Matody stosowane do identyfikacji odmian i wykrywania niektórych

patogenów ziemniaka – instrukcje

Bonin, 28 stycznia 2000 r.

dr Krzysztof Treder
Sam. Prac. Diagn. Molekul. i Biochemii
Inst. Hod. i Aklim. Roślin Oddział w Boninie

CZUŁE METODY WYKRYWANIA WIRUSA LIŚCIOZWOJU

ZIEMNIAKA
WYKRYWANIE PLRV TESTEM KOKTAJLOWYM

Zasada:
Otworki w mikropłytce powleka się przeciwciałami IgG rozpoznającymi wirusa. Po
odmyciu niezwiązanych z podłożem przeciwciał do otworków wlewa się sok z badanych
roślin i rozpoznające wirusa przeciwciała znakowane enzymem (koniugat). Przeciwciała
związane ze ściankami mikropłytki wyłapują zawarte w soku cząstki wirusa. W tym
samym czasie cząstki wirusa wiązane są przez koniugat co prowadzi do powstania
kilkuwarstwowej „sieci” przeciwciała - wirus - koniugat - wirus - koniugat i związania
większej ilości wirusa oraz koniugatu niż ma to miejsce w standardowej DAS-ELISA
(„kanapka” przeciwciała -wirus -koniugat). Sok i niezwiązany z wirusem koniugat
odmywa się, po czym otworki napełnia się substancją, która jest substratem dla enzymu
tworzącego koniugat z przeciwciałami. W efekcie w otworkach, w których przeciwciała
związały wirusa zachodzi reakcja enzymatyczna, najczęściej barwna lub
fluorescencyjna. Opisana metoda jest znacznie czulsza i mniej pracochłonna niż
standardowa DAS-ELISA.

Odczynniki:
• IgG anty PLRV 1mg/ml (IHAR Oddział Gdańsk)
• Koniugat alkaliczna fosfataza-IgG anty PLRV: 1 mg/ml (IHAR Oddział Gdańsk)
• Bufor A (powlekający): 50mM bufor węglanowy, pH 9.6:
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
NaN3 0.20g
Rozpuścić w 1000ml H2O, pH powinno wynosić 9,6 bez doprowadzania.
• Bufor B (do płukania): 10 mM PBS’em + 0.05 % Tween 20, pH 7.4:
NaCl 8.00g
KH2P04 0.20g
Na2H P04 x12 H2O 2.90g
KCl 0.20g
Tween 20 0.50g
NaN3 0.20g
Rozpuścić w 900ml H2O, jeżeli pH jest zbyt alkaliczne (>7.4) doprowadzić 1M HCl,
gdy za kwaśne (<7.4) doprowadzić 1M NaOH, dopełnić do 1000ml.
 • Bufor C (koniugatowy): 10 mM PBS, 0.05% Tween 20, 2% PVP, 1% żelatyna,
1mM MgCl2 x 6 H2O
Polivinylopirolidon (PVP) MW 24000 20.00g
Żelatyna 10.00g
MgCl2 x 6 H2O 0.20g
Rozpuścić w 1000ml buforu B
• Bufor D (substratowy): 1 M dwuetanoloamina pH 9.6, 0.02% azydek sodowy
• Dwuetanoloamina 97.00ml
NaN3 0.20g
Rozpuścić w 900ml H2O, 6M HCl doprowadzić pH do 9.8 i dopełnić do 1000ml.
Wszystkie bufory należy przechowywać w 4°C. Przed użyciem powinny osiągnąć
temperaturę pokojową.

Sprzęt:
mikropłytki, wytrząsarka do mikropłytek, czytnik do mikropłytek z filtrem na 405 nm.

Procedura

1. Przeciwciała rozcieńczyć 1000 razy buforem A (Na jedną płytkę 96 otworkową -

0.01ml IgG 1mg/ml + 9.99ml buforu A). Do otworków mikropłytki napipetować po
100µl 1000x rozcieńczonych przeciwciał. Wytrząsać 1 h w temperaturze pokojowej.

2. W trakcie wytrząsania płytki wycisnąć sok z badanych i kontrolnych roślin na prasie

lub w moździerzu, i rozcieńczyć go 10 x buforem C (np.: 100µl soku + 900µl
buforu C).
3. Koniugat IgG-alkaliczna fosfataza rozcieńczyć 500x buforem C (0.02ml koniugatu
+ 9.98ml buforu C).
4. Płytkę po 1 h wytrząsania dokładnie umyć Buforem B i napipetować do niej po 50µl
10 x rozcieńczonego soku a następnie po 50µl 500x rozcieńczonego koniugatu. W
efekcie ciecz w otworku zawierać będzie 20x rozcieńczony sok i 1000x rozcieńczony
koniugat.
5. Płytkę wytrząsać w temperaturze pokojowej od 2 do 5 godzin lub zostawić do
następnego dnia (bez wytrząsania).
6. Po inkubacji z sokiem i koniugatem płytkę dokładnie umyć buforem B. W trakcie
mycia przygotować roztwór substratu (fosforanu paranitrofenolu) w buforze D - na
każdy mililitr buforu D odważyć 1mg fosforanu paranitrofenolu (pNPP)(Czyli na 10ml
buforu -10mg substratu). Po umyciu i osuszeniu płytki napipetować do otworków po
100µl roztworu substratu. Roztwór substratu należy przygotowywać tuż przed
użyciem ponieważ
7. Płytkę inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej - odczyt absorbancji w 405
nm wykonywać po 30, 60 lub 120 minutach.
ad. 1. Warunki wiązania przeciwciał ze ściankami otworków mikropłytki powinny być tak
dobrane, by przeciwciała stworzyły na nich jednomolekularną warstwę. Osiągnąć
można ten efekt poprzez użycie do opłaszczania określonego stężenia przeciwciał -
mieszczącego się zazwyczaj w granicach od 1 do 10 µg/ml. Zależnie od sposobu
powlekania czas tego procesu może wynosić od 12 h (powlekanie w 4°C) do 1h
(wytrząsanie w ·temperaturze pokojowej). Powleczone przeciwciałami płytki można po
dokładnym przemyciu osuszyć, zamrozić i przechowywać do 6 miesięcy. W takim
wypadku płytkę należy po wyjęciu z zamrażarki odmrażać przez 1h w temperaturze
pokojowej.
ad. 2. Sok roślinny wpływa hamująco na wiązanie przeciwciał z wirusem, efekt ten
ustępuje po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu soku. Sok z roślin kontrolnych - to sok z
roślin zdrowych (kontrola negatywna) i porażonych badanym wirusem (kontrola
pozytywna). Często kupić można gotowe kontrole - należy je wtedy rozpuścić w połowie
proponowanej przez producenta objętości buforu. Należy jednak pamiętać, że do
wyznaczania wartości progowej ekstynkcji, (czyli wartości pozwalającej odróżnić reakcję
pozytywną od negatywnej) najlepiej używać świeżej kontroli negatywnej, przygotowanej
w taki sam sposób jak próbki badane. Podczas testowania dużych partii roślin dokładne
rozcieńczanie soku może zająć dużo czasu. Jeżeli dysponuje się prasą, można wtedy
wykonywać rozcieńczenia w następujący sposób: do probówek napipetować po 450µl
buforu C. Następnie do tych probówek łapać po dwie krople soku z liści badanych
roślin, wyciskanych na prasie. Wałki prasy należy pomiędzy próbami dokładnie umyć
wodą, przepłukać buforem C i osuszyć ręcznikiem papierowym. Jeżeli probówki pasują
średnicą do otworu mikropłytki, to można je ustawiać używając zamiast statywu
używanej mikropłytki w takiej kolejności, w jakiej trafią do otworków mikropłytki testowej.
Jeżeli nie dysponuje się takimi probówkami, warto przygotować sobie statyw
styropianowy lub drewniany w formacie mikropłytki (8x12 otworków), Ustawianie prób w
takich statywach pozwala na uniknięcie zamieszania prób.
ad. 3. Stężenie optymalne należy wyznaczać samemu dla każdej partii sporządzonego
koniugatu. Jeżeli stosuje się zakupiony koniugat należy rozcieńczyć go 2x mniej niż
zaleca producent (np.:, jeżeli optymalne stężenie wynosi 1µg/ml to należy koniugat o
stężeniu 1mg/ml rozcieńczyć 500 razy do stężenia 2µg/ml - wtedy po połączeniu z
sokiem w otworku mikropłytki końcowe stężenie równe będzie optymalnemu - 1 µg/ml).
ad. 4. W celu dokładnego przemycia płytkę należy spłukać, co najmniej czterokrotnie,
przy czym przedostatnie płukanie powinno trwać ok. 1 minuty. Po wypłukaniu należy
pozbawić otworki kropli cieczy poprzez delikatne pukanie płytką o bibułę lub ręcznik
papierowy. Nie wolno jednak dopuścić do całkowitego wyschnięcia otworków - należy
bezpośrednio po umyciu i usunięciu resztek cieczy natychmiast pipetować do otworków
odpowiedni roztwór.
ad. 5. Najwyższą czułość daje 5 godzinna inkubacja soku z koniugatem na płytce (5 -7
razy wyższe niż uzyskiwane standardowo, patrz wykres 1), inkubowanie przez noc do
następnego dnia zasadniczo nie zwiększa czułości metody, ale również jej nie obniża.
Przy dwugodzinnym czasie inkubacji soku i koniugatu test trwa tyle samo czasu, co
standardowa procedura (oddzielna inkubacja soku i koniugatu), ale wymaga mniejszej
ilości czynności (jeden etap mniej) i nadal jest 3 -4 razy bardziej czuły niż test
standardowy.
ad. 7. Im dłuższy czas inkubacji substratu przed odczytem tym wyższe wartości
absorbancji, po zbyt długim czasie wzmagają się jednak również reakcje niespecyficzne
i zachodzi nieenzymatyczny rozkład substratu. To ostatnie zjawisko przebiega jednak
wolno i łatwo je odróżnić od reakcji enzymatycznej wykonując pomiar wj dwóch różnych
czasach inkubacji. Dobrze wykonywać każdą próbkę, chociaż w dwu powtórzeniach -
jeśli uzyskane wyniki dla powtórzeń tej samej próby różną się o wartość większą niż 0,1
oznacza to, że jedna z prób daje wynik nieprawdziwy. W takiej sytuacji test należy dla
takich próbek powtórzyć. Za reakcję pozytywną przyjmuje się zazwyczaj taką, której
wartość absorbancji jest równa trzykrotnej wartości absorbancji kontroli negatywnej.
Stosunek kontroli pozytywna/negatywna powinien przekraczać wartość 10.

Porównanie wykrywania PLRV testem standardowym ( S ) i

koktajlowym ( K ).
E - 405 nm po 1 h ikubacji płytki z p- NPP

2,5

1,5 koktajl
Standard
kn K
1 kn S

0,5

0
0 5 10 15 20 25
Czas inkubacji soku i koniugatu na płytce ( h ).
WYKRYWANIE PLRV TECHNIKĄ IMMUNO RT-PCR

Zasada metody
Etap I. Immunopułapkowanie wirusa.
Do powleczonych przeciwciałami probówek 0.2 - 0.5 ml lub otworków mikropłytki
(wykonanej z materiału odpornego na ogrzewanie do 100°C) pipetuje się sok z
badanych roślin. Jeżeli obecny jest w nim wirus, zastaje związany przez przeciwciała.
Po czasie potrzebnym na wysycenie przeciwciał wirusem, probówki należy dokładnie
umyć buforem pozbawionym rybonuklezay (RNazy). Enzym ten w kolejnych etapach
może strawić RNA i uniemożliwić wykrycie wirusa.
Etap II Odwrotna transkrypcja (RT)
Białkowy płaszcz wirusa należy zdenaturować termicznie. Odsłonięty dzięki temu RNA
staje się dostępny dla dodanej do probówki mieszaniny sześcionukleotydów
(heksamerów). Sekwencja nukleotydów w heksamerach jest przypadkowa, więc część z
nich będzie komplementarna do niektórych miejsc RNA wirusowego. Heksamery, które
zhybrydyzują z RNA wirusowym, (czyli połączą się wiązaniami wodorowymi z
komplementarną sekwencją nukleotydów) staną się starterami dla odwrotnej
transkryptazy. Enzym używając wirusowego RNA jako matrycy, zsyntetyzuje
komplementarną do niego nić cDNA z obecnych w mieszaninie reakcyjnej
trójfosforanów deoksyrybonukleotydów.
Etap III Amplifikacja specyficznego dla wirusa fragmentu genomu w reakcji PCR.
Powstały cDNA posłuży następnie jako matryca w łańcuchowej reakcji polimerazy
(PCR). Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się kilka mikrolitrów cDNA wirusowego,
startery rozpoznające specyficzny fragment genomu wirusa, mieszaninę trójfosforanów
deoksyrybonukleotydów, MgCl2, termostabilną polimerazę DNA i właściwy dla niej bufor.
Reakcja PCR składa się z trzech etapów.
Pierwszy z nich to denaturacja1. Polega on na podniesieniu temperatury, w jakiej
znajduje się mieszanina reakcyjna, do takiej wartości, w której następuje rozdzielenie
dwuniciowego DNA na dwie pojedyncze nici (ok. 90-96°C).
W kolejnym etapie, tzw. przyłączaniu starterów, temperaturę obniża się tak by
startery mogły hybrydyzować z komplementarnymi miejscami na jednoniciowym DNA
(30-72°C).
Po zmianie temperatury na optymalną dla polimerazy DNA (70-75°C), rozpoczyna
się etap wydłużania starterów, polegający na syntezie przez polimerazę nici
komplementarnej do obecnego w mieszaninie reakcyjnej DNA. Enzym działa w ten
sposób, że dołącza nukleotyd do 3’ końcowej grupy OH starterowego oligonukloeotydu
DNA (startera) związanego z nicią matrycową w poprzednim etapie (w omawianym
przypadku matrycą jest cDNA wirusowe). Ponieważ dodane do mieszaniny startery
przyłączają się do ściśle określonej sekwencji DNA, jedynie ona ulega powieleniu przez
polimerazę.
Powstanie nici potomnej kończy pierwszy cykl reakcji PCR. Należy teraz rozpocząć
drugi cykl przeprowadzając kolejno denaturację (aby rozłączyć kompleks stara nić-nowa
nić), przyłączanie starterów i wydłużanie starterów. W reakcji PCR wykonywanej w
ramach wykrywania genu białka płaszcza PLRV pojedyńczy cykl ma następującą
postać :
Denaturacja - 94°C przez 1 minutę
Wiązanie starterów - 54°C przez 2 minuty
Wydłużanie starterów - 72°C przez 3 minuty.
 Powtarzając takie cykle ok. 30 - 45 razy uzyskuje się duże ilości ściśle określonego
fragmentu DNA, który można po reakcji zidentyfikować rozdzielając zawartość
mieszaniny reakcyjnej drogą elektroforezy w żelu agarozowym. W przypadku
przedstawianego w ramach warsztatów sposobu wykrywania PLRV, produktem reakcji
będzie fragment cDNA zawierający sekwencję kodującą białko płaszcza PLRV.
Obecność w żelu po elektroforezie prążka cDNA o wielkości 622 pary zasad (wielkość
genu białka płaszcza) będzie świadczyła o tym, że badany materiał porażony jest
wirusem.
1
- Jeżeli nie przeprowadza się w reakcji odwrotnej transkrypcji etapu syntezy
drugiej nici, otrzymane cDNA jest jednoniciowe, nie trzeba więc go denaturować.
Jednak denaturacja w pierwszym cyklu reakcji PCR jest konieczna, gdyż zapobiega
niespecyficznemu wiązaniu starterów z matrycą (tzn, wiązaniu z niekomplementarnymi
fragmentami matrycowego DNA), lub z tzw. „obcym” DNA (wprowadzonym do
probówek w sposób niezamierzony). Ponadto zniszczeniu ulegnie obecna w próbce
cDNA odwrotna transkryptaza. Wpływa ona hamująco na przebieg reakcji PCR.

Odczynniki:

• Bufor A (powlekający) - 50mM bufor węglanowy, pH 9.6:

Na2CO3 1.59 g
NaHCO3 2.93 g
NaN3 0.20 g
Rozpuścić w 1000 ml H2O, pH powinno wynosić 9.6 bez doprowadzania.
• Bufor B - 10 mM PBS, pH 7.4:
 NaCl 8.00 g
KH2P04 0.20 g
Na2H P04 x12 H2O 2.90 g
KCl 0.20 g
Rozpuścić w 900 ml H2O, jeżeli pH jest zbyt alkaliczne (>7.4) doprowadzić
1 M HCl, jeżeli jest mniejsze niż 7.4, doprowadzić 1 M NaOH. Dopełnić do
1000 ml. Można przygotowywać 5xstężony i rozcieńczać przed użyciem.
• Bufor elektrodowy TBE . pH 8.0:
Tris 10.80 g
Kwas borny 5.50 g
EDTA 0.93 g
Rozpuścić w 1000 ml. Można przygotowywac 10 x stężony.
• Bufor do prób
Błękit bromofenolowy 0.025 g
Glicerol 3.000 ml
Woda do 10.000 ml.

Bufory po zautoklawowaniu przechowywać w 4°C.

• IgG anty PLRV (1 mg/ml) (IHAR O/w Gdańsku)
• Mieszanina heksamerów o przypadkowej sekwencji -0.5 µg/1 µL (Promega)
• Mieszanina wszystkich czterech dNTP’s (ATP, GTP, CTP,TTP - każdy z nich w
stężeniu 2 mM) (DNA Gdańsk)
• Odwrotna transkryptaza MMLV (200 U/µL) i 5 x bufor dla niej (Promega)
• Inhibitor Rnazy, 40 U/µL (Promega)
• Polimeraza termostabilna (10 U/µL) i 10 x bufor (DNA Gdańsk)
• Startery specyficzne dla PLRV - S1 i S2 (DNA Gdańsk)
S1 - 5’AGG CTC TGA TCC GGA GTC TA 3’
 S2 - 5’ TCC CAC GTG CGA TCA ATT GT 3’
• MgCl2, 25 mM (DNA Gdańsk)
• Bromek etydyny, 10 mg/ml (Boehringer Manheim Biochemicals) (UWAGA -
substancja toksyczna - bezwzględnie unikać kontaktu ze skórą i błonami
śluzowymi!!!)
• Agaroza (BDH Chemicals Ltd)

Przygotowywanie odczynników i sprzętu pozbawionych RNazy

Sprzęt plastikowy - zalać 0,1% wodnym roztworem dwuetylopirokarbonianu (DEPC)

na 12 h. Autoklawować razem z cieczą (DEPC jest silną trucizną, lecz w 121°C
rozkłada się do CO2 i wody).
Szkło i szpatułki metalowe - prażyć 8 h w 180°C.
Woda i bufory nie zawierające amin - dodać DEPC do stężenia 0.1% i po 12 h
autoklawować.
Bufory zawierające aminy (np. Tris) - Do sporządzania tego rodzaju buforów używać
osobnej partii odczynników gwarantowanych przez producenta jako wolne od
RNazy. Naważać je należy wyprażonymi szpatułkami i rozpuszczać w wodzie
traktowonej 0,1% DEPC.

Sprzęt:
Probówki cienkościenne 0.2 ml, pipety 0.1-20 i 2-100 µl, łaźnia wodna, blok termiczny,
termocykler, sprzęt do elektroforezy agarozowej poziomej, transiluminator - 254-300
nm.

Procedura:

1. Probówki 0.2 ml pokrywać 12 h w 4°C 150 µL buforu A zawierającego IgG anty

PLRV (1 µg/ml). Myć je 5 x po 150 µL 1 x PBS bez Rnazy.
2. Do probówek nakropić po 100 µL badanej próby i inkubować przez noc w 4°C.
Należy pamiętać o wykonaniu, co najmniej jednej kontroli ze zdrowych roślin. Płukać
jak w pkt 1.
3. Do probówki dodać: 5 µL wody bez Rnazy i 0.5 µg (1µL) heksamerów. Inkubować
5 min. w 70°C po czym szybko umieścić w łaźni lodowej (0°C).
4. Przygotować mieszaninę reakcyjną do odwrotnej transkrypcji (RT-MasterMix):
40U/µL LLInhibitor RNazy - 0,625 µL
5x bufor dla MMLV - 5.000 µL
2mM dNTP’s - 6,250 µL
Woda - 6.125 µL
Razem - 18.000 µL
5. Do mieszaniny RNA i heksamerów (6 µL) dodać 18 µL RT-MasterMixu, 1 µL
odwrotnej transkryptazy (M-MLV) i inkubować 1 h w 37°C. Po tym czasie MMLV
denaturować przez 5 min. w 96°C.
6. Przygotować mieszaninę reakcyjną do reakcji PCR (PCR-MasterMix):
 10 x bufor dla polimerazy 2.5 µL
10 µM STARTER1 - 2.0 µL
10 µM STARTER2 - 2.0 µL
25 mM MgCl2 - 2.0 µL
2 mM dNTP’s - 1.0 µL
Woda - 9.5 µL
Razem - 19.0 µL
7. Z prób po odwrotnej transkrypcji pobierać po 5 µL i dodawać 19 µL PCR
MasterMix’u. Próby ogrzewać 1 min. w 96°C, po czym dodawać 1 µL polimerazy
(1U). Inkubować dodatkowo 1 min. w 96°C. Bezpośrednio po tym wykonywać PCR
wg poniższego programu:
94°C - 1 min, 54°C - 2 min, 72°C - 3 min > 35 x
72 °C - 10 min > 1 x.
8. W trakcie trwania reakcji PCR przygotować 2% żel agarozowy:
Odważyć 0.5 g agarozy do kolby na 100 ml, zalać 25 ml buforu 1 x TBE, zaznaczyć
markerem poziom cieczy, zamieszać i rozpuścić agarozę ogrzewając kolbę w łaźni
wodnej lub w mikrofalówce. Po rozpuszczeniu agarozy, dopełnić poziom cieczy
wodą do zaznaczonej linii. Odczekać aż żel osiągnie temperaturę około 55°C (kolba
daje się utrzymać w dłoni). W tym czasie należy włożyć grzebień elektroforetyczny
do wanienki i wstawić wanienkę do aparatu do elektroforezy w taki sposób, by ściany
aparatu uszczelniły otwarte boki wanienki (zawierające uszczelkę). Ochłodzoną
agarozę należy wylewać równomiernie na środek wanienki tak by utworzyła warstwę
nie grubszą niż 5 mm. Elektroforezę można prowadzić dopiero po 30 - 60 minutach
od wylania agarozy. Należy wtedy wanienkę ułożyć w aparacie w taki sposób, by jej
otwarte boki łączyły oba pojemniki buforu elektrodowego. Do aparatu należy wlać
bufor 1 x TBE tak, by zalał powierzchnię żelu w wanience warstwą 2 - 3 mm.
Następnie należy wyjąć ostrożnie grzebień z żelu, uważając by nie przerwać ścianek
pomiędzy utworzonymi studzienkami.
9. Po skończeniu reakcji PCR próby obciążyć buforem do prób (2 µL buforu na 10 µL
próby) i analizować w 2% żelu agarozowym. Otrzymany produkt powinien mieć
wielkość 622 pz.
Ad.1. Ponieważ RNaza jest enzymem produkowanym przez wszystkie żywe
organizmy łącznie z ludźmi, jest ona obecna praktycznie wszędzie. Szczególnie
groźnym jej źródłem jest skóra i oddech osoby przeprowadzającej wykrywania wirusa. Z
tego powodu wszystkie etapy procedury od punktu 3 powinny być wykonywane w
warunkach sterylnych, w fartuchu, rękawiczkach i masce przeciwpyłowej.
Ad.4 i 5. Roztwory MasterMix do odwrotnej transkrypcji i PCR należy
przygotowywać w ilości nieco większej niż ilość analizowanych prób. Np. jeżeli
analizuje się osiem roślin, należy sporządzić 180 µL RT- i 190 µL PCR MasterMix’u, po
czym rozdzielić odpowiednio do probówek po 18 i 19 µL.
Fot.1 Wykrywanie PLRV techniką immuno RT-PCR. Wpływ stężenia MgCl2 na
efektywność amplifikacji cDNA białka płaszcza w reakcji PCR. cDNA otrzymano
poddając odwrotnej transkrypcji RNA wirusa immunopułapkowanego z soku
porażonych roślin ziemniaka.
 M - markery

622pz

M 1 2 3 4 5
1 - cDNA białka płaszcza PLRV+ PCR MasterMix z 1 mM MgCl2
2 - 1.5 mM MgCl2
3 - z 2 mM MgCl2
4 - z 2.5 mM MgCl2
5 - Kontrolne cDNA ze zdrowych roślin + PCR MasterMix z 1 mM MgCl2
Dr Teresa Pastuszewska
Sam. Prac. Chorób i Szkodników kwarantannowych.
IHAR Oddział w Bydgoszczy

WYKRYWANIE LATENTNYCH INFEKCJI BULW I ŁODYG PRZEZ

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SSP. SEPEDONICUS TECHNIKĄ
PCR.
Ekstrakcja bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

Ekstrakcja bakterii z bulw

1.1. Przy pomocy jałowego skalpela (noża) usunąć skórkę z części przystolonowej
bulw, wyciąć małe stożki tkanki przewodzącej.
1.2. Umieścić je w plastikowym, jednorazowym pojemniku (lub kolbie stożkowej),
zalać buforem PB pH 7.0, 0.05 M.
1.3. Wytrząsać przez okres 4 godz. z częstotliwością 150 cykli/min.
1.4. Po ekstrakcji płyn zlać ostrożnie i wirować 1 min. przy obrotach 500-1000
obrotów/min., by resztki tkanki i skrobia osiadły na dnie.
1.5. Supernatant wirować przez 10 min. przy 12000 obrotów/min.
1.6. Supernatant odrzucić a osad zawiesić w 1ml sterylnego buforu PB, pH 7.2,
0.01 M.
1.7. Tak przygotowany ekstrakt, po dodaniu kropli glicerolu można przechowywać w
temp. -200C.
Ekstrakcja bakterii z łodyg i stolonów
2.1 Łodygi (ok. 10 cm. odcinki z części przyziemnej)), stolony pociąć na krótkie
odcinki przy użyciu sterylnego skalpela (noża)
2.2 Postępować jak w punktach 1.3 do 1.7.

Izolacja całkowitego DNA z bakterii Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus (zmodyfikowana metoda izolacji całkowitego DNA wg. Davis
i wsp. 1986])

Materiały:
1. Hodowla bakterii Cms
2. Bufor TE (10 mM Tris - HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA)
3. Bufor 10 x TE (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA)
4. 10% SDS
5. 8 M. KAc (octan potasu)
6. 3 M. NaAc (octan sodu)
7. Etanol 96%
8. i 80%

Wykonanie:
1. Do probówki eppendorfa napełnionej wodą sterylną w ilości 1ml pobrać ezą bakterie
z hodowli. Czynności te wykonać w komorze laminarnej. Dodać 110µl buforu 10xTE
oraz 100 µl 10% SDS.
2. Wymieszać i inkubować 30 min w temp. 650C. Pobrać następnie 300 µL lizatu do
nowej probówki.
3. Dodać 85 µL 8 M Kac, (stężenie końcowe KAc wynosi 1.75 M).
4. Zamieszać na vortexie.
5. Schładzać przez 10 min w lodzie.
6. Wirować w 40C przez 5 min., przy 12000 obr./min.
7. Supernatant przenieść do nowej probówki, osad wyrzucić.
8. Dodać 3 M NaAc w ilości odpowiadającej 1/10 obj. supernatantu i 2.5 krotną ilość
96% etanolu. Delikatnie wymieszać przez odwracanie probówki i obserwować
precypitujący DNA w postaci „kłaczka”.
9. Pozostawić na noc w temp. -200C.
10. Wirować przez 10 min. w 40C, przy 10 000 obr./min. Odrzucić supernatant.
11. Przemyć osad 80% etanolem, schłodzić wstawiając na 15 min. do temp. -200C.
12. Delikatnie wymieszać zawartość probówki i ponownie wirować przez 10 min. w
temp. 40C przy 10 000 obr./min..
13. Ostrożnie zlać etanol a osad osuszyć pod próżnią w eksykatorze.
14. Wysuszony osad rozpuścić w 100 µl buforu TE. Jest to matrycowy DNA gotowy
do reakcji. Matrycę przechowywać w temp. -200C.

Izolacja całkowitego DNA z ekstraktów łodyg, stolonów i bulw ziemniaka

podejrzanych o porażenie latentną postacią bakteriozy pierścieniowej
ziemniaka.

Materiały:
1. Ekstrakty z łodyg, stolonów i bulw ziemniaka
2. Bufor TE
3. Bufor 10 x TE (100 mM Tris-HCl, pH 8.0. 10 mM EDTA)
4. 10 % SDS
5. 8 M KAc
6. 3 M NaAc
7. Etanol 96% i 80%

Wykonanie:
1. Ekstrakty w probówce Eppendorfa wytrząsać krótko na vortexie.
2. Całość zwirować przy 400 - 500 obr./min.
3. Pobrać 300 µL górnej warstwy do nowych probówek Eppendorfa.
4. Dodać 36 µL 10 x TE i 36 µL 10 % SDS.
5. Wymieszać i inkubować 30 min w temp. 650C.
6. Dodać 85 µL 8 M KAc, (stężenie końcowe KAc wynosi 1.75 M).
7. Zamieszać na vortexie.
8. Schładzać przez 10 min w lodzie.
9. Wirować w 40C przez 5 min., przy 12000 obr./min.
10. Supernatant przenieść do nowej probówki, osad wyrzucić.
11. Dodać 3 M NaAc w ilości odpowiadającej 1/10 obj. supernatantu i 2,5 krotną ilość
96% etanolu. Delikatnie wymieszać przez odwracanie probówki i obserwować
precypitujący DNA w postaci „kłaczka”.
12. Pozostawić na noc w temp. -200C.
13. Wirować przez 10 min. w 40C, przy 10 000 obr./min. Odrzucić supernatant .
14. Przemyć osad 80% etanolem, schłodzić wstawiając na 15 min. do temp. -200C.
15. Delikatnie wymieszać zawartość probówki i ponownie wirować przez 10 min. w
temp. 40C przy 10 000 obr./min..
16. Ostrożnie zlać etanol a osad osuszyć pod próżnią w eksykatorze.
17. Wysuszony osad rozpuścić w 100 µl buforu TE. Matrycowy DNA przechowywać
w temp. -200C.
Diagnostyka bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus techniką
PCR z użyciem starterów i warunków reakcji podanych przez Schneidera i
wsp. (1993) oraz Firrao i Lozzi (1994).
 Wykorzystując bakteryjne DNA izolowane z czystych hodowli czy z ekstraktów z łodyg,
stolonów i bulw ziemniaka podejrzanych o porażenie latentną postacią bakteriozy
pierścieniowej ziemniaka można przeprowadzić reakcje PCR z użyciem starterów i
warunków reakcji zaproponowanych przez:

Schneider i wsp.(1993) :
starter CMS 6 - 5’ - CGC TCT CCC TCA CCA GAC TC
starter CMS 7 - 5’ - TCC CGT GCT TGC CTG CGT TG
program reakcji: denaturacja wstępna - 950C, 2 min; 35 cykli : ( denaturacja - 950C, 1,5
min.; annealing - 550C, 1.5 min.; elongacja - 720C, 1.5 min.), elongacja końcowa - 720 C,
10 min. produkt - 258 pz, plazmidowy DNA.

Firrao i Lozzi (1994) :

starter A 47a - 5’ - CAC CCC TCG ACT GCG AGA AAC G
starter A 47b - 5’ - TCC TCC GAG ACT TTC GGG ACG C
program reakcji: denaturacja wstępna - 960C, 2 min.; 30 cykli : (denaturacja - 960C, 20
s; annealing i wydłużanie - 700C, 40 s) elongacja końcowa - 720C, 5 min. produkt - 670
pz, DNA plazmidowe.
Identyfikacja produktów PCR po elektroforezie w agarozie i barwieniu bromkiem
etydyny
Doc. Dr hab. Jerzy Lewosz
Sam. Prac. Diagn. Molekul. i Biochemii
Inst. Hod. i Aklim. Roślin Oddział w Boninie

IMMUNOENZYMATYCZNE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI

GLIKOALKALOIDÓW ZIEMNIAKA PRZY POMOCY ZESTAWU AP002
FIRMY ENVIROLOGIX INC.
Jak działa zestaw
Zestaw ELISA do ilościowego oznaczania zawartości glikoalkaloidów ziemniaka
służy do określania “całkowitej ilości glikoalkaloidów” tzn. sumy alfa-solaniny i alfa-
chaconiny.
Test ma charakter kompetytywny, co oznacza, że cząsteczki glikoalkaloidów obecne
w ekstrakcie tkankowym współzawodniczą z kompleksem: peroksydaza chrzanu -
solanidyna o ograniczoną liczbę cząsteczek immunoglobuliny umiejscowionej na
wewnętrznej powierzchni zagłębień mikropłytki i wiążącej antygen.
Po przepłukaniu płytki, ocenia się stopień współzawodnictwa na podstawie
zabarwienia pojawiającego się w wyniku działania peroksydazy. Tak jak we wszystkich
immunotestach kompetycyjnych, stężenie badanej substancji jest odwrotnie
proporcjonalne do intensywności powstającej barwy.
Ciemniejszy kolor = niższe stężenie
Jaśniejszy kolor = wyższe stężenie

Charakterystyka testu
Zakres wykrywalności
Granice wykrywalności (Limit of Detection LOD) testu wynosi 0.07 ppm sumarycznej
zawartości glikoalkaloidów. LOD oznaczano przez inte rpolację krzywej kalibracyjnej dla
solaniny przy wartości Bo = 93.9%. Wartość Bo = 93.9% odpowiada trzykrotnej
wartości odchylenia standardowego dla średniej z 11 prób kontrolnych negatywnych
(bez glikoalkaloidów).
Wartość 100% Bo równa się takiej ilości koniugatu glikoalkaloid-enzym, która wiąże się
na płytce pod nieobecności jakichkolwiek glikoalkaloidów w próbie. tj. w próbach
kontrolnych negatywnych. % Bo = (OD próby wzorcowej/OD kontroli negatywnej x 100)
Wykrywanie i ocena ilościowa
Zestaw zawiera wzorce ilościowe α-solaniny w stężeniach : 0.15, 0.75 i 2.5
cząsteczek na milion (ppm; mikrogramów w 1 ml). Jest to zakres wykrywalności w
próbkach ekstraktów. Ponieważ metoda ekstrakcji obejmuje rozcieńczanie próby
rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, to zakres wykrywalności glikoalkaloidów w próbkach
tkanek jest wyższy niż zakres kalibracji (należy wynik pomnożyć przez współczynnik
rozcieńczenia stosowanego przy ekstrakcji).
Dokładność
Roztwory kontrolne wzbogacone w solaninę były wielokrotnie analizowane zarówno
jako powtórzenia jednej analizy, jak i różne analizy w różnych dniach.
Wyniki wyrażono jako współczynnik zmienności (CV = odchylenie standardowe /
średnia x 100) zarówno dla znanych ilości dodanej solaniny (odzysk), jak i zmierzonej
absorbancji (OD)
Odzysk OD Odzysk OD
(%CV) %CV) (%CV) (%CV)
 n=7 W powtórzeniach Między powtórzeniami
0.25 ppm 6.8% 1.5% 10,1% -
1.25 ppm 3.3% 1.9% 6.3% -

Reakcje krzyżowe
Przy pomocy testu nie można rozróżniać glikoalkaloidów, lecz można wykrywać
obecność różnych glikoalkaloidów z różną i specyficzną dla nich skutecznością.
Poniższa tabela wskazuje zawartości różnych glikoalkaloidów w ekstraktach (ppm) dla
poziomów 50% i 85% Bo czyli dla poziomów odpowiadającym najniższym roztworom
wzorcowym
Substancja 50% Bo 85% Bo
α-Solanina 0.77 0.15
α-Chaconina 0.75 0.10
β2-Chaconina 0.36 0.05

γ-Chaconina 0.37 0.07

Solanindyna 1.1 0.19
Demissydyna 1.9 0.27
α-Tomatyna 8.8 1.5
Tomatydyna 55 10
Solasonina 220 38
Solasodyna >2500 470
Solamargina 620 120

Ostrzeżenia i uwagi
∗ Mikropłytka i składniki testu powinny być przechowywane w temperaturze od 4 do 8o
C gdy nie są używane.
∗ Nie należy wystawiać zestawu na działanie temperatury wyższej niż 37 0C lub niższej
niż 20C.
∗ Przed użyciem pozwól odczynnikom osiągnąć temperaturę otoczenia.
∗ Nie należy używać odczynników lub mikropłytek jednego zestawu z odczynnikami lub
mikropłytkami innego zestawu.
∗ Nie należy wystawiać substratu na światło słoneczne podczas pipetowania lub
inkubacji płytek.
∗ Nie należy rozcieńczać lub podmieniać odczynników testu lub używać próbek nie
wymienionych w procedurze testu
∗ Zaleca się stosować odmienne metody (takie jak chromatografia cieczowa lub
gazowa) dla potwierdzenia wyników testu.

Materiały
Zestaw EnviroLogics do oznaczania glikoalkaloidów zawiera następujące
składniki
- 8 pasków polistyrenowych z 12 studzienkami pokrytymi przeciwciałem wraz z ramką
- 1 ampułka roztworu kontrolnego negatywnego
- 1 ampułka roztworu wzorcowego z 0.15 ppm solaniny
- 1 ampułka roztworu wzorcowego z 0.75 ppm solaniny
- 1 ampułka roztworu wzorcowego z 2.5 ppm solaniny
- 1 buteleczka koniugatu solanidyny z enzymem
- 1 butelka 10x skoncentrowanego rozcieńczalnika
- 1 butelka substratu
- 1 butelka roztworu zatrzymującego reakcję

Próby wzorcowe i kontrolna negatywna są w roztworze 2% kwasu octowego

Do własnoręcznego przygotowania
∗ roztwór 2% kwasu octowego w wodzie destylowanej
∗ woda destylowana do 10-krotnego rozcieńczania koncentratu rozcieńczalnika i
cylinder miarowy do odmierzenia 270 ml
∗ butelka szklana do wlania 300 ml roztworu rozcieńczalnika
∗ probówki lub fiolki szklane do rozcieńczania roztw. wzorcowych lub ekstraktów
∗ pipeta lub dozownik na 50 ml lub pipeta o obj. 5 ml do dawkowania rozcieńczalnika
∗ pipety automatyczne do dozowania porcji 10 µl i 100 µl
∗ pisak do szkła
∗ taśma samoprzylepna lub parafilm
∗ zegar sygnałowy na 1 godzinę i 30 min
∗ zimna woda wodociągową lub destylowaną do przemywania płytek
∗ czytnik mikropłytek
∗ myjka automatyczna do płytek (do wyboru)
∗ pipeta 12-kanałowa do dozowania 100 µl
∗ statyw z probówkami do zasysania roztworów pipetą 12-kanałową
∗ wytrząsarka kołowa do płytek

Ekstrakcja prób
Próbki ziemniaków (liofilizowana lub świeża tkanka) ekstrahuje się 2% wodnym
roztworem kwasu octowego . Ekstrakty należy filtrować lub wirować dla usunięcia
stałych cząsteczek przed etapem rozcieńczania.
1. Liofilizowane obierki i bulwy ziemniaka:
Mieszaj 100 mg naważkę z 30 ml 2% kwasu octowego przez 1 godz.
Rozcieńczenie wynosi 1:300
2. Liofilizowana wewnętrzna część bulwy:
Mieszaj 1 g tkanki z 30 ml 2% kwasu octowego przez 1 godzinę.
Rozcieńczenie = 1:10
3. Ziemniaki świeże i całe:
Homogenizuj lub rozetrzyj 10 g tkanki z 60 ml 2% kwasu octowego. Mieszaj przez
godzinę. Rozcieńczenie = 1:6
4. Liofilizowane liście lub kiełki ziemniaka:
Mieszaj 20 do 50 mg naważkę w 40 ml 2% kwasu octowego przez 2 godziny.
5. Odfiltruj i zalkalizuj amoniakiem. Wytrząsaj dwukrotnie z 20 ml porcjami butanolu
nasyconego wodą, Połącz frakcje butanolowe i odparuj do sucha. Rozpuść
pozostałość w 5 ml metanolu.
Rozieńczenie od 1:250 do 1:100 (20 - 50 mg próba).
Uwaga: Te ekstrakty muszą być poddane analizie w ciągu 24 godzin od momentu
przygotowania, a jeżeli nie są analizowane bezpośrednio, to przechowaj je w lodówce
Przygotowywanie roztworu roboczego do ekstrakcji
W zestawie znajduje się 10-krotnie stężony rozcieńczalnik. Musi być on
rozcieńczony wodą destylowaną 10-krotnie dla uzyskania roztworu roboczego. W 10-
krotnie stężonym roztworze mogą znaleźć się substancje wytrącone w trakcie
przechowywania w lodówce. Z tego powodu należy rozcieńczyć całą zawartość butelki
(30 ml) od razu. Zrób te czynności przed rozpoczęciem jakichkolwiek innych.
Wlej całą zawartość koncentratu do butelki o pojemności 300 ml, dodaj 270 ml wody
destylowanej do butli, przemywając pojemnik z koncentratem. Wymieszaj w
temperaturze pokojowej, rozpuść wszystko i oznakuj “ Roztwór Roboczy”. Przechowuj w
lodówce gdy nie jest w użyciu.

Rozcieńczanie roztworów wzorcowych i ekstraktów próbek

1. Oznakuj probówki lub fiolki na kontrolę negatywną (KN), wzorzec 0.15 ppm (C1);
0.75 ppm jako (C2); 2.5 ppm jako (C3). Podobnie oznakuj każdą probówkę lub fiolkę
na każdy ekstrakt tkankowy
2. Przy pomocy pipety dodaj 5 ml roztworu roboczego do każdej oznakowanej
probówki lub fiolki.
3. Rozcieńcz roztwór kontroli negatywnej i roztwory wzorców dodając po 10 µl każdego
z roztworów do roztworu roboczego w odpowiednio oznakowanych probówkach.
Wymieszaj dokładnie.
4. Rozcieńcz ekstrakty próbek. Dodaj 10 µl ekstraktu każdej próby do roztworu
roboczego w probówce. Dobrze wymieszaj.

Uwaga: Te rozcieńczone roztwory powinny być analizowane natychmiast (w ciągu 1

godziny po przygotowaniu).

Jak posługiwać się zestawem

• Przeczytaj instrukcję przed rozpoczęciem.
• Pozwól osiągnąć odczynnikom temperaturę otoczenia przed rozpoczęciem (co
najmniej 30 min z zapakowanymi płytkami i odczynnikami w temperaturze pokojowej
- nie wyjmuj
• płytek z woreczka z desykantem przed ich ogrzaniem).
• Przygotuj wszystkie ekstrakty prób, odczynniki, pipety tak, aby etap 1 i 2 mogły być
wykonane w ciągu 10 minut lub krócej.
• Jeżeli używane będą więcej niż trzy paski w jednym czasie, to przypuszczalnie 10
minut nie wystarczy i należy wówczas używać pipety wielokanałowej. (patrz Uwaga
poniżej).
• Jeżeli używane będą trzy paski lub mniej, używaj jednorazowych czystych końcówek
do pipet automatycznych do dodawania każdego roztworu wzorcowego do
studzienek. Koniugat, substrat i roztwór zatrzymujący reakcję może być dodawany w
ten sam sposób; ewentualnie można stosować pipetę powtarzalną z jednorazowymi
końcówkami do tych wszystkich odczynników.
• Jeżeli używane będzie mniej niż 8 pasków, zamknij nieużywane opaski w
dostarczonym woreczku z desykantem.
• Oznakuj studzienki na ramce aby nie popełnić błędu przy pipetowaniu próbek i
odczynników.
• Dwa paski mogą być użyte do kontroli negatywnej, (KN), trzy do roztworów
wzorcowych (C1 - C3) i osiem próbek w dwu powtórzeniach. Większa ilość prób
wymaga większej ilości pasków. Przykład ułożenia prób na płytce przedstawiono na
Rys. 1.

1. Dodaj 100 µl rozcieńczonego roztw. kontroli negatywnej (KN), 100 µl każdego

rozcieńczonego roztworu wzorcowego (C1-C3) i 100 µl każdego rozcieńczonego
ekstraktu tkankowego (S1-S8) do odpowiednich studzienek jak to przedstawiono na
Rys. 1. Naśladuj ten sam sposób dodawania wszystkich pozostałych odczynników.
Uwaga: Dla skrócenia czasu napełniania studzienek zaleca się używać pipety
wielokanałowej przy wykonywaniu etapów 1,2,6 i 8 przy używaniu 3 i więcej pasków.
2. Natychmiast dodać 100 µl koniugatu solanidyny z enzymem do każdej studzienki.
3. Wymieszaj dobrze zawartość studzienek kołowym ruchem ramki na powierzchni stołu
przez okres 20 - 30 sekund. Uważaj aby nie rozlać zawartości.
4. Przykryj studzienki taśmą lub parafilmem aby ochronić przed parowaniem i
inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Jeżeli dostępna jest
wstrząsarka, wytrząsaj ramkę przy 200 cyklach na minutę.
5. Po inkubacji, zdejmij ostrożnie przykrycie i energicznie wytrząśnij zawartość do zlewu
lub jakiegoś pojemnika.. Zalej całkowicie otworki zimną wodą wodociągową i wytrząśnij
aby zostały puste. Powtórz to przemywanie 4-krotnie. Uderzaj płytką o powierzchnię
papierowego ręcznika aby usunąć tyle wody ile można. Zastosuj ewentualnie myjkę do
mikropłytek do wykonania tego etapu.
6. Dodać 100 µl substratu do każdego otworu.
7. Dokładnie wymieszaj zawartość studzienek jak w etapie 3. Przykryj płytkę nowym
kawałkiem taśmy lub parafilmu i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej. Użyj
kołowej wytrząsarki jeśli to możliwe.

Uwaga: Roztwór zatrzymujący reakcje jest 1 N kwasem solnym. Zachowaj ostrożność.

8. Dodaj 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję do każdej studzienki i dokładnie
wymieszaj.

UWAGA: Wykonaj odczyt w ciągu 30 min od momentu dodania roztworu

zatrzymującego reakcję.

Jak interpretować wyniki

Pomiar spektrofotometryczny i interpretacja

1. Ustaw długość fali odczytu swego czytnika na 450 nm ( jeżeli jest to czytnik
dwuwiązkowy, to użyj fali 600, 630 lub 650 nm jako odnośnej).
2. Jeżeli czytnik nie daje się wyzerować na studzienki puste, wyzeruj instrument wobec
studzienki zawierającej 200 µl wody. Zmierz i zapisz gęstość optyczną zawartości
każdej studzienki. Można też mierzyć i zapisywać OD każdej studzienki odejmując
następnie od każdej wartość OD próby ślepej z wodą.
3. Zastosuj półlogarytmiczny układ krzywej kalibracyjnej jeżeli czytnik płytek jaki
posiadasz ma taka opcję. Jeżeli nie, to oblicz wyniki posługując się instrukcją podaną w
następnym rozdziale.

Jak obliczać wyniki

1. Po zrobieniu odczytu oblicz średni wynik każdego zestawu wzorców i prób i oblicz
%Bo jak niżej:

średnia OD wzorca lub próbki x 100

% Bo=
średnia OD kontroli negatywnej
Obliczanie % Bo potrzebne jest do wyrównania różnych serii pomiarów. Podczas gdy
nie przeliczone wyniki pomiarów OD kontroli negatywnych, wzorców i prób mogą różnić
się miedzy seriami, to stosunek %Bo wzorców i prób do kontroli negatywnej powinien
pozostawać prawie stały.
Wartość % Bo każdego wzorca powinna wypadać w następujących granicach:
Wzorzec % Bo
0.15 ppm 75 - 91%
0.75 ppm 38 - 59%
2.5 ppm 18 - 31%
Współczynnik zmienności (CV) wartości OD każdej pary wzorca i próbki nie powinien
przekraczać 15%
2. Wykreśl zależność między % Bo każdego wzorca a stężeniem glikoalkaloidów na
skali półlogarytmicznej (patrz rys. 3)
3. Wyznacz stężenie glikoalkaloidów każdej rozcieńczonej próbki przez odnalezienie jej
wartości %Bo i odpowiadającego stężenia na wykresie. Pomnóż wynik przez
współczynnika rozcieńczenia próby podczas ekstrakcji.
4. Interpolacja stężenia glikoalkaloidów w próbce możliwa jest jedynie wtedy, gdy % Bo
próbki leży w zakresie % Bo wzorców.
Jeżeli % Bo próbki jest wyższy niż najniższego wzorca, to stężenie w próbce musi być
uznane jako niższe niż najniższy wzorzec ( tj. jeśli współczynnik rozcieńczenia ekstraktu
wynosi 1:300, to zawartość glikoalkaloidów będzie niższa niż 45 ppm).
Jeżeli %Bo próbki jest niższa niż ta, jaką ma najwyższy wzorzec, to zawartość
glikoalkaloidów w próbce będzie wyższa od najwyższego wzorca (tj. jeżeli współczynnik
rozcieńczenia wynosi 1:300, to zawartość glikoalkaloidów wyniesie ponad 750 ppm).
Jeżeli trzeba wyznaczyć zawartość glikoalkaloidów w próbach tak bogatych, to należy
oryginalny ekstrakt rozcieńczyć 1:10 2% kwasem octowym, a następnie ten nowy
ekstrakt powinien być traktowany jak poprzedni, rozcieńczany roztworem roboczym i
powtórnie poddany immunoanalizie. Jeżeli wyniki będą leżały w granicach % Bo
wzorców, to należy uwzględnić te dodatkowe rozcieńczenie mnożąc je przez
początkowy wsp. rozcieńczenia.
Uwaga: Jeżeli z góry wiesz, że analizowany przez ciebie materiał posiada wyższe
stężenie glikoalkaloidów niż zakres pomiaru, to należy uwzględnić to przy rozcieńczaniu
esktraktów przed rozpoczęciem testu. Na przykład, liofilizowane obierki ziemniaka mają
wsp. rozcieńczenia 1:300. Pomnożenie tego współczynnika przez wysoki i niski poziom
wzorców daje zakres pomiaru pomiędzy 45 i 750 ppm. Jednak wiele obierek ziemniaka
zawiera glikoalkaloidy w ilościach od setek do tysięcy ppm. Bezpośrednie rozcieńczenie
każdego ekstraktu 1:10 2% kwasem octowym powinno zwiększyć ten zakres do 450 -
7500 ppm i zwiększyć prawdopodobieństwo prawidłowej oceny już w pierwszej serii
pomiaru.
Rys.1. Przykład typowego układu wzorców i ekstraktów na płytce
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A KN C1 C2 C3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
B KN C1 C2 C3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
C
D
E
F
G
H

Rys. 2. Przykłady obliczeń

Zawartość OD Średnie OD %CV %Bo Zawartość
studzienki sd Glikoalkaloidów
Kontrola 2.053 2.041 0.8 100 -
negatywn 2.029 0.017
a
0.15 ppm 1.765 1.741 0.034 1.9 85 -
wzorzec 1.717
0.75 ppm 1.003 1.024 0.029 2.8 50 -
wzorzec 1.044
2.5 ppm 0.476 0.488 0.017 3.5 24 -
wzorzec 0.500
Próba 1.204 1.188 0.023 2.0 58 0.52 ppm*
1.171

* Jeżeli na przyklad próbkę stanowiła liofilizowana skórka ziemniaków o rozcieńczeniu

początkowym podczas ekstrakcji = 1:300, a następnie rozcieńczona dodatkowo 10-
krotnie , to całkowita zawartość glikoalkaloidów wynosi 1560 ppm

Rys. 3. Przykładowa krzywa kalibracyjne

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.1 1.0 10.0 Glikoalkaloidy (ppm)
% Bo
Doc. Dr hab. Jerzy Lewosz
Sam. Prac. Diagn. Molekul. i Biochemii
Inst. Hod. i Aklim. Roślin Oddział w Boninie

SYSTEMY AMPLIFIKACYJNE REAKCJI ELISA AMPAC - DKK 1212 i

AmpliQ - DKK 1452 DAKO (Dania)
Oba systemy stosowane są do wzmocnienia sygnału kolorymetrycznego przy testach
immunoenzymatycznych z użyciem koniugatu alkalicznej fosfatazy .
ZESTAW AMPAC

1. Amplifikacja enzymatyczna
AMPAK jest unikalnym cyklicznym układem enzymatycznym przeznaczonym do
wzmacniania sygnału kolorymetrycznego wytwarzanego przez alkaliczną fosfatazę,
enzym powszechnie stosowany w testach immunoenzymatycznych (EIA). W
konwencjonalnym teście EIA, enzym stosowany jako znacznik działa bezpośrednio na
substrat, wytwarzając barwny produkt. W układzie wzmacniającym, enzym działa na
substrat jakim jest NADPH (fosforan dwunukleotydu adenino- pirydynowego)
zamieniając go na NADH, który wskutek działania nastepnych enzymów ulega
Alkaliczna
cyklicznym i powtarzalnym przemianom fosfataza
red-ox. Dwa enzymy układu wzmacniającego
(diaforaza i dehydrogenaza alkoholowa) (konuigat)katalizują cykl reakcji redukcyjno-
oksydacyjnych (redox), w których NADH przechodzi w NAD z wytworzeniem w każdym
cyklu barwnego formazanu. W ten sposób sygnał pierwotnej reakcji jest powielany
wielokrotnie i z łatwością można uzyskać 100-krotne wzmocnienie sygnału.
:
NADPH

SUBSTRAT

Pi
aldehyd octowy NADH
INT

Uklad
wzmacniający dehydrogenaza
diaforaza
alkoholowa

etanol NAD+ Formazan

 Amplifikacja enzymatyczna:

2. Skład zestawu
Σ Koncentrat buforu do płukania 25 ml Zawiera 15 mmol/L azydek sodu jako

konserwant. Unikaj kontaktu z skórą

S Substrat 26 ml Ilość przybliżona po rozpuszczeniu
S+ Roztwór do rozpuszczania 26 ml Zawiera 15 mmol/L azydek sodu jako
substratu konserwant. Unikaj kontaktu ze skórą
A Układ amplifikujący 26 ml Ilość przybliżona po rozpuszczeniu
A+ Rozwtór do rozpuszczania 26 ml Zawiera 15 mmol/L azydek sodu jako
układu amplifikującego konserwant. Unikaj kontaktów ze
skórą
X Roztwór zatrzymujący reakcję 12 ml 0.3 mol/L kwas siarkowy. Unikaj
kontaktu z skórą
Taki zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania testów na 4 płytkach
po 96 otworków każda.
Ampak przeznaczony jest wyłącznie do testów in vitro.
UWAGA: Zestaw zawiera azydek sodu który jest trucizną i należy uważać przy
pracy z wszystkimi roztworami unikając połykania ich i stykania się ich ze skórą.
Azydek sodu może tworzyć wybuchowe azydki miedzi i ołowiu po zetknięciu się z
kanalizacją. Zawsze spłukuj dużą ilością wody wylewane do zlewu resztki
roztworów z azydkiem.

3. Instrukcja użycia
3.1. Test immunoenzymatyczny
AMPAK może być stosowany do każdego testu, w którym używa się alkalicznej
fosfatazy do znakowania przeciwciał. Układ nadaje się do stosowania każdą
techniką, jak np. w probówkach, mikropłytkach, mikrosferach; o ile test kończy
się kolorymetryczną oceną przebiegu reakcji. Nie nadaje się do stosowania w
systemach gdzie wymagane jest punktowe powstawanie barwy, np. na błonach
lub do testów in situ w tkankach, wskutek rozpuszczalności NADH.
Substancja znakująca (enzym alkaliczna fosfataza) może w zasadzie być
przyłączona w różny sposób: przez bezpośrednią koniugację z przeciwciałem
wykrywającym, poprzez przeciwciała drugiego zwierzęcia skierowane przeciwko
immunoglobulinom wykrywającym innego gatunku zwierzęcia, lub poprzez
jakikolwiek układ ligandów (np. awidyna-biotyna). Na ogół jednak bezpośrednie
koniugaty dają najniższy poziom wiązań niespecyficznych i tło reakcji zwykle
rośnie, im więcej pośrednich związków bierze udział w reakcji. Ponieważ AMPAK
będzie wzmacniał reakcje alkalicznej fosfatazy bez względu na to, czy daje ona
sygnał rzeczywisty, czy też pochodzi on z tła, ważne jest aby być bardzo
ostrożnym w układaniu i optymalizacji immunologicznych etapów testu.
Dwa czynniki są ważne dla zmniejszenia reakcji niespecyficznych: jeden to
jakość koniugatu z enzymem i skład buforów, szczególnie buforu do koniugatu
i buforów do płukania płytek.. Na ogół koniugaty wytwarzane przez sprzęganie
przy pomocy odczynników heterodwufunkcyjnych są lepsze od tych, które
otrzymano przez proste i mniej specyficzne metody sprzęgania, jak np z
glutaraldehydem. AMPAK dostarczany jest wraz z buforem do płukania, który ma
specjalny skład minimalizujący niespecyficzne wiązanie koniugatów alkalicznej
fosfatazy. Ten sam bufor może być stosowany jako bufor do testu lub do
koniugatu po dodaniu albuminy surowicy krwi wołowej do stężenia 30 g/L.
3.2.Technika testu
a) Należy być pewnym, że pipety i inne szkło laboratoryjne używane do
dozowania koniugatu, lub innych źródeł alkalicznej fosfatazy są trzymane
oddzielnie od sprzętu używanego do dozowania innych składników zestawu,
szczególnie substratu. Należy używać oddzielnej pipety do dozowania
koniugatu i nie powinna być ona używana do żadnego innego składnika
zestawu.
b) Wszystkie naczynia muszą być czyste.
c) Wszystkie odczynniki muszą być doprowadzone do temperatury pokojowej
przed użyciem.
d) Upewnij się czy substrat i układ amplifikujący są całkowicie rozpuszczone
przed użyciem.
e) Ważne jest aby zminimalizować nie-specyficzne wiązanie koniugatu do płytek
podczas testu. Osiąga się to przez dobre płukanie płytek i dobre
zaprojektowanie układu i przebiegu testu.
f) Unikaj stosowania fosforanów w jakichkolwiek buforach, ponieważ hamują
one silnie reakcję z substratem.
g) Reakcja amplifikacji enzymatycznej wymaga bardzo precyzyjnego
przestrzegania czasu wykonywania testu. Aby zapewnić jednakowy czas
inkubacji w każdym otworku, dodawaj substrat, układ amplifikujący
i odczynnik zatrzymujący reakcje w tej samej kolejności i w takich samych
przedziałach czasu.
3.3. Użycie AMPAK
a) Przygotować potrzebną ilość buforu roboczego o odpowiednim stężeniu
rozcieńczając koncentrat wodą destylowaną lub dejonizowaną. Rozcieńczenie
20-krotne jest wystarczające do większości zastosowań, lecz można też
stosować rozcieńczenia 12 - 40-krotne. Na jeden otworek płytki trzeba mieć
1 ml buforu.
b) Przeprowadzaj test stosując alkaliczną fosfatazę z jelita cieląt jako marker
enzymatyczny.
UWAGA: Bufor do płukania płytek może być także stosowany jako bufor przy
inkubacji i wiązaniu antygenu z przeciwciałem. Powinna być wówczas
dodawana albumina surowicy krwi wołowej do stężenia 30 g/L.
c) Odmyj niezwiązaną alkaliczną fosfatazę od związanej przez przemywanie
każdego otworu mikropłytki czterokrotnie 250 µL porcjami buforu do mycia.
d) Rozpuść substrat na 10 min przed użyciem przez wlanie zawartości pojemnika
z roztworem do rozpuszczania substratu do fiolki z substratem. Odrzuć
gumowy korek i sprawdź czy zawartość rozpuściła się całkowicie przez
delikatne mieszanie. Unikaj wprowadzenia zanieczyszczeń.
e) Dodaj 100 µL* roztworu substratu do każdej studzienki w równych
przedziałach czasu i inkubuj 20 minut w temperaturze 20-30oC. Czas inkubacji
może być wydłużony dla przyśpieszenia tempa powstawania barwy w
następnym etapie. Jeżeli stosuje się 50 µL porcje substratu i amplifikatora, to
do zatrzymywania reakcji barwnej powinno się stosować 25 µL roztworu do
hamowania reakcji na każdą studzienkę.
f) Rozpuść amplifikator na 10 min przed użyciem przez wlanie zawartości
pojemnika z roztworem do rozpuszczania amplifikatora do fiolki zawierającej
amplifikator. Odrzuć gumowy korek i upewnij się mieszając delikatnie, czy
zawartość jest całkowicie rozpuszczona.
g) Dodać 100 µL roztworu amplifikatora do każdego otworku w takiej samej
kolejności.
h) Albo: zatrzymaj reakcję barwną po odpowiednim czasie (np. 10 minut) przez
dodanie 50 µL roztworu zatrzymującego reakcje do każdego otworku w tej
samej kolejności. Odczytaj absorbancję przy około 492 nm w okresie 1
godzimy (patrz rozdz. 4),
Lub:
Umieść płytkę bezpośrednio na czytniku nadającym się do wykonywania
pomiarów kinetycznych i rób odczyty przy 492 nm (patrz rozdz. 4).
* 50uL można używać lecz spowoduje to niższy sygnał i niższą czułość.

4. Pomiar barwy
Następujące przepisy stosuje się do testów wykonywanych z użyciem
mikropłytek, lecz są to generalne zasady stosowane w wielu układach z użyciem
naczyń lub faz stałych. Istnieją dwa sposoby odczytywania wyników
immunotestów.
4.1. Zatrzymywanie reakcji
W tym typie testów, rozwój reakcji barwnej przebiega przez z góry określony
czas, pozwalający na powstanie odpowiedniego natężenia barwy w studzienkach.
Wymaga to jedynie prostego czytnika mikropłytek lub spektrofotometru do
odczytywania wartości absorbancji.
Zestaw AMPAK zawiera roztwór do zatrzymywania reakcji cyklicznej. Reakcja
powinna być zatrzymana, gdy próbka standardowa o najwyższym stężeniu osiąga
absorbancję bliską 2.0 lecz zależy to również od objętości odczynników i zakresu
liniowości czytnika mikropłytek. Roztwór zatrzymujący reakcje powinien być
dodawany w takiej samej kolejności i takich samych odstępach czasu, jak
dodawano substrat i wzmacniacz, a odczyt płytki trzeba zrobić w ciągu 1 godziny.
Jeżeli nie może być odczytana w takim czasie, płytka powinna być
przechowywana z dala od jasnego światła które może spowodować wypłowienie
barwy. Odczyt powinien być zrobiony przy 492 nm.
4.2. Pomiar kinetyki reakcji
Nie używa się roztworu zatrzymującego reakcję.
Wiele współczesnych czytników może wykonywać pomiary kinetyczne przez
powtarzalne odczytywanie płytki w pewnym okresie czasu, a wyniki są wyrażane
jako szybkość narastania barwnego produktu. Polepsza to czułość pomiaru
i zwiększa dynamikę, ponieważ czas wykonywania pomiaru nie jest ograniczony
przez szybkie pojawianie się barwy w próbach stężonych. Próby o powolnym
przebiegu reakcji mogą być pozostawione aż do wyznaczenia ich szybkości
reakcji. Ponieważ szybkość powstawania barwnego produktu jest prawie liniowa,
a składniki reakcji są w roztworze, to wytrząsanie płytki podczas inkubacji jest
zbyteczne.
Pomiary kinetyczne powinny być rozpoczęte tak szybko, jak jest to możliwe po
dodaniu amplifikatora. Zależnie od konstrukcji czytnika, pomiary kinetyczne
mogą być przeprowadzane w okresie 5 - 10 minut przy 30 - 60-sekundowych
powtórzeniach pomiaru.

5. Czynniki wpływające na wyniki testu

5.1. Czas trwania testu
Kinetyka reakcji alkalicznej fosfatazy z substratem i następnie reakcja z
enzymami amplifikującymi ma charakter liniowy, zatem maksymalną ilość
barwnego produktu uzyskuje się (dla określonej ilości alkalicznej fosfatazy), gdy
oba czasy inkubacji są prawie jednakowe.
Szybkość powstawania barwnego produktu w drugim etapie reakcji może być
zwiększona przez przedłużenie etapu inkubacji z substratem. Zakres barwnej
reakcji wzrasta proporcjonalnie do czasu inkubacji w II etapie z układem
amplifikującym. Przedłużanie czasu inkubacji z substratem (I etap) nie wpływa na
tło - próbę odczynnikową (tj. absorbancje w otworku gdzie nie było alkalicznej
fosfatazy), lecz tło próby odczynnikowej będzie rosło proporcjonalnie z czasem
inkubacji II etapu. W praktyce, inkubacja przez 20 minut z substratem i 10 minut z
układem amplifikującym jest wystarczająca, aby uzyskać dobrą relację między
sygnałem a tłem. Zaleca się stosowanie tych czasów inkubacji, a jeżeli wymagana
jest większa dokładność, to lepiej wydłużać czas inkubacji z substratem.
UWAGA: Jeżeli wydłuża się czas inkubacji z substratem, to może nastąpić
obniżenie aktywności alkalicznej fosfatazy. Powodowane jest to hamowaniem
enzymu przez EDTA. Można utrzymać aktywność alkalicznej fosfatazy przez
dodatek soli magnezu do stężenia 1 mmol/L do roztworu substratu przez jego
użyciem.
5.2. Objętości odczynników
Powinno się używać takich samych objętości substratu i amplifikatora.
Powstający sygnał będzie się zmieniał w zależności od proporcji objętości
użytego substratu i amplifikatora. Zwiększenie końcowej objętości substratu
i amplifikatora z 50 µL do 100 µL da wyższy sygnał.
Substrat i amplifikator powinny być rozpuszczone w całej objętości
dostarczonych rozpuszczalników i nie powinny być używane jako roztwory
bardziej rozcieńczone lub skoncentrowane. Odczynniki są z sobą tak dobrane, że
nie osiągnie się żadnego polepszenia stabilności lub ułatwienia przy stosowaniu
niestandardowych stężeń odczynników.
5.3. Temperatura
Amplifikacja enzymatyczna, podobnie jak inne reakcje enzymatyczne są zależne
od temperatury. Zaleca się, aby gdy jest to możliwe, używać odczynniki do
amplifikacji w stałej temperaturze w zakresie 20 - 300C. Reakcja z substratem
może być przeprowadzana w temperaturze do 500C, jeżeli wymagana jest wyższa
aktywność.

6. Rozwiązywanie trudności
Niżej podano listę możliwych zakłóceń i przypuszczalne ich przyczyny
 Problem Przyczyny
1. Wysokie tło OD Stary roztwór substratu
Substrat/amplifikator inkubowany zbyt długo.
Pominięto roztwór zatrzymujący reakcję
Niewystarczające płukanie płytki
Zabrudzenie substratu fosfatazą
Dodano zbyt wiele koniugatu
Odczynniki przechowywane nieprawidłowo
Wysoki poziom reakcji niespecyficznych

2. „Zaróżowiona płytka” Rozlany koniugat

(wysokie OD) Końcówki pipety zabrudzone koniugatem
Niewystarczające płukanie
Substrat/amplifikator nienależycie
rozpuszczony/wymieszany

3. Płytka cała czerwona Substrat zmieszany w pojemniku

zanieczyszczonym alkaliczną fosfatazą.

4. Powolny rozwój Temperatura inkubacji zbyt wysoka lub zbyt

barwy niska
Zbyt krótki czas inkubacji
substratu/amplifikatora
Substrat/amplifikator niecałkowicie
rozpuszczone
Nieodpowiednie rozpuszczalniki użyte do
rozpuszczenia substratu/amplifikatora
5. Odczyty Czytnik ustawiony na złą długość fali odczytu
nieoczekiwanie Zanieczyszczenia na dnie płytki
wysokie, niskie, lub Pęcherzyki w studzienkach
zmienne Niewłaściwe pipetowanie
Niewłaściwe przygotowanie
substratu/amplifikatora
Błędy w odczytywaniu kanałów czytnika
Niewystarczające usunięcie buforu do płukania
Niedokładne pipetowanie
6. Duża zmienność Zabrudzone końcówki pipety
sygnału Niewłaściwe przygotowanie
substratu/amplifikatora.
7. Przechowywanie
Zestaw AMPAK i wszystkie nie otwarte odczynniki powinny być przechowywane
w 2 - 80C. Substrat i amplifikator po rozpuszczeniu mogą być przechowywane do
4 tygodni w 2 - 80C, lub do 12 tygodni zamrożone w -200C. Należy unikać
wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Bufor roboczy do przemywania może być przechowywany do 5 dni w 2 - 80C.
ZESTAW Ampliq

1. Wstęp

AmpliQ jest zestawem stabilizowanych roztworów odczynników, o różnorodnych

możliwościach zastosowania i o dużej elastyczności. Stosując tylko jeden czas
inkubacji i dozując odczynniki kroplami, AmpliQ jest wyjątkowo łatwy w użyciu
i daje niezwykłą czułość wykrywania alkalicznej fosfatazy.
Uwaga: AmpliQ jest rozwinięciem wcześniejszego produktu AMPAK. Chociaż
zasada reakcji amplifikacji nie jest zmieniona, to miedzy obu zestawami są ważne
różnice. Użytkownicy AMPAK powinni uważnie przeczytać instrukcje,
szczególniepkt. 5.3 - 5.5.

2. Zawartość zestawu
Instrukcja użytkowania
Koncentrat buforu do płukania 125 ml 20X stężony roztwór buforowy Tris z
detergentem.
Zawiera 15 mmol/L azydek sodu jako konserwant

Apmlifikator A 2 x 13 ml. Roztwór soli nieorganicznych

i buforowany roztwór enzymu z fioletem
nitrotetrazoliowym. Zawiera 15 mmol/L azydek
sodu jako konserwant.

Amplifikator B 2 x 13 ml Stabilizowany roztwór NADPH

Roztwór STOP 2 x 13 ml 1 mol/L kwas fosforowy.

Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 192-384 oznaczeń

zależnie od ilości użytych odczynników (patrz pkt. 5.4..) Czas trwałości zestawu
umieszczono na nalepce każdej buteleczki.

3. Ostrzeżenia

3.1. Bezpieczeństwo

3.1.1.Koncentrat buforu do płukania i amplifikator A zawierają azydek sodu

(15 mmol/L), który jest trucizną i powinien być traktowany z ostrożnością,
unikając kontaktu z skórą lub połknięcia. Przy wylewaniu do zlewu, roztwory
azydków powinny być spłukiwane dużą ilością wody aby zapobiec powstawaniu
eksplozyjnych azydków ołowiu lub miedzi.
3.1.2. Roztwór STOP jest 1 mol/L kwasem fosforowym o działaniu żrącym. Unikaj
stykania się ze skórą lub oczami przez stosowanie odpowiedniej odzieży
i okularów.
3.1.3. Nie jedz, nie pij, nie kładź żywności lub kosmetyków na powierzchni stołu
przeznaczonego do pracy.
3.1.4. Nie pipetuj odczynników ustami.

3.2. Uwagi techniczne

3.2.1. Składniki nie mogą być używane po upływie daty ważności.

3.2.2. Odczynniki dostarczane są w stężeniu roboczym lub mają ustaloną
objętość do jakiej powinny być rozcieńczone (np. 20 X bufor do mycia). Czułość
amplifikacji będzie znacznie zmniejszona w wypadku modyfikacji odczynników
lub przechowywania ich w warunkach innych niż te jakie podano wpkt. 4.
3.2.3. Nie mieszaj i nie wymieniaj odczynników pochodzących z różnych serii.
3.2.4. Wszystkie odczynniki powinny być doprowadzone do temperatury
pokojowej przed użyciem.
3.2.5. Unikaj kontaminacji odczynników przy otwieraniu buteleczek i pobieraniu
odczynników.
3.2.6. Przy niewielkich ilościach testów zaleca się metodę nakrapiania z
buteleczek.
3.2.7. Używaj oddzielnych jednorazowych pipet lub końcówek do pipet do
każdego odczynnika (jeśli nie stosujesz wkraplania) aby uniknąć kontaminacji
odczynników
3.2.8. Przechowuj wodę dejonizowana lub destylowaną do rozcieńczeń buforu do
płukania w czystych naczyniach aby zapobiec kontaminacji przez
mikroorganizmy.
3.2.9. Nie przechowuj rozcieńczonego buforu do płukania do następnego użycia.
Nieużywany pojemnik na bufor do mycia powinien być spłukany wodą
dejonizowaną lub destylowaną i pozostawiony do wyschnięcia.
3.2.10. System amplifikujący jest bardzo czułym detektorem obecności alkalicznej
fosfatazy. Bardzo istotne jest zminimalizowanie niespecyficznego wiązania
koniugatu z płytką. Osiąga się to przez skuteczne mycie płytki i właściwe
zaprojektowania układu testu. (patrz 5.1.).
3.2.11. Wszystkie szklane naczynia powinny być czyste.
3.2.12. Należy bardzo przestrzegać, aby te pipety i naczynia, które służyły
dozowaniu koniugatu lub inne źródła fosfatazy alkalicznej były trzymane
oddzielnie od tych, które były używane do dozowania innych składników
zestawu., szczególnie Amplifikator B. Zaleca się, aby stosować oddzielną pipetę
do dodawania koniugatu, i aby nie była ona używana do żadnego innego
składnika zestawu.
3.2.13. Ręczne lub automatyczne wyposażenie do mycia płytek powinno być
wolne od kontaminacji mikroorganizmami, powinno być właściwe kalibrowane
i utrzymywane zgodnie z instrukcjami wytwórcy.
3.2.14. Bufor fosforanowy z solanką (PBS) i inne roztwory do płukania
zawierające fosforany nie mogą być używane razem z zestawem AmpliQ, aby nie
spowodować zahamowania enzymu w koniugacie i nie zmniejszyć czułości testu.
Wyposażenie do mycia używane poprzednio z roztworami fosforanów, powinno
być dokładnie przepłukane wodą, zanim zastosuje się je do zestawu AmpliQ.
3.2.15. Bufor do płukania nie powinien zawierać jonów Zn2+ ponieważ hamują one
działanie amplifikatora.
3.2.16. Niektóre środki antymikrobiologiczne mogą hamować działanie
amplifikatora. Azydek sodu jest czynnikiem anty-mikrobiologicznym wybranym
specjalnie z powodu jego adolności do hamowania wzrostu mikroorganizmów
i braku oddziaływania na składniki zestawu.
3.2.17. Odczynniki amplifikujące reakcję enzymatyczną wymagają bardzo
dokładnego przestrzegania czasu reakcji. Aby zapewnić dokładnie takie same
czasy inkubacji, dodawaj odczynnik amplifikujący i roztwór STOP w takiej samej
kolejności i takich samych odstępach czasu.

4. Przechowywanie
Odczynniki zestawu powinny być przechowywane w 2 - 80C. Nie zamrażaj
odczynników amplifikatora. Przygotowuj zawsze świeży bufor do płukania na 1
dzień stosowania. Nie przechowuj buforu rozcieńczonego. Pozostałe koncentraty
przechowuj w 2 - 80C.

5. Instrukcja stosowania

5.1. Immunotest (patrz pk. 3.1. opisu stosowania testu AMPAK).

5.2. Wielokrotne użycie testu AmpliQ
AmpliQ jest stabilny w formie roztworu i może być używany wielokrotnie podczas
okresu używalności. Jednak, ze względu na wyjątkową czułość zestawu, należy
unikać mikrobiologicznej kontaminacji. Łatwo jest kontaminować amplifikator A
lub B bakteryjnymi fosfatazami z włosów, śliny, śluzówki nosa, kurzu, cząsteczek
skóry. Jeżeli się to wydarzy, to tło reakcji AmpliQ będzie stopniowo wzrastać
nawet podczas przechowywania w 2 - 80C.
Następujące środki ostrożności pomogą uniknąć kontaminacji:
5.2.1. Zaleca się stosowanie buteleczek z wkraplaczem do dozowania
amplifikatorów A i B - stosowanie ich zmniejsza ryzyko kontaminacji.
5.2.2. Jeżeli nie stosujesz wkraplaczy, to zawsze stosuj czyste i sterylne
końcówki pipet do
dozowania amplifikatora A i B i unikaj dotykania końcówek pipet.
5.2.3. Nie wkładaj powtórnie końcówek pipet do naczyń z amplifikatorem A i B
5.2.4. Nie wlewaj z powrotem niewykorzystanego Amplifikatora A i B do
wkraplaczy
5.2.5. Myj ręce przez użyciem AmpliQ - kontakt ze skórą jest największym
źródłem
kontaminacji
5.3. Stosowanie AmpliQ

5.3.1. Przygotuj bufor do płukania o odpowiednim rozcieńczeniu przez dodanie

wody dejonizowanej lub destylowanej. 20-krotne rozcieńczenie jest odpowiednie
do większości zastosowań, lecz rozcieńczenia rzędu 12 - 40 razy mogą być także
stosowane. 1 ml rozcieńczonego buforu są potrzebne na 1 otworek. Przygotuj
tyle buforu aby wystarczyło go na 1 dzień - nie więcej. Nie przechowuj
niewykorzystanego buforu do następnego użycia.
5.3.2. Stosuj alkaliczną fosfatazę jelit cieląt jako enzym markerowy
5.3.3. Usuwaj nadmiar alkalicznej fosfatazy przez przemywanie każdego otworku
płytki czterokrotnie używając 250 µL buforu do płukania.
5.3.4. Dodaj odczynniki amplifikujące A i B do otworków. Może to być 100 µL A
i następnie 100 µL B, 200 µL mieszaniny A i B, lub 2 krople A i następnie 2 krople
B (50 µL lub jedna kropla każdego może być użyta, Patrz pkt. 5.4.3.)
5.3.5. Wyniki mogą być oznaczane dwoma sposobami: po okresie inkubacji
reakcja jest zatrzymywana i mierzona jest absorbancja w spektrofotometrze przy
492 nm, lub mierzona jest kinetyka przyrostu barwy.

5.4. Dozowanie odczynników amplifikacyjnych

Są trzy sposoby dodawania odczynników amplifikujących do otworków, używając

buteleczek z wkraplaczem lub przez pipetowanie z buteleczek. Są to:
5.4.1. Dodaj 100 µL amplifikatora A, i następnie 100 µL amplifikatora B do
każdego otworka. Reakcja amplifikacji nie rozpocznie się dopóki nie będzie
dodany odczynnik B.
5.4.2. Zmieszaj wstępnie odpowiednie objętości amplifikatora A i B i dodaj do
każdego otworka po 200 µL mieszaniny. Mieszanina powinna zostać
wykorzystana w ciągu 30 minut po wstępnym zmieszaniu. Wszystkie pozostałości
mieszaniny powinny zostać wyrzucone.
5.4.3. Dodaj 2 krople Amplifikatora A, potem 2 krople B do każdego otworka.
Wielkość kropli może się nieznacznie różnić, lecz jeśli wymagana jest precyzja,
należy użyć pipety. Wielkość kropli jest bardziej równomierna przy wkraplaniu
gdy trzyma się wkraplacz pionowo nad płytką

Można stosować 50 µL porcje wszystkich trzech odczynników (A, B i Stop), lecz

najwyższy do osiągnięcia sygnał zostanie w ten sposób zmniejszony o połowę.
Ilość odczynników jest wystarczająca do wykonania 384 oznaczeń po 50 µL lub
192 oznaczeń przy 100 µL.
5.5. Wstrząsanie reakcji amplifikującej
Liniowość reakcji amplifikującej polepszana jest przez wstrząsanie, które
przyśpiesza dyfuzję różnych substratów enzymatycznych podczas reakcji. Dla
większości zastosowań wytrząsanie płytek nie jest konieczne, lecz jeśli jest
stosowane, to wystarczy ustawić wytrząsarkę na niskie lub średnie obroty. Jeżeli
nie stosuje się wytrząsania, może pojawić się „aureola” wskutek lokalnej
produkcji formazanu wokół krawędzi otworu. Dodatek roztworu STOP powinno
spowodować ujednolicenie zawartości otworka przed dokonaniem odczytu (Pkt.
6.2.).
6. Powstawanie barwy
6.1. Projektowanie testu i ustalenie czasu inkubacji z amplifikatorami
Po dodaniu odczynników amplifikujących (pkt. 5.4.) inkubować płytkę w 250C
przez 30 minut. Optymalna temperatura pracy wynosi 25 0C, lecz amplifikatory
działają w zakresie 15 - 400C.
Czas inkubacji może trwać od 10 minut do 2 godzin zależnie wymaganej czułości;
dłuższe czasy inkubacji nie są normalnie zalecane. Płytkę można przykryć
pokrywką jeżeli trzeba.
Amplifikatory powodują powstawanie tła ze stałą liniową szybkością. Sygnał
właściwy jest jednak wytwarzany z szybkością do kwadratu (aż do czasu
wyczerpania prekursora barwnej substancji). Różnica w szybkości tworzenia się
tła i sygnału może być wykorzystana do zwiększenia czułości.; im dłużej trwa
inkubacja, tym lepsze powinny być wyniki czułości.
6.2. Pomiar barwy

6.2.1. Zatrzymanie testu

Przebieg reakcji powinien zostać zatrzymany gdy najwyższy standard osiągnie
absorbancję o wartości około 3.0, lecz zależy to także od stosowanych objętości
odczynników i liniowego zakresu czytnika. Liniowość odpowiedzi zredukowana
jest przy absorbancjach wyższych niż 3.5. Przy doświadczeniach wstępnych,
zaleca się stosować 30-minutowy czas inkubacji.
Po okresie inkubacji dodać 100 µL (około 2 krople) roztworu STOP do każdego
otworka, wymieszać zawartość otworków na wytrząsarce przez 15 sekund
(mieszanie nie jest bardzo istotne, lecz pomaga zatrzymać reakcję). Roztwór
STOP powinien być dodawany do każdego otworu w tej samej kolejności jak
dodawano amplifikatory A i B.
Odczytaj absorbancję przy 492 nm w ciągu 30 minut. Jeżeli nie można zrobić
odczytu w tym okresie czasu, płytka powinna być przechowana z dala od światła
aby uchronić barwnik przed spłowieniem.
Jeżeli to możliwe, to płytka powinna być odczytywana przy dwu długościach,
przy 492 nm i przy około 650 nm. Odjęcie wartości absorbancji przy 650 nm
skoryguje możliwe nieregularności płytki.
6.2.2. Pomiar kinetyki
Nie używa się roztworu STOP. AmpliQ wytwarza barwę z szybkością do kwadratu.
Szybkość powstawania zabarwienia może być oznaczona, lecz wymaga to
oprogramowania nadajacego się do analizy kinetyki II-rzędu. Dla większości
zastosowań, zatrzymywanie biegu reakcji jest bardziej wygodne.

7. Czynniki wpływające na wyniki testu

7.1. Objętości odczynników

Powinno się używać jednakowych objętości odczynników A i B. Wielkość
sygnału będzie zmieniać się przy zmianie proporcji A/B. Zmniejszenie ilości
amplifikatora A i B do 50 µL (po jednej kropli każdego) jest możliwe, lecz
wówczas wielkość sygnału zostanie zredukowana o połowę.
7.2. Temperatura
Amplifikacja enzymatyczna jest podobnie -jak wszystkie reakcje enzymatyczne-
zależna od temperatury. Zaleca się stosowanie zestawu w stałej temperaturze w
zakresie 15 - 400C.

8. Usuwanie trudności

8.1. Rzeczy podstawowe

Jeżeli wstępnie zmieszano z sobą amplifikatory A i B, to powinny być z sobą
wymieszane bardzo dokładnie. Wyrzuć mieszaninę jeżeli nie została zużyta w
ciągu 30 minut.
Upewnij się, że użyto właściwych objętości odczynników.
Nieodpowiednie mycie może spowodować trudności, dlatego upewnij się, że
mycie wykonano skrupulatnie i że nie użyto do mycia buforu zawierającego
alkaliczną fosfatazę.
Poniżej przedstawiono listę możliwych trudności i ich przypuszczalne przyczyny.
8.1.1. Wysoki poziom gęstości optycznej tła
Koniugat/amplifikator inkubowano zbyt długo lub w nieodpowiedniej
temperaturze
Nieodpowiednie płukanie
Zbyt wielka ilość koniugatu
Wysoki stopień niespecyficznych wiązań
Odczynniki amplifikujące zanieczyszczone zostały koniugatem lub miały
kontakt ze skórą, śliną.
Brudne końcówki pipet
Bufor do płukania powtórnie używany po przechowywaniu
8.1.2.Różowe otworki mają OD wyższe niż oczekiwano
Rozlanie koniugatu
Końcówki pipety lub palce zabrudzone koniugatem
8.1.3. Płytka cała czerwona
Odczynnik A lub B lub oba zostały dodane do pojemnika zawierającego
koniugat
Amplifikator B został mocna zanieczyszczony koniugatem
Niewystarczające płukanie
8.1.4. Powolny rozwój barwy
Zbyt niska temperatura inkubacji
Nieodpowiednia ilość dodanego koniugatu
8.1.5. Nieoczekiwanie wysokie, lub niskie lub zmienne odczyty
Ustawienie czytnika na nieodpowiednią długość fali
Brud i zadrapania na dnie płytki
Niewłaściwe pipetowanie koniugatu lub amplifikatora A/B
Rozlanie zawartości otworków podczas płukania, wstrząsania, inkubacji,
odczytu
8.1.6. Wysoka zmienność
Niedokładne pipetowanie
 Rozlanie zawartości otworków podczas
wstrząsania/mycia/inkubacji/odczytu
Niedokładne pipetowanie koniugatu lub amplifikatora
Niedokładne usunięcie buforu do płukania
Niedokładne pipety
Niedokładne mycie płytki
Amplifikator B dodany do otworków przed amplifikatorem A
Zanieczyszczone końcówki pipet.

Mgr Anna Pilecka

Sam. Prac. Diagn. Molekul. i Biochemii
Inst. Hod. i Aklim. Roślin Oddział w Boninie

IDENTYFIKACJA JEDNORODNOŚCI I TOŻSAMOŚCI ODMIANOWEJ

ZIEMNIAKA
W obrocie nasiennym istotna jest jednorodność odmianowa materiału i możliwość
łatwej identyfikacji odmiany. Niewielkie zróżnicowanie cech morfologicznych bulw
(kształt, kolor miązszu i skórki), oraz stosunkowo krótki czas występowania innych cech
(kolor kwiatu, kiełków świetlnych, pokrój rośliny) - może utrudniać prawidłowe
rozpoznawanie odmian. Dla zwiększenia ilości kryteriów rozpoznawczych, skrócenia
czasu analizy i uniknięcia wpływu zmienności środowiskowej na ekspresję cech
morfologicznych, zaczęto wykorzystywać własności makrocząsteczek (białek,
enzymów, DNA) do identyfikacji odmian.
Prezentujemy tu stosunkowo prosty system porównywania elektroforetycznych form
białkowych inhibitorów proteaz soku bulw, o których wiadomo, że charakteryzują się
dużą stabilnością metaboliczną i specyficznością odmianową. Ta metoda identyfikacji
odmian polega na izolowaniu białek bulw (około 20%) o własnościach inhibitorów
proteaz od białek pozostałych i elektroforetycznym rozdzieleniu tych białek. Skład frakcji
elektroforetycznych jest cechą służąca identyfikacji odmiany. Metoda może być
wykorzystywana do identyfikacji odmian ziemniaka w okresie, gdy są dostępne bulwy.
Identyfikacja odmian metodą elektroforezy inhibitorów trypsyny
Izolacja inhibitorów proteaz (trypsyny) z ziemniaków
Zasada metody:
Izolacja inhibitorów trypsyny polega na ich adsorbowaniu przez trypsynę
kowalencyjnie związaną na nośniku Sepharose umieszczonym w kolumnie
chromatograficznej. Białka nieinhibitorowe i inne substancje nie wiążące się z
trypsyną pozostają wolne i są wymywane z kolumny wraz z prądem
przepływającego buforu. Po usunięciu substancji niesorbujących się z kolumny,
nastepuje desorpcja zwiazanych inhibitorów przez obniżenie pH przepływajacego
buforu do wartości 2.0. W tak niskim pH kompleks trypsyna-inhibitor ulega
rozpadowi.
Odczynniki:
• 1M Tris
• β-merkaptoetanol
• Bufor do dializy: 0,01M cytrynianowy pH 3.5
10.5 g kwasu cytrynowego rozpuścić w 2.5 l H2O
5.9 g cytrynianu sodowego rozpuścić, dopełnić H2O do 2 l (roztwór 0.01 M)
doprowadzić roztworem cytrynianu sodu pH roztworu kwasu cytrynowego do
3.5
dopełnić H2O do 5 l
schłodzić w lodówce
1. Bufor boranowy 0.05 M pH 8.6 + 0.01 M CaCl2
3 g kwasu borowego rozpuścić w ok.500 ml H2O
doprowadzić pH do 8.6 5% NaOH (ok.23 ml NaOH)
dodać 10 ml 1 M CaCl2
dopełnić H2O do 1000 ml

2. Roztwór soli : 0,3 M NaCl + 0,01 M CaCl2

odważyć 19,5 g NaCl
dodać 10 ml 1M CaCl2
dopełnić H2O do 1000 ml
3. Roztwór: 0,05 M HCl + 0,001 M CaCl2
pobrać 50 ml 1M HCl
dopełnić H2O do 1000 ml
dodać 1ml 1M CaCl2
Postępowanie:
1. Na plastikowej tarce szybko utrzeć 2 umyte bulwy (ok. 150 g) dodając 100 µL
5% β-merkaptoetanolu (50 µL po pierwszej bulwie na tarkę, a 50
µL po wyciśnięciu), wycisnąć przez nylonową szmatkę, przelać do worka
dializacyjnego, włożyć do buforu do dializy (pH 3.5), wstawić do lodówki na 16
h (zmienić bufor dwukrotnie).
2. pH dializatu doprowadzić 1M Trisem do 8.8-8.9 ; po ok.10 min. odwirować,

3. Kolumnę przemyć buforem 1 aż do uzyskania w eluacie pH 8.6

4. Supernatant wprowadzić na kolumnę Sepharose - trypsyna, wymywać frakcję
niezaadsorbowanych białek buforem 1., aż do uzyskania w eluacie E280nm= 0.05
(frakcji tej nie bierzemy do dalszego badania)
5. Przemywać kolumnę roztworem 2. do uzyskania w eluacie pH ~7 (frakcji tej nie
bierzemy do dalszego badania)
6. Wymyć frakcję inhibitorów z kolumny roztworem 3.
Zbierać frakcje ok. 2 ml, zmierzyć ekstynkcję E280nm wobec roztworu 3., dla
potrzeb elektroforezy pobrać frakcje o ekstynkcji conajmniej E280nm = 1.5

7. Po wymyciu inhibitorów kolumnę przemyć buforem 1, a próbę zalkalizować

1M Trisem do pH 8.2 , w przypadku zmętnienia próby odwirować.
8. Oznaczanie białka
Do 0.1 ml roztworu inhibitorów dodać 1ml 10% TCA , odwirować, osad
rozpuścić w 2 ml 3% NaOH, dodać 0,1ml odczynnika Benedicta. Po 10 min.
mierzyć absorbancję przy 330 nm.
Zawartość białka obliczyć z krzywej wzorcowej dla albuminy wołowej
krystalicznej (stężenia 100, 200, 300, 400 µg/ml)
Elektroforeza białkowych inhibitorów proteaz
Specyficzny odmianowo skład białkowych inhibitorów proteaz w bulwach
ocenia się na podstawie elektroforetycznego obrazu tych białek. Inhibitory
migrują w polu elektrycznym zależnie od posiadanego ładunku, wielkości i
kształtu cząsteczek. Po rozdziale inhibitorów na szereg frakcji, denaturuje się je w
żelu w miejscu do jakiego dotarły podczas migracji i w tej postaci
(nierozpuszczalnej) barwi się je, co pozwala uwidocznić obecność i stężenie
poszczególnych form inhibitorów.
Odczynniki:
• Akrylamid 30% A / 0,8% bis:
6 g akrylamid
0.16 g N,N’-methyleno-bisakrylamid
dopełnić do 20 ml wodą bidestylowaną,
• TEMED, 10% nadsiarczan amonu
• 4x Tris-Cl pH 6.8:
3.025 g Tris
rozpuścić w 30 ml H20
doprowadzić 1N HCl -em do pH 6.8, dopełnić do 50 ml H20
• 4x Tris-Cl pH 8.8:
9.1 g Tris rozpuścić w 30 ml H20 doprowadzić 1N HCl -em do pH 8.8, dopełnić
do 50 ml H20
• 5x bufor elektrodowy:
15.1 g Tris 72 g glicyna ( kwas aminooctowy) dopełnić do 1000 ml H20
• Bufor do prób ( bez Tris ):
10 ml glicerol
5 mg błękit bromofenolowy
doprowadzić 1N HCl-em do pH 6.8, dopełnić do 50 ml H20
• Utrwalacz:
7.5% TCA
• Mieszanina barwiąca:
50% metanol
0,05% Coomassie Brillant Blue R
10% kwas octowy
40% H20
• Mieszanina odbarwiająca:
5% metanol
7% kwas octowy
88% H20

Postępowanie:
1. Złożyć aparat do elektroforezy
2. Rozcieńczyć bufor elektrodowy 5X, schłodzić go do temp. 4C0
3. Przygotować mieszaninę do polimeryzacji żelu poliakryloamidowego 7.5% (żel
rozdzielający):
PAA 6 ml
 4x Tris-Cl pH 8.8 6 ml
H2O 12 ml
odpowietrzyć, dodać 100 µL 10% nadsiarczanu amonu, 20 µL TEMED-u
4. Wylać mieszaninę między szyby aparatu, nawarstwić izopropanol, odczekać aż
spolimeryzuje (ok.1 godz.), następnie opłukać górną powierzchnię żelu i
osuszyć
5. Przygotować mieszaninę do polimeryzacji żelu górnego - zagęszczającego 4%:
PAA 0.65 ml
4x Tris-Cl pH 6.8 1.25 ml
H2O 3.05 ml
odpowietrzyć, dodać 25 µL 10% nadsiarczanu amonu, 5 µL TEMED-u
6. Wylać żel między szyby, włożyć grzebień, odczekać aż żel spolimeryzuje
7. Wyjąć grzebień z żelu, wlać do aparatu schłodzony bufor elektrodowy
8. Próby białka przygotować w ten sposób, aby stężenie wynosiło około 1,2
mg/ml
Połączyć z buforem do prób w stosunku 1:1, odwirować
9. Nakładać białka do kieszonek - po 30 µL
10.Przeprowadzić elektroforezę:
Nastawić zasilacz tak aby napięcie wynosiło 100 V, a gdy próby wejdą w żel
rozdzielający, zmienić na 300 V
11.Po skończonej elektroforezie wyjąć żel z aparatu, utrwalić ok. 20 min. w
7,5%TCA, wypłukać, włożyć na 1 dobę do barwnika, po czym odbarwić.
Obraz elektroforetyczny należy zarejestrować (kamerą fotograficzną lub
skanować) w celu porównania z wzorcami.
Identyfikacja odmian metodą ISSR-PCR
Drugą techniką identyfikacji odmian o bardziej uniwersalnym charakterze jest
porównywania polimorfizmu DNA. Obiektem bliższej analizy sa tu odcinki
rmikrosatelitarnych sekwencji DNA, które po amplifikacji metodą PCR (ISSR-PCR)
tworzą odmianowo specyficzne wzorce. Ta metoda może być wykorzystywana
wówczas, gdy nie dysponujemy bulwami. Materiałem porównawczym jest tu DNA
ziemniaka, który może być izolowany z różnych części rosliny (z kultur in vitro,
kiełków, liści, kwiatów, bulw itp.)
Postępowanie:
1. Izolowanie DNA
1.1. Około 250 mg zamrożonej tkanki (kiełek, młody liść) rozgnieść w probówce
Eppendorfa dopasowanym metalowym tłoczkiem i dodać 600 µL buforu 2xCTAB (
100 mM Tris pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 1%
merkaptoetanol, 1% PVP MW 40000) ogrzanego do 650C i całość inkubować w tej
temperaturze przez 30 min.
1.2. Dodać 600 µL mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1 v/v) i po
delikatnym wymieszaniu wirować przy 11 000 g przez kilka minut.
1.3. Górną fazę przenieść do nowej probówki Eppendorfa mierząc jej objętość i
dodać 1/10 obj. 10% CTAB + 0.7 N NaCl w temperaturze 650C.
1.4. Dodawać jedną objetość mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1
v/v), mieszać tworząc emulsję i wirować
1.5. Fazę górna przenieść do nowej probówki mierząc jej objetość i dodać
jednakową objętość buforu P (1% CTAB, 50 mM Tris, 10 mM EDTA pH 8.0)
mieszając delikatnie
1.6. Całość wirować od 10 do 60 s. Osad rozpuszczać w buforze TE (10 mM Tris, 1
mM EDTA pH 8.0) z dodatkiem 1M NaCl ogrzewając w 650C przez 5-10 minut.
1.7. Po całkowitym rozpuszczeniu osadu strącać kwasy nukleinowe dwoma
objętościami etanolu, osad wirować, przemyć 80% etanolem i suszyć w wirówce
próżniowej
1.8. Osad kwasów nukleinowych rozpuścić w niewielkiej ilości 0.1 x TE (1 mM
Tris, 0.1 mM EDTA pH 8.0)

2. Amplifikacja sekwencji intersatalitarnych

2.1. Primery
Użyć dwu primerów o tandemowo powtarzalnych sekwencjach : (GC) 2(AC)8 oraz
CCGG(AG)8
2.2. Warunki reakcji amplifikacji
Bufor PCR ( z 1.5 mM Mg++) i polimeraza Taq „Shark2” produkcji DNA Gdańsk 1
U/25 µL mieszaniny reakcyjnej. 0.2 mM dNTP produkcji „Fermentas”, 200 µg DNA
matrycowego
Reakcja przebiegała w termocyklerze Techne w warunkach:
940C (5 min)
940C (1 min) + 580 (1 min) + 720 (1.5 min) X 35 cykli
720C (5 min)
2.3. Analiza produktów PCR
Elektroforetyczny rozdział produktów rekacji PCR prowadzić w 6% żelu
poliakrylo-amidowym w obecności 8 M mocznika w buforze TBE (89 mM Tris
boran, 2 mM EDTA pH 8.3).
Produkty reakcji PCR barwić odczynnikiem srebrowym