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Tabla de contenido
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 3
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 4
2.1 Nombres comunes ................................................................................................................... 4
2.2. Clasificación taxonómica ........................................................................................................ 4
2.3. Descripción botánica ............................................................................................................... 4
2.4. Distribución geográfica ........................................................................................................... 6
3. MATERIALES ........................................................................................................................... 6
3.1. Material vegetal: obtención de esquejes ................................................................................. 6
3.2. Medio de cultivo para esquejes de Citrus reshni var. “Cleopatra” ..................................... 7
4. METODOLOGIA ....................................................................................................................... 7
4.1. Protocolo de esterilización de esquejes ................................................................................... 7
4.1.1. Método 1: ............................................................................................................................ 7
4.1.2. Método 2: ............................................................................................................................ 8
4.1.3. Método 3 ............................................................................................................................. 9
4.1.4. Condiciones de incubación ................................................................................................. 9
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES .......................................................................................... 10
5.1 Determinación de la cantidad de esquejes contaminados ..................................................... 10
6. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 18
7. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 19
8. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 20
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1. INTRODUCCIÓN
El género Citrus se cultiva en más de 100 países, por lo que es uno de los cultivos frutales
comerciales más importantes en términos de valor económico y nutrición humana (Barlass y
Skene, 1986). Las mandarinas son cultivadas por sus propiedades nutricionales y medicinales,
entre las que se destacan las siguientes, su mayor componente es el agua y, respecto a otras
frutas de su género aporta menos cantidad de azúcares y por tanto menos calorías, la cantidad
de fibra es apreciable y se encuentra sobre todo en la parte blanca entre la pulpa y la corteza y
su consumo favorece el tránsito intestinal. De su contenido vitamínico sobresale la vitamina C,
el ácido fólico y la provitamina A, más abundante que en cualquier otro cítrico, también
contiene cantidades destacables de ácido cítrico, potasio y magnesio. En menor proporción se
encuentran ciertas vitaminas del grupo B y minerales como el calcio, aunque de menor
aprovechamiento que el que procede de los lácteos u otros alimentos que son buena fuente de
dicho mineral. La provitamina A o betacaroteno se transforma en vitamina A en nuestro
organismo conforme este lo necesita. Dicha vitamina es esencial para la visión, el buen estado
de la piel, el cabello, las mucosas, los huesos y para el buen funcionamiento del sistema
inmunológico. La vitamina C interviene en la formación de colágeno, huesos y dientes,
glóbulos rojos y favorece la absorción del hierro de los alimentos y la resistencia a las
infecciones. (Robles, 2010).
El cultivo in vitro de cítricos ha sido una metodología de gran utilidad para complementar los
programas de mejoramiento genético de estas especies. Diversas estrategias de regeneración
han sido establecidas para estos propósitos. Estas se basan principalmente en el cultivo de
brotes apicales, microesquejes, epicotíleos y germinación de semillas. El desarrollo de técnicas
biotecnológicas ofrece nuevas alternativas para el mejoramiento de cítricos. Entre ellas, la
transformación genética tiene gran potencial y permite la introducción de genes que modifican
características de interés agronómico, manteniendo las características originales de una
variedad y evitando la transferencia de características negativa (Vargas, 2003).
Por lo tanto, de acuerdo al trabajo realizado y a la selección de esta especie vegetal, el presente
informe tiene como objetivo determinar un protocolo de esterilización eficiente de los esquejes
de mandarina cv. “Cleopatra” (Citrus reshni) que pueda ser implementado para su cultivo in
vitro, tomando en cuenta las posibles adversidades que pudieran derivarse del presente estudio.
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2. MARCO TEÓRICO
División : Espermatofita
Subdivisión : Angiosperma
Clase : Dicotiledónea
Subclase : Arquiclamídea
Orden : Sapindales
Familia : Rutáceae
Subfamilia : Aurantioideae
Género : Citrus
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Figura 1: Estructura vegetativa de Citrus reshni var. “Cleopatra”, obsérvese las hojas
oblongoovales, la estructura floral, y los frutos tipo cidra.
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2.4. Distribución geográfica
Originario del sureste de Asia, es muy conocido y cultivado en todas las regiones tropicales
por el sabroso sabor de sus frutos. Se distribuye en las áreas subtropicales (30-40º latitud norte
sur) donde su producción es estacional y la calidad del fruto para el consumo en fresco es
excelente. La producción mundial de mandarinas muestra un ritmo de crecimiento más
dinámico que el de las naranjas (países comprendidos: Estados Unidos, México, España,
Portugal, Italia, China, Corea, Japón, Egipto, Israel, Turquía, Chile, Argentina, Australia)
(Robles, 2010).
3. MATERIALES
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3.2. Medio de cultivo para esquejes de Citrus reshni var. “Cleopatra”:
Se usó un medio de cultivo compuesto por medio básico (MS) (Murashige & Skoog, 1962).
Para la formulación del medio MS se adicionaron 30 g/L-1 de sacarosa; 7,5 g/L-1 de agar-agar.
El pH se ajustó a 5,6 con hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl), antes del
agregado del agar-agar. El medio de cultivo se vertió en frascos de vidrio que fueron tapados
con papel aluminio. Se realizó el proceso de autoclave por 30 minutos a 120º C, manteniendo
la presión entre 15 y 20 lb.
4. METODOLOGIA
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7. Se limpió y alistó la cámara de flujo laminar con los materiales necesarios para la
siembra (pinzas, cuchillas, placas Petri, alcohol 70°, mecheros, etc.).
8. Pasado los tiempos necesarios, se llevaron los frascos a la cámara de flujo laminar para
el enjuague con agua destilada estéril (se enjuagó 4 veces).
9. Se cortó el material vegetal con el fin de obtener esquejes que contengan solo 1 yema
o 2 en caso de que las yemas estén muy juntas.
10. Finalmente, se introdujeron en frascos que contenían medio MS preparado previamente
o medio MS reciclado.
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Para este método se realizaron 2 repeticiones para cada tratamiento de concentración de
hipoclorito por tiempo, es decir, se usaron un total de 6 frascos.
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5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
A) Método 1:
Figura 4: Resultados obtenidos para los frascos sembrados con el método 1. Hubo un error al
momento de rotular los frascos.
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Pasada una semana, se observó contaminación en todos los frascos, aunque algunos esquejes
estaban rescatables, no se procedió a rescatarlos porque estaban dañados superficialmente por
acción de la lejía y/o podría ser que el hongo que contaminó el medio ya haya situado sus hifas
en el esqueje que aparentaba ser recuperable (Escalona y Contreras, 2011).
25 R1 4 3
minutos R2 4 4
1.5 %
Siembra 35 R1 4 4
de minutos R2 4 2
esquejes 8
25 R1 4 4
del
minutos R2 4 4
método 1
3%
35 R1 4 3
minutos R2 4 4
Debido a los resultados obtenidos, para el próximo método se optó por usar una concentración
de hipoclorito de sodio promedio del método 1, es decir, se usó una concentración al 2 %.
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B) Método 2:
20 R1 – (A) 4 3
minutos R2 – (B) 4 2
Siembra
25 R1 – (C) 4 4
de
minutos
esquejes 6 2% R2 – (D) 4 0
del 30 R1 – (E) 4 4
método minutos R2 – (F) 4 4
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Pasada dicha semana, se procedió a rescatar los esquejes de los frascos A y B dentro de un
mismo frasco que contenía medio MS. Los esquejes del frasco D se traspasaron completamente
a otro frasco que también contenía medio MS.
Debido a los resultados obtenidos, para el próximo método se optó por usar una concentración
de hipoclorito de sodio al 2 % y con un único tiempo de 25 minutos, ya que al parecer fue el
más exitoso en el método 2.
C) Método 3:
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Luego de una semana se observó lo siguiente:
R1 – (G) 4 4
Siembra 4 3
R2 – (H)
de
esquejes 4 2% 25
del minutos 4 4
R3 – (I)
método
3
4 0
R4 – (J)
Pasada dicha semana, se procedió a rescatar el único esqueje del frasco H dentro de otro frasco
que contenía medio MS. El frasco J se dejó simplemente en el banco de germoplasma
incubando a las condiciones ya anteriormente mencionadas.
D) Resiembras realizadas:
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D H J
Luego de una semana más, se evidenció contaminación en dicho último frasco resembrado.
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Figura 8: Resiembra de los frascos H y J juntos en mismo frasco.
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Gráfico 1: Se observan los porcentajes de esquejes contaminados por método de
esterilización.
Uno de los patógenos más representativos de Citrus reshni var. “Cleopatra” es el hongo
Aspergillus sp. el cual podría haber infectado a los esquejes utilizados, ya que se observó en el
medio de cultivo para los métodos de esterilización 1, 2 y 3, colonias con características
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similares a las reportadas para este hongo, las cuales fueron de color blanco, textura frondosa
de bordes enteros y de superficie lisa rodeando a los esquejes (Escalona y Contreras, 2011).
6. CONCLUSIONES
La contaminación bacteriana o por hongos, sigue siendo una continua amenaza para el cultivo
de tejidos y estructuras vegetales, es por ello que diferentes técnicas para reducir la
contaminación se encuentran disponibles. Se deben detectar las principales fuentes de
contaminación para estimar los cambios que permitan una adecuada y optimizada función de
los procesos sin sufrir estos inconvenientes, evadiendo o eliminando estas diferentes fuentes.
Debe ser considerada la identificación de contaminantes, para pruebas con antibióticos para la
determinación de concentraciones efectivas como tratamientos, evitando la fitotoxicidad en el
hospedero.
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7. RECOMENDACIONES
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8. BIBLIOGRAFIA
Becerra Vargas, D. C. 2003. Efecto del origen del material vegetal y la edad sobre la
capacidad morfogénica de dos especies de cítricos cultivadas in vitro. p. 1-177.
Fischer, I. H., & Rezende, J. a. M. 2008. Diseases of Passion Flower. Pest Technology,
2(1), 1–19.
Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiology Plant. 15:473-497.
Rákosy-Tican, E., Aurori, C. M., & Aurori, A. 2011. The effects of cefotaxime and silver
thiosulphate on in vitro culture. Romanian Biotechnological Letters, 16(4), 6369–6377.
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