superproductora se detecta por la formación de un halo
coloreado alrededor de la colonia, producto de la reacción
del ácido citrico con el reactivo p-dimetil-amino-benzaldehi-
do.
En nuestro caso se utilizaron discos de papel filtro
Whatman # 1 con un diámetro de 120 mm. Los discos se
colocaron en cajas de Pétri y fueron esterilizadas a 120 C
durante 20 minutos a 15 PSI. Una vez enfriados se les agregó,
asépticamente, 12 ml de los medios de selección descritos
anteriormente en la parte de materiales.

\~U")
Para sembrar los discos de papel filtro impregnados con
los medios de selección, se utilizó una suspensión de esporas
de cada una de las colonias aisladas durante la mutagénesis.
También se utilizó como control una suspensión de esporas de

.3
la cepa parental, diluida hasta 2 x 10 esporas/mi. Los discos
fueron inoculados tocando ligeramente el papel con una
micropipeta que libera apro>:imadamente 1 microlitro de
muestra. La incubación se hizó a 30c9 C durante 6 días.
Se realizaron dos procesos de selección. El primero se
basó en el método descrito por James y col. <1956}. En este
caso se seleccionaron las colonias que produjeron un mayor
halo de acidez a su alrededor. En el segundo procéso se
utilizó el método de selección propuesto por Rohr y col.
( 1979). Las colonias seleccionadas an ter iormen te se
sometieron a un nuevo proceso de selección pero tomando en
cuenta tanto la facilidad de crecimiento en un medio con una
alta concentración de azúcar como la producción de un halo
coloreado alrededor de la colonia.
La capacidad de producción de ácido citrico, por las
diferentes colonias mutan tes analizadas, se determinó
dividiendo el diámetro del halo de acidez entre el diámetro
de la colonia. El valor obtenido se denominó unidad de acidez
<James y col., 1956).

(103)
La unidad de acidez se determinó para cada colonia. Las
colonias que dieron los más altos valores, respecto a la cepa
parental, fueron seleccionadas para ser utilizadas en los
experimentos siguientes.
B.4.- Caracterización de las colonias mutantes
Las colonias mutantes superproductol-as de ácido citrico,
se caracterizaron en cuanto a:
1.- Tiempo y grado de esporulación en los medios Agar-
Papa-De>~trosa, Agar Czapek · s Do>: y Agar de esporula-
ción.
2.- Tamafto de las esférulas formadas en el medio de ger-
minación.
3.- Producción de ácido citrico en cultivos a nivel de
fiola de 500 ml.
Para determinar el tiempo y el.grado de esporulación, se
tomó con un asa espal-as de las colonias mutantes mantenidas
en cajas de Agar-Papa-Dextrosa y se sembraron en cuhas de los
medios Agar-Papa-Dextr~sa, Agar Czapek's Dox y Agar de
esporulación. Se utilizaron 3 cuhas por cada medio Y· por cada
colonia. Las curtas fueron incubadas a 30 C. Diariamente se

(104)
hizó un examen de las cuhas sembradas con el fin de detectar
la presencia de esporas y el grado de esporulación~
A partir de las cajas de mantenimiento de las colonias
mutan tes, se preparaJ-on suspensiones de esporas lavando las
cajas con 10 ml de agua estéril. La concentración de esporas
en la· suspensión se ajustó a una concentración de 7 :x 10
esporas/mi diluyendo con .agua ·estéril. El n(tmero de esporas
se determinó por conteo en el hematocimetro de Neubauer
modificado <Andueza, 1986).
Se inocularon 10 ml de la suspensión de esporas en
f iolas de 256 ml conteniendo 100 ml del ;tredio de germinación
de Benuzzi. Las ff~las se incubaron durante 48 horas a 30 C
con agitación. Finalizado el tiempo de incubación se verificó
la capacidad de formación de esférulas, de cada una de las
colonias mutantes analizadas asi como su tamatlo.
Por último se determinó la capacidad de producción de
ácido citrico por cada una de las colonias mutantes y por la
cepa parental ATCC 11414, en el medio I, descrito en
Materiales y Métodos.
Fiolas de 250 ~1 conteniendo 50 ml del medio de
germinación, se inocularon con esporas de cada una de las
colonias analizadas. Los cultivos se incubaron a 30 C, con

( 105)
agitación, durante 48 horas.
Con las esférulas obtenidas se inocularon fiolas de 500
ml conteniendo 100 ml del medio de prbducción I y los
cultivos se incubaron a 30 C con agitación durante 4 dias.
Finalizado este tiempo se determinó el contenido de ácido
citrico y la cantidad de azúcar consumida segun los métodos
descritos anteriormente.
B.5.- Producción de ácido citrico por el mutante de A.
niger FAL 11414 A.3.0 ·en un fermentador de 10 li-
tros de capacidad conteniendo un medio de cultivo
con sacarosa de distinto grado de pureza~
Con el fin de estudiar la producción de ácido citrico
por parte de la cepa de A. niger FAL 11414 A.3.0 y ATCC
11414, en medios de diferentes fuentes conteniendo sacarosa;
se realizaron las siguientes experiencias:
B.5.1.- Preparación del inóculo.
Tanto en las experiencias doné:ie se utilizó la cepa FAL
11414 A.3.0 como en las que se utilizó la cepa ATCC 11414, se
partió de una suspensión de esporas obtenidas de cuhas de
Agar-Papa-Dextrosa de 10 dias de incubación. La suspensión de.
esporas se obtuvo lavando la cufia con dos porciones de 5 ml
de agua destilada estéril conteniendo Tween 80 al 0,1 %. La

( 106)
concentración de esporas se ajusto a 2 X 10 esporas/mi con
agua destilada estéril. El número de esporas se determinó por
el método del hematocimetro de Neubauer modificado.
El inóculo de la fermentación se preparó sembrando 100
ml de la suspensión de esporas en 900 ml del medio de
germinación de Benuzzi. El cultivo se incubó a 30 e con
agitación durante 48 horas. Finalizado el periodo de
incubación se recolectaron las esférulas formadas, se lavaron
'con agua destilada esté•-il y se transfirieron al fermentador
LKB.
B.5.2.- Producción de ácido citrico.
Todos los e>:per imen tos de produce ión de ácido e i tr ico se
realizaron en un fermentador U<B, esquematizado en la Figura
7. Se utilizó el mutante de A. niger FAL 11414 A.3.0,
obtenido en el presente trabajo y como control la cepa
parental ATCC 11414 de A. niger.
Se realizaron experiencias de fermentación con cada uno
de los medio de producción descritos en la parte de
materiales. Estos medios difieren entre si en cuanto al
origen y procesamiento de la sacarosa presente en los medios,
aunque todos contienen .sacarosa. Cada medio fue esterilizado,
dentro del fermentador LI<B, en un autoclave horizontal duran-

ll07J
te 30 minutos a 120 °C y a 15 PSI. Una vez enfriado el medio
hasta 30 °C se inoculó con esfé¡-ulas del hongo obtenidas
según la metodologia descrita en el aparte B.5.1.
La temperatura de la fermentación fue controlada y
manten ida constan te en 30 ° C. La ag i tac 1ón también se mantuvo
constante durante toda la experiencia a 750 rpm. El nivel de
la aereación del medio se reguló por medio de una v~lvula y
se mantuvo constante en 10 l de aire 1 minuto. El pH inicial
se ajustó manualmente. con t:1cido clorh:ldrico en 4;5 y no se
controlo durante .la fermentación. Cuando fue necesario se
eliminó la espuma con antiespumante comercial (marca DalcoJ.
Se tomaron muestras de 100 ml del cultivo cada 12 horas~
durante 6 dias. Cada muestra fue filtrada por succión a
traves de un papel vJhatman # 1 puesto en un filtro Buchner.
Con la parte sólida del filtrado se determinó tanto el peso
húmedo como el seco de la biomasa formada y con el
sobrenadante la cantidad producida de écido citrico, asi como
la del azúcar consumido segt~m los métodos desc¡-itos en el
apal- te B * 1 •
Con los datos obtenidos se consb-uye¡-on gr2,ficas,
cada uno de los medios de producción estudiados~ en las que
se relaciona la cantidad de écido citrico y el crecimiento
del cultivo con el tiempo de la fermentación.

ll08J
Como con·tro 1 se rea liz.:u-on las mismas e>:per ienc ias de
fet-men tac ión , bajo las mismas condiciones experimentales
utilizando la cepa parental de A. niger ATCC 11414.
B.6.- Efecto del metanol y el ferrocianuro de potasio
sobre la producción de ácido cítrico por A. niqer
FAL 11414 A.3.0.
Para estudiar este efecto, se realiza¡-on las siguientes
e >:per ienc ias:
B.6.1.- Preparación del inórulo.
Se realizó de acue¡-do con lo·desc¡-ito antel-iormente en
el aparte 8.5.1. Se utilizó como control la cepa ATCC 11414
mantenida en cu~as de Agar-Papa-Dextrosa.
8.6.2.- Producción de ácioo citrico en un medio de
cultivo suplementado con fPrrocianuro de potasio.
Se utilizó el medio I I y el fermentador LKB descritos
an ter iormen te.
El medio II esterilizado a 120°C y 15 PSI durante 20
minutos y en caliente se le ariadió fen-ocianuro de potasio a
una concentración de 0,8 g/1 D.' 1962 y Gardner,
1956). Una vez enfriado, el nH:>dio se inoculó con esférulas de

\J.U~J
A. niqe¡- FAL 11414 A.3.0, obtenidas según la metodolog:La
descrita en el aparte B.5.1.
La fermentación se realizó a 30°C, con una agitación de
750 rpm y con una velocidad de aereación de 10 1 de
aire/minuto. El pH inicial se ajustó a 4,5 con ~cido
clorh:Ldrico y no se mantuvo constante durante la experiencia.
Se tomaron muesb-as de 100 ml cada 12 hol-as dw-ante 6
dias. Una vez filtrad~s se procesaron d~ acuerdo con la
metodolog:La descrita ~n el aparte 8.5.2.
Los datos de producción de ácido citrico y de oiomasa se
gi~ficaron en función del iiempo.
B.6.3.- Producción de écioo citrico en un medio de
cultivo suplementado con metano!.
Durante esta experiencia se utilizó el medio II y el
fermentador LKB descritos previamente.
El medio fue estel-ilizado a 120.0 C y 15 PSI durante 20
minutos. Una vez frio, fue inoculado con esférulas de ~
niger FAL 11414 A.3.0 obtenidas de acuerdo a la metodologia
descrita en el aparte B.5.2. Al segundo día de la
fermentación el metano! se aRadió a una concentrdción del 3 %
(p/v) <Roukas, 1987).

\.l.WUJ
La fermentación se realizó durante 6 dias a 30 ° C con
una velocidad de agitación de 750 rpm y una velocidad de
aereación de 10 1 de aire/minuto. El pH se ajustó
inicialmente en 4,5 con ácido clorhid¡-ico y no se controlo
durante la experiencia.
Cada 12 horas se toma¡-on muestras de 100 ml. Cada
muestra .fue procesada de acuerdo a la metodología descrita en
el aparte B.5.2.
Con los datos obtenidos se construyeron gréficas de
produce ión de É1C ido e i tr ico y de incremento de biomasa en
función del tiempo.
B.6.4.- Producción de ácido cítrico en un medio de
¿ultivo suplementado can ferrocianuro de potasio y metanol.
Se utilizó el medio de producción II y el fermentador
LKB. El medio fue esterilizado a 1200 C y 15 PSI durante 20
minutos. Después de esterilizado se trató con ferrocianuro de
potasio de acuerdo a lo descrito en el aparte B.6.3. Una vez
enfriado a 30° e, el medio se inoculó con una suspensión de
esférulas de A. niger FAL 11414 A.3.0, obtenidas según lo
descrito en el aparte B.5.1.
La f.ermentación se realizó durante 6 dias a 30 ° C. La
velocidad de agitación se mantuvo constante en 750 rpm. Se

(111)
utilizó una tasa de aereación de 10 1 de aire/ minuto. El pH
inicial se ajustó a 4,5 con ~cido clorhidrico y no se
controlo durante la feJ-mentación. El metanol se af1adió a una
concentración del 3 %, al segundo dia de la fermentación
<Roukas, 1987) •
Muestr.as de 100 ml fuel-on tomadas cada 12 horas durante
6 dias y se procesaron de acuerdo con la metodologia descrita
en .el apaJ-te B.5.2. Al finalizar la fermentación y para
separar la masa fungica de la solucción acuosa se filtró.todo
el medio a través de un liencillo. El micelio se pesó y se
guardó en trio con el fin de utilizarlo en otra experiencia.
El sobrenadante fue sometido a un proceso de extracción para
aislar y precipitar el ácido citrico. La extracción se
realizó de acuerdo con la metodologia descJ-ita en el aparte
B.1.5.
Con los datos obtenidos se consb-uyeron gr~ficas de
producción de ~cido c:l.trico y de biomasa en función del
tiempo.
B.7.- Efecto del l-eciclaje de biomasa sobre la pro-
ducción de ácido citrico en un medio de cultivo
suplementado con ferrocianuro de potasio y metano!
En la presente experiencia se utilizó el medio de
produce ión 11 y e 1 fer.men tado1- LI<B dese¡- i tos an ter iDl-men te.
El medio de producción II fue esterilizado a 120 °C y a
15 PSI de presión durante 20 minutos. Después de la
esterilización el medio se trató según .lo descrito en el
aparte B.6.3. Una vez alcanzada la temperatura de 30 °C, el
medio se inoculó con 700 gramos de la biomasa fúngica
obtenida en la experiencia descrita en el aparte B.6.4.
La fermentación con reciclaje de biomasa se realizó a·
una temperatura constante de 30 °C. La agitación se mantuvo
en una velocidad constante c:te 750 rpm. Se utilizó una tasa de
aereación de 10 litros de aire/minuto. El pH inicial se
ajustó en 4.5 con ácido clorhidri~o y no se controló durante
el resto del proceso. Al segundo dia de la fermentación se
agregó metanol a una concentración final del 3 % (p/v).
Cuando fue necesario se eliminó la espuma con antiespumante
comer e ia 1 <ma.rca Da leo).
Muestras de 100 ml fuer.on tomadas cada 12 horas durante
6 dias y se procesaron de acuerdo a la metodologia descrita
en el aparte B.5.2.
Con los datos obtenidos se realizarón gráficas para
re.lac ionar la producción de ácido citrico y el incremento de
bioma~a en función ·del tiempo.

\ ..LJ. ::S)
C A P ! T U L O IV
A.- RESULTADOS Y DISCUSION.
A.t.- Obtención de un mutante superproductor de écido
citrico del hongo A. niger mediante mutagénesis con luz
ultravioleta.
En la figura 8 se muestra una curva de sobrevivencia
<Figura 8 >, expresada en% de sobrevivencia vs tiempo de
irradiación con luz U.V. Se puede observar que a los 20
minutos de irradiación con luz U.V. se obtiene un 3 % de
sobrevivencia y a los 25 minutos un valor cercano a cero. Por
otra par te, la forma y pendiente de la curva obten ida nos
indican que las esporas de A. niger muestran ·cierta
resistencia a la acción de la luz U.V. Por ell6 se requiere
de un tiempo de irradiación largo para alcanzar un porcentaje
de mortalidad del 99 %.
Investigadores como Gardner y col. (1956> y Sénchez y
col. (1969) reportan un Y. de mortalidad del 99.9% para
esporas de A. niger irradiadas con luz U.V. durante 15
minutos. La diferencia entre los valores obtenidos por
nosotros y los reportados en la bibliograf:(a pueden deberse a
a la utilización de cepas con distinto grado de resisten¿ia a
la luz U.V. Otra posibilidad es que las lamparas de U.V
tengan distinto poder energetizante o hayan sido colocadas a

t114)
F\GUF\A 8. CV~VA 0{; S09~G:V~V(;l\JCiA DE LA

CEPA DE fo. niger· ATc.C 11414 A LA ACC~ON
DE LA Ll)2_ VLTRAVIOtGTfL
2..6
2 - -- ----- ----------------1
e
é
1
u
i 1.6
a
8
1
m
}
1
)(
1
()
o.s L
0~----------------~~~~~-=~-~--~-~~
o 6 10 16 20 26 30 36
T~e'YY'lpo (hora.s.)
Las condiciones de la experiencia fueron: 5 ml de una sus-

pensi6n de esporas de A. niger ATCC 11414 (2 x 10 6 esp./ml) co-
locadas en una caja de Petri se irradiaron a una distancia de
12 cm con luz u.v. El experimento se realiz6 en la oscuridad, a
temperatura ambiente durante 30 minutos.
(115)
Figura 9. Esquema del procedimiento de mutagénesis para
la obtención de un mutante superproductor de
ácido citrico del hongo Aspergillus niger.
CuRas de la cepa de A. niqer esporulada de 4 dias de
incubación.
Lavado de las cur1as con 5 ml de agua es tér i 1 con O ,a %
de Tween 80.
Ajuste de la concentración de esporas en la suspensión a
2 >: to• esporas/mi, con agua estéril.
Irradiación de 5 ml de la suspensión de esporas con una
lampara de luz U.V. de onda corta, colocada ·a 12 cm de
la suspensión, durante 20 minutos.
Incubación de la suspensión de esporas irradiadas en la
la oscuridad y en frío durante 12 ho·ras.
Sembrado de la suspensión de esporas irradiadas e incu-
bación durante 6 dias a 30 C.
Según James y col., 1956 y Scherferl y col., 1986.

lll6)
distancias diferentes de la suspensión a irradiar.
En base a los resultados obtenidos se decidió escoger
para realizar la mutagénesis el tiempo de irradiación de 20
minutos, para el cual se obtiene un 3 %. de sobrevivencia. Se
ha reportado que un valor del 1 X de sobrevivencia es el
adecuado para la obtención de mutantes superproductores de
metabolitos <Calam, 1971 y Hopwood, 1971).
La obtención de los mutantes superproductores de écido
citrico se realizó itradiando una suspensión de esporas de la
cepa de A. niger ATCC 11414 con luz U~V. durante 20 minutos.
Del tratamiento mutagénico se aislaron 60 colonias.
Estas se ma.n tuvieron en fria en cajas y cuRas de

'
agar-papa-dextrosa hasta que se realizó la selección de los
mutantes superproductores de ácido citrico.
A.2.- Selección de cepas mutantes de A.niger superpro-
ductoras de ácido cítrico y resi~tentes a altas presiones
osmóticas v a altas concentraciones de iones metálicos.
Las colonias aisladas del ti-atamiento mutagénico fueron
sometidas a un proceso de selección que se esquematiza en la
figura 10.
(117)
FIGURA 10. Esquema del procedimiento seguido para la se-
lección de colonias mutantes de A. niger superproducto-
ras de ~cido cítrico.
Suspensión de esporas de cada una de las colonias mutan-

tes aisladas a una concentración de 2 >: 103 esporas/m}.
Siembra de los discos de papel filtro impregnados con el

medio de James modificado, con 1 ul de cada suspensión.
(azúcar morena con alto contenido de ,iones met~licos en
lugar de azúcar refinada con baja concentración de iones
Incubación de los discos durante 6 dias a 30 °C.
D.eterminación de las unidades de acidez de las colonias.
Selección de las colonias con mayores unidades de acidez
Preparación de suspensiones de esporas de las colonias

seleccionadas a una concentración de 2 x 10 3 esporas/mi.
Siembra con 1 ul de las suspensiones preparadas en dis -

cos de papel filtro impregnadas con el medio de Kubicek.
'
Incubación de los discos sembrados durante 6 dias a 30
Tratamiento de los discos con una soh.tcción de p-dimetil

amino-benzaldehido al 4 Y. en etanol.
Revelado de los discos tratados con p-dimetil-amino-ben-

aldehido en una estufa a 100 C durante 2 horas.
Determinación de las. unidades de acidez para cada colo-

nia examinada.
Según James y col., 1956 y Rohr y col., 1979

\ ...... v¡
Una vez preparadas las suspensiones de esporas de la
cepa parental y de cada una de las colonias a~sladas durante
la mutagénesis, se sembraron en el medio de selección de
James modif.icado por nosotros.
El método de selección de mutantes superproductores de
ácido citr.ico, propuesto por James y col. <1956>, se basa en
la producción de un halo de decoloración alrededor de la
colonia analizada. Este halo es producto de la reacción entre
el ácido citrico excretado por la colonia y el indicador de
acidez <azul de bromocresol> presente en el medio de James.
En nuestro caso- este medio se modificó· con el fin de
seleccionar, simultáneamente, las colonias superproductoras
·de ácido citrico y las resistentes a altas concentraciones de
iones metálicos. Esa modificación consistió en utilizar en
lugar de sacarosa refinada cpn un bajo contenido de iones
metálicos, sacarosa no refinada (azúcar morena) con un alto
contenido de iones metálicos.
La capacid~d de producciqn de ácido citrico por cada
una de las colonias se cuantificó calculando unidades de
acidez. Una unidad de acidez se define como el valor obtenido
de la división del diámetro del halo de decoloración entre el
diámetro de la colonia (James y col., 1956>.

(119)
Seleccionando los valores más altos de unidades de
acidez, en comparación con los obtenidos para la cepa
parental utilizada como control, se aislaron 4 colonias.
Estas colonias se denominaron A.l.O, A.2.0, A.3.0 y A.4.0 y
muestran valores de unidad de acidez de 6, 6, 10 y B,
respectivamente, <tabla 6)~
Rohr y col. ( 1979) han reportado que una de las
desventajas del método de selección propuesto por James y col
(1956>, es que no se puede asegurar que la formación del halo
de decoloración alrededor de la colonia se deba exclusivamen-
te a la excreción de ácido c:ítrico. En muchas ocasiones este
halo de es producto de la excreción de otros ácidos asi como
de la acción de ácidos minerales.presentes en el medio. Por
otra parte, Schreferl y col. <1989) han reportado que una de
las caracter1sticas de la cepas superproductoras de ácido
cítrico es su habilidad de crecer facilmente en medios con
una alta concentración de azúcar.
De acuerdo con esto decidimos someter a las colonias
mutantes, aisladas durante la primera selección a un segundo
proceso de selección. Para ello esta vez se utilizó un medio
con altos contenidos de azúcar y de iones metálicos, y se
empleó un método de selección más especifico para el ácido
ci tr ico.
\ l.i!U)
TABLA 6. Acidez producidd por colonias mutantes de
A. niger obtenidas durante el primer ciclo
de mutagenésis.
CEPAS METODO DE JAMES METODO DE ROHR

mutantP DC OH UA oc OH UA
Parental (mm) (mm) (mm) (mm>
A .1 .O 5 30 6 5 30 6,0
11414' 5 25 5 5 25 5,0
A.2.0 5 30 6 5 30' 6,0
11414 5 25 5 5 25 5,0
A.3.0 5 50 10 5 47 9,4
11414 5 25 5 .5 25 5,0
A.4.0 5 4(1 8 5 3? ?,4
11414 5 25 5 5 25 5,0
Las condiciones del experimento se describen en ~~
aparte B.3. En los dos métodos de selección utilizado» titt
mü1ieron loe.; dibmet,-os de lr1s colonias <DC), el di¿,metro del
halo dP. <:1cidP.: <nH> y la unid.~rf dP. acidez <UA>.

ll21)
El método de selección propuesto por Rohr y col. (1979)
se basa en la reacción del ácido citrico, existente en el
halo alrededor de la. colonia, con . el p-dimetil-
aminobenzaldehido .originandose una coloración púrpura. Al
igual que con el método de James y col <1956>, la capacidad
de producción de ácido citrico, por parte de las colonias
analizadas, se cuantifica en base al valor de las unidades de
acidez <U.A.>. Para este caso las U.A. se obtienen dividiendo
el diámetro del halo de coloración entre el diámetro de la
colonia.
De acuerdo con los resultados obtenidos, resumidos en la
tabla 6, se seleccionaron las colonias mutantes <A.3.0 y
A.4.0> que mostraron valores 1.88 y 1.48 veces superiores,
respectivamente, que los obtenidos por la cepa parental. Esto
indica que los mutantes producen más ácido citrico y que son
más capaces de crecer en medios con alto contenido de
azúcares y altas concentraciones de iones metálicos.
James y col. (1956) reportan para los mutantes
aisladas por ellos una producción de ácidez, 6 veces superior
a la de la cepa parental. De igual forma Rohr y col. (1979)
aislaron mutantes con una producción de acidez 3.5 veces
superior a la de la cep~· parental.
Vemos, según es"to , que 1os mu tan tes obten idos por no so
(122)
tras tienen una capacidad de producir ácido, inferior a los
reportados en la bibliografía. Es probable que ello se deba
al hecho de que en nuestras experiencias se utilizaron medios
de selección que poseian condiciones adversas para el
desarrollo de las colonias superproduc toras de ácido e i tr ico.
Tal es el caso de la utilización de sacarosa (azúcar morena>
con alto contenido de iones métalicos <Gardner y col., 1956;
Trumpy y col., 1963; Sánchez, A., 1969 y Sánchez, A., 1970).
Estos son inhibitorios de la producción de ácido cítrico
<Shu, P.,1947; Shu, P., 1948; Martín, S., 1952; Noguchi, Y.,
1961; Clark, D., 1962; Cla,-k, D., 1966 y l<isser, M., 1980).
Sin embargo es posible 1~ baja producción de acidez de las
colonias mutantes aisladas por nosotros, se vean compensadas
con una mayor resistencia a altas concentración de iones
metálicos presentes en los medios de producción.
Es importante aclarar que en los procesos de obtención
de mutantes superproductores de metabolitos no solo es
importan te obtener un mutante que sobreproduzca el
metabolito deseado; se requiere además, que e>:hiba otras
características que lo hagan apto para ser utilizado en
proceso industriales en los que se utilizan materias primas
con poco o ningun procesamiento.
Los mutan tes A • 1 • O , A • 2 •O , A •3 • O y A. 4 . O , obten idos
durante los dos procesos de selección antes mencionados~ se

sometieron nuevamente a un ciclo de mutagénesis con luz U.V.
El fin fue obtener un mutante con mayor capacidad para
producir ácido e i tr ico.
Despues de la mutagénesis se seleccionaron 4 colonias
denominadas A.l.l, A.2.1, A.3.1 y A.4.1. Las características
de estos mutantes en cuanto a la capacidad de producir acidez
y al diámetro de los halos de decoloración y colorimetricos,
se resúmen en la tabla 7.
De entre esas colonias mutantes solo la A.~.l aumentó la
capacidad de producir acidez en comparación con la cepa
paren ta 1 A. 4. O. E 1 aumento e xper imen tado fue de 1 . 25 veces.
La colonia mutante A.l.l mantuvo el valor de la unidad de
acidez de su cepa parental A.l.O. Para las colonias A.2.1 y
A.3.1 fue imposible medir las unidades de acidez puesto que
perdieron su capacidad de esporular.
En resúmen, se logró .seleccionar 6 colonias mutan tes
superproductoras de ácido citrico. Las colonias A.l.O, A.2.0,
A.3.0, A.4.0, A.l.l y A.4.1. Todas ellas se utilizarón en las
siguientes experiencias.
A.3.-Caracterización de las colonias mutantes super-
productoras de ácido·citrico.
Se utilizaron los mutantes de B..::_ni~.L superproductor'as

(124)
TABLA 7. Producción de ~cidez por las colonias mu-
tantes de A. niger obtenidas despues del
segundo ciclo de mutagénesis.
METODO DE JAMES METODO DE ROHR
e E P A S De DH UA De DH UA
Mu t/Paren t. <mm) <mm) (mm) (mm)
A .1 .1 5 30 6 5 25 5,0
A.1.0 5 30 6 5 30 6,0
A.2 .1
A.2.0 5 30 6 5 30 6,0
A.3.1
A.3.0 5 50 10 5 47 9,4
A .4 .1 5 50 10 5 47 9,4
A.4.0 5 40 8 5 37 7,4
11414 5 25 5 5 25
Las condiciones de 1 e>~per imen to se describen en e1
·aparte B.3. En los dos métodos de selección utilizados se
midieron los diélmeb-os de las colonias me>' el di~metro del
halo de acidez <DH> y la unidad de acidez <UA>.

(125)
de ácido citrico y resistentes a altas presiones osmóticas .Y
a altas concentraciones de iones met~licos.
El objetivo que se pel-sigió con este estudio fue, por un
lado, caracterizar a las colonias mutantes fenotípicamente.
Y, por el otro, detel-minar cual de las colonias mutantes
muestran mayores ventajas en cuanto a los parámetros
estudiados •
El estucjio incluyó
1.- Determinación del tiempo y grado de esporulación de
cada una de las colonias seleccionadas en los medios
agar-papa-dextrosa, agar Czapek's Dox y agar de
esporulación.
2.- Medida del tama~o de las esférulas formadas en el·
medio de germinación.
3.- Cuantificación de la producción de ácido cítrico en
cultivos en fiolas.
Se determinó el grado y el tiempo de esporulación de
cada una de las cepas mutantes seleccionadas utilizandose 3
tipos 3 tipos de medios de esporulación~ que difieren entre
si, por los contenidos de azúcar y de fuente nitrogenada.

(126)
Los resu 1 tados de estas exper ienc.ias se resúmen en la
tabla B. Su analisis indica que existen diferencias en el
grado y el tiempo de esporulación de las ~epas mutantes en
comparación con la cepa parental. Estas diferencias se
observaron con todos los medios de esporulación utilizados.
El grado de esporulación, se define como el % de la
superficie de las colonias que se encuentran cubierta por
esporas. Tanto la cepa A.2.1 como la A.3.1, obtenidas luego
de dos ciclos de irradiación con luz U.V., perdieron la
capacidad de esporular. Esta característica se mantuvo en
todos los medios analizados. Pareciera que durante la
segunda mútagénesis fueron afectados drasticamente los genes
responsables de la esporulación. El resultado fué la perdida
total de esta característica. Es de hacer notar que las
colonias de estas dos cepas se desarrollan de una manera
restringida aunque no fueron capaces de esporular durante 12
días de observación. Tampoco esporularon en los sucesivos
repiques que se hicieron en Agar-Papa-Dextrosa.
Hannan, M. <1975>, aisló mutan tes de A. niger
defectuosos en la esporulación. Estos mutantes· fueron
obtenidos despues del tratamiento de las esporas con
radiaciones gamma y muestran características similares a las
observadas en nuestras cepas A.2.1 y A.3.1 luego de 2 ciclos
de mutagénesis con luz U.V. Gardner y col. (1956), también

¡' •. ' ,,
rulación de las colonias mutantes de

',
A. niger. ..)-
" .
CEPAS GRADO DE ESPORULACION TIEMPO DE ESPORULACION

APD ACD ADE APD ACD ADE
A.1 .o +++ +++ +++ 7 7 7 ,., \
•,·
A.2.0 ++ ++ ++ 4 4 4
A.3.0 +++ +++ +++ 5 7 5 .··~ ,_' { .

. ¡~¡ "(
·'·
A.4.0 ++++ ++++ ++++ ó B 7 ,,
A.1 .1 ++ + ++ B 10 7 ,.
• • ' ' • ~ :'<
A.2.1 '·?·~~·.~ : ',
~~~?~(
A.3.1
~-4 .1 ++ ++ ++ 9 10 9
>, •• ,
11414 ++++ ++++ ++++ 3 3 3 '
,, .' '
) .}
Las condiciones de la experiencia se describen en ~l ~:;·

' •,, ~::;·~ .: ;: .
a par te B. 4 de Materia 1es y Métodos • Los medios u ti 1 i zado• , . ~:.· ')<";: · '
" ' ~
•,•,' r , , .\''
" .
fueron: Medio agar-papa-dextrosa <APD>, medio Czapek•s
CACO> y medio de esporulación <ADE>. Se utilizaron lo• '',
siguientes simbolos para indicar el grado de esporulación; ( \ ~ '
++++ un 100 Y., +++ 75 %, '++ 50 Y. de, y + < de 25 %.

(128)
reporta la obtención de cepas mutantes de A. niger con estas
mismas características.
De las cepas restantes solo la A.4.0 mantuvo un grado de
esporulación similar al observado con la cepa parental.
Es evi~ente que las cepas mutantes obtenidas por naso -
tras son fácilmente distinguibles de la cepa parental
utilizada como control por el restringido desarrollo de sus
colonias y por su falta de esporulación.
Las cepas mutantes en estudio fueron sembradas en cajas
de Petri al mismo tiempo en cada uno de los medios
utilizados. Se observó que la esporulación se presenta en
diferentes tiempos. A los 3 dias aparecieron las esporas de
la cepa parental cubriendo toda la superficie de la placa en
cada uno de los medios utilizados. En segundo lugar se vió la
esporulación de la cepa A.2.0 que a los cuatro dias solo
mostraba esporulación en la mitad de la superficie de las
colonias. Despues, a los cinco dias de incubación, la cepa
A.3.0 mostró una esporulación en 3/4 de la superficie de la
colonia. Seguidamente apareció la cepa A.4.0, con una
esporulación total, aunque tardia, en toda la superficie de
la colonia. Luego se observaron esporas en la superficie de
las colonias de las cepas A.l.O, A.l.l y A.4.1, aunque en
diversos g¡-ados de e>:tension. Finalmente, las cepas A.2.1 y
A.3.1 no mostraron esporulación en el tiempo analizado.

(129}
Es importante destacar el hecho de que el tiempo de
esporulación, pór lo general, fue más corto en los medios con
una a 1 ta caneen trae ión de azúcar <Medio agar-papa-de>:trosa y
medio de esporulación de Sánchez, 1970>, que en un medio con
bajo contenido de azúcar <Medio Czapeck"Dox>. Esto es
par tic u larmen te interesante ya que confirma nuestros
resultados anteriores en el sentido de que estos mutantes,
además de producir mayor cantidad de ácido cítrico en cajas
de Petri, son resistentes a altas presiones osmóticas. Se ha
reportado que las cepas de baja produce ión de ácido e i tr ico
se caracterizan por una disminución en su capacidad de
germinar y crecer en medios con altas concentraciones de
azúcar <Xu, D., 1989 y Schreferl y col., 1 989 ) • De esta
manera el hecho de que la mayoría de las colonias mutantes
estudiadas por nosotros crezcan más rápido en un medio con
alta que con baja concentración de azúcar, nos permite
concluir que es tamos en presencia de cepas superproduc toras
de ácido citríco.
Se ha reportado que la producción de ácido citrico por
cultivos sumergidos de A. niger requiere de una forma
especial de morfología del hongo. Es necesario que crezca en
forma de esférulas llamadas "Pellets" para que se obtenga una
buena producción de ácido cítrico. Estas esférulas deben de
ser de un diámetro pequef,o ya que así se incrementa la
relación superficie-volúmen aumentando de esta manera la

(130)
producción final del 'cido <Karow, E.~ 1947; Haritsu y col.,
1966; Clark y col., 1966; Das, A., 1969; t<ubicek y col.,
1977; Kirk-Othmer, 1979; Kisser y col., 1980; Abou-Zeid y
col., 1984; Kubiceck, c., 1986; Benuzzi y col., 1986;
Eikmeier, M., 1987 y Benuzzi y col •. , 1989>.
Nosotros tratamos de' establecer el tamaf,o y las
carac ter :í s tic as de las esférulas formadas por nuestras
mutantes de A. niger en un medio de germinación. El an~lisis
de los resultados resumidos en la tabla 9 muestran que las
esférulas tienen diámetros menm-es que los de la cepa
parental. As:í, estos mutantes adem~s de tener restringido su
mecanismo de esporulación también tiene afectada la capacidad
de-formación de esférulas.
Las esférulas obtenidas de las distintas cepas
analizadas muestran las siguientes ca¡-acter:ísticas: Las de la
cepa A .3 .O fueron las de menor tamaF1o ( 1 mm) en comparación
con las de la cepa parental <8 mm>. Las de las otras cepas
resultaron de mayor tamaño que las de esta cepa pero siempre
mucho menor que las de la cepa parental. Estos resultados son
similares a los reportados por otros autores aunque nuestros
valores para el diámetro de las esférulas son menores <Horit-
su y col., 1966; Clark y col., 1966 y Benuzzi y col., 1986).
Otro aspecto importante relacionado con la producción de
esférulas tiene que ver con la cantidad formada por cada una
(131)
TABLA 9. TamaRo de las esferulas y producción de
ácido cítrico por colonias de A. niger.
TAMA~10 DE LAS PRODUCCION DE RENDIMIENTO
ESFERULAS ACIDO CITRICO (Y.}
<mm) (q 11)
C E P A S
A.1.0 3 22 18
A.2.0 4 17 14
A.3.0 1 46 35
A.4.0 2 30 23
A .1 .1 6 12 8,8
A.2.1
A.3 .1
A.4.1 2 1 0,8
11414 <parental> 6 15 12
Las condiciones de las experiencias se describen en el
aparte B.4 de materiales y métodos. El rendimiento de la
fermentación se calculó dividiendo la cantidad de ácido
cfb-ico producido durante la fermentación entre la cantidad
de azúcar consumido durante la fermentación. De esta manera
el rendimiento queda definido como la cantidad de ácido
producido respecto al azúcar consumido.

(132)
de las cepas estudiadas~ a pesar de que se utilizó una
concentración igual de esporas durante la incubación de cada
cepa en el medio de germinación.
La cepa A.3.0 no obstante de producir las esférulas de
menor tamaho fue la que las produjo en mayor número. Ello
puede deberse a una falla en el proceso de formación o
compactación de las esférulas. Investigadores como Benuzzi y
col. (1989> han reportado resultados similares.
Siguiendo la car-acterización de las cepas mutantes, se
estudió su producción de ácido citrico en el medio de
producción I conteniendo azúcar refinada <azúcar blanca>. Los
resultados de estas experiencias se resúmen en la tabla 9.
Se puede observar que la cepa A.3.0 fue la mutante que
produjo mayor cantidad de ácido citrico <46 g de ácido
citrico/1), con ella también se obtuvo el mejor rendimiento
definido como la cantidad de ácido producido respecto al
azúcar consumida <35 %>. Esta cepa fue capaz de producir 46 g

de ácido citrico/1 en contra de 15 g/1 obtenido para la cepa
parental. Se logro, asi, obtener un aumento de 3 veces en la
producción de ácido citrico en comparación con la cepa
salvaje. Las otras ~epas mutantes también exhibieron un
aumento en la producción aunque menor que la cepa A.3.0.
Solo las cepas A.l.l y A.4.1, provenientes de una doble

(133)
mutagénesis, mostraron una disminución en la producción del
ácido.
De nuestros resultados se desprende que las radiaciones
con luz U .V., aplicadas por 2da vez sobre mutantes
preseleccionados, no originaron cepas más activas. Por el
centrar io, originaron cepas menos productivas y con
incapacidad de germinar en medios con alto contenido de
azócar. Estos resultados difieren de los de Gardner y col.
(1956>, quienes reportaron que sucesivas mutaciones con luz
U.V. resultan en un incremento progresivo en la producción de
ácido cítrico por parte de cepas de A. niger. Creemos que
esta falta de productividad luego de 2 ciclos de mutagénesis
se debe al hecho de que el tratamiento fue muy severo y que,
posiblemente, se obtuvieron mutaciones que afectaron algunas
de las enzimas principales del sistema de producción de ácido
cítrico. Sin embargo, los resultados obtenidos con los
mutantes seleccionados durante el primer ciclo de mutagénesis
son semejantes, aunque inferiores, a los reportados en la
bibliografía <Gardner, J. y col., 1956; James, J., 1956;
Millis y col., 1963; Das, A., 1969; Sénchez, A., 1969;
Imshenetsku, A., 1966; Harnan y col., 1975; Islam, C., 1984;
Benuzzi y col., 1989 y Schreferl y col., 1989). En todos los
casos nuestros mutan tes producen más ~~c ido e i tr ico que la
cepa parental.
(134)
De acuerdo con los resultados presentados, decidimos
escojer a la cepa mutante A.3.0 para la realización de las
pruebas de optimización de la producción de écido cítrico.
Estas pruebas seran realizadas a nivel de fermentador de 10
litros de capacidad en medios con distintos tipos de sacarosa
y con la adición de diferentes estimulantes de la fermen-
tación. Nos proponemos estudiar en que medida las condiciones
de fermentación pueden potenciar o reducir las
características genéticas de una cepa superproductora de
ácido e í tr ico.
B.4.- Producción de é1cido c:(b-ico por el mutante FAL
11414 A.3.0 en medios conteniendo sacarosa con diferentes
grados de pureza.
Se ha reportado que altas concentraciones de los iones
metálicos, como hierro, zinc, magnesio y manganeso, presentes
en medios utilizados para la producción de ácido cítrico,
inhiben la fermentación cítrica. (Quilico, A., 1932; Perlman,
D., 1946; Shu, P., 1948; Tomlinson, N., 1950; Tomlinson, N.,
1951; Gardner y col., 1956; James, L., 1956; Naguchi, Y.,
1961; Prescott, S., 1962; Clark y col., 1966; Choudhary, Q.,
1966; Patarau, M., 1969; Sénchez, A., 1970; Kirk-Othmer,
1979; Peppler, H., 1979; Singh y col., 1981; Williams, R.,
1982; Kundu y col., 1984; Druri, M., 1987; Rankas, I., 1987 y
Gome z , R • , 1 988 > •

(135)
De entre estos iones metálicos, el que parece tener
mayor influencia en la regulación de la producción del ácido
citrico es el manganeso <Clark y col., 1966; Kubicek, C.,
1979; Orthofer, R., 1979; Ma, H., 1985 y Meixner, O., 1985>.
La mayoría de los procesos empleados en la producción
industrial del ácido citrico utilizan materias primas con un
alto contenido de iones metálicos. En estos casos se necesita
pretratar los sustratos, con el consiguiente incremento en
los costos de producción.
Dentro de esas materias primas se incluyen sustratos
ricos en sacarosa tales como las melazas de caRa de azúcar y
de remolacha, desechos vegetales y sacarosa no refinada
<Gardner y col., 1956; Peppler, H., 1979 y Benuzzi, D.,
1989). Se ha demostrado que la sacarosa y la maltosa son
mejores fuentes de carbono para la producción de ácido
e i tr ico <Xu , D. , 1989 > •
De acuerdo con esto nuestro siguiente objetivo fue
cuantificar la produce ión de ácido e i tr ico por par te de 1
mutante de A. niger FAl 11414 A.3.0 crecido en medios con
sacarosa de diferentes grados de pureza.
Se estudio, en primer lugar, la producción de ácido
e i trico y la formación de biomasa por la cepa ATCC 11414
utilizada como control, en los medios de produce .ión I , ! I '·y

(136)
III que difieren entre si en el grado de pureza de la
sacarosa presente. El medio I, utiliza como fuente de carbono
sacarosa refinada <Azúcar blanca, grado comercial>, el medio
II, sacarosa no refinada <Az~car morena, grado comercial> y
el medio III, melaza de caRa de azúcar.
Los resultados obtenidos durante estas experiencias se
muestran en las figuras 11, 12 y 13. La cepa parental ATCC
11414 crece mejor en el medio I con azúcar blanca como fuente
de carbono, aunque la producción de ácido citrico es menor en
este medio, respecto a los otros medios empleados. Se obtuvo
73 g de peso húmedo de biomasa/1 y una producción de écido
c"!trico de 53 g/1 <Fig. 11).
En el medio II, cuya fuente de carbono es azúcar morena,
se obtuvo 57,4 g de peso húmedo de biomasa/1 y 48,5 g/1 de
ácido citrico <Fig. 12). En comparación con el medio I la
disminución en la cantidad de biomasa producida fue de 22 % y
la producción del ácido es 9 % inferior. Ambas diferencias
pueden deberse la presencia de sustancias inhibitorias en el
azúcar morena. Diversos investigadores han reportado que los
sustratos no refinados, como seria el caso del azúcar morena~
poseen una alta concentración de iones inorgénicos asi como
de impurezas orgénicas que inhiben tanto la producción de
ácido citrico como la de biomasa, en el caso de A. niger
<Gardner y col., 1956; Clark y col., 1966; Sánchez, A., 1970;

(137)
FIGURA 11. PRODUCCION DE ACIDO CITRICO Y

DE BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger ATCC
11414 CRECIDA EN EL MEDIO l.
80.-------------------------------------~
60 - .........................
g
1 40 . . . .
1
20 -·
40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (h)
+ BIOMASA • ACIDO CITRICO
Las condiciones de la fermentaci6n fueron: Concentraci6n de

azúcar 14 %, temperatura 30 °c, velocidad de agitaci6n 750 rpm,
velocidad de aereaci6n 10 litros de aire/minuto y pH 4,5.
(138)

DE BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger ATCC
11414 CRECIDA EN MEDIO 11
60.-------------------------------------~
50
4 o -..,. . . . . . . -. . . . . . . '·• . . . . . . . . . . . . . . . . ,. .,. . . . . . . . . . -.. -· . . . . . . . -._. ,. . . . . .
~ 30 ,...
1
10 -
o----~---~-----~---~-----~
o 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo· (h)
+ BIOMASA • AG:IIDO CITRICO

az~car 14 %, temperat~a 30 °C, velocidad de agitaci6n 750 rpm
velocidad de aereaci6n 10 litros de aire/minuto y pH 4,5
(139)

DE BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger FAL A
3.0 EN EL MEDIO 111
80.-----------------------------------~
6o ·-· · · .-· -·-· ·-· · · · -· · · ·- · · · · · ·- · . . . . . . . . . . . .·-· ·-· . . · · · - · · · · · -· · · · · · · · · ·- ·- · · - -·· ·-·--·· · · -· -· · · ·-· -·-· -·--·· ---·. · ·- -· -· · -· . · ·- · · - · · · · · ·
~ 40
1
20-
20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (h)
Las condiciones de la fermentación fueron Concentración de

az~car 14 %, temperatura 30 °c, velocidad de agitación 750 rpm,
(140)
1 kena ~ Y.~ 1975; Gupta y cal., 1976; Hassain~ M., 1984 y
Kundu y col., 1984>.
En relación con el medio III, que posee sacarosa de un
grado de pureza muy inferior al de los otros medios, la
producción de biomasa, medida cama peso húmedo, fue de 70 g/1
y la de ácido citrica de 11.2 g/1 <Fig. 13).
La producción de biomasa en los medias I (fig. 11) y III

(f ig. 13) es similar. No ocurre asi con la producción del
ácido cib-ico que disminuye drásticamente en un 79 Y..
Compárandolo con el medio II se observa que en el medio III
hubo un aumento en la producción de biomasa del 20 % y en la
··producción de ácido citrico se observa una disminución del 77
% •
Estos resultados son comprensibles si se tiene en cuenta
que la melaza de cafia de azúcar es un medio rico, con una
gran cantidad de sustancias orgánicas que pueden ser
asimiladas y propiciar el crecimiento de una gran cantidad. de·
microorganismo incluyendo a los hongos <Sánchez, J.A., 1984 y
Andueza, F., 1986.). En cuanto a la producción de ácido
citrico diversos investigadores han reportado lo inadecuado
de utilizar sustratos como la melaza de caNa de azúcar para
la producción de ácido citrico debido a la presencia en altas
concentraciones de sustancias orgánicas e inorgánicas que
inhiben la producción del ácido <Perlman, D., 1946; Mallea,

(141)
O., 1950; Gardner y col., 1956; Prescott, S., 1962; Sénchez,
A., 1964; Clark y col., 1966; Singh, V., 1981; Panda y col.,
1984; Islam, M., 1986 y Druri, M., 1987).
Podemos concluir que la cepa parental de A. niger ATCC
11414 crece mejor y produce una mayor cantidad de écido
cítrico, en el medio I <Azúcar blanca).
Estudiamos también la producción de biomasa y écido
cítrico por la cepa mutante de A. niger, FAL 11414 A.3.0, en
los mismos medios.
En la figura 14 se muestran los resultados obtenidos. Se
puede observar que.la producción de biomasa, en peso húmedo
fue de 56 g/1 y la de ácido cítrico de 60 g/1. En comparación
con la cepa parental en este mismo medio <Fig. 11>, hubo una
disminución en la ca del 30 % en la producción de biomasa y
un aumento del 13% en la cantidad de écido c:!trico.
Pareciera, asi, que la disminución en la producción de
biomasa es compensada con un aumento en la producción del
ácido. Estos resultados estén de acuerdo con los que
obtuvimos a nivel de cajas de Petri <aparte A.3 de este
capitulo>. En este caso· las limitaciones en el crecimiento no
se pueden atribuir a la presencia de sustancias inhibitorias
en el sustrato ya que se trata de un medio que contiene
azúcar refinada.
(142)

BIOMASA POR LA CEPA MUTANTE FAL 11414 A
3.0 CRECIDA EN MEDIO l.
70~--------------------------------------~
60
+,~
50 -----------------------------------4-----
40-
g
1
1
30-
20 -
10 --
20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (h)
+ BIOHASA • ACIOO CITRICO
Las condiciones de la fermentación fueron: concentración de

velocidad de aereación 10 litros de aire/minuto y pH 4,5.
(143)
En la figura 15 se muestran los resultados obtenidos
para el crecimiento de la cepa mutante en el medio I I . La
producción de biomasa,·medida como peso hómedo, fue de 48 g/1
y la de ácido cítrico de 83, 4 g/1. Si comparamos estos
resultados con los obtenidos para la cepa parental en este
mismo medio <Fig. 12>, observamos que la formación de biomasa
disminuyó en un 11.5% mientras que la producción de ácido
cítrico se incrementó en un 58 %. Estos resultados parecen
indicar que estamos en presencia de un mutante que ha logrado
eludir algunos mecanismos de inhibición o represión • Estos
mecanismos estarian presentes en la cepa parental haciendo
que se produjera una menar cantidad de écida citrico en
medios con sacarosa no refinada.
Es importante destacar el hecho de que el mutante sigue
mostrando una restricción en su crecimiento, tal como se vió
en las experiencias en cajas de Petri, pero produce una mayor
cantidad de écido. Este resultado implicaría que existe un
desequilibrio en el metabolismo en el mutante' que seria
causante de la restricción en la proliferación de las células
De esta manera se desvia el flujo de compuestos carbonados,
destinados al crecimiento, hacia la producción del écido
e 1 tr ico.
Al comparar la producción de écido citrico por la cepa
mutante en el medio II (sacarosa no refinada), con la de la

(144)

DE BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger FAL
A.3.0 CRECIDA EN MEDIO 11.
100.-----------------------------------~
8o ·-··········--···-·······----·--·-··········-···-·--·-····------------·----···----·-······-······--·----·------·--------------·---·-·---···--····· ----
6o . . . . . . . . . . ·---· . . . . . . . . . . . ,.,. · -· · · · · -· · · · · ·-· · . . . . . . . . . . . . . . . . . . · ·- . . . . . . . . . . . . . . . __. . . . . . . . . . . . . . -.. . . · -· · · · · --·-· · · --·· -·. -·. ·-· -· - ·
g
1
1
40 •• , -• - • oü ••• •••• -•"''''''••••>•••-·••-• o-•, •• o >••••-• •••··-••••-••>>«•-·•• •• -••••• '" _, •-" -•••·-- • , - ''''''''' "''" -•• -• ,,,..,,,_._,_ ••-•••on•••-••••••~·• "' ,.,,,,,,_... _,_, _ _ ,,,,,,,,_,
20
~-~=r+-r.--,.
_¿_.¡-+--- ¡L---+--+....---.1r---T
o~~-~----~--~----~--~----~--~--~
o 20 40 60 80 100 120 140 160

TiempÓ (h}
+ BIOMASA /. ACIDO CITRICO

az~car 14 %, temperatur~ 30 °c, velocidad de agitaci6n 750 rpm,
(145)
cepa parental en el medio I (azócar refinada>, pcidemos
observar que la producción de écido cítrico es 38 X menor en
el cultivo crecido en el medio I. Ello a pesar de que la cepa
parental crece en un medio <medio I> sin inhibidores como es
el caso del azócar refinada y ademés libre de iones
metélicos.
La existencia de estos iones en el medio II estaría
indicando que para poderse lograr una buena producción de
écido cítrico es necesaria su presencia en cierta cantidad.
También podría interpretarse como una mayor resistencia de la
cepa mutante a altas concentraciones de iones metélicos. Este
resultado es interesante pues se ha reportado que cepas de ~
niqer son sensibles a estoa iones CGardner y col., 1956;
Clark y col., 1966; Sénchez, A., 1970; Gupta y col., 1976 y
Sandu, S. , 1984 ) •
Los resultados del estudio de la producción de biomasa y
de écido cítrico por la mutante FAL 11414 A.3.0 en medio III
<Melaza de caRa de azúcar) se muestran en la figura 16.
Se puede observar que la mutante produjo en este medio
81 g de biomasa/1 y 17.6 g de écido cítrico/l. Comparando
estos resultados con los de la

. cepa parental en el mismo
medio <Fig. 13) podemos ap,-eciar que se incrementa tanto en
la producción de biomasa corno en la producción de ácido. El

(146)

DE BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger FAL
A.3.0 CRECIDA EN MEDIO 111.
100~------------------------------------~
8o . . . . . . . . . . . . . · ---------·-· · ·-· · · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .--.. . . . . . . . . . . . . . ____ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-.. .-.. . ._. . . . . ._. --.. .-~
/+
60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . -.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ._. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . _. . . . . . . _. . . . . .__. . ..

g
1
1
40 --- . . . . . . . . . .. .. . - · . ..... . .. . . 7 . . . . . . . . . _. . . . . ____.,__. . . ___,_____
20 - - - - ----¿ ____ ------------ - - /V

/
/
y/
/ . -/
.__..-t..::"'---· +............ . . r ------------ ------------- .

o~--~--~-~-~---~----L----~--~----J_--~----~
o 20 40 60 80 100 120 140 160

tiempo (h)
Las condiciones de la fermentación fueron: Concentración de

azúcar 14 %, temperatura 30 °c, velocidad de agitación 750 rpm,
velocidad de aereación 10 litros de aire/minuto y pH 4,5.
(147)
aumento en la producción de biomasa fue de 12.5 % y en la de
ácido citrico de 57 r.. Estos resultados ponen en evidencia
que la cepa mutante es más resistente que la cepa parental a
altas concentraciones de sustancias inhibitorias de la
fermentación cftrica. Esto en razón de que se sabe que
sustratos como la melaza de caña de azúcar presentan una alta
caneen tr ación de tales sustancias <Ma llea, O., 1950;
Prescott, S., 1962; Sánchez, A., 1964; Singh, V., 1981; Panda
y col., 1984; Islam, M. , 1986 y Drur i, M. , 1987 > • En todo
caso hay que tener en cuenta que no hay dos melazas iguales
<Stmchez, J., 1984).
Es evidente que la cepa mutante, aún en presencia de
medios con altas concentraciones de sustancias inhibitorias
<medio III>, supera la producción de biomasa de la cepa
parental crecida en medios sin ningún tipo de sustancias
inhibitorias <medio I>. Sin embargo, en lo que respecta a la
produce ión de ácido e f b- ico si se observa que en e 1 medio I I I
existen sustancias que inhiben el proceso de producción de
ácido significativamente (67 % de disminución respecto a la
producción obtenida por la cepa parental en el medio I>.
Comparando la producción de biomasa y de ácido cítrico
por la cepa mutante en los medios II <Fig. 15> y medio III
<Fig. 16), podemos ver que en lo que respecta a la producción
de biomasa, el medio III resulta mejol- para el crecimiento

(148)
(81 g/1 de biomasa) que el medio II <48 g/1 de biomasa}. Se
observa un aumento en la producción de biomasa en el medio
III respecto al medio II de un 68.5 %. En el caso del ácido
cítrico la producción fue mayor en el medio II (83 g/1) que
en el medio III < 17.6 gil>, se observa que en el medio III
se tiene una disminución del 74 % en la producción de ácido
cítrico respecto a la obtenida con el medio I I .
Estos resultados confirman por un lado, lo reportado por
diversos autores en cuanto a lo inadecuado de utilizar la
melaza de caRa de azúcar sin un pretratamiento para la
producción de ácido cítrico. Ello debido a la presencia de
altas concentraciones se sustancias inhibitorias de la
fermentación cítrica y, por el otro, abren la posibilidad de
utilizar un substrato menos procesado y de un menor valor
monetario, como lo es el azúcar morena que, además, posee
iones metálicos, para la producción industrial de ácido
cítrico. Desde un punto de vista industrial este hecho
serviría para reducir los costos de producción de ácido
e í tr ico.
Como consecuencia de lo expuesto, se decidió utilizar el
medio II (azúcar morena) para realizar las experiencias de
óptimización de la producción de ácido cítrico por el mutante
FAL 11414 A.3.0.

(149)
e: • '.':.: • ..... r~~.c.~~;;¡.:;!_,_,l_~;,~_~,::. . L(UJ......cLf!:::.. ..... <i~~;:. . tU_;}.... .c.~:. )_:!::.~::)._!;.~__cL ...... J:~f_:¡_c_ __________g __t ...........rnJ,_\ _ :t:/:iD...ot~.f~~----·--f .G.L:.
1..1. :::VJ!}_____________ ft~:. ;:L.::...Q__________ ~::~n_________t:. L ___ in.t.;~:;J._;~s:,'_.........:r. .~;__ j_..__ J~L. ~i~..i.:.:~~~--r)g ___s;_stc!. . . .-.. .f:'.5::.\5:.J,.<==!.!!..s~ . :i.,si~~-
§ .. ~!!~_t.:i.rT!.UJ...E~.!.L:LS:~.~~: .._..t:i.f::'.... .J. :~!._ .. fi?!!L..f.i.i~:~:l!...JJ=!_i;_;___l,. r2!.)........ ~::. .. 1:..:1~l_::.).~:;,_~i\ ..
Diversos autores han r·~portado el efecto· benéfico que
tiene sobre la fermentación cítrica la adición de sustancias
estimulante como el fe~ricianuro de potasio y el metano]
p. , 1 e;; 1 r; :; !-: 1946; Mover, J., 1953;
r·L, C'lc:~i'" k :• 1.962;
F't.H;mte y c:c:•.l.:, 19óí.:~.'; ~1ánc:!··,¡:,:.:;;:,, ?-~ •.• t<}f.:J+;; CJc:trk y c:::CJl .. ,, l96b;
Choudhary, O., 1966; Horitsu y col .• 1966 y Roukas y col.,
j_ 9E37) •
p]
sobre la producción del écido cftrico.
~n la figura 17 se muestran los resultados obtenidos
durante la fermentación del medio II tratado con ferrocianuro
de potasio a una concentración de 0.8 g/1.
Un anblisis de esos resultado~ permite ver CIU€-' COn

J.'"
adición de ferrocianuro de potasio se logra producir 39 g de
peso húmedo de biomasa/1 y una producción de bcido cítrico de
8B , t.¡ <J / 1 • Comparando estos resultados con los obtenidos en
este mismo medio pero sin la adici.ón de ferrocianuro (Fig.

( 150)

BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger FAL A3.0
CRECIDA EN MEDIO 11 CON FERRICIANURO.
100~-----------------------------------~
80
60
g
1
1
40-
20
20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (h}
Las condiciones de la fermentación fueron: Concentración de

velocidad de aereación lO litros de aire/minuto y pH 4,5. La
concentración de ferrocianuro fue de 0,8 g/1.
(151)
de ácido cítrico se incrementa en 10.5 %.
Así, la adición de ferrocianuro de potasio estaría
restringiendo por una pal- te el cree imien to de la cepa
mutante, y por la otra, estimulando la producción de ácido
e í b- ico.
Estos resultados estan de acuerdo con el papel que se le
ha atribuido al ferrocianuro de potasio en la fermentación
del ácido cítrico. En efecto, se ha reportado que el
ferroc ianw-o, por una parte, ac tCta ejerciendo un efecto
inhibitorio sobre el crecimiento de A. niqer debido a su
naturaleza tó>:ica. Y, la ind irec tamen te
precipitando trazas de metales que inhiben la fermentación
cítrica. Especialmente los iones manganeso e

< 1a r k , D•, 1 9 62 ;
Clark y col., 1966; S~1nchez, A., 1970 y Ouukas y col., 1987).
El incremento del 10.5 % correlaciona bien con las
observaciones hechas por Clark y col., (1966) en el sentido
de que la producción de ácido cítrico se ve reducida en un
rango del 10 al 20 Y. cuando se tiene una elevada
concentracción de iones de manganeso en el medio. Este set-ía
el caso del medio II no tratado con ferrocianuro puesto que
autores como Gardner y col. <19561 y Sánchez, A. <1969, 1970)
han reportado que el azúcar morena presenta cantidades
apreciables de manganeso.
Realizamos también otra experiencia similar a la
anterior pero el medio II contiene metanol al 3 Y.. Los
resultados se muestran en la figura 18.
Puede observarse que la producción de biomasa fue· de
42 g/1 y la de ácido citrico de 90.4 g/1. Comparando estos
resultados con los obtenidos con el medio II sin metano!
<Fig. 15>, la producción de biomasa se mantiene igual no asi
la producción de ácido citrico pero se incrementa la
producción de ácido citrico en 10.8 Y.. De este modo la acción
del metano! seria directamente sobre el proceso de formación
del ácido citrico y no indirectamente a través de la
restricción del crecimiento del mutante. A este respecto
nuestros resultados difieren de las·observaciones realizadas
por Moyer y col. (1953). Estos investigadores atribuyen ese
efecto del metano! a una disminución en el crecimiento del
hongo.
En base a nuestros resultados, creemos que el efecto del
metanol estar ia más bien relacionado con procesos de
solubilizacióri de la membrana celular. Esto ayudaria a la
excrección del ácido por parte del hongo. Otra posibilidad es
que el metano! sea utilizado por el hongo para generar
moleculas adicionales de Acetil CoA. Estas moléculas son
necesarias en el mantenimiento del flujo de compuestos
carbonados a través del ciclo de Krebs para grantizar una
alta producción de ácido citrico.

( 153)

BIOMASA POR LA CEPA DE A. niger FAL A3.0
CRECIDA EN MEDIO 11 CON METANOL.
100~----------------------------------~
8o <..................... - ......................... --·······-··-··--·--· .. ··•· ·-<"""< <_,,,.,,,_,_, ............... < < .................... '" • .. ......... < .....- ............ ___ ...- ................... -- ... ..
60
g
1
1
1
40
20
o~~-L----~--~----~--~----~--~----~
o 20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (h}
Las condiciones de la fermentación fueron: concentraci6n de

az~ar 14 %, temperatura·3o 0 c, velocidad de agitaci6n 750 rpm,
velocidad de agreaci6n 10 litros de aire/minuto y pH 4,5. Se
utiliz6 una concentración de metanol del 3 %.
(154)
Por otra parte, si comparamos los resultados obtenidos
para el medio II con metanol, con los obtenidos con
ferrocianuro de potasio, vemos que el metano! promueve un
incremento del 2 % sobre la producción de ácido citrico por
el ferrocianuro.
Por último estudiamos el efecto que tiene sobre la
producción del ácido cítrico, el ferrocianuro de potasio y el
metano! aRadidos conjuntamente en el medio I I . Los resultados
de esta experiencia se muestran en la figura 19.
La producción de ácido cítrico fue de 98.4 g/1 y la de
peso húmedo de biomasa fue de 30,1 g/1. Al comparar estos
resultados con los obtenidos para el medio II tratado
solamente con ferrocianuro de potasio <Fig. 17), podemos ver
que hay un aumento del 11.1 % en la producción de ácido
citrico. La biomasa, sin embargo disminuye en 13 %, lo que
indicaría que la combinación de las dos sustancias influyen
de un modo negativo sobre el crecimiento del hongo.
Este resultado indicaría que el efecto del ferrocianuro
sobre la fermentación cítrica se ve potenciado con la adición
de metanol. De este modo cobra fuerza nuestra suposición de
que el metano! actuaria de un modo diferente a como lo hace
el ferrocianuro en la estimulación de la fermentación
citrica.
'.
' ~ ;:·~: ' .~' ~
, . <' ll •
FfGUAA 19. PRODVCCJON DE AC\oo CíTRICO Y

BIOMASA POA EL MVTANTr F.lL A.2.0 EN ME-
DlO \1 CON ME'il.NOL '1 f'EAROClANU~O
120 ---------···----- ------------ _____ :__________,
100
80 -
f oo···
.. 40
20 .. . .... '··' ...... .
o- ~- ~--- ·-·--------- -------··------·-------~--'--- .....

o 20 4-0 60 BO 100 ""'O
~~ 140 160
Tfempo (o)
+ BIOMASA (Peso h6medo) • ACIDO Cl'l'UCO
Las condiciones de la fermentaci6n fueron: Concentracióo da

azflcar 14 %, temperatura, 30 °c, velocidad de agi tac:i6n 750
rpm, velocidad de aereaci6n lO litros de aire/minuto y pi 4,5.
se utilizó una concentración de ferrocianuro de pot~sio 4e
0,8 g/1 y de metanol del 3 %.
tl56J
Como se indico anteriormente el efecto del ferrocianuro
en la fermentación del ácido cítrico esta relacionado con su
capacidad de precipitar iones metálicos como el hierro, zinc
y manganeso. Todos ellos inhibítorios de la producción del
ácido cítrico \f1íilis, N., 1962; Clark, D., 1962;
col., 1966; Horitsu y col., 1966 ; Sénchez, A., 1970 y Roukas
y col., 1987). Es probable que la precipitación del ion
manganeso sea el factor decisivo en el aumento de la
producción de écido cítrico CClark y col. 1966).
Es te ion e:. un meta 1 esenc i.a 1 para el crecimiento
filamentoso de A. niger. En ausencia de manganeso (niveles
inferiores a 10 M) ocurre un desarrollo anormal del hongo y
se produce una alta caneen tl-ac ión de ¡~e ido e i tr ico. Se ha
determinado que el manganeso está involucrado en la
composición de la pared celular <Kisser, M., 1980). Bajo
condiciones de deficiencia de manganeso se eleva el contenido
de quitina y se reduce .la cantidad de B-glucanos en la pared.
del hongo.
La deficiencia de manganeso según Kubicek y col. ( 1977)
resulta en una disminución de la concentración de varias
enzimas relacionadas con el anabolismo de ~A~-~~n~~~·g~e~r_. También
se ha reportado que una deficiencia en manganeso desequilibra
el recambio de proteínas lo que conduce a una elevación de la
caneen trace ión in trace lula¡- de amonio. Esta alta
concentl-ación de amonio serviría pal-a contrarestar la inhibí-

(157)
ción, por retroalimentación,de enzimas de la vi a
gluccoliticas. Se promovería asi, un flujo ilimitado de
fuentes carbonadas que servirían para mantener la
sobreproducción del 'cido cítrico ( Rohr y col., 1981).
Es tambien posible que la deficiencia en manganeso
cause permeabilidad membrana! como se ha sugerido para el
caso de las bacterias productoras de ácido glutámico
<Kubiceck y col., 1980). Estudios realizados por Orthofer y
col. (1979> han demostrado que la deficiencia en manganeso
causa a la disminución de la síntesis de fosfbtidos lo cual
afecta la estructura de la membrana.
De esta manera, el efecto estimulador del fen-oc ianuro
de potasio en la fermentación cítrica puede ser interpretado
como una modificación favorable del equilibrio de los iones
metálicos en el medio de fermentación, particularmente
produciendo una deficiencia del ión manganeso. Los resultados
obtenidos por nosotros indican que esto es lo que ocurre con
respecto al medio II de producción tratado con ferrocianuro
de potasio. Efecto que se ve reforzado con el tratamiento
simultaneo con metanol.
Para el caso de la comparación de la producción de écido
cítrico en el medio tratado con las dos sustancias <Fig. 19),
con la producc1ón obtenida en el mismo medio tratado

(158)
sólamente con metano! e F ig . pc.:aen1os que el
Este resultado nos
confirma que la accion del ierro~ianuro y la del metanol, en
la fermentación del ei ·u- ic:o ~ son oi·ferentes aunque
complementa¡- ias.
En estudios, realizAdos por dife¡·entes investigadm-es,
~.obre la utilización ~e medlos con sustratos carbonados con
altas concentraciones de iones met~~1cos en la fermentación
a los factores que influyen en la producción del <.k ido. Sin
embargo, se pueden observar algunos puntos de concordancia
tales como la influencia benéfica de io::. tr a tam .len tos con
o con me -tan o l . :DLt~-an te nLtes tra revisión
bibliogr6fica no se cc~sigulo referencia alguna que tratara
sobre el efecto de estas dos sus.tanc ias
simultaneamente auran~e que
ello se debe de que es~e tipo de información se
mantiene en secreto con el fin de pro~eger los métodos que se
han pantetado para la produccion oe ac1do c1trico.
En aunque e1 oe acc ic:m de los
alcoholes, COfOC• de la p¡-ocucción de
citrico, no se conoce con I?S. un que su
utilización pennite el 2:1lp.l.eo oe medio·:;; de cultivos con altas
concen~racc1ones ~e sustrinci3s noc1vas. 81 ademés de
con ten-oc ianuro oe

(159)
qUE:'
manganeso sobre
todo, e~. po<;:-. it• le
producción de ~c1do cítrico.
.... 2 del
p;- oc eso de Cl~rlCO ooservada durante
nuestras ex~eriencia v repor~ada par otros investigac>ores
h.
Kubicek, L.~ 1986). El slguiente paso d= nuestro trabajo fue
la posibilidad Ce uti~izar, ~urante ia fermen~ación oel
í:_l C! t) ] 2 L } v ¡J
Las células de u~lJ~~ad~s fuPrGn la~ mutan te FAL
11414 14.3 .(¡ ~e l~ fina:ización de la
experienc1a ce fermentac10n real~~dc6 con el medio II tratado
con
e ~~per· ienc ia se
( 160)
FIGURA 20. PRODUCCION DE ACIDO CITRICO

POR CELULAS RECICLADAS DE A. niger EN
MEDIO 11 CON METANOL Y FERRICIANURO
80~------------------------------------~
60 -- -----
+ /~
--- --- --- - - - - ~+=~+=:--±:::::::±
'
~
~ 4 0_¡___..,--·
/
+--_:~,r-/~..... .. . . . . . ..
/
20
o~--~----~----~----~--~----~----~--~
o 20 40 60 80 . 100 120 140 160

Tiempo (h)
Las condiciones de la fermentación fueron Concentración de az~car

14 %, temperatura 30 °c; velocidad de agitación 750 rpm, velocidad
de aereación 10 litros de aire/minuto y pH 4,5. Las células de~·
niger utilizadas fueron guardadas en fri~ durante 5 dias antes de
se utilizadas. La concentración de ferrocianuro fue de 0,8 ·g/1 y la
de metanol del 3 %.
(161)
Se obtuvo una producción de 70 g de peso húmedo de
biomasa por litro y 65.3 g de ácido citrico/1. Al comparar
estos resultados con los obtenidos en el medio II tratado con
ferrocianuro y metanol bajo iguales condiciones, pero sin
reciclaje de células CFig. 19>, se obtuvo una disminución en
la producción de ácido cítrico del 35 Y. y se doblo la
producción de biomasa.
El reciclaje de células no aumentó la producción de
ácido cítrico pero favoreció la formación de biomasa. En este
caso las células recicladas no utilizaron la nueva fuente de
compuestos carbonados para la producción del ácido. El
sistema metabólico de A. niqer desvió este flujo hacia la
formación de nueva biomasa.
Muy probablemte la alta densidad fungica unida al hecho
de que no hubo una reutilización inmediata de ~a masa fungica
<las células se guardaron en frio durante 5 dias) y la alta
viscosidad obtenida crearon un ambiente desfavorable para la
producción de ácido cítrico. Ello limitaría la difusión del
oxigeno necesario para la producción de ácido cítrico cuyos
requerimientos son elevados( 0.5 a 1.5 vvm Kubicek y col.,
1980). Por otra parte, de acuerdo a lo reportado por Bolívar,
F., <1975), en el caso de los m-ganismos fi¡amentosos que
crecen en forma de esférulas, como es el caso de A. niger, la
capa periférica de la esfé¡-u la crecer ia e>~ponenc ialmen te
cuando excede cierto diámetro. Cuando esto ocurre el sustrato

(162)
no se dinfundiria adecuadamente dentro de la esférula.
En conclusión la utilización de células recicladas de ~
niger para la producción de ácido ·citrico requiere de
estudios que tomen en cuenta lo pl-ecisado anteriormente.
Hasta la fecha no se ha reportado la utilización
comercial de un método que emplee el reciclaje de células de
A. niqer para la producción de ácido citrico. Sin embargo,
Al-Obaidi y col. (979) han demostrado las posibilidades de
las células recicladas para la producción de ácido citrico.
A. 7.- Aspectos e iné tic os del proceso.
Respecto a la cinética de la fermentación inducida por
el mutan te obtenido durante todas las experiencias
realizadas, podemos decir que fue posible observar la
naturaleza difásica del proceso de fermentación citrica. El
periodo inicial es de 2 di.as y se caracte¡-iza po'f la
utilización rápida del azócar para mantener el crecimiento
fóngico. Durante esta fase hay una e~casa producción de ácido
citrico. La fase final es de producción ascendente del ácido
como consecuencia del consumo de azúcar destinado a la
producción del metabolito, en lugar de ser utilizado para el
crecimiento.
(163)
Para cada fermentación se determinó a apartir de sus
respectivas gráficas de cree imien to y producción los
siguientes parámetros:
1.- Velocidad de crecimiento.
2.- Velocidad de producción del ácido citrico.
3.- Rendimiento.
4.- Productividad.
La velocidad de crecimiento se define como el incremento
en el número de generaciones de A. niger respecto al tiempo
de la fermentación y se calculó a apartir de los datos que se
exiben en cada una de las gráficas de crecimiento. La
velocidad de producción del ácido citrico se definió como el
incremento en la cantidad de ácido citrico producido a través
del tiempo de la fermentación y se determinó a partir de los
datos que se muestran en cada una de las gráficas de
producción. Pat-a determinar el rendimiento del proceso de
producción, entendido este como la relación entre la cantidad
de ácido citrico producida y la cantidad de azúcar consumida
durante el proceso, se dividía la cantidad de ácido citrico
obtenida durante la. fermentación entre la cantidad de azúcar
consumida durante el mismo. Por último se determino para cada
proceso la productividad, definida como la cantidad de ácido
citrico obtenida por litro de cultivo y por hora.
Los resultados de estos estudios se resúmen en la tabla
10.
(164)
Tabla. 10. f'a¡-;~meb-os cinéticos de los distintos proce-
sos de fermentación estudiados durante el
presente trabajo.
Proceso Velocidad de Velocidad de Rendimiento Productividad

cree imien to ¡:u-aduce ión d~) (g/l.h)
<geneaciones (g/h)
/h)
Fig. 11 0,036 0,330 41 0,0330
Fig. 12 0,025 0,310 40 0,0310
Fig. 13 0,036 0,071 10 0,0071
Fig. 14 0,032 0,380 49 0,0380
Fig. 15 0,015 0,540 64 0,0540
Fig ~ 16 0,036 0,110 15 0,0110
Fig. 17 0,029 0,570 69 0,0570
Fig. 18 0,030 0,580 68 0,0580
Fig. 19 0,025 0,630 74 o' 063()

Fig. 20 0.900 O,Lt-20 57 0,0420
Los valores fueron obtenidos a partir de los datos de las
figuras 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.
(165)
La mayor velocidad de producción de ácido citrico asi
como el mayor rendimiento y productividad se obtienen para el
caso de la figura 19 que corresponde a la experiencia de
fermentación en donde se utilizan células del mutante FAL
11414 A.3.0 de A. niger crecido en medio II sUplementado con
metano! y ferroc ianuro de potasio. La velocidad de
crecimiento en este caso fue de 0,025 generaciones por hora,·
siendo una de las menores velocidades obtenidas a lo largo
del trabajo. Estos resultados nos demuestran que en este caso
el flujo de compuestos carbonados, por efecto del
ferrocianuro de potasio, el metanol y la naturaleza genética
del mutante, se desvia en su mayor parte hacia la producción
de ácido· citrico, restringiendose el crecimiento fungico.
La menor velocidad de producción de ácido citrico asi
como el menor rendimiento y productividad del proceso se
obtiene en el caso de la figura 13, correspondiente a la
experiencia en donde se crece la cepa parental de A. niger
ATCC 11414 en el medio III.
Comparando ambos resultados podemos concluir que se
logró aumentar la velocidad de producción del ácido citrico,
el rendimiento y la productividad del proceso de fermentación
citrica, mediante el empleo de una cepa mutante de A. niger
crecida en un medio· con sacarosa poco purificada y
suplementado con ferrocianuro de potasio y metanol.

(166)
A.B.- Factibilid~d económica de la producción de ácido
e i tr ico en Venezw=• la.
Para establece¡- una indust¡- ia quimica en un pais en
desarrollo como Venezuela, es indipensable que exista un
mercado interno suficientemente amplio y en expansión que
pueda absorber la producción que se pretende establecer.
En el caso de que no exista una producción nacional de
la sustancia que se desea fabricar, se debe recurrir a las
estadísticas de importación, con el fin de tener una visión
de 1 mercado in terno pal-a ese producto.
Hasta el presente el mercado del éc ido e i tr ico en
Venezuela se ha cubierto mediante la importación. En la tabla
# 4 se puede observar la cantidad, el valor y el país de
origen de las importaciones de ácido cítrico realizadas por
Venezuela durante los aRos 1986, 1987 y 1988 <Anuario del
I CEV , 1 987 , 1 988 y 1 989 > •
Analizando la tabla ~ 4 podemos observar que los
principales proveedores de ácido citrico de Venezuela son
Colombia y México, con un volúmen de exportación para
Venezuela de 3.506 tm y 693 tm respectivamente. El precio
promedio de importación CIF es de, aproximadamente, 100.000
Bs /tm.
(167)
Se obse¡-va, además, una tendencia hacia el aumento en el
volúmen del ácido citrico importado, lo cual estaria
reflejando la existencia de un mercado amplio y en expansión
para este producto.
Por otra parte, la demanda de ácido citrico en el pais
esté dada por sectores industriales como la industrias de las
gaseosas, de los caramelos, de los jugos de frutas, de
alimentos concentrados para niRos, de las mermeladas y la
farmaceú tic a. Si tomamos en cuenta que han venido
e>:per imen tan do un cree imien to en su mercado, no es de dudar
que habrá un aumento en la demanda del ácido citrico en los
años venideros.
Todo lo dicho anteriormente nos lleva a _pensar que
"existe un mercado para el ácido citrico, con muy buenas
perpectivas de crecimiento en el futuro, que podria soportar
inversiones adecuadas para fomentar la producción nacional de
ese producto. Todo ello bajo un régimen competitivo de libre
mercado.
\~VVJ
C A P I T U L O V
A.t.-CONCLUSIONES.
De los resultados y discusiones precedentes es posible
resumir un conjunto de conclusiones. Ellas nos permiten
afirmar que fueron cubiertas las hipótesis y objetivos
propuestos.
Durante el tratamiento de las esporas del hongo
Aspergillus niger ATCC 11414 con luz ultravioleta, durante 15
minutos, se logró obtener el 3 % de sobrevivencia. Las
colonias" mutantes obtenidas durante el primer ciclo ·de
irradiación resultaron ser buenas productoras de ácido
citrico tanto a nivel de caja de Petri como a nivel de
fiolas. Además, mostraron una marcada resistencia a las altas
C:oncentracciones de iones metálicos. Una segunda mutagénesis
con luz ultravioleta no originó cepas más productoras de
ácido e i tr ico. Tanto las mutan tes se lec e ionadas de 1 ·primer
ciclo de irradiación con luz ultravioleta como las aisladas
durante el segundo ciclo se distinguen facilmente por su casi
completa ausencia de esporulación,· su crecimiento restringido
y su capacidad para formar esférulas de diámetros inferiores
a los obtenidos para la cepa parental.

~.l.0::;1)
De todas las mutantes aisladas resalta la cepa FAL 11414
A.3.0, la cual mostró una mayor resistencia a las altas
concentraciones de iones metálicos. Con ella se obtuvo la
mayor producción de ácido citrico tanto a nivel de caja de
Petri como a nivel de fiolas dando, simultaneamente, los
mejores rendimientos en base a la azúcar consumida. Esta
cepa posee caracteristicas tales como una restricción en su
crecimiento y la formación de esférulas de menor tamaho y más
abundantes. Estas caracteristicas la hacen apta para ser
utilizada en procesos de fermentación citrica a escala de
planta piloto.
La.mutante FAL 11414 A.3.0 mostró una producción de
ácido e i tr ico, en un medio con azúcar refinada, 1 .13 veces
mayor que la observada por la cepa parental en el mismo
medio. Respecto a la producción de ácido en el medio con
azúcar morena la cepa mutante obtuvo una producción 1.72
veces mayor que la mostrada por la cepa parental en el mismo
medio. Por último la producción en medio melaza de caha de
azúcar, fue 1.57 veces mayor respecto a.la cepa parental.
La adición de sustancias estimuladoras de la
fermentación citrica, tales como el ferrocianuro de potasio y
el metano!, agregadas individualmente resultaron en un
aumento de 1,86 veces en la producción de ácido citrico por
la cepa mutante, FAL. 11414 A.3.0 en comparación con la
parental.
tl70)
La adición simultánea de las sustancias estimuladoras al
medio de producción se tradujo en un aumento en la producción
de ácido citrico, siendo en este caso el aumento de dos veces
respecto a la observada por la cepa paren ta 1.•
Por último la utilización de células recicladas durante
la fermentación del ácido citrico no se tradujo en un aumento
en la producción del ácido citrico, tal como se esperaba, si
no que disminuye la producción.
De acuerdo a los resultados obtenidos por nosotros
podemos decir que la fermentación citrica es un tipico
ejemplo de fermentación tipo II que se caracteriza por un
desfasaje del proceso de crecimiento del de producción y
donde estarian presentes eventos complejos de regulación.
Por último diremos que en los actuales momentos, dada
las condiciones económicas por las que atraviesa nuestro
pais, es buena la factibilidad económica para montar una
planta productora de ácido citrico. De hecho se cuenta tanto
con el recurso material como con la infraestructura humana y
de investigación para acometer esa tarea. ! Manos a la obra~.

(172)
C A P I T U L O VI
A.- BIBLIOGRAFIA.
1.- Abou-Zeid, A.A.; Ashy, M.A. Production of citric
acid. A review Agric. Wastes 9 : 51-76, 1984.
2.- Acosta, Yaneth. Selección de un mutante de S ..
cerevisiae superproductor de invertasa y su utilización en
estudios de inmovilización en reactores de flujo continuo
empacados con desechos agroindustriales para la producción
biológica de endulcorantes. Tésis de grado. Departamento de
Biología. Facultad de Ciencias ULA, 1986.
3.- Aguillon, Félix. Primer encuentro nacional de
investigadores e industriales de alimento. San Felipe.
Fudeco, 1974 .
4.- Ahmed, S.A.; Smith, J. y Anderson J. Trans. Mycol.
Soc. 59 :51-61, 1972
5.- Aiba, S.; Humphey, A. y Millis, N. Biochemical
Engineering. Segunda Edición. Academic Press, 1973.
6.- Aiba,S. y Matsuoka M. Symposium of the FEMS
"Overproduction of microbial products." Symposium # 13, pag.
263' 1982.
(173)
7.- Akiyama, S.; Suzuki, T.; Sumino, Y.; Nakao, Y. y
Fukuda, H. Proceeding of the IV international fermentation
symposium, l<yoto, 1972.
8.- Albornoz, Isabel. Selección de un mutante auxotrofo
de S. cerevisiae resistente a analogos de la metionina. Tésis
de grado. Opto. de Biología. Facultad de Ciencias, 1987.
9.- Alexopoulos, C. Introductory Mycology. Tercera
Edición. John Wiley Sons. N.Y., 1979.
10.- Alikhanian, S.I. Induced mutagenesis in the
selection of microorganism. Advance in applied Microbial Vol
4·; pag. 1-50, 1970.
11.- Al-Obaide Z. y Berry, D. Extended production of
citric acid using a exchange filtration technique. Biotech.
Lett. Vol. 1, pag. 221-224, 1979.
12.- Allen, S.E.; Grimshaw, H. y Ouarmby, C. Chemical
analysis of ecologicals materials. Blackwell Scientific
publications. Oxford, 1974.
13.- Allinson, J. Patente USA# 281304, 1957.
14.- Amelung, H. Chem Ztg. 54: 118, 1930.

(174)
15.- American type collection culture. Catálogo de cepas
de bacterias, algas y hongos. ATCC. Maryland. USA, 1984.
16.- Anderson, J.; Blain, J.; Divers, M. y Tood, J. Use
the disc fermenter to e>:amine production of citric acid by
Aspergillus niger. Biotechnology Letters. Vol 2 # 3, pags.
99-104' 1980.
17.- Andueza, Félix. Obtención de un mutant.e
superproductor de ácido glutámico de la levadura Candida
utilis y estudio de las condiciones de producción del
metabolito en un medio de cultivo no convencional. Tésis de
grado. Lab. de Fermentaciones. Facultad de Ciencias ULA,
1986.
18.- Anuario del -Instituto de Comercio Exterior de
Venezuela. OCEI. Caracas. Años 1986, 1987 y 1988.
19.- Archibald, I. CRC. Critica! Reviews in
Microbiology. Vol 13, pag. 63-109, 1986.
20.- Arts, E.; Kubicek, C. y Rohr, M. Regulation of
phosphofructokinase from A'""-=s..O::p'-=e'-'r-'g=ic.::l:..:l;;..:L='s=----'n-'-=i.::lg'""'e'-'-r : E t t ec t ot
fructose 2-6-diphostate on the action of citrate, ammonium y
AMP. Journal of general microbiology. Vol. 133, pag.
11 95-11 99 ' 1 987 •

(175)
21.- Association of American Feed Control Offials.
Secticus # 8788, 1977.
22.- Association of analitycal Chemist. Official Methods
of analysis of the official analytical chemist. 13th Edition.
1980.
23.- Atkinson, B. Biochemical reactors. Pion Limited,
London , 1974 •
24.- Auling, G. European Journal of applied microbiology
and biotecnology • Vol 18, pag. 229-235.
25.- Barnett, H.L. Ilustrated genera of imperfect fungi.
2da edición. Burgess publishing, 1965.
26.- Barnett, H.L. y Lilly, V. Mycologia Vol. 58:
585-591 ' 1 966 •
27.- Bartels, H. Uber die Bedenting ven eisen, zink und
kupfer fur microorganismen. Biochem. Z. Vol. 182: 301-358,
1927.
28.- Batti, M.A. Patente USA# 3290227, 1966.

(176)
29.- Benuzzi, D. Influence of operating conditions on
pellets formation for use in citric acid production. Arch.
Biol. M. Vol 19 (2): 180, 1986.
30.- Benuzzi, D. y Segovia R. Estudio sobre la
preselección de cepas de Aspergillus niqer destinadas a la
producción de écido citrico. Acta científica venezolana. Vol
40 , pag • 1 95 , 1 989 •
31.- Bernhauer, K. Zum Chemis~us der citro nen
saurebilding durch pilze. Biochem Zeit. Vol. 197: 309, 1928.
32.- Bernhauer, K. Uber die Charaklerisierung der stamme
van A. niger. Biochem. Vol 2: 205-240, 1929.
33.- Bernhauer, K. Die oxydative Garungin Springer-
Verlag, Berlín, Viena, 1932.
34.- Bernhauer, K.; Bockl, N. y Siebenauger, H. Biochem.
Zeit. Vol 253 : 37-41, 1932.
35.- Bernhauer, K.; Knobloch, A. y Iglaver, A. Uber die
Saurebilding aus zucker durch A. niger. Biochem Zeit. Vol 2:
319-499' 1941 •
(177)
36.- Bertrand, G. y Javiller, M. Influence du manganese
sur le deve loppemen t de 1" Asperg i llus n iger. Comp. Rend •
Vo 1 • 152 : 225-228 , 1 911 •
37.- Beuehat, L. Food and beverage mycology. Avi
publishing Inc. USA, 1978.
38.- Bhat, H.K. Effect of 5-hidroxymethilfusfural on
production of citric acid A. niqer I.S.Ex.Biol. Vol 22 <1>:
37-38' 1984 •
39.- Biles, J. Patente USA# 3335793, 1967.
40.- Blaun, J.A.; Anderson, J.; Tood, J. y Divers, M.
Cul tivation of f ilamentous fungui in the disc fermenter.
Biotech. Lett. Vol. 2, 1979
41.- Bleyer, B. Patente Alemana# 434729, 1926.
42.- Bolivar, F. y Quintero, R. Influencia de la
biotecnologia en el desarrollo de las ciencias. Parte I. Rev.
Soc. Quim. Mex. Vol 19 <Marzo/Abril>. Pag. 6-9, 1975.
43.- Bolivar, F. y Quintero, R. Influencia de la
biotecnologia en el desarrollo de las ciencias. Parte II.
Rev. Soc. Quim. Mex. Vol. 19 : 43-47, 1975.

(178)
44.- Bomsteín, R. y Johnson, M. The Mechanísm of the
fermentation of citrate and oxalate by A. niger. J. Biol.
Chem. Vol 198:143-153, 1952.
45.- Borges, J. Utilización integral del follage de yuca
<Manihot esculenta) para la producción de proteínas
unicelulares. Tesis de grado. Facultad de Ciencias. ULA,
1987.
46.- Bortels, H. Uber die bedeuting von eisen zink. und
kupfer fur microorganismen. Biochem Zeit. Vol 182: 301-358,
1927.
47.- Bruchmann, E. Biochem Zeit. Vol 2 (335): 199-211'
1961.
48.- Brusch, F. Biochim e Biophys. Acta. Vol 1:77, 1947.
49.- Bull, A. y Bushell, M. The filamentous fungui. Vol
2. Edit. Smith, J. Edward Arnold, Londres, 1975.
50.- Buttkewitsch, W.; Menzschenskaya, E. y Trofirmova,
E. Zur biochemischen her kunbt von e i tronen-und o>:a lsaure
Biochem. z. Vol. 272: 290, 1934.

(179)
51.- Buttkewitsch, W.S. y Baewskaya, M. Compt. Rend.
Acad. Sci. URSS Vol. 3 : 405, 1935.
52.- Calam, C. Improvement of microorganisms by mutation
hibridization and selection. Methods in microbiology. Cap.
#7, Vol.# 3A, Academic Press, 1971.
53.- Casida, L. Industrial Microbiology. Edit. Norris.
USA, 1975.
54.- Challenger, F.; Subvamaniam, V. y Walker, T. The
mechanism of the fermentation of citric and oxalic acids from
sugar by A. niger. J. Chem. Ind. Vol. 50:200-208, 1927.
55.- Chaudhary, K. y Lakishm, M. Ind. J. Microbiol. Vol.
# 14: 42, 1974.
56.- Chaudhary, K. Journal of fermentation Technology.
Vol. 56:554, 1978
57.- Chibata, 1.; Fosa, T. y Sato, T. Immobilized
aspartase-containig microbial cells. Appl. Bioch. Biotech.
Vol. 27: 878-885, 1974.
58.- Choudhary, Q. y Pirt, S. The influence of metal
complexing agents on citric acid production by A. niger. J.
Gen. Microbio!. Vol.# 43: 71-81, 1966.

(180)
59.- Chrzaszcz, T. y Tiukow, D. Biochemesche um
bildungen der essigsaure durch schimmelpilze und uber der
chemismus der citronensaurebilding. Biochem Zeit. Vol. 229:
343,1930.
60.- Ciusa, R. y Brull, L. Sul mecanism d~lla
fermentazione cítrica. Ann. Chem. Appl. Vol.# 29: 3-11,
1939.
61.- Clark, D.S. y Lentz, C. Submerged citric acid
fermentation of sugar beet molasses: Effect of pressure and
recirculation of exigen. Can. J. Microbio!. Vol. # 7:
447-453' 1961.
62.- Clark, D. Submerged citric acid fermentation. Ind.
Eng. Chem. Resch. Vol. 1 <1>: 59- 62, 1962.
63.- Clark, D.S.; Ito, K. y Horitsu, H. Effect of
manganese and other heavy metals on sumerged citric acid
fermentation of molasse. Biotech. and Bioengineering. Vol
VIII,# 4: 465-471, 1966.
64.- Clark, D.S. y Len tz, C. Submerged citric acid
fermenta tion of beet molasses in tank-type fermenters.
Biotech. and Bioengineering. Vol. V: 193-199, 1963

(181)
65.- Clausen, C. Principies of industrial chemistry,
1978.
66.- Cleland, W. y Johnson, M. Tracer experiments on.the
mechanism of citric formation by A. niger. Biochem. Vol. #
12: 679-689, 1953.
67.- Clement, M.T. Citric acid fermentation of beet
molasses by A. niger in sumerged culture. Canad. J. Tech.
Vol. # 30:82, 1952.
68.- Cortez, José G. Estudio comparativo de los
complejos celulasas de tres hongos diferentes. Tesis de
maestría. Lab. de Fermentaciones. Facultad de Ciencias. ULA,
1989.
69.- Cramer, C. y Rowland, H. Screening for amino acid
pool mutants of Neurospora and yeast: Replica-Printing
technique. Jo.urnal of bacteriology. Vol. # 137: 1437-1438,
1979.
70.- Currie, J.N. The citric acid fermentation of B..:_
niger. J. Biol. Chem. Vol. 31: 15, 1917.
71.- Das, A. y Nandi, P. Improved production of citric
acid from A. niger by mutagenic treatment. Indian J. E>:p.
Biol. Vol. # 7: 275-276, 1969.

(182)
72.- Das, A. y Ilczuk, Z. Spontaneous segregation of a
heterozygous diploid of A. niger. Folia. Microbio!. Vol. #
23: 362-365, 1978.
73.- Das, A. y Pan ty, R. Improved produc tion of e i tr ic
acid by a diploid strain of A. niger. Can. J. Microbio!. Vol.
# 24: 622-625, 1978.
74.- Das, A. Parasexual hybridisation and citric acid
production by A. niger. European J. Appl. Microbio!.
B io tec hno 1 • Vo 1 • # 9 : 11 7-11 9 , 1 980 •
75.- Dawes, I. Fisiologia de los microorganismos. Edit.
Blume, 1978.
76.- Dawson, M. Effect of interruptions to the ail-
supply on citric acid production by A. niger. Enzyme Micr.
Vol# 8 <1>: 37-40, 1986.
77.- Dawson, M.; Maddox, I. y Brooks, J. Evidence for
the ni trogen catabolite represion during citric acid
production by A. niger under phophate-limeted grotwth
conditions. Biotech. and Bioeng. Vol. # 33: 1500-1504, 1989.
78.- Demain, A. J. Appl. Chem. Biotechnol. Vol. # 22:
345, 1972.
(183)
79.- Deroo, J. The Connecticut Agricultura! E>:perimental
Station. Bulletin <750), 1975.
80.- Detroy, R. y Ciegler, A. Induction of yeastlike
development in Aspergillus parasiticus J. Gen. Microbio!.

Vol. 65:259-264, 1961.
81.- DIFCO. Manual de medios, 1975.
82.- Doelger, W. y Prescott, J. Citric acid
fermentation. Ind. Engng. Chem. Vol. # 26: 1142, 1934.
83.- Druri, M. Investigation of components of beet
molasses having a to>dc effect on A. niqer at the citric acid
production. Acta. Biotech. Vol. # 7 (3) : 275-278, 1987.
84.- Eikmeier, H. Produc tion of e i tr ic ac id with
immobilized A. niger. Appl. Micrb. B. Vol. # 20 (6): 365-370,
1984.
85.- Eikmeier, H. Semicontinuous and continous
production of citric acid with immobilized cells of A. niger.
Z. Naturfo. C. Vol. 42 <4>: 408-413, 1987.
86.- Elving, O. Finska. Soc. Ford. Math. Naturw. 61
(15), 1919.
(184)
87.- Emde, H. Zur theorie der citronensauregarung.
Biochem. zeit. 752: 373, 1935.
88.- Emmans, C.; Binford, C.; Putz, J. y Kwon, K.
Medica! mycology. 3era edición. Lea and Febiger Philadelphia,
1977.
89.-Enzminger, J. y Asenjo, J. Use of cell recycle in
the aerobic fermentativa production of citric acid by yeast.
Biotech. Lett. Vol. 8 (1): 7-12, 1986.
90.- Euler, H. Brunschweig. Vol. III, 1909.
91.- Faith, W.; keyes, D. y Clark, R. Industrial
chemicals, N.Y. John Wiley and Sons, 1965.
92.- Foster, J. y Davis, H. Detection and ocurrence of
acid producing fungui. Bull. Torrey. Bot. Cl. Vol. 76: 174,
1949.
93.- Foster, J. y Carson, S. Citric acid formation by A.
niger Through condehsation of 3 Ce moieties. J. Am. Chem.
Soc. Vol. 72: 1865, 1950.
94.- Franzen, H. Ber. Vol. 58: 222-226, 1925.

(185)
95.- FUDECO. Informe Técnico sobre la producción de
écido citrico. Barquisimeto. Edo. Lara. Octubre de 1988.
96.- Furth, O. y Herrmanm, .H. Biochem z. Vol. 280: 488,
1935.
97.- Gaden, E.L. J. Chem. Ind. Vol. 12: 154, 1954.
98.- Garassini, L. Microbiologia Tecnológica. ucv.

Caracas, 1970.
99.- Ga,-dner, J.; James, V. y Rubbo, S. Production of
citric acid by mutants of A. nige,-. J. Gen. Microbio!. Vol.
14: 228-237, 1956.
100.- Garraway, M. y Evans, R. Fungal nub-ition and
physiology. 1 era Edición. John Wiley & Sons, 1984.
101.- Gerdhardt, P.; Dorrell, W. y Baldwin, I. Citric
acid fermentation of beet molasses. J. Bact. Vol. 52: 555,
1946.
102.- Grimaux, P. y Adams, P. C.R. Hebd. Seances. Acad.
Vo 1 . 90 : 1252 , 1880 •
(186)
103.- Gómez, R.; Schnabel, I. y Garrido, J. Factores que
afectan la producción de ~cido citrico en cultivos sumergidos
-por Aspergillus niger 110. Interferon y Biotecnologia Vol. 5
(1): 18-30, 1988.
104.- Goodwin, T. Metabolic rols of citrato. Academic.
Press. London, 1968.
105.- Gudlet, M.; Kirsanova, V. y Makarowa, V. Inst.
Nahruhgsmittelind <USSR> Vol. 1: 45, 1935.
106.- Gupta, J.; Heding, L. Effect of sugar, hydrogen
ion concentration and amonium nitrate on the formation of
the acid citric by A. niger. Acta. Microbio!. Acad. Sci.
Hung. Vol. 23: 63-67, 1976.
107.- Habison, A.; l<ubicek, c. y Rohr, M.

Phosphofruc tokinase as a regula tory en zyme in e i tr ic ac id
production by A. niger. FEMS. Microbiology Letters. Vol. 5:
39-42 ' 1 979 •
108.- Habison, A.; Kubicek, C. y Rohr, M. Partial
purification and regulatory properties of phosphofructokinase
from A. niger. Biochem. J. Vol. 209: 669-676, 1981.

(187)
109.- Hang, Y. Y Woodams, E. Effect of substrate
moisture content on fungal production of citric acid in a
salid state fermentation system Biotech. Lett. Vol. 9 <3>:
183-186., 1987.
110.- Hannan, M.A. Ind. J. Exp. Biol. Vol. 10:379-381,
1972.
111.- Hannan, M.A. J. Ferment. Technol. Vol. 51:
606-608, 1973.
112.- Hannan, M.A. Isolation and analysis of conidiation
detective mutants of A. niger. Malee. Gen. Genet. Vol. 142:
333-340, 1975.
113.- Hannan, M.A. Folia. Microbio!. Vol. 21: 409-412,
1976.
114.- Hartford, C. Rapid spectrophotometric method for
the determination of itaconic, citric, aconitic and fumaric
acids. Anal. Chem. Vol. 34 (3):426-428, 1962.
115.- Hee Yong L~e; Chang Woo Lee y Ho Nam Chang. Citric
acid production by A. niger immobilized on polyurethane foam.
Appl. Microbio! Biotechnol. Vol. 30: 141-143, 1989.

{188)
116.- Heinrich, M. y Rehm, H. Growth of Fusarium
monoliforme on n-alkanes. Eur. J. Appl. Microbio}. Biotech.
Vol. 11: 139-145, 1981.
117.- Heinrich, M. y Rehn~ H. Formation of gluconic acid
at low pH by free and immobilized A. niger cells during
citric acid fermentation. European J. Appl. Microbio!.
Biotechnol. Vol. 15: 88-92, 1982.
118.- Herzog, R. y Polotsky, A. Zeit. Physiol. Chem.
Vol. 59: 125-128, 1909.
119.- Hildergard, K.; Guvrin, R. y Henis Yigal. Citric
acid fermentation by A. niqer on Low sugar concentrations and
cotton waste. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 42
(1): 1-4, 1981.
120.- Himoe, A. y Rinne, R. Separation of citrate,
malate, aspartate and glutamate in crude extracts by one
dimensional ion exchange thin-layer chromatography.
Analytical Biochemistry. Vol. 88: 634-637, 1978.
121.- Hockertz, S.; Schmid, J. y Auling, G. A specific
transport system for manganese in the filamentous fungus ~
niger. J. Gen. Microbio!. Vol. 133: 3513-3519, 1987.

(189)
122.- Hockertz, S.; Plonzig, J. y Auling, 6. Impairment
of DNA formation is an early event in A. niger under
manganese starvation. Appl. Microbio!. Biotechnol. Vol. 25:
590-593 ' 1987 •
123.- Holliday, R. A New m~thod for the identification
of biochemical mutants of microorganisms. Nature. Vol. 4540:
987' 1965.
124.- Honecker, S.; Bisping, B.; Yang, z. y Rehm, H.
Influence of sucrose concentration and phophate limitation on
citric acid production by immobilized cells of A. niqer.
Appl. Microbio!. Biotechnol. Vol. 31: 17-24, 1989.
125.- Horitsu, H. y Clark, D. Effect of ferrocyanide on
growth and citric acid production by A. niger. Canadian
Journal of Microbiology. Vol. 12: 901-907, 1966.
126.- Horitsu, H.; Adachi, S.; Takahashi, Y.; Kawai, K.
y t<awano, Y. Production of citric acid by A. niger
immobilized in polyacrylamide gels. Appl. Microbio!.
Biotechnol. Vol. 22: 8-12, 1985.
127.- Hopwood, D. The isolation of mutants. Methods in
Microbiology. Cap. 6. Vol. 3A. Academic Press, 1971.

(190)
128.- Hossain, M. Broks, J. y Maddox, D. Productian of
citric acid from whey by fermentative using A. niger. New
Zealand J. Dairy Sci. Technol. Vol. 18: 161-168·~ 1983.
129.- Hossain, M. The effect of the sugar source on
citric acid production by A. niger. Appl. Micr. B. Vol. 19
(6): 393-397, 1984.
130.- Ikeno, Y.; Masuda, M. y Tannok, O. Citric ac:id
production from various raw materials by yeast. J. Fermt.
Technol. Vol. 53: 752-756, 1975.
131.- Ilezuk, Z. Genetics of citric acid producing
strains of A. niger. Citric acid synthesis by forced
heterokaryons between au>~otrophic mutants of A. niger Die.
Nahrung. Vo 1. 15: 251-262, 1971.
132.- I lezuk, Z. Genetics of e i tr ic ac id produc ing
strains of A. niger. Citric acid synthesis by heterozygous
diploides of A. niger. Die. Nahrung. Vol. 15: 381-388, 1971.
133.- Imshen~tskii, A. y Kuzyurina, L. Variability in ~
niger induced by the combined effect of ethyleneimine and
ul traviolet irradiation. Mikrobiologiya. Vol. 35: 812-816,
1966.
(191)
134.- Islam, M.; Begum, R. y Choudhury, N. Semi-pilot
scale studies on citric acid fermentation by a Gamma ray
induced mutants of A. niger. Biotechnology Letters Vol. 6
(7): 431-434, 1984.
135.- Islam, M.; Begum, R. y Choudhury, N. Semi- pilot
scale production of citric acid in cane molasses by gamma ray
induced mutants of A. niger Enzyme Microb. Technol. Vol. 8:
469-471' 1986.
136.- James, V.; Rubbo, S. y Gardner, J. Isolation of
high acid yielding mutants of A. niger by a paper culture
selection technique. J. Gen. Microbio}. Vol. 14 (1): 223-227,
1956.
137.- Jernejc, K; Cimerman, A. y Perdih, A. Citric acid
production in.chemically defined media by A. niger • European
J. Appl. Microbio!. Biotechnol. Vol. 14: 29-33, 1982.
138.- Johansen, R. y Col. U.S. Bur- Mine inform Circ. #
7797' 1957.
139.- Jorgensen, M. Microbiología de las fermentaciones
industriales. Editorial A~riba, España, 1978.
140.- Karow, E. y Wasksman, S. Production of citric acid
in submerged culture. Ind. Eng. Chem. Vol. 39: 821, 1947.

(192)
141.- Khan, A. y Ghose, T. J. Fermt. Technol. Vol. 51:
734-741' 1973.
142.- Khanna, V. Effect of dithiocarbamates on citric
acid production by A. niger. Fol. Microb. Vol. 31 <4>:
288-292 ' 1 986 •
143.- Kirk- Othmer. Encyclopedia of chemical technolbgy.
Vol. 6. Wiley. Interscience publications. John Wiley & Sons,
1979.
144.- Kirimura, K.; Laguchi, T. y Usami, S.
Intraspecific protoplast fusion of citric acid producing
strain of A. niger. J. Fermt. Technol. Vol. 64: 473-479,
1986.
145.- KirimLn-a, t<. Alte)-ations of respiratory systems in
A. niqer under the conditions of citric acid fermentation.
Agr. Biol. Chem. Vol. 51 (5): 1299-1303, 1987.
146.- Kirimura, K.; Iwao, N.; Sing Pyo, L.; Kawabe, S. y
Shogui, U. Citric acid production by the diploid strains of
A. niger obtained by protoplast fusion. Appl. Microbio!.
Biotechnol. Vol. 27: 504-506, 1988.

(193)
147.- J<isse.r, N. ; l<ubicek, C. y Rohr, M. Inf luence. of
manganese on morphology and cell wall composition of ~
niger during citric acid fermentation. Arch. Microbio!. Vol.
128: 26-33, 1980.
148.- J<luyver, A. y Perkin, L. Biochem. Z. Vol. 266 :
68, 1937.
149.- Knorr. D. Food biotechnology. Pergamon Press,
1982.
150.- Kono, T. t Assai, T. Biotech. and Bioeng. Vol. 11:
19 y 293 ' ' 1969
151.- Kristiansen, B. y Sinclair, C. Production of
citric acid in batch culture. Biotech and Bioeng. Vol. 20:
1 711-1 722 ' 1 978 •
152.- Kristiansen, B. y Sinclair, C. Production of
citric acid ·in continuos culture. Biotech. and Bioeng. Vol.
21: 297-315, 1979.
153.- Kubicek, C.; y Rohr, M. Influence of manganese on
enzyme synthesis and citric acid accumulation in A. niger.
European J. Appl. Microbio!. Vol. 4: 167-175, 1977.

•
(194)
154.- Kubicek, C.; Zehentaruber, O. y Rohr, M. An
indirect method for studying the fine control of citric acid
by A. niqer Biotech. Lett. Vol. 47: 47-52, 1977.
155.- Kubicek, C. y Rohr, M. The role of the
tricarbo>:ilic acid cycles in citric acid accumulations by tL_
niger. European J. Appl. Microbiol. Vol. 5: 263-271, 1978.
156.- Kubicek, C.; Hampel, W. y Rohr, M. Manganese
deficiency leads to elevated amino acid pools in citric acid
accumulating A. niger. Arch. Microbio!. Vol. 123: 73-79,
1979.
157.- Kubicek, C.; Zehentaruber, O.; El-Kalak, H. y
Rohr, M. Regulation of citric acid production by oxygen:
Effect of disolved oxygen tension on adenylate levels and
respiration in A. niger. European J. Appl. Microbio!.
B io tec h • Vo 1 • 9 : 1 O1-115 , 1980 •
158.- Kubicek, C. y Rohr, M. Regulation of citrate
synthese from the citric acid accumulating fungus A. niqer
Biochimica et biophysica Acta Vol. 615: 449-457, 1980.
159.- Kubicek, C. y Rohr, M. Aconitase and citric acid
fermenta tion by A. niger Appl. and Env ironmen ta 1
Microbiology. Vol. 50 <5>, 1985.157.-

(195)
160.- Kubicek, C. Citric acid fermentation. C.R.C C. R.
Biot. Vol. 3 <4>: 331-373, 1986.
161.- Kundu, S.; Panda, T.; Majumdor, S.; Gutha, B. y
Bandyo, K. Pretreatment of indian cane molasse for increased
production of citric acid. Biotech and Bioeng. Vol. 26:
1114-1121, 1984.
162.- Kuzyurina, L.A. Mikrobiologiya. Vol. 30 897,
1961.
163.- La nauze, J. Aconitase and isocitric dehydrogenase
of A. niger in relation to citric acid production. J. Gen.
Microbio!. Vol. 44: 73-81, 1966.
164.- Larousse, C. Gran Enciclopedia Larousse. Vol. 2.
Editorial Planeta, 1967.
165.- Lee Yang, H.; Chang Wood, L. y Ho Wam, C. Citric
acid production bt A. niger ~mmobilized on polyurethane foam.
Appl. Microbio!. Biotechnol. Vol. 30: 141-143, 1989.
166.- Legisa, M.; Cimerman, A. y Sterle, M. Germination
of A. niger in a high citric acid yielding medium. FEMS.
Microbio!. Lett. Vol. 11: 149-152, 1981.

(196)
167.- Legisa, M. ~lycerol is an initiator of citric acid
accumulation in A. niger. Enzyme. Micrb. Vol. 8 (5): 258-259,
1986.
168.- Legisa, M. Glycerol synthesis by A. niqer under
citric acid accumulating conditions. Enzyme. Micrb. Vol. 8
( 10): 607-609' 1986.
169.- Legisa, M. y Kidric, J. Initiation of citric acid
accumulation in the early stages of A. niger growth. Appl.
Microbio!. Biotech. Vol. 31: 453-457, 1989.
170.- Lehninger, A. Bioquímica. Segunda edición.
Editorial Omega, 1978.
171.- Leland, A.; Underkofler, S. y Hickey, J.

Fermentations industrial. Vol. 1: 420-425, 1954.
172.- Leopold, J. y Valtr, L. Fermentation .of citric
acid from cane molasses. Folia Microbio!. Vol. 4: 109-118,
1959.
173.- Lewis, K. y Weinhouse, S. Studies on the mechanism
of citric acid production in A. niger. J. Am. Chem. Soc. Vol.
73: 2500-2503, 1951.

(197)
174.- LKB. Manual de operación.,Suiza, 1976.
175,- Lockwood, L. y Batti, M. Patente USA # 3,129,527
(1965>.
176.- Lockwood, L. Production of organic acids by
fermentation. Cap. 11: 355-387" in the microbial technology.
Ed. por Peppler y col. Vol. 1, 1979.
177.- Lugg, J. y Overell, B. One and two dimensional
partition chromatographic separation of organic acids on an
inert sheet support. Aust. J. Sci. Res. Serie A. Vol. 1 98,
1948.
178.- Ma, H.; Kubicek, c. y Rohr, M. Mala te
dehydrogenase isoenzyme in A. niger FEMS. Lett. Vol. 12:
147-151, 1981.
179,- Ma, H.; Kubicek, C. y Rohr, M. Metabolic effect on
manganese deficiency in A. niger: evidence for increased
protein degradation. Archives of Microbiology. Vol. 141:
266-268, 1985.
180.- Malik, S. Genetics of applied microbiology.
Advances in Genetic. Vol. 20, 1979.

(198)
181.- Mallea, O.; Blaisten, R. y Camargo, H. Ensayos de
utilización de melazas para la fermentación cítrica. Rev.
Asoc. Bioquim. Arg, Vol. 15: 280, 1950.
182.- Manonmaní, H. y Sreekantiah, 1<. Studies on the
con ver tion of ce llulose hydro 1ysa te in to e i tr ic ac id by ~
niger. Process. Biochemistry. June: 92-94, 1987.
183.- Marier, J. y Boulet, M. Direct determination of
citric acid in milk and ímproved pyridine-acetic anhydride
method. The Analyst. Vol. 85: 574, 1960.
184.- Martin, S.; Wilson, P. y Burris, R. Cítric acid
formation from C 1 40a by A. niger. Arch. Biochem. Vol. 26:
1 03-111 ' 1 950 •
185.- Martín, S.; Wilson, P. y Burris, r. Uptake of C O
by A. niger in the formation of citric acíd. Arch. Biochem.
Vo 1 • 32 : 1 50-1 57 , 1 951 •
186.- Martín, S y Waters, W. Productíon of citric acid
by submerged fermenta tion. Industrial and Engineering
Chemistry. Vol. 44 (9): 2229-2233, 1952.
187.- Martín, S. Can. J. Microbiol. Vol. 1: 6, 1954.

(199)
188.- Martin, S. Production of organic acids by moulds
in the biochemestry of industrial microorganism. Edit.
Raiwbow y col. Capitulo 12: 415-449, 1970.
189.- Mattey, M. Citrate regulation of citric acid
production in A. niger. FEMS. Microbio!. Lett. Vol. 2: 71-74,
1977.
190.- Mattieeva, E. Rapid chemilumissicence method for
the determination of citric acid in plant materials. J. Anal.
Chem • Vo 1 • 39 ( 2 > : 1 785 , 1 984 •
191.- Mattiason, L. Appl. Microbio!. Vol. 16: 52-55,
1982.
192.- Maze, P. y Perrier, A. Compt. Rend. Vol. 139:
311-313, 1904.
193.- Meixner, B.; Kubicek, C.; Habison, A.; Kubicek, E.
y Rohr, M. Presence and regulation of the alfa-ketoglutarate
dehydrogenase multienzyme complex in the filamentous fungus
A. niger. J. Bact. Vol. 161 (1): 265-271, 1985.
194.- Meixner, O.; Mischak, M.; Kubicek, C. y Rohr, M.
Effect of manganese deficiency on plasma-membrane lipid
composition and glucose uptake in A. nioer. FEMS. Microbio!.
Lett. Vol. 26: 271-274, 1985.

(200)
195w- Meyrath, J. Process. Biochem. Oct.: 25-28~ 1967.
196.- Mial, L. The filamentous fungi. Industrial
Mycology. Editado por Smith, J, y col. Vol. 1, 1975.
197.- Millis, N.; Trumpy, H. y Palmer, B. The effect of
lipids on citric acid production by an A. niger mutant. J.
Gen. Microbio!. Vol. 30: 365-379, 1963.
198.- Miles Laboratorio C.A. Patente Britanica 3 908,024
(1962).
199.- Miura, Y. y Ghose, T. Adv. Biochem. Eng. Vol. 4,
1976.
200.- Moat, A. Microbial Physiology. A Wiley & Sons.

Interscience publication, 1979.
201.- Molliard, M. C.R. Hebd. Sences. Acad. Sci. Vol.
174: 881-883, 1922.
202.- Morse, L. Anal. Chem. Vol. 19: 1012-1013, 1947.
203.- Morrinson, J. y Pelers, R. Biochem J. Vol. 58:
473' 1954.
(201)
204.- Mosbach, E.; Phares, E. y Casan, S. The role of
one carbon compounds in citric acid biosynthesis. Arch.
Biochem. Vol. 35: 435-442, 1952.
205.- Moyer, A. Effect of alcohols on the mycological
production of citric acid in surface and submerged culture.
Appl. Microbio!. Vol. 1: 7-13, 1953.
206.- Ng, M.; Smith, J. y Mcintosh, A. Influence of
dilution rate enzyme synthesis in A. niger in continuos
culture. J. Gen. Microbio!. Vol. 81: 425-434, 1974.
207.- Nieman, C. Patente USA# 3044941, 1954.
208.- Noguchi, Y. y Johnson, M. Citric acid fermentation
of sugar purified with chelating resin. J. Bact. Vol. 82:
538-541 ' 1961.
209.- Norris, R. Chemical Process Industrial. Vol. II,
cuarta edición, 1977.
210.- Nowakowskawaszczuk, A. The effect of acetate on
the production of citric acid by A. niger. Appl. Microbio}.
Biotech. Vol. 20 (6): 416-418, 1984.

( 202)
211.- Orthofer, R.; Kubicek, C. y Rohr, M. Lipid levels
and manganese deficiency in citric acid producing strains of
A. niger. FEMS. Microbio!. Lett. Vol. 5: 403-406, 1979.
212- Owen, W. Citric acid a most important by product.
Sugar. Vol. 50: 38-42, 1955.
213.- Panda, T. Studies on citric acid production by ~
niger using trated indian cane melasses. Process. Biochem.
Vo 1 • 1 9 <5 > : 183-187 , 1 984 •
214.- Parges, N. Am. J. Batany Val. 19: 559, 1932.
215.- Patarau, M. Citric acid in the " By-Product of the
cane sugar industry. Elservier Publishing C.O., 1969.
216.- Peppler, H. y cal. Microbial Technalagy. Segunda
edición. Val. l. Academic press, 1979.
217.- Perkin, L. Tesis, Delft, 1938, Citado por
Prescott, 1962.
218.- Perlman, D.; l<ila, D. y Peterson, W. Productian of
citric acid from cane molasses. Arch. Biachem. Biophys. Vol.
11: 123-_129' 1946.

(203)
219.- Perlman, D.; Dorrell~ W. y Johnson, M. Effect of
metallic ions on the production of citric acid by A. niger.
Arch. Biochem. Vol. 11: 131-143, 1946.
220.- Per lman, D. Mycolog ica 1 produc tion of e i tr ic ac id.
The submerged culture method. Econ. Botany. Vol. 3: 360-374,
1949.
221.- Perlman, D. Fungal synthesis of citric, fumaric
and itaconic acids. Progress. Ind. Microbio!. Vol. 2: 168,
1960.
222.- Perlman, D. Fermentation advances. Academic Press,
N. Y., 1969.
223.- Pfizer. Products for petroleum produc tion
technical. Bulletin i 97. Pfizer, INC, N.Y., 1961.
224.- Pfitzner, A. Presence and regulation of ATP
citrate lyase from the citric acid producing fungus A. niger.
Arch. Microb. Vol. 147 (1): 88-91, 1987.
225.- Pontecorvo, G. y Roper, S. J. Gen. Microbio!. Vol.
8 : 198-21 o ' 1953 •
226.- Poorse, H. Ind. Eng. Chem. Vol. 15: 775, 1923.

(204)
227.- Porges, N. C i tr ic ac id produc tion by A • n iger • Am •
J. Botany. Vol. 19: 559-567, 1932.
228.- · Potvin, J.; Oesrochers, .M. y Yves Arcand.
Fermentation of Kraft black liquor for the production of
citric acid by Candida tropicalis. Appl. Microbio!. Biotech.
Vol. 28: 350-355, 1988,
229.- Prescott, S. y c. Microbiología
Industria 1. Tercera edición. Editorial Aguilar, pags.
561-606' 1962.
230.- Pucher, G. J. Biol. Chem. Vol. 156: 33, 1944.
231.- Puente, A. y Regueiro, B. Estudios sobre la
producción de ~cido citrico por fermentación. Microbio!. Esp.
Vol. 15: 35-58, 1962.
232.- Punekar, N. Mechanisms of citric acid fermentation
by A. niqer. J. Sci. In. R. Vol. 43 <7>: 398-464, 1984.
233.- Purohit, H. y Ratledge, C. Mitochondrial location
of pyruvato carboxylase in A. niger. FEMS. Microbio!. Lett.
Vo 1 • 55 : 129-132 , 1 988 .
( 205)
234.- Ouestel, J. Metabolic inhibitors. Vol. 2. Academic
Press, 1985.
235.- Quilico, A. y Di Capua, H. I'inluenza del ferro
sulla fermentazione citrica dell' A. niger. Chimica e
industria • Vo 1 • 14 : 289 ~ 1932 •
236.- Ouilico, A.; Panizzi, L. y Visconti, S. Richerche
sulta fermentatione citrica con mutantis indoti de A. niger.
Ru C. Accad. Linei. Vol. 6: 40, 1949.
237.- Ouillet. Diccionario Enciclopedico. Tomo II, 1970.
238.- Quintero, R. y Bolivar, F. Ingeniería Bioquímica.
Editorial Alambra, 1979.
239.- Raistrick, H. y Clark, H. The mechanism of oxalic
acid formation by A. niger. Biochem. J. Vol. 13: 329, 1919.
240.- Ramakrishnan, C. y Martín, S. Can. J. Biochem.
Phys io 1 • Vo 1 • 32: 434 , 1954 •
241.- Ramakrishnan, C. Enzymologia. Vol. 71. Fas. 3:
169', 1954.
(206)
242.- Ramakrishnan, C.; Steel~ R. y Lentz, C. Mechanism
of citric acid formation and accumulation in A. niqer Arch.
Biochem. Biophys. Vol. 55: 270-273, 1955.
243.- Ramakrishnan, C. y Martin, S. Arch. Biochem. and
Biophys. Vol. 55: 403, 1955.
244.- Rapper, K. y Fennell, D. The genus Aspergillus.
Editado por Willians y Wilkins. 1965.
245.- Rathose, H. A new Spectrophotometric method for
the determination of citric acid. Annali Di. Chimica. Vol. 74
(11): 873-880, 1984.
246,- Raulin, J. Etudes chimiques sur la vegetation.
Ann. Sci. Nat. Botan. Vol. 11: 93-299, 1869.
247.- Reigel, E. Citric acid. Industrial Chemicals.
Editado por Wiley & Sons, 1974.
248.- Rhodes, A. Principios de Microbiología Industrial.
Ed. Acriba, España. 1969.
249.- Rippon, J. Medical Mycology. Ed. Sandins, W.,
1974.
( 207)
250.- Riviere~ J. Indusb-ial applications of
microbiology. Ed. Jhon Wiley & Sons, 1977.
251.- Rohr, M.; Stadler~ P.; Salzbrunn, W. y Kubicek, C.
An improved method for characterization of citrate production
by conidia of A. nioer. Biotechnol. Lett. Vol. 1: 281-286,
1979.
252.- Rohr, M.; Zehentgruber, O. y Kubicek, C. Kinetics
of biomass formation and citric acid production by A. niger
on pilot scale. Biotech and Bioeng. Vol. 23: 2433-2445, 1981.
253.- Rohr, M. y Kubicek, C. Regulatory aspects of
citric acid fermentation by A. nioer. Process Biochemistry.
June/July: 34-37, 1981.
254.- Roh1-, M.; Kubicek, C. y Kominik, J. Citric acid.
Biotechnology. Vol. 3: 5- 45, 1983.
255.- Rohr, M.; Kubicek, C.; Zehentgruber, O y Q¡-thofer,
R. Accumulation and partial re-consumption of polyols during
citric acid fermentation by A. niqer. Appl. Microbio!.
Biotech. Vol. 27: 235-239, 1987.
256.- Roukas, T. Production of citric acid from brewery
wastes by surface fermentation using ~-iqer. J. Food. Sci.
V o 1 • 51 <1 > : 225 , 1 986 •

(308)
257.- Roukas, T. y Kotzekidou, P. Influence of sorne
trace metals and stimulants on the citric acid production
from brewery wastes by A. niqer. Enzyme Microb. Technol. Vol.
9: 291-294, 1987.
258.- Rusman, B. Economic analysis of fermentation
processes. CRC. Press, 1988.
259.- Safran, M. y Denstedt, F. A rapid method for the
determination of citric acid. J. Biol. Chem. Vol. 175: 849,
1948.
260.- Saha, J. y Jain, N. Can e sugar juice
clarification. Proc. Sugar. Technol. Assoc. India Vol. 2:
162-165, 1953.
261.- Salvat. Enciclopedia Salvat de ciencia y
tecnología. Tomo# 1. Primera edición. Salvat editores, 1967.
262.- S8nchez, J.A. Procesamiento y utilización de
vinazas de destilerías. Lab. de Fermentaciones. ULA. Mérida,
1984.
263.- Sánchez, A. Fermentación cítrica de la melaza de
caRa de az6car. Rev. Soc. Quim. Mex. Vol. 8: 61-67, 1964.

(209)
264.- Sánchez, A.; Fachler, M.; vierna, L. y Meza, 6.
Características reologicas de la fermentación citrica y su.
implicacion en el diseño a mayor escala. Rev. Latamer.
Microbio!. Parasitol. Vol. 11: 25-32, 1969.
265.- Sénchez, A.; Vierna, L. y Meza Graciela. Mutantes
de A. niger en la producción de écido citrico. Rev. Lat.
Amer. Microbio!. Parasitol. Vol. 11: 191-198, 1969.
266.- Sénchez, A.; Carreña, R. y Ledezma, M. Effect of
the trace elements on citric acid fermentation by A. niger.
Appl. Microbio!. Vol. 20 (6): 888-892, 1970.
267.- Saz, H.J. The enzyme formation of glyoxalato and
succinato from tricarboxylic acid. Proceding of the
biochemical society • Vol. XX, 1953.
268.- Scott, T. Determination of dextran with anthrone.
Analytical Chem. Vol. 25 <11): 1656, 1953
269.- Scheele, W. Crells. Ann. Vol. 2 1, 1789.
270.- Schierholt, J. Fermentation processes for the
production of citric acid. Process Biochemistry. Noviembre:
20-21, 1977.
(210)
271.- Schreferl, G.; Kubicek, C. y Rohr, M. Inhibition
of e i tr ic ac id accumula tion by Mn ions in A. n iqer mutan ts
with reduced citrate control of phosphofructokinasa. J. Bact.
Vo 1 • 165 <3 > , 1 986
272.- Schreferl, G.; Grotz, M.; Rohr, M. y Kubicek, C.
Increased citric acid production by mutants of A. niqer with
increased glycolytic capacity. FEMS. Microbio}. Lett. Vol.
59: 297-300, 1989.
273.- Schreyer, R. Biochem Zeit. Vol. 202: 131, 1928.
274.- Schweiger, L. Production of citric acid by
fermentation. Patente USA. # 2,970,084, 1961.
275.~ Shamala, T. Ind. J. Microbio!. Vol. 76, 1985.
276.- Shiga, T. Un tersuchungen uber du
citronensauregarung zuckerrohmelasse durch A. niqer. J.
Agric. Chem. Soc. Japon. Vol. 27: 118, 1953.
277.- Shu, P y Johnson, M. Effect of the composition of
the sporulation medium on citric acid production by A. niqer
in submerged culture. J. Bact. Vol. 54 <2): 161-167, 1947.

(211)
278.- Shu, P. y Johnson, M. The interdependence of the
medium constituents in citric acid production by submerged
fermentation. J. Bact. Vol. 56: 577-585, 1948.
279.- Shu, P. y Johnson, M. Citric acid fermentation
with A. niger Ind. Eng. Chem. Vol. 40 (7): 1202-1205, 1948.
280.- Shu, P. J. Agríe. Food. Chem. Vol. 1: 1119-1126,
1953.
281.- Shu, P.; Funk, A. y Neish, A. Mechanism of citric
~cid fermentation from glucose by A. niger. Can. J. Biochem.
and Physiol. Vol. 32: 68-80, 1954.
282.- Shukla, J. y Misra, H. Production of citric ~cid
from sacarina raw materials by surface ~rowth of A. niger
from low grade sugar products and molasses. Proc. Sugar
Technol. Asocc. India. Vol. 11: 88-93, 1956.
283.- Singh 1 ·V.; Vadehra, D. y Gaptas, J. Ocurrence of
an organic ~nhibitor in cane molasses affecting citric acid
production. Enzyme Microb. Vol. 3 (4): 341-343, 1981.
284.- Slanbury, P. Principies of fermentation
technology. Academic Press, 1988.

(212)
285.- Smith, J.; Nowakowska, E.; Waszuk, A. y Anderson,
J. Ind. Aspect. Biochem. Vol. 1 :297 ~ 1974.
286.- Smith, J. y Paleman, J. Genetics and Physiology of
Aspergillus. Academic Press, N.Y., 1977.
287.- Sobotka, M.; Machan~ V.; Seichert, L.; Ujcova, E.
y Marschalkova, z .• Chemical engineering aspects of submerged
production of citric acid. Folia Microbio!. Vol. 30: 381-392,
1985.
288.- Sodeck, G.; Modl, J.; Kominek, J. y Solzbrunn, W.
Production of citric acid according to the submerged
fermentation. Process Biochemistry. Oct./Nov., 1981.
289.- Solorzano, E. Principales caracteristicas del
diseRo de un fermentador industrial para producción de écido
citrico. Tesis de grado. Fac. de Ing. Quim., U.C.V., 1971.
290.- Spencer, A. y Lowenstein, J. Citrate content of
liver and kidney of rat in varius metabolic states and in
fluoracetate poisoning. Biochem. J. Vol. 103: 342-348, 1967.
291.- Steel, R.; Lentz, C. y Martin, S. Can. J.
Microbio!. Vol. 1: 299-311, 1955.

( 213)
292.- Steimbe)-g, R. A. A study of sorne fac tors in the
chemical stimulation of the growth of A. niger. Am. J.·
Botany. Vol. 6: 330-372, 1919.
293.- Steimberg, R.A. The nutritional requeriments of
the fungus A. niger. Bull. Torrey. Bot. Club. Vol. 62: 81-90,
1935.
294.- Steimberg, R.A. A dibasal solution (mineral salt,
maximun yield for A. niqer: acidity and Mg optimum. Plant.
Phys io 1 • Vol . 20 : 600-608 , 1 945 •
295.- Steimberg, R.A. Specificity of K and Mg for the
growth of A. niger. Am. J. Bot. Vol. 33: 210-214, 1946.
296.- Supplee, G. y Bellis, B. J. Biol. Chem. Vol. 48:
453, 1921.
297.- Swanson, C. The effect of supplementary factors in
the radiaction-induced frecuency of mutations in Asperqillus
ter rus J • Ce ll • Comp. Phy. Suplemento # 1 : 27-38, 1962.
298.- Szucs, J. Patente USA.# 235377118, (1944).
299.- Tabuchi, T. y Hara, S. Nippon Nogeikagaku kaishi.
Vol. 48: 417-424, 1974.

(214)
300.- Tejwani, C. y Ramaah, A. Biochem. J. Vol. 125:
507-514, 1971.
301.- Thies, W. Zentr. Bakt. Parasitenk. Part. II. Vol.
82: 321, 1930.
302.- Thom, C. y Currie, J. Aspergillus nioer. Group.
Oxalic-Acid. Production of species of Aspergillus. J. Agr.
Research. Vol. 7: 1-5, 1916.
303.- Thom, C. y Church, M. The Aspergilli. The Williams
& Wilkins, 1926.
304.- Tomlinson, N. y Campbell, J. The influence of Zn,
Fe y Mn on the production of citric acid by A. niger Part. I
J. Bact. Vol. 59: 217-227, 1950.
305.- Tomlinson, N. Y Campbell, J. The influence of Zn~
Fe, Cu y Mn on the production of citric acid by A. niger.
Part II. J. Bact. Vol. 61: 17-25, 1951.
306.- Treton, B.; Le Dall, M. y Heslot, H. Excretion of
citric and isocitric acids by the yeast Saccharomycopsis
lipolytica. European J. ~ppl. Microbio!. Biotech. Vol. 6:
67-77, 1978.
( 215)
307.- Trumpy~ H. y Millis, N. Nub-itional requel-ements
of a A. n iger mutan ts e i tr ic ac id produc tion. J. Gen.
Microbio!. Vol. 30: 381-393, 1963.
308.- Tsay, S. y To, K. Citric acid production using
inmobilized conidia of A. niger TMB 2022. Biotech. Bioeng.
Vol. 29: 297-304, 1987 •
•
309.- UNCTAD-GATT. Centro de comercio internacional. El
mercado de los productos químicos a base de sacarosa en
especial: El ácido cítrico, el sorbitol y los ésteres del
azúcar. Ginebra, 1972.
310.- Ullman, R. Enciclopedia de química industrial.
Sección II. Editorial Gustavo Gilli, 1931.
311.- Vaija, J.; Linko, Y. y Linko, P. Citric acid
production with alginate bead entrapped A. niger. Appl.
Bioch. Biotech. Vol. 7: 51-54, 1982.
312.- Vaija, J. Continuous citric acid production by
immobilized A. niger reactor pe¡-formance and fermentation
kinetic. J. Mol. Catal. Vol. 38 (3): 237-253, 1986.
313.- Van Loesecke, H. A review of in forma tion on
mycological citric acid production. Chem. Eng. News. Vol. 23:
1952-1959' 1945.
314.- Wang, C. Fermentation and enzyme technology. John
Wiley & Sons, 1978.
315.- Warne, F. Ind. Eng. Chem. Vol. 17: 1283, 1925.
316.- Webbs, F. Drganic acids. In Biochemical
Engineering. Editorial Acriba, 1966.
317.- Wehmer, C. Note sur la fermentation citrique.
Bull. Soc. Chem. Vol. 9: 728-730, 1893.
318.- Wehmer, C. Chem. Ztg. Vol. 36: 1106, 1912.
319.- Wehmer, C .• Ber. Vol. 58: 2616, 1925.
220.- Weimberg, E. Adv. Microbiol. Phys. Vol. 4, 1970.
321.- Wells, P.; Moyer, A. y May, O. The chemistry of
the citric acid fermentation. Part. I: The carbon balance. J.
Am. Chem. Soc. Vol. 58: 555, 1936.
322.- Wells, P. y Herrick, A. lnd. Eng. Chem. Vol.
30:255~ 1938.
323.- West, E. Bioquimica general. Edit. Acriba, 1969.

t 217)
324.- Williams, R. Free Mn y Fe cations can act as
intracellular controls. FEBS Lett. Vol 140: 3-10, !982.
325.- Wingossen, J. Patente USA# 3869272, 1975
326.- Woodward, J. Patente USA# 2492673, 1949.
327.- Woodward, R. Patente USA # 2514689, 1950.
328.- Wold, W~ y Suzuki, A. The citric acid fermentation
by A. nioer regulation by Zn of growth and acidogene~is. Can.
J. Microbio!. Vol. 22: 1083-1092~ 1976.
329.- Wolff, L. y Emmerie, A. Uber dar des Wachstum der
A. niqer und den kupfergehalt des nahrbodeus. Biochem Z. Vol.
228: 441-450, 1930.
330.- Xu, D.; Kubicek, C. y Rohr, M. A comparation of
fac tors inf luenc ing e i tr ic ac id produc tion by A. n iger g¡-o¡.m
in submerged culture and on f i 1 ter papel- • App 1 • Mict-ob io 1 •
Biotech. Vol. 30: 444-449~ 1989.
331.- Xu, D.; Madl-id, C.; Roh¡-, M. y l<ubicek, C. The
influence of type and concentration of the carbon source on
production of citric acid by ~- niger. Appl. Microbio!.
Biotech. Vol. 30: 55:-558, 1989.

(218)
332~- Yabula, Y. Ger. Offer. Vol. 2: 163, 1972.
333.- Yull, J. Fermentation with mixed strains of ~
niqer. Proceeding of the biochemical Society. Vol. 19, 1946.
334.- Zakowska, Z. Separation of sorne fractions of sugar
beet molasse which are toxic in production of citric acid.
Act. Biotech. Vol. 4 <2>: 171-178, 1984.
335.- Zamora, R. Producción de proteínas celulares a
partir de extractos acidos de paja de arroz. Tesis de grado.
Fac. de Ciencias. ULA., Mérida, 1984.
336.- Zehentgruber, D.; Kubicek, C. y Rohr, M.
Alternative respiration of A. niger. FEMS Microbio!. Lett.
Vol. 8: 71-74, 1980.
337.- Zeteloki, K. Biotech and Bioeng. Vol. 12: 379-397,
1970.
338.- Zonnereld, B. Arch. Microbio!. Vol. 105: 101,
1975.
View publication stats

Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger

Uploaded by

Document Information

Original Description:

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

Estudio ﬁsiológico de la producción de acido cítrico por el mutante Fal A. 3. 0 de

The user has requested enhancement of the downloaded file.

ESTUDIO FISIOLOGICO DE LA PROGUCCION DE AC!GO CITRICO

TRABAJO ESPECIAL DE G~AGD PRESENTADO ANTE .

L I CE-·K.' I f~DO EN B :: DL_C·E: {~

FELIX DANIEL ANOUEZA LEAL

COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TITULO DE

MAGISTER SCIENliARUM EN BlOLOGIA MOLECULAR OPCION

El presente trabajo fué realizado en

!'"lEF: TIJf-f ~ 19'-:.1

La creciente demanda de alimentos, medicinas, sustancias

orgánicas de interés industrial y otros bi7nes de consumo, ha

dado origen a nuevas áreas de investigación. De maner.a

especial, la producción de alimentos, de antibióticos y de

diversos metabolitos asl como la utilización de los recursos

naturales renovables, ha adquirido gran importancia tanto en

e 1 campo de la Ciencia COI'f'O en e 1 de ¡;a economia y en e 1'

estas á¡-eas tienen un efec¡to di¡-ecto, y en ocasiones

inmediato, sobre los diferrntes grupos que componen la

Desde hace miles de a~os el hombre ha utilizado los

métodos biológicos para producir y conservar sus alimentos y,

también, para obtener productos que le han ayudado a mejorar

su salud. Sin saber lo, ha utiliz'ado un recurso renovable que

no solo proporciona un bienestar económico si no que,

además, en muchos casos, le ayuda a salvar la vida. Este

recurso renovable son los microorganismos.

Los principios de la microbiologia industrial fueron

establecidos cuando Pasteur, a mediados del siglo pasado,

producida por levaduras <Prescott, 1962}. Desde ese momento

hasta la segunda Guerra Mundial se desarrollaron muchos

procesos industria les de fermentación. Fundamentalmente ·las

fermentaciones alcohólicas y la producción de ácidos acético

y citrico <Aiba, 1972).

Los procesos clásicos, utilizados durante ese periodo

fueron el cultivo sumergido anaeróbico y el cultivo en

superficie aeróbico <Prescott, 1962). Sin embargo, debido a

la necesidad apremiante de producción de antibióticos durante

la I I Guerra Mundial, hubo que utilizar· un proceso industrial

más rápido y eficiente que los comunmente utilizados.·Este

fue el cultivo sumergido aeróbico en tanques agitados

En los af'ros cuarenta y cincuenta se lograron grandes

avances tecnológicos en el cultivo microbiano, y se

desarrolló el fermentador agitado con controles automáticos

<Aiba, 1972>. La mayoria de los procesos utilizados en esa

época eran aeróbicos y operaban de manera discontinua.

Durante las décadas de los sesenta y setenta, se

establecieron los procesos de cultivo continuo <Peppler,

1979>, los métodos de inmovilización celular <Chibata, 1974>,

las técnicas de mejoramientó genético de cepas microbianas

por ingenier ia genética y la utilización de desechos

agroindustriales como sustratos de las fermentaciones

(Quin-t:-ero, 1980). Todos estos avances han abierto nuevos

campos para la producción industrial de sustancias org~micas

Desde un punto de vista tecnológico~ para un pafs con

las condiciones socieconómicas de Venezuela (abundancia de

mano de obra barata y de recursos naturales renovables y

recursos económicos 1 imitados> , los problemas pueden ser

atacados empleando técnicas y métodos microbiológicos

adecuados. Entre esos problemas resaltan los de producción de

alimentos para animales, medicamentos, sustancias orgánicas

de uso industrial, además de los relacionados con la