Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt – 20.02.

2019

Kultury komórkowe i tkankowe są to hodowle materiału biologicznego wyizolowanego z organizmów

wyższych, które są prowadzone poza ustrojem w tz. Układach in vitro. Efektem takiej hodowli jest
produkcja klonów (organizmów mających identyczny genotyp, o ile nie są mutantami).

W przypadku roślin możemy uzyskać w pełni funkcjonalne osobniki (każda komórka zawiera genom
pozwalający na to). U zwierząt uzyskujemy jedynie populację klonów tejże komórki.

Totipotencja – każda komórka roślinna posiada cechy aby móc odtworzyć cały organizm.

Warunki in vitro – syntetyczny układ hodowlany uzyskany w celu hodowli materiału biologicznego
poza organizmem macierzystym (ograniczone pojemnością/rozmiarem naczynia)

Czynniki determinujące warunki in vitro:

 Dobrana gatunkowo kompozycja składników syntetycznej pożywki hodowlanej

 Fizyczne parametry środowiska wzrostu komórek (typ medium hodowlanego, osomolarność,
temperatura inkubacji, fotoperiodyczność (stosunek dnia do nocy), skład atmosfery, rodzaj
powierzchni itp.)
 Jałowość układu w którym prowadzi się hodowle oraz sposób odseparowania układu od
środowiska zewnętrznego (naczynie)

Przykładowe zasostanie:

 Badania podstawowe
o Funkcje biologiczne komórek organizmów wyższych
o Toksykologia i tzw. „modele in vitro”
 Otrzymywanie biofarmaceutyków
o Roślinnych metabolitów wtórnych
o Białek (enzymów, hormonów, mAb) (zwierzęce)
o Szczepionek
 Inżynieria tkankowa
o Hodowle przestrzenne (np. kości)
o Medycyna regeneracyjna
 Produkcja roślin
o Mikrorozmnażanie klonalne

Zalety i korzyści

 Otrzymywany jest jeden, ściśle określony typ komórek

 Kontrola i możliwość zmiany warunków doświadczeń
 Dostępność dowolnej ilości materiału biologicznego
 Metoda alternatywna względem badań na zwierzętach (modelowy układ do badań
fizjologicznych oraz brak ograniczeń etycznych)
Wady i mankamenty:

 Nie można traktować agregatów komórkowych jako organizmu

o Brak organizacji komórek w organizmie
o Monowarstwa a nie 3D tkanka
 In vitro nie reprezentuje układu in vivo (brak oddziaływań międzykomórkowych i
międzytkankowych)
 Nieokreślony (niemożliwy do zbadania dostępnymi metodami) wpływ niektórych naturalnych
składników medium hodowlanego, np. składników:
o Surowicy – zwierzęce
o Elicytorów i retardautów - roślinne

Teoria komórkowa:

 Komórka jest jednostką struktury i funkcjonalną jednostką wszystkich żywych organizmów

 Organizmy zbudowane są z komórek
 Komórki powstają z komórek
 Komórki zawierają informację genetyczną, którą przekazują
 Zbliżony skład chemiczny
 Przepływ energii zachodzi wewnątrz komórek

Zasadnicze różnice między hodowlani komórek roślinnych i zwierzęcych:

 Totipotencja komórek roślinnych

 Apoptoza komórek zwierzęcych ograniczająca liczbę ich podziałów
 Pasażowanie (zwierzęce częściej)
 Nieokreślony ilościowo skład pożywek

BHP:

Komórki zwierzęce mogą być groźnym materiałem czynnym biologicznie, który może być przyczyną
skażeń biologicznych.

Rodzaje śmierci komórek: (różnice na poziomie molekularnym, biochemicznym i morfologicznym) –

dla zwierzęcych komórek.

 Apoptoza
o Szczególny sposób śmierci komórki będący rezultatem jest aktywnego,
programowanego samobójstwa
 Nekroza – kataboliczne degradowanie komórek
 Czynniki indukujące śmierć mogą być biologiczne, chemiczne oraz fizyczne
 O rodzaju śmierci decyduje:
o Rodzaj i dawka czynnika
o Okres trwania ekspozycji na czynnik
o Rodzaj stymulowanych komórek
Objawy apoptozy:

 Zmniejszenie objętości komórki

 Kondensacja i biegunowe ułożenie chromatyny w jądrze
 Kondensacja cytoplazmy i deformacja błony komórkowej (zachowanie integralności organelli
i błony)
 Na wskutek fragmentacji jadra i kondensacji cytoplazmy tworzą się ciałka apoptoczny
 W układach in vivo – komórki są zjadane przez makrofagi
 W układach in vitro – wtórna nekroza
 Rodzaje apoptozy:
o Interfazowa (zachodzi przed podziałem)
o Reprodukcyjna (przechodzi przynajmniej 1 podział)
o Mitotyczna (zachodzi tylko 1 podział)

Objawy nekrozy (młotek w palec):

 Zwiększenie rozmiarów komórki

 Obrzęk organelli komórkowych
 Degradacja DNA i zmniejszenie się rozmiarów jądra
 Tworzą się wakuole
 Destrukcja chromatyny, zanik jądra
 Całkowita, strukturalne dezintegracja komórki

Klasyfikacja hodowli komórek zwierzęcych in vitro Wykład 2 – 27.02.19r

Teraźniejszość hodowli komórek

 Macierzyste i zarodkowe komórki macierzyste

 Przeciwciała monoklonalne
 Bioprodukty, z komórek endokrynnych linii komórkowych np. szczepionek, hormony
(wzrostu, insulina), interferony
 Podstawowy materiał badawczy w naukach biomedycznych
 Modele in vitro zastępujące żywe zwierzęta np. hodowle komórek jajników drobiu, hodowle
komórek sutków bydlęcych

Wpływ środowiska in vitro:

 Różnice w zachowywaniu się komórek hodowlanych in vitro w odniesieniu do warunków in

vivo wynikają z:
 Wyizolowania z 3D struktury organizmu
 Zniszczenia specyficznych interakcji międzykomórkowych obserwowanych w
wielowymiarowej przestrzeni zróżnicowanych komórek
 Hodowli komórek w postaci monowarstwy
Metabolizm komórek in vitro:

 Głównie glikoliza, w mniejszym stopniu cykl krebsa

 Istotnym problemem jest wyraźne obniżenie wydajności metabolicznej z czasem trwania
hodowli
 Brak czynników regulujących homeostazę in vivo czyli bodźców pochodzących z układu
nerwowego i endokrynnego – sprawia to, ze metabolizm w warunkach in vitro może być
stabilniejszy niż in vivo, przez co nie jest charakterystyczny dla tkanek wyjściowych, z których
komórki zostały wyizolowane

Klasyfikacja komórek i hodowli:

 Komórki adherentne (monowarstwa lub mikronośniki w hodowlach przestrzennych)

o Większość typów komórek
o Zmienna (nienatywna) morfologia
o Wymagają regularnego pasażowania
o Poddawane trypsynizacji lub oddzielane mechanicznie
o Szybkość wzrostu i wydajność sekrecji (wydzielanie produktu) limitowana dostępną
powierzchnią
o Wymagają naczyń hodowlanych o zmodyfikowanej powierzchni
 Adhezja komórek (sprawdź zdjęcie!!!)
o Komórki adherentne (ancharage dependent cells)
o Powierzchnia międzyfazowa czynnikiem środowiskowym determinujących
prawidłowy rozwój komórek
o Wieloetapowa adhezja komórek do powierzchni:
 Pokrycie (opłaszczenie) powierzchni przez białka adhezyjne (np.
fibronektyna, laminina, fetuina)
 Właściwa adhezja komórek do uprzednio przygotowanej (opłszczonej)
powierzchni dzięki białkom powinowactwa (kodhezyna, intouina)
o Ca 2+ i Mg2+ wymagane są do prawidłowej konformacji białek biorących udział w
adhezji
o Matriks zewnątrzkomórkowa stabilizująca strukturę monowarstwy
 Komórki rosnące w zawiesinie
o Komórki krwi oraz komórki zaadaptowane do wzrostu bez powierzchni stałej
o Natywna morfologia – przestrzenna
o Ułatwiony pasaż (bez trypsynizacji, tylko rozcieńczenie)
o Częste (np. dzienne) monitorowanie
o Wzrost limitowany gęstością komórek w objętości medium hodowlanego
o Wymagają ciągłego łagodnego mieszania (np. mieszanie typu wave)
o Nie wymagają specjalnych naczyń
 Wyróżniamy monokultury, kokultrury (2) oraz multikultury
 Monokultury
o Hodowle jednego typu komórek rosnących w monowarstwie
o Ekspresja jednostkowych, podstawowych funkcji komórek hodowanego typu
o Brak wpływu bodźców generowanych przez złożone wielowymiarowe zależności w
tkance/narządzie/organizmie.
o Zastosowania: badanie metabolizmu i fizjologii komórek (komórki nabłonka,
śródbłonka, fibroblasty, neurony)
  Ko i multikultury
o Hodowla polimorficznej zawiesiny uprzednio rozdzielonych (aby wiedzieć co jest w
środku) typów komórek z tendencją do samoorganizowania się w przestrzenne
struktury
o Określenie kierunku różnicowania się poszczególnych typów komórek (proliferacja
czy sekrecja)
o Natywna selekcja typów komórek w długotrwałych hodowlach
o Konstrukcje modeli in vitro symulujących układy in vivo
o Zastosowania: badanie interakcji międzykomórkowych, modele in vitro w
toksykologii, hodowle przestrzenne

Hodowle pierwotne – wyprowadzane są z materiału biologicznego pobranego bezpośrednio z

organizmu

 Natywne cechy, ponieważ pochodzą z ustroju

 Eksplanty można rozdrabniać mechanicznie jak i enzymatycznie
 Mechanicznie:
o Technika stosowana, gdy jest mała ilość tkanki (np. biopsja) lub komórki trudno się
adoptujące do warunków in vitro
o Migracja komórek z fragmentów eksplantu
 Enzymatycznie:
o Inokulum w postaci zawiesiny komórek (lub niewielkich
kilku/kilkunastokomórkowych agregatów)
o Proliferacja po etapie adhezji po powierzchni międzyfazowej (lag faza)
o Monowarstwa komórek
 Konfluencja i limitowanie właściwej szybkości wzrostu
o Konfluencja to względna miara % powierzchni zajętej przez komórki
o Efekt zahamowania kontrolowanego wzrostu w układach o wysokiej gęstości
komórek

Hodowle wgłębne (wszystkie na komórkach szczurzych i roślinnych) – rosnące w zawiesinie:

 W przypadku sekrecji produktu

o Zawiesina komórek -> okresowa hodowla
o Komórki adherentne -> możliwe ciągłe odbieranie bioproduktu
 Rodzaje biomasy komórek
o Zawiesina komórek i hodowle na mikronośnikach są zdecydowanie wydajniejsze niż
monowarstwa (klasyczna)
Hodowle przestrzenne – zwierzęce

 Zalicza się je do metod inżynierii tkankowej, której celem jest opracowywanie zamienników
tkanek i narządów na potrzeby transplantologii.
 Szybkość hodowli przestrzennych determinowana jest przez:
o Przestrzenne kontakty pomiędzy komórkami
o Charakterystyczny układ poszczególnych typów komórek
 Podział hodowli przestrzennych:
o Hodowle agregatów (pełne w środku) i sferoidów (agregatów pustych w środku –
wynika z ograniczeń dyfuzyjnych)
o Ko/multikultury organotypowe
o Hodowle na sztucznych naczyniach włosowatych
o Modele tkankowe i narządowe
o Agregaty (250-700 µm), sferoidy (powyżej 700 µm)
 Układy do hodowli przestrzennych
o Matrigel – oczyszczona macierz zewnątrzkomórkowa
o Tzw. inserty -membrany syntetyczne pokryte elementami niedopuszczającymi na
pojawienie się monowarstwy
o Termomodyfikowanalny polimer – w temp. 37°C jest stały, po schłodzeniu jest cieczą,
komórki się odrywają
o Porowate rusztowania 3D
o Układy międzyfazowe ciecz/ciecz

Wykład 3 – środowisko i medium hodowlane 6.3.2019

Środowisko hodowli – środowisko w którym wyizolowane komórki zwierzęce się rozwijają, dzielą i
różnicują, zastępuje naturalne warunki in vitro.

Czynniki kształtujące środowisko hodowli in vitro komórek zwierzęcych

 Rodzaj powierzchni na której rosną komórki

o Stałe (szkło, tworzywa sztuczne)
o Półpłynne (np. kolagen, agar, matrigel)
o Ciecz/ciecz (np. ciekłe perfluorozwiązki)
o Brak powierzchni międzyfazowej
 Skład medium hodowlanego (pożywka, dodatki proliferacyjne/sekrecyjne)
 Skład fazy gazowej nad warstwą pożywki (atmosfera CO2 i utrzymanie pH)
 Temperatura inkubacji
Rodzaj powierzchni

 Szkło (tradycyjne – do lat 90-tych powszechne)

o Zachowuje właściwości adhezyjne
o Łatwość sterylizacji dowolną metodą
o Niska cena, wielokrotne użycie
 Tworzywa sztuczne (polistyren, PVC, teflon i inne)
o Powszechnie wykorzystywane, materiały w technologii single use
o Hydrofobowa powierzchnia stwarza warunki do hodowli wgłębnej komórek
o Stosuje się wykończenia powierzchni przeciwciałami γ lub modyfikowane chemiczne
o Przezierność, niewielka grubość ścian
o Skrajnie niska cena
 Mikronośniki (polistyren, poliakrylamid, żelatyna, Sephadex)
o Do hodowli komórek adherentnych
o Surowe lub dodatkowo powlekane
o Umożliwiają rozwinięcie powierzchni
o Dodatkowe powlekanie:
 Związkami ułatwiającymi adhezję komórek
 Biopolimerami (kolagen, żelatyna)
 Naturalne białka powierzchniowe wydzielane przez komórki (fibronektyna
(do 1 mg/ml), laminia (do 5 mg/ml)
 Związki syntetyczne (poli-D-lizyna, siarczan heparanu)
 Warstwa odżywcza fibroblastów – szybkie pokrycie, wydzielanie składników

Media hodowlane – podział pożywek do hodowli komórek zwierzęcych

 Podstawowe (syntetyczne)
 Naturalne (stały się domieszkami do podstawowych)
o Surowica, Limfa, osocze krwi, wyciąg zarodkowy, frakcje krwi bydlęcej, hemolimfa
o Historycznie jako pierwsze
o Zawierają znaczną ilość nieoznaczalnych składników
o Jałowe roztwory lub w postaci liofilizowanej

Surowica – stężenia fizjologiczne!

 Jedna z ciekłych frakcji krwi (powstaje po uformowaniu się skrzepu)

 W przeciwieństwie do osocza nie krzepnie (nie zawiera czynników krzepliwości krwi ani
komórek
 Złożona mieszanina makro i mikroelementów pełniących funkcje fizjologiczne i metaboliczne
 Zawiera hormony i czynniki stymulujące wzrost, hormony regulujące metabolizm
 Białka ułatwiające adhezję, białka nośnikowe
 Inhibitory proteaz
 Witamin i soli mineralnych
Funkcje i źródła surowicy:

 Nośnik mikro i makroelementów w fizjologicznych ilościach oraz odpowiednich stosunkach

składników
 Buforowanie środowiska hodowli
 Neutralizowanie negatywnego wpływu egzo i endotoksyn
 Źródłem surowicy są żywe zwierzęta:
o Płody cieląt (surowica bydlęca płodowa)
o Krew kilkudniowych cieląt (surowica bydlęca neonatalna)
o Krew starszych cieląt i bydlęca
o Krew ludzka, końska, świńska, królicza, jagnięca, kozia, kurczęca
 Aby przechowywać surowicę należy:
o Surowicę surową przefiltrować (<= 0,2 µm), zamrozić do -20°C, wtedy można
przechowywać ją przez dwa do pięciu lat.
 Aby użytkować zamrożoną surowicę:
o Ogrzać do 37°C, schłodzić do 2-4°C, można stosować przez 2-3 tygodnie (po ogrzaniu
do 37°C)

Skład surowicy

 Białkowe składniki surowicy: czynniki wzrostu, hormony, białka nośnikowe, transferryna

antyproteazy, czynniki adhezyjne
 Czynnik wzrostu to białko o masie cząsteczkowej rzędu kilku kDa
o Zawartość rzędu pg-ng/ml surowicy, specyficzność osobnicza
o Działają za pośrednictwem receptorów błonowych generując sygnały specyficzne
procesom proliferacji lub różnicowania
o Brak lub niewiele w medium hodowlanym, nasila apoptozę
 Hormony: insulina
o Stymuluje pobieranie glukozy i aminokwasów
o Działa mitogennie
o Krótki czas działania (limitowana cysteiną)
o Względnie wysokie stężenie
 Hormon wzrostu
o W dużych ilościach w surowicy płodowej
o Działa silnie mitogennie (komórczaki!)
 Kortykosteroidy
o Maskują odczyny immunologiczne
o Intensyfikują zdolność komórek do adhezji
 Białka nośnikowe
o Regulują ciśnienie onkotyczne (in vivo)
o Transport substancji małocząsteczkowych (np. nierozpuszczalnych w wodzie lipidów)
o Transport witamin rozpuszczalnych w tłuszczach
o Specyficzne miejsce wiązania kationów Ni2+, Zn2+, Cu2+
o Działanie detoksykujące (wiązanie jonów metali ciężkich i inhibitorów)
o Stabilizują pH i buforują komórki, ochraniają przed uszkodzeniami mechanicznymi
 Transferyna
o Białko transportujące żelazo Fe3+ u kręgowców, kationy V, Mn, metale ciężkie
o Ok 3-6% całkowitego białka w surowicy
o Nie przenosi miedzi
  Globuliny (α1, α2, β, γ)
o Transportują kwasy tłuszczowe i hormony steroidowe
o Odpowiedzialne za mechanizmy odpornościowe
o Stymulują wzrost komórek
o Przykłady:
o α2 – aruloplazmina (transport miedzi)
o β – transferryna (transport żelaza)
o γ – immunoglobuliny
 Antyproteazy:
o Białkowe inhibitory enzymów proteolitycznych zapobiegające hydrolitycznemu
uszkadzaniu białek strukturalnych komórek, enzymów, białkowych lub peptydowych
metabolitów komórkowych
o Ok 2% całkowitego białka w surowicy
o dwa główne typy globuliny α-antytypsynowe, makrobloguliny α2

Ograniczenia surowicy:

 nieidentyczność poszczególnych serii

 utrudniona standaryzacja metod badawczych spowodowana zmiennością składu
 wymagane dodatkowe metody oczyszczania surowicy i zawartej w niej białek
 potencjalne źródło zakażeń wirusowych lub związków toksycznych
 potencjalna obecność przeciwciał przeciw wirusom od zakażonych lub szczepionych zwierząt
 brak pełnej uniwersalności zastosowania tzn. dany typ komórek może wymagać innej
surowicy
 niektóre składniki wykazują działanie hamujące proliferację/sekrecję danych komórek

Zamienniki surowicy:

 idea: syntetyczna mieszanka hormonów, czynników wzrostu, białek nośnikowych i czynników

adhezyjnych o zdefiniowanym składzie jakościowym i ilościowym
 frakcja naturalnej surowicy: albuminy bydlęce, α globuliny z krwi cieląt
 o wzbogaconym składnie: czynniki wzrostu, hormony, witaminy, mikroelementy

Media niezawierające surowicę – w hodowlach specjalnych wykorzystuje się medium niezawierające

surowicy (Serum Free Media)

 Wady SFM
o Skład dobierany osobniczo do komórek
o Eliminacja naturalnej antytoksycznej warstwy
o Ograniczenie liczby podziałów oraz wolniejsza proliferacja komórek

Niebiałkowe składniki pożywki – medium hodowlanego

 Surowica, sole mineralne, bufory, źródła węgla, witaminy, białka i peptydy, tłuszcze i
nienasycone kwasy tłuszczowe, kationy metali
 Sole mineralne zapewniają równowagę osmotyczną pomiędzy komórką a fazą wodną
środowiska in vitro, regulują potencjał błonowy komórki, kofaktory enzymów
 Biorą udział w procesie adhezji do podłoża
  Bufory i regulacja pH medium hodowlanego:
o pH optymalne 7,2-7,4 – dla fibroblastów 7,4-7,7
o do regulacji pH wykorzystywana jest równowaga CO2/HCO, atmosfera ok 5% CO2
o zastosowanie specyficznych buforów nie wymaga kontrolowania składu atmosfery
(np. HEPES, C8H18N2O4S)
o komercyjnie dostępne media hodowlane zawierające czerwień fenolową jako
wskaźnika wartości pH (żółte – za kwaśno, czerwone – optimum, fioletowe – zbyt
zasadowe)
 Źródła węgla:
o Monosacharydy (glukoza, galaktoza, rzadko maltoza, fruktoza, stężenie 1,0-4,5 g/L
 Witaminy
o Podstawowym źródłem jest surowica
o Niektóre komórki wymagają egzogennego dodatku
o Witaminy grupy B
o Witaminy A, C, E
 Białka i peptydy
o Suplementacja szczególnie istotna podczas SFM
o Warunkują prawidłowe poziom ciśnienia onkotycznego
o Dodatki albuminy, transferryny, fibronektyny
 Tłuszcze:
o Prekursory endogennych regulatorów komórkowych
o Suplementacja SFM – cholesterol i steroidy
 Pierwiastki śladowe:
o Atomy metali, których obecność jest wymagana do uzyskiwania i zachowywania
aktywności katalitycznej wielu enzymów
o Selen, cynk, miedź
 Komercyjne dostępne podłoża oferowane są w postaci naważek bądź roztworów gotowych
do rozcieńczenia

Wykład 4 – linie komórkowe

Informacje podstawowe – zwierzęce linie komórkowe i ich pasażowanie

 Linia komórkowa to populacja komórek uzyskana z hodowli pierwotnej po ich pierwszym

pasażowaniu
 Kryterium determinującym pasaż jest stopień konfluencji
 Pasażowanie wykonuje się w celu namnażania biomasy oraz zachowania ciągłości hodowli
 Charakteryzują się wyższą częstotliwością podziałów niż hodowle pierwotne
 Najczęściej po kilku pierwszych pasażach linia komórkowa się stabilizuje i uzyskuje stałą
szybkość proliferacji
 Selekcja komórek podczas pasaży zwiększa homogeniczność
Wyprowadzanie linii komórkowej:

 Pobraną tkankę można w postaci zintegrowanego eksplantu bądź zawiesiny komórek

inokulować hodowlę pierwotną, następnie pierwszy pasaż i uzyskujemy linię z komórek
normalnych ograniczoną, którą następnie możemy transformować do ciągłej, ciągłą
uzyskujemy też z komórek nowotworowych.
 Klonowanie – uzyskiwanie klonalnej (homogenicznej) linii komórkowej, która została
uzyskana w wyniku izolacji pojedynczej komórki i jej następczych podziałów
 Techniki klonowania – opierają się na inokulacji rozcieńczoną zawiesiną komórek
o Specjalnych naczyń do hodowli izolowanych pojedynczych komórek (kapilara, celka,
izolowana kropla pożywki)
o Naczyń zawierających warstwę komórek odżywczych
o Naczyń z podłożem półpłynnym (np. matrigel)

Media kondycjonowane – zawierające wszystkie substancje potrzebne pojedynczej komórce do

wzrostu ponieważ uprzednio hodowano w nich komórki danej linii (używane medium)

 Matrigel
o Komercyjnie dostępne podłoże hodowlane (rusztowanie, rodzaj biomateriału)
o Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)
o Szereg analogów/odpowiedników

Linie komórkowe:

 FCL – linia komórkowa o ograniczonym czasie życia

o Uzyskane z normalnych, diploidalnych komórek
o Ograniczona liczba podziałów (pokoleń), charakterystyczny okres przeżywania (life
span)
o Starzenie się linii komórkowej w warunkach in vitro jest odzwierciedleniem starzenia
się komórek in vivo
o Najczęściej 20-80 pokoleń, a następnie komórki danej linii zamierają
o Czas życia zależy od: wieku dawcy, endokrynnego cyklu narządu, rodzaju tkanki
 CCL - linia komórkowa o nieograniczonym czasie życia
o Eksplantami są guzy nowotworowe, komórki poddane transformacji
o Komórki wykazujące nieograniczoną zdolność proliferacji
o Transformacja komórek (unieśmiertelnianie) – zmiana fenotypu uwarunkowana
zmianą genotypu komórek
o Zdolność linii komórkowych do transformacji wynika z jej niestabilności genetycznej

Transformacja

 Spontaniczna
o Najczęściej w warunkach hodowli in vitro wywoływana przez dużą gęstość komórek
o Ulegają jej keratenocyty, limfocyty
o Nie ulegają jej łatwo np. niektóre linie fibroblastów (mogą one w stanie konfluencji
zamierać bądź pozostać żywe nawet do kilku miesięcy
 Indukowana
o W warunkach in vitro dokonuje się jej z wykorzystaniem onkogennych związków
chemicznych
o Uzyskane w wyniku transformacji CCL są heterogeniczne fenotypowo oraz
genotypowo
Krzywa wzrostu FCL i CCL – narysować muszę

1) Adaptacja
2) Wzrost wykładniczy
3) Faza stacjonarna – plateu
4) Faza apoptozy i wtórnej
nekrozy

 Faza Adaptacji
o Analogiczna do lag fazy (długość zależna od różnic środowiska)
o Liczba komórek maleje (umierają komórki uszkodzone)
o Ograniczona podczas hodowli komórek linii ciągłych
o Komórki odbudowują zewnętrzne warstwy błony komórkowej zniszczonej w trakcie
pasażowania
o Postępuje adhezja komórek i ich rozpłaszczanie
o Wzrasta ilość i aktywność enzymów komórkowych
 Faza wykładniczego wzrostu
o Faza intensyfikowanych podziałów komórkowych
o Komórki podczas mitozy odrywają się od podłoża, po podziale zachodzi ponowna
adhezja
o Faza ta kończy się, gdy hodowla osiąga stan konfluencji
o Czas trwania zależy od gęstości początkowej komórek
 Faza stacjonarna – plateu
o Stała liczba komórek (tyle proliferuje cu umiera)
o Efekt kontaktowego zahamowania silnie limituje szybkość podziałów komórek
o Komórki zaczynają podlegać przemianom apoptotycznym
 Faza apoptozy i wtórnej nekrozy
o Stopniowe nasilanie się przemian apoptotycznych w komórkach
o Przemiany nekrotyczne komórek

Pasażowanie hodowli komórek adheretnych

1. Usuwanie zużytej pożywki

2. Przepłukanie warstwy komórek buforem fosforanowym (PBS) niezawierającym jonów Ca2+,
Mg2+, kompleksowanie wolnych jonów przez dodatek czynników chelatujących, np. EDTA
3. Enzymatyczne uwolnienie komórek od powierzchni międzyfazowej katalizowane trypsyną
(trypsynizacji) lub kolagenazą (kolagenizacja)
4. Inkubacja wraz z monitorowanie procesu pod mikroskopem
5. Liczenie uwolnionych komórek i inokulacja porcji świeżej pożywki zawiesiną komórek w
założonym stężeniu.
6. Po 12-24h ponowna wymiana pożywki w celu usunięcia uszkodzonych komórek oraz
swobodnie pływających
Krioprozerwacja komórek

 Linie komórkowe przechowuje się długotrwale (kilka lat) w postaci zamrożonej dzięki
technice krioprezerwacji
 Zalety:
o Długoterminowe magazynowanie (bankowanie) linii komórkowych
o Bankowanie czystych linii komórkowych bez zanieczyszczeń innymi typami komórek
o Redukcja zagrożeń infekcji mikrobiologicznych/wirusowych
o Brak zmian genetycznych zachodzących podczas podziałów komórkowych oraz
pasażowania
o Redukcja kosztów (pożywki, odczynniki, robocizna, itp.)
 Charakterystyka krioprezerwowanego materiału biologicznego oraz medium do
krioprezerwacji
o Wysoka żywotność komórek (powyżej 90%)
o Komórki z wykładniczej fazy wzrostu
o Brak oznak mikrobiologicznego zakażenia
o Dodatek krioprotektantów (zwykle 10%)
o Powszechnie stosuje się DMSO oraz glicerol
 Zdjęcie od Klaudii z porównaniem metod
  
  
  

Proces zamrażania:

 Komórki+ medium+krioprotektant
 W temperaturze do -20°C do 2h
 -70°C daje nam 24h
 -196°C pozwala przechowywać przez kilka lat

Rozmrażanie

 Z temperatury -196°C ogrzewamy do 37°C, następnie dodajemy pożywki bez toksycznego

DMSO

Transport komórek

 Zamrożone w pojemnikach, -80°C, do 3 dni

 Komórki adheretne w pojemnikach wypełnionych medium w temperaturze około 37°C –
doraźnie
Przegląd linii komórkowych

Linia komórkowa L929

 Wyizolowana z normalnych komórek tłuszczowych sutka 100 dniowej samicy CH3

(klonowanie w 95 pasażu)
 Komórki adherentne
 Morfologia fibroblastów
 Linia L jest ot jedna z pierwszych linii CCL, a L929 to pierwsza klonalna linia komórkowa
 Zastosowania:
o Produkcja medium kondycjonowanego oraz jako warstwa odżywcza
o Powszechne badania toksykologiczne
o Modelowy materiał

Linia komórkowa Hela

 Wyizolowana z komórek raka szyjki macicy 31 letniej afroamerykanki

 Adherentne
 Transformowana wirusem brodawczaka (HPV 18)
 Powszechnie wykorzystywane jako model in vitro
 Próba klasyfikacji jako nowy gatunek organizmu jednokomórkowego

Linia komórkowa CHO

 Wyizolowana z komórek jajników chomika chińskiego

 Komórki adherentne rosnące także w zawiesinie
 Wykorzystywane do produkcji
o Ludzkiego hormonu folikulotropowego
o Ludzkiego hormonu tarczycy
o HSV gb.2 (Zovirax)
o Wirusa EBV
o Wirusa zapalenia wątroby typu B

Vero

 Wyizolowana z normalnych komórek nerki małpy zielonej

 Komórki adherentne
 Wykorzystuje się do produkcji szczepionek przeciw wirusom: polio i wścieklizny
 Używane ze względu na gatunek (ssaki wyższe)

MRC-5

 Wywodzi się z normalnych komórek tkanki płuc pochodzących z ludzkiego płodu (po aborcji)
 Komórki adherentne o morfologii fibroblastów
 Linia wykorzystywania do produkcji szczepionek przeciwwirusowych:
o Zapalenia wątroby typu A
o Świnki
o Odry
o Ospy
MG-63

 Wyizolowana z kostniakomięśniaka 14 letniego chłopca

 Adherentne o morfologii osteoblastów
 Charakteryzują się wysoką wydajnością produkcji interferonu (bardziej zgodnego z ludzką
tkanką mięśniową niż interferon bakteryjny)
 Wykorzystywana do produkcji ludzkiego interferonu, amplifikacji genów nowotworowych,
implantów kostnych

C2C12

 Wyizolowana podczas pasaży komórek mięśnia udowego myszy

 Adherentne o morfologii fibroblastów
 Tworzą miotuby
 Linia wykorzystywana w badaniach nad:
o Różnicowaniem się komórek mięśni szkieletowych
o Ekspresja białek mięśni
o Regeneracja ubytków mięśni

BHK-21

 Klonalna linia wyizolowana z komórek nerek pięciu 1-dniowych chomików syryjskich po 84

dniach ich hodowli
 Komórki adherentne, rosnące także w zawiesinie
 Rutynowo wykorzystywana do diagnostyki wścieklizny u zwierząt
 Hodowana na skalę przemysłową w bioreaktorach o objętości do 8m3
 Wykorzystywane do badań nad replikacją wirusów polio, różyczki, ospy oraz arbowirusów
(wirusów przenoszonych przez owady)

Sf9/Sf21

 Pochodzi z komórek układu rozrodczego ćmy Spadopteria frugiperda (sówka)

 Sf9 to sklonowane komórki Sf21
 Kuliste komórki rosnące wgłębnie
 Nie wymaga surowicy
 Linia wykorzystywana do produkcji:
o Bydlęcej β-laktoglobuliny (badanie alergii pokarmowych)
o Antystatyny (inhibitora koagulacji komórek krwi)
o Insektycydów

Banki linii komórkowych – oferują ustabilizowane i scharakteryzowane linie komórkowe

 ECACC – europejska kolekcja hodowli komórkowych

 ATCC – amerykańska kolekcja hodowli komórkowych
Modele in vitro w badaniach cytotoksyczności– 20.03.2019

Podstawowe założenie cytotoksyczności: większość ksenobiotyków działa na różne typy komórek

zaburzając te same funkcje komórkowe.

Źródła danych dotyczących wpływu ksenobiotyków na organizm człowieka:

 Badania epidemiologiczne (dane in vivo) – najbardziej cenne

 Badania laboratoryjne (na ochotnikach)
 Badania na zwierzętach
 Modele in vitro

Stosowane w badaniach toksykologicznych modele in vitro (zwane metodami alternatywnymi)

pozwalają określić wpływ badanych czynników na poziomie komórkowym i subkomórkowym.

Ksenobiotyki – to egzogenne związki chemiczne, które w normalnych warunkach nie są przez dany
organizm biosyntetyzowane ani przyjmowane wraz z pokarmem. Ich toksyczny wpływ wynika z:

 Właściwości fizykochemicznych
 Akumulacji w organizmach (rozpuszczalne w płynach ustrojowych, często w tłuszczach)
 Addytywnego działania (zwielokrotniony wpływ grupy ksenobiotyków w porównaniu z
efektami pojedynczych związków)

Efekty działania ksenobiotyków:

 Farmakologiczne – inhibicja enzymów

 Genotoksyczne – mutacje w genomie
 Patologiczne –
destrukcja

Metabolizm
ksenobiotyków –
schemat
Warunki ekspozycji komórek – przed przystąpieniem do badań na modelu in vitro należy:

 zanalizować dane in vivo (o ile dostępne)

 zanalizować dane na zwierzętach i dostępne dane in vitro
 określić zgodność badanego związku chemicznego z medium hodowlanym (zmiany pH,
ciśnienia osmotycznego, denaturacja białek itp.:.)
 określić rozpuszczalność czynnika w wodzie, tłuszczach, DMSO
 wybrać odpowiednią fazę wzrostu komórek do badań
 Wpływ fazy wzrostu komórek na wyniki badania toksykologicznego:
o Komórki bezpośrednio po pasażu charakteryzują się nadwrażliwością (uszkodzenia
błony komórkowej)
o Komórki w fazie wzrostu wykładniczego są odpowiednie do większości badań
o Komórki w fazie stacjonarnej mogą wykazywać brak efektu (wolniejszy metabolizm i
ograniczona dyfuzja czynnika)

Dawki ksenobiotyków – wykres:

Czas ekspozycji – zależy od specyfiki badań toksykologicznych

 Badania zaburzeń funkcji komórek [minuty, godziny] (np. zmiany metabolizmu,

przepuszczalności błon komórkowych itp.)
 Badania cyklu komórkowego i żywotności komórek [dni]
 Jeżeli wymagane jest badanie odwracalności działania ksenobiotyku, należy zastąpić medium
hodowlane zawierające badany czynnik pożywką bez tego czynnika
Określanie cytotoksyczności

 Wychwyt czerwieni obojętnej(fenolosulfoftaleniny)

o Bierny transport przez błonę komórkową i wbudowywanie barwnika do lizosomów
żywych komórek
o Uszkodzone lub martwe komórki nie wykazują tych właściwości
o λmax=540 nm
 Alamar blue ™
o Nietoksyczny dla komórek, stabilny chemicznie barwnik umożliwiający
monitorowanie proliferacji komórek w hodowli
o Barwnik ten zawiera wskaźnik redox
o Proliferujące komórki indukują procesy redox w medium hodowlanym
o Zmiana barwy z niebieskiej (570 nm) na czerwoną (600nm)
 Test MTT
o Wykorzystuje zdolność mitochondrialnej reduktazy do katalizy przemiany MTT
(pochodnej formazanu) o pomarańczowej barwie do formazanu o budowie
purpurowej
o Zdolność tą wykazują tylko żywe komórki
o λmax=565 nm
 Test LDH – dehydrogenazy mleczanowej
o LDH jest obecna w cytoplazmie wszystkich komórek
o Po uszkodzeniu błony komórkowej LDH jest bardzo szybko uwalniana do medium
hodowlanego
o Test to enzymatyczna reakcja pirogronianu z 2,4-dinitrofenyloydrazyną dającą
barwny hydrazon
o Zmiana λmax z 400 nm do 550 nm
o Powszechny w diagnostyce nowotworów o wysokiej zjadliwości histologicznej,
zawałów mięśnia sercowego, zapalenia opon mózgowych, hemolizy.
 Barwienie oranżem akrydyny i bromkiem etydyny
o Możliwe rozróżnianie komórek żywych, apoptotycznych i nekrotycznych
o OA wnika przez błony komórkowe żywych komórek i barwi cytoplazmę oraz jądro
komórkowe
o BE wnika przez uszkodzone błony komórek żywych, apoptotycznych i nekrotycznych
barwiąc jądro komórkowe
o Cytoplazma komórek nekrotycznych jest zabarwiona przez OA i BE
o Możliwe wyniki: jasno zielony, ciemno zielony, pomarańczowy, ciemno
pomarańczowy
o Komórki żywe: jasno zielone jadro bez kondensacji chromatyny
o Komórki wczesnoapoptotyczne: jasno zielone jądro + kondensacja chromatyny w
postaci ciemno zielonych wkrętów
o Komórki późnoapoptotyczne: pomarańczowe jądro z kondensacja chromatyny w
postaci ciemno pomarańczowych wtrętów
Zalety modeli in vitro

 Możliwości pracy na komórkach ludzkich

 Dostępność materiału biologicznego do badań
 Szybka i dokładna identyfikacja uszkodzenia tkanek
 Powtarzalne wyniki doświadczeń
 Badanie odwracalności cytotoksyczności
 Prostota technik badawczych i możliwość ich automatyzacji
 Zużycie niewielkich ilości ksenobiotyków, niższe koszty i mniejsza czasochłonność w
porównaniu z badaniami in vivo
 Ograniczenie liczby badań na zwierzętach

Wady modeli in vitro

 Modele in vitro to zbytnie uproszczenie złożoności organizmu

 Trudność korelowania warunków i wyników badań in vitro z sytuacją obserwowaną in vivo
 Trudność w doborze odpowiednich dawek ksenobiotyków (zwykle dawki ostre, a nie
chroniczne)
 Trudność w wyborze sposobu ekspozycji ze względu na fizykochemiczne właściwości
ksenobiotyków
 Ograniczone możliwości badania kliku toksycznych mechanizmów podczas jednej serii
doświadczeń

W badaniach toksykologicznych wykorzystuje się:

 Hodowle pierwotne
o Materiał biologiczny najbardziej podobny do warunków in vivo, krótki czas przeżycia,
trudności w standaryzacji
 Ustalone linie komórkowe
o Tracą stan zróżnicowania istniejący in vivo, postępująca aneuploidalność komórek,
specyficzny czas przeżycia
 Ciągłe linie komórkowe
o Są nieśmiertelne, co pozwala na standaryzację metod i uzyskiwanie powtarzalnych
wyników

Za pomocą modeli in vitro w toksykologii bada się:

 Cytotoksyczność podstawową
 Działania drażniące
 Hepatotoksyczność – na komórki wątroby
 Neurotoksyczność
 nefrotoksyczość