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Objetivo: Optimizar los diferentes parámetros para generar la mejor sensibilidad para cada
analito.
Ajuste de Probe
Ajuste 4500 TQ/4500 Qtrap 3200 TQ/3200Qtrap
5500TQ/5500Qtrap 4000 TQ/4000Qtrap
Vertical( mm) 7 10
Horizontal(mm) 5 5
b) Llene la jeringa con la solución del compuesto a optimizar (recuerde que la solución debe
contener agua e idealmente el modificador de la fase móvil), cuidando de no generar
burbujas.
c) Coloque la jeringa en la Harvard Pump con delicadeza, esta debe quedar asegurada y en
correcta posición. El instructor le señalará como debe realizar esta operación.
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d) Luego manteniendo presionado el botón(dorado) que se encuentra al costado de la plataforma
móvil, debe desplazar esta, hasta topar el embolo de la jeringa.
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2- Configuración Analyst Sofware:
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a) Observe que el perfil seleccionado este de color verde.
e. Cierre la ventana.
f. seleccione en la barra de herramientas lateral izquierda la sección Tune and calibrate → abrir
pantalla manual tuning. Si no abre inténtelo nuevamente puede que el detector no esté
operativo aún. si observa un mensaje léalo, interprételo, e inténtelo nuevamente
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h. Pantalla Manual Tunning
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e) Aparecerá la pantalla normal de Manual Tuning
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b. Seleccione polaridad de trabajo: Polarity →Positive o Negative
d. Indique un Rango de masas: depende del Ion que se busque Ej: si su analito a fragmentar es
de 350Da, seleccione un rango de 300Da a 400Da.
e. En la columna Time, colocar un valor de 1 sec. Si se coloca en gris (inactivo) esta columna
significa que el modelo de su detector calcula automáticamente este valor.
f. Indique la duración de su análisis en minutos (5 minutos), en la casilla Duration.
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h. Se desplegara la ventana Acquire to Disk
i. Ingrese un nombre de data filename tal como Diciembre 2013 (carpeta donde se guardaran
las inyecciones pertenecientes a esa secuencia de trabajo). Si ya ha efectuado este paso para
otro analito puede usted buscar por ejemplo la carpeta Diciembre 2013 en Browse, para que
todas sus optimizaciones queden ubicadas en la misma carpeta.
l. Presione Ok.
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o. Verifique presencia de los iones esperados.
g) Verifique que la intensidad del Total Ion sea alrededor de 1x10E6 cuentas, si esto no es así
diluya o concentre la solución. Recuerde que sobre este valor el detector podría saturarse.
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4- Optimizando Declustering Potential. (Intensidad max. 1xE6)
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e. Ingrese los parámetros: Start = 0
Stop = 200,
Step= 5 ,Clic
f. Presione OK.
g. Se seleccionara automáticamente el recuadro Ramp parameter, presione el Boton Start
h. Presione Acquire
i. Se desplegara la ventana de análisis en línea de DP.
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j. Realizar un doble clic sobre la ventana TIC.
k. Se desplegara una nueva ventana
l. Clic y mantener presionado el botón izquierdo del mouse, desplazar la barra a través del
cromatograma hasta encontrar la máxima intensidad del ion precursor en la ventana
desplegada anteriormente.
o. El Valor Entrance Potencial (EP) se sugiere siempre en 10, sin embargo puede ser
optimizado.
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5- Product Ion Scan : Se utiliza para encontrar los fragmentos de los Iones precursores.
a. Seleccione Scan Type → Product Ion (MS2)
d.
e. Ingrese la m/z del Ion Precursor en el recuadro Product Of, solo se puede fragmentar un
precursor a la vez.
f. Ingrese un rango de masas adecuado para su compuesto en particular. Ej: si su analito tiene
m/z de 350 Da, escogerá un rango de 50 a 360, lo cual le permitirá ver todos los fragmentos y
el ion precursor.
g. Time Sec utilizar 1 sec. Si su sistema es un modelo 4500 o superior, esta columna es
controlada por el software.
h. Ingrese en la tabla los valores DP, EP previamente seleccionados y CE un de 5 volt y un
CXP de 5 Volt.
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i. Presione Acquire, rellene los datos solicitados y presione start.
j. Usted deberá observar que prácticamente no hay fragmentación del Ion Precursor, se observa
a la derecha del gráfico.
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k. Aumente el CE de 5 en 5 hasta obtener la fragmentación Ideal
l. Verifique que los fragmentos buscados estén presentes en la fragmentación, si no los conoce
escoja los más abundantes y estables.
m. Guarde el espectro en la librería del Sofware. (si lo requiere), si usted tiene un detector
hibrido Qtrap, utilice Enhance Product Ion con un CES de 15.
6- Optimizando Collision Energy para cada ion producto. Este valor es individual para cada
Precursor/ Ion Producto.
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d) Seleccione Collision Energy (CE) Parameter
f) Presione OK.
g) Verifique que MCA no este seleccionado.
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j) Realizar un doble clic sobre la ventana TIC.
k) Se desplegara una nueva ventana
l) Clic y mantener presionado el botón izquierdo del mouse, desplazar la barra a través del
cromatograma hasta encontrar la máxima intensidad del ion precursor en la ventana desplegada
anteriormente. Observe que en la nueva ventana desplegada (abajo) se ven dos señales usted
debe considerar en la evaluación para escoger CE la que tenga la m/z de su Ion producto no
confundirse con los isotopos.
7- Optimizando Collision Cell exit Potential(CXP) para cada ion producto. Este valor es
individual para cada Precursor/ Ion Producto.
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c. Ingrese el fragmento a optimizar en la columna Center(Da)
g. Presione OK.
h. Clic en el botón Acquire.
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i. Seleccione el valor mas adecuado para CXP, siguiendo el procedimiento antes descrito para
evaluar CE.
p) Llene un registro con los valores de CXP seleccionados para cada m/z optimizada.
a) Seleccione desde la barra de herramientas lateral con un doble Clic la opción Build
Acquisition Method.
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b) En la ventana desplegada seleccione el scan type MRM
d) ingrese el valor de su Ion Precursor en la casilla indicada como Q1 Mass (Da), y al fragmento
de cuantificación en la casilla Q3 Mass (Da), en la columna Dwell Time (Time Sec),
coloque un valor inicial de 200msec (este valor cambiará dependiendo del número de
transiciones ingresadas), en la columna ID ingrese el nombre del Analito con un espacio y un
1, indicando al software que esta es la primera transición. y un 2 si es la transición de
calificación.
e) Seleccione haciendo un clic con el botón derecho del ratón, sobre la tabla, en el menú
desplegado seleccione DP, CE, CXP.
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f) Ingrese los valores de DP, CE, CXP, Individuales optimizados para cada transición (Ion
molecular/Ion fragmento)
i) En la ventana desplegada seleccione la viñeta Source/Gas, Ingrese los valores básicos para
realizar optimización de la Fuente (FIA)
j) Presione OK
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k) Guarde el método de adquisición generado.
l) Verifique que este en el proyecto que corresponde a su analito,
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