CUBA TABACO Vol. 12, No.

1, 2011

INTRODUCCIÓN A LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN

CEDRO (CEDRELA ODORATA L.)
Leixys Rodríguez Rodríguez, Anabel Díaz Ramos
Instituto de Investigaciones del Tabaco. Carretera Tumbadero km 8 ½, San Antonio de
los Baños, Artemisa, Cuba

RESUMEN
El Cedro (Cedrela odorata L.) es una especie particularmente importante para la indus-
tria tabacalera. Sus poblaciones naturales han decrecido considerablemente debido a
talas indiscriminadas y a la falta de programas de reforestación. Sin embargo, la siem-
bra de poblaciones que suplan la demanda de madera de cedro se dificulta por los
problemas de propagación que presenta la especie. Las técnicas biotecnológicas,
específicamente la embriogénesis somática, constituye una herramienta tentativa para
su manejo, por las ventajas que brinda. Poco se conoce sobre el tema, y los trabajos
preliminares presentan bajos niveles de inducción de callos a partir de fuentes no dis-
ponibles durante todo el año. Por tal motivo, el siguiente trabajo pretende determinar
las condiciones primarias para una exitosa inducción de callos embriogénicos en cedro.
Para ello se evaluaron diferentes tipos de explantes: cotiledones e hipocotilos de plántulas
germinadas in vitro, raquis y hojas de brotes rejuvenecidos, raquis y hojas de plantas
adultas, así como embriones inmaduros; en cuanto a disponibilidad del material, nive-
les de contaminación, formación de callos y sus características. Aunque varios explantes
permitieron el desarrollo de callos como los cotiledones e hipocotilos, los explantes de
raquis rejuvenecidos mostraron los más altos valores. Los resultados demuestran que
es posible la obtención de callos de cedro a partir de diversos explantes, incluso de
plantas adultas, durante todo el año.
Palabras claves: Cedrela odorata L., explantes, callo, inducción, embriogénesis somática
ABSTRACT

INTRODUCTION TO THE SOMATIC EMBRYOGENESIS IN CEDAR

(CEDRELA ODORATA L.)
Cedar (Cedrela odorata L) is one of the most important species for the tobacco industry.
The cedar natural populations have considerably decreased because of unreasonable
fellings and the lack of reforestation programs. However, the sowing of populations
that supplies the cedar wood needs, is difficult because of the propagation problems of
this species. Biotechnology, particularly the somatic embryogenesis, is a potential tool
for cedar management due to all advantages that these techniques offer. This topic is
little known nowadays. Early works suggest low levels for callus induction for different
explants sources in cedar, from sources that are not available during throughout the
year. For that reason this work tries to determine the primary conditions for successfull
induction of embryogenic callus in cedar. Different sources like cotyledons and hypocotyls
explants from in vitro plantets, raquis and leaves explants from rejuvenated buds,
raquis and leaves collected from adult trees, and immature cygotic embryos were
evaluated for the following characters: available material, contamination levels, callus
formation and their characteristics. Although some explants allowed the development
of callus, like cotyledons and hypocotyls, the rejuvenated raquis showed the highest
values for callus induction character. These results proved the possibility to obtaining
callus of different explants, even from mature trees, during throughout the year.
Key words: Cedrela odorata, explants, callus, induction, somatic embryogenesis

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INTRODUCCIÓN ES se ha descrito como un fenómeno compli-

cado, donde la naturaleza y las característi-
El Cedro (Cedrela odorata L.) es una de las
cas fisiológicas y temporales de los explantes
especies de la familia Meliaceae citada entre
son cruciales (Gonzáles y Peña, 2007). Su
las más valiosas del mundo. Particularmente
aplicación tiene amplio potencial para el me-
para la industria tabacalera la madera del
joramiento genético y constituye una herra-
Cedro juega un papel muy importante, pues
mienta muy dinámica pues permite, con enor-
se utiliza en la construcción de las cajas de
mes ventajas de tiempo, dinero y espacio,
tabacos por su durabilidad, fortaleza, resisten-
establecer un diverso número de líneas
cia, aroma y belleza; características que ase-
somáticas derivadas de múltiples individuos;
guran que el producto contenido en ellas esté
posibilita la crioconservación in vitro a largo
protegido de agentes externos (insectos, con-
plazo con altas tasas de recuperación; facilita
diciones ambientales, de almacenamiento
la rápida generación de stocks de embriones
etc.) (Morán et al., 2009) y le confieren al ta-
en cantidades suficientes para suplir de ma-
baco un bouquet especial.
terial a plantaciones de gran tamaño; permite
además el secado de embriones y su
Cedrela odorata Linnaeus, junto a Swietenia
encapsulación como semillas artificiales para
macrophylla King (Caoba), han sufrido en las
su transporte y germinación en campo, así
ultimas décadas la disminución del tamaño de
como el desarrollo de sistemas de selección
sus poblaciones (número de individuos), de-
temprana de individuos, etc.
bido a diversos factores, entre los que se des-
tacan los procesos de deforestación y el apro-
Para el caso específico del cedro, desarrollar
vechamiento selectivo sobre los mejores indi-
un sistema de propagación vía embriogénesis
viduos, lo cual afecta la constitución genética
somática es altamente tentativo; sin embar-
de las poblaciones (Patiño, 1997). A este he-
go, las investigaciones en este sentido son
cho se incorporan los problemas de propaga-
muy limitadas, debido a las características
ción que presenta la especie, como por ejem-
propias de la especie.
plo: la corta área de dispersión de semillas,
(FAO, 1974 citado por Galván, 1996), su bajo
Varios investigadores han realizado intentos
potencial germinativo y el ataque del lepidóp-
de lograr la inducción de callos
tero Hypsipyla grandella (Zeller), que son las
embriogénicos a partir de varias fuentes. Por
principales causas que inciden en la
ejemplo, se obtuvieron callos a partir de
reforestación.
inflorescencias (Daquinta et.al., 2004) con el
En este sentido, las técnicas de cultivo in vitro
empleo del tidiazurón; sin embargo, aunque
y propagación clonal pueden atenuar estos
es la primera vez que se reportan callos pro-
inconvenientes. Sin embargo, de manera ge-
venientes de plantas adultas, no se logró ma-
neral, el cultivo in vitro de especies leñosas
durar embriones. Explantes provenientes de
se considera muy difícil de realizar, debido a
plántulas regeneradas a partir de semillas in
las características morfofisiológicas de los
vitro tales como: cotiledones, hipocotilos,
árboles, que limitan la respuesta de los teji-
epicotilos y raíces jóvenes, constituyen otra
dos y albergan gran cantidad de
alternativa; no obstante, existen algunos tra-
microorganismos que afectan el proceso.
bajos con bajos intervalos de obtención de
callos embriogénicos (Gonzáles y Peña, 2007;
Particularmente la embriogénesis somática
Muñoz, 2003) a partir de este tipo de
(ES) constituye una de las herramientas
explantes.
biotecnológicas más empleadas en el mejo-
ramiento de especies vegetales.
A pesar de estos resultados, es necesario
Específicamente para especies tropicales, la

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establecer una metodología para la introduc-
ción al cultivo de tejido, específicamente la
embriogénesis somática, que posibilite la
obtención de material en condiciones favora-
bles para la inducción de callo. Es por ello que
el siguiente trabajo consiste en determinar las
condiciones primarias para la inducción de
callo embriogénico en cedro (Cedrela odorata
L.).
MATERIALES Y MÉTODOS
Los experimentos se realizaron en los labora-
torios de cultivo de tejidos del Instituto de In-
vestigaciones del Tabaco (IIT) y del CIGB, y
constaron de dos etapas: la obtención del
material a evaluar y la inducción de callos
embriogénicos a partir de los diferentes
explantes obtenidos.
Material vegetal
Se evaluaron diferentes fuentes para la obten-
ción del material vegetal:
a) Estacas terminales aéreas provenien-
tes de árboles jóvenes de la plantación esta-
blecida en áreas del IIT. Se determinó el ta-
maño de todas las estacas por encima de 10
cm y el diámetro en la base, de 1 cm.
b) Semillas de Cedrela odorata L., dona-
das por el Instituto de Investigaciones Fores-
tales (IIF).
c) Hojas y raquis provenientes de árbo-
les jóvenes (5 años) de la plantación estable-
cida en el IIT.
d) Embriones cigóticos inmaduros prove-
nientes de cápsulas de 2 cm de longitud do-
nadas por el IIF.
Desinfección y obtención de explantes
Se procedió, ante todo, a obtener el material
rejuvenecido. Para ello, las estacas cortadas
se colocaron en frascos de vidrio de 8 cm de
diámetro y 19 cm de altura, con un volumen
de solución de ¼ de la altura total de la esta-
ca. Se hicieron cambios de solución cada 7
días durante el tiempo de emisión de brotes.
En total se evaluaron 20 estacas para cada
una de las soluciones siguientes:
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A. Agua común
B. Sales MS suplementadas con 0.25 mg/
L de benzilaminopurina (BAP) [Modificación
según resultados de García et.al., (2004)].
Paralelamente, las semillas maduras fueron
desinfectadas y sembradas según protocolo
propuesto por Acanda et al. (2008). Germina-
ron en fotoperíodo (16 h luz/8 h oscuridad) a
25 oC. Después de 65 días aproximadamen-
te, se escindieron los cotiledones, hipocotilos
y raíces, así como hojas verdaderas y raquis
de las plántulas germinadas in vitro.
Para la desinfección de explantes de hojas y
raquis provenientes de árboles y estacas se
procedió como se explica a continuación: las
ramas jóvenes fueron colectadas y lavadas por
15 min con abundante agua común y deter-
gente comercial. Fueron desinfectadas con
alcohol 70 % (v/v) durante 1 min y posterior-
mente con solución de hipoclorito de sodio
comercial al 50 % v/v más unas gotas de
Tween 20 durante 20 min, seguido de 3 lava-
dos, de 1, 2 y 3 min de duración, con agua
destilada estéril. Todo el proceso anterior se
realizó bajo cámara de flujo laminar [el proto-
colo está basado en las experiencias de
García et al. (2004)].
Para la siembra de embriones inmaduros, las
cápsulas recibieron un tratamiento similar al
descrito con anterioridad. Las cápsulas de-
sinfectadas fueron seccionadas bajo condicio-
nes estériles mediante cortes profundos en
septos para acceder a los embriones.
Inducción de callo
Para la determinación de la fuente de
explante, el medio MS fue suplementado con
vitaminas MS, sacarosa 30 %, ácido
ascórbico (1 mg/L), ácido cítrico (100 mg/L),
benzilaminopurina (1 mg/L), ANA (0.5 mg/L) y
agar. El pH fue ajustado a 5.8. Los explantes
fueron colocados a razón de 10 explantes por
placa petri con 5 réplicas, bajo fotoperíodo (16
h luz/ 8 h oscuridad), a una temperatura de 25
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ºC ±1 ºC durante 40 días. Después de la in-
ducción se efectuaron análisis
macromorfológicos que incluyeron aspectos
como textura, color y friabilidad de los callos.
Análisis estadístico
Para el carácter formación de callos por
explante se utilizó un ANOVA de clasificación
simple y la prueba de rangos múltiples con el
procedimiento de diferencia mínima significa-
tiva (LSD) de Fisher para discriminar entre las
medias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Rejuvenecimiento de yemas
La tabla 1 muestra el valor de los datos esta-
blecidos como criterios de evaluación para
cada una de las soluciones analizadas. Ob-
sérvese que existen diferencias marcadas
entre las soluciones. La solución A constitui-
da por agua común fue la que permitió mejo-
res resultados.
Tabla 1. Comportamiento de los principales criterios de evaluación para
cada una de las soluciones
Yemas formadas por estaca
Estos resultados superan los obtenidos por
García et al. (2004), quienes evaluaron dife-
rentes concentraciones de BAP en el rejuve-
necimiento de estacas a partir de varias con-
centraciones con BAP. Los explantes comen-
zaron a emitir sus brotes entre los 5 y 7 días a
partir de su inmersión en las soluciones eva-
luadas. Los brotes comenzaron su formación
mostrando una coloración verde intensa y a
los 21 días de emitidos alcanzaban una talla
promedio de 5 cm.
Se debe agregar que en la solución B se ob-
servó el rápido desarrollo de hongos, por lo
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que hubo que cambiarla con mayor frecuen-
cia que la solución A.
Este resultado demuestra que no es necesa-
rio emplear fitohormonas u otro componente
del medio de cultivo para propiciar el desa-
rrollo de brotes a partir de estacas.
Obtención de explantes a partir de semillas
Aproximadamente 95 % de las semillas colo-
cadas en fotoperíodo germinaron al cabo de
16 días y solamente se observó 12 % de con-
taminación. Según Courbineau et al. (1985)
la germinación de semillas de cedro se reali-
za sin ninguna dificultad entre 15 °C y 35 °C
en luz como en oscuridad, aunque es más rá-
pida entre 30 °C y 35 °C. De acuerdo a nues-
tra experiencia personal, temperaturas entre
15 oC y 20 oC retrasan la germinación de las
plántulas y reducen el porcentaje de
germinación (datos no mostrados).
Los índices de contaminación registrados se
pueden atribuir a la asociación de semillas de
especies forestales tropicales con muchos
microorganismos, que de manera natural ayu-
dan a los procesos de germinación, pero re-
presentan un factor limitante para los trabajos
in vitro (Pérez et al., 2003).
Para la mayoría de las especies tropicales se
ha demostrado que las semillas recalcitran-
tes requieren un estricto almacenamiento que,
generalmente, implica condiciones de alta
humedad y sin refrigeración. Al parecer, el al-
macenamiento a 4 ºC durante un período re-
lativamente corto no afecta significativamente
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los niveles de germinación de las semillas de Trabajos previos de desinfección de brotes en

cedro rojo.
Desinfección de hojas, raquis y cápsulas
La figura 1 representa los porcentajes de con-
taminación presentados después de estable-
cer los explantes en los medios de inducción.
Los mayores valores de contaminación deri-
van de explantes provenientes de plantas adul-
tas: hojas y raquis de plantas establecidas en
la población del Instituto de Investigaciones del
Tabaco (figura 1). Estos explantes resultaron
muy maltratados durante el proceso de des-
infección, lo cual incidió posteriormente en la
inducción de callo embriogénico. Las pérdi-
das por contaminación ocurrieron en la prime-
ra semana de establecido el cultivo, funda-
mentalmente de naturaleza fúngica y
bacteriana, de supuesto origen ambiental.
cedro indican la presencia de gran contami-
nación en el cultivo in vitro. Esta puede estar
asociada a los microorganismos en la super-
ficie y tejidos endógenos de las plantas adul-
tas donantes, que dificulta emplear explantes
provenientes de árboles de cedro (Maruyama,
2006). No obstante, también se ha visto la
aparición de contaminación bacteriana des-
pués de realizados varios subcultivos en
explantes que no mostraron contaminación
una vez iniciado el cultivo.
Flores (2006) reporta 90 % de contaminación
en explantes provenientes de plantas adultas,
y plantea que esto incidió sobre la pérdida o
la muerte de explantes. Según nuestra expe-
riencia, los explantes provenientes de plantas
adultas fueron los más afectados en la induc-
ción de callo embriogénico (figura 2); aque-
llos que no se contaminaron mostraron signos
de oxidación y necrosis del tejido.

Figura 1. Porcentajes de contaminación presentados durante la desinfección de explantes provenientes

de raquis y hojas rejuvenecidos

Leyenda:
Raq. Estacas: Raquis provenientes de brotes rejuvenecidos
Hoj. Estacas: Hojas provenientes de brotes rejuvenecidos
Hoja Adult. y Raq. Adult: Hojas y Raquis provenientes de árboles jóvenes de la plantación del
Instituto de Investigaciones del Tabaco

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Fuente de explante
En total fueron evaluadas nueve variantes de
explantes: raquis y hojas derivados de plan-
tas adultas; raquis y hojas rejuvenecidos de
estacas; raquis, hojas, cotiledones e
hipocotilos provenientes de plántulas germi-
nadas in vitro y embriones inmaduros para el
carácter formación de callo (tabla 2).
Tabla 2. Valores obtenidos para el carácter formación de callos de los
diferentes explantes
Raquis provenientes de estacas
Los resultados indican la media del cociente
entre los explantes que forman callos y el total
de explantes para cada explante evaluado, así
como el error estándar (ES). Las diferentes
letras indican diferencias estadísticamente
significativas con un nivel de 95 % de confian-
za.
Como se observa en la tabla 2, los explantes
más reactivos fueron los raquis provenientes
del material rejuvenecido, seguido por los
cotiledones e hipocotilos. Los callos obteni-
dos a partir de hojas de estacas fueron pe-
queñas masas compactas menores de 0.4 cm
que no resultaron idóneas para la
embriogénesis. Algunos callos formados de
cotiledones desarrollaron rutas morfogénicas
dirigidas principalmente hacia caulogénesis
y rizogénesis, situación que, para algunas
especies maderables como Eucalyptus, se
considera que reduce posteriormente la tasa
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de producción de callo embriogénico (Gómez
et al., 2006). Esta situación no se repitió para
el resto de los explantes.
Los callos presentaron diferencias
morfológicas evidentes (figura 2). Los callos
inducidos a partir de embriones inmaduros se
presentaron con consistencia gelatinosa, muy
oxidados sin desarrollar estructuras
embriogénicas. Los callos originados a partir
de cotiledones e hipocotilos se mostraron
translúcidos, friables y de color amarillo a café,
características que se han atribuido a un com-
portamiento embriogénico en especies leño-
sas (Rodríguez et al., 2005). Los callos indu-
cidos a partir de raquis y hojas de estacas se
mostraron compactos, con coloración de blan-
quecina a verde y ausencia de oxidaciones.
Específicamente en raquis, se obtuvieron ca-
llos mayores de 1 cm2 que pudieran desarro-
llar y madurar estructuras embriogénicas.
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Figura 2. Diversidad de callos obtenidos en el medio de inducción propuesto: a, b y c) Callosidades
blanquecinas- verdosas en explantes de raquis provenientes de estacas; d) Callosidades translúcidas
obtenidas en hipocotilos
De manera general, estos resultados indican
la posibilidad de obtener callos a partir de di-
versas fuentes de explantes. Trabajos anterio-
res reportan la obtención de callos a partir de
inflorescencias inmaduras (Daquinta, 2004),
de cotiledones (Muñoz, 2003; Gonzáles y
Peña, 2007), de meristemos apicales, de ho-
jas verdaderas y de raíces de plántulas ger-
minadas in vitro (Gonzáles y Peña, 2007). Sin
embargo, estas fuentes de explantes no es-
tán a disposición durante todo el año. Las
inflorescencias están disponibles sólo en épo-
ca de floración y las semillas no se recomien-
da almacenarlas durante largos períodos por
la pérdida, tanto de la capacidad germinativa
como del vigor en las plántulas germinadas
(Pérez, 2003).
CONCLUSIONES
• La inducción de masas callosas para cedro
es posible en el medio MS propuesto.
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• Diversas fuentes de explantes como:
hipocotilos, cotiledones y raquis rejuvenecidos
permitieron el desarrollo de callos con carac-
terísticas promisorias para el posterior desa-
rrollo y maduración de estructuras
embriogénicas.
• Es necesario rejuvenecer el material vege-
tal para regenerar callos a partir de hojas y
raquis de plantas adultas.
RECOMENDACIONES
• Evaluar otros medios para la inducción de
callos a partir de los explantes propuestos.
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