Tesis Lacto Suero

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS
ALIMENTOS Y NUTRICIÓN
DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
TESIS DOCTORAL
AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS

DEL LACTOSUERO EN UN YOGURT FUNCIONAL
POR
CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO
MAYO, 2012
AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS

DEL LACTOSUERO EN UN YOGURT FUNCIONAL
Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por
CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO
como requisito parcial para optar al grado académico de
Doctor en Ciencia de los Alimentos
Con la asesoría de la Prof.
MARISA GUERRA
MAYO, 2012
ii
iii
iv
DEDICATORIA
Para Thais, Alejandra, Aída y Francisco, razones

suficientes para seguir adelante.
v
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por su constante apoyo, cariño e inspiración.
A mi tutora, por haberme aceptado como tesista y guiado, con mano firme y
respetuosa, durante todo el trayecto del postgrado.
A todo el personal de la Cátedra de Industria de la Leche y de la Carne, por la

colaboración prestada en el desarrollo de la parte experimental de la tesis: Matilde,
Mónica, María, Tony, Javier, José, Wilfred, Aroldo, Bernavé, Olymar, Rina, José,
Laura. A la Cátedra de Fisiología FCV-UCV, por todo el apoyo prestado: Ana Zuley,
Héctor, Jesús, Tatiana, Andrés, Simón. A Milagro y María Virginina del Centro de
Bioquímica Nutricional FCV-UCV.
A las Profesoras Marisa Gonzatti y Alexia Torres, por haberme permitido trabajar en
los laboratorios que dirigen. A la Dra Nardy Diez y su grupo de trabajo en la
Fundación IDEA por su colaboración y apoyo.
A los investigadores del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

(CIAL), que me aceptaron rápidamente como compañero de trabajo y prestaron su
apoyo desinteresado durante mi estancia en España: Marisi, José Ángel, Paquita,
Dani, David, Mar, Gustavo, Wilman, Tania, Mercedes, Lourdes, Constanza. A mis
cordiales anfitriones Manuel, Elymar y Carolina.
A Lesbia, Jenny y Adriana, por su apoyo con el estudio clínico.
Al CDCH-UCV, Postgrado de Medicina Veterinaria y Fundacite Aragua, por los

financiamientos otorgados para el desarrollo de este trabajo.
vi

AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS DEL

LACTOSUERO EN UN YOGURT FUNCIONAL
Por: ALVARADO CARRASCO, CARLOS ENRIQUE
Carnet No.: 8474473
Tutor: MARISA GUERRA
MAYO 09, 2012
RESUMEN
El lactosuero desechado de la producción quesera nacional constituye una

importante fuente de nutrientes de alto valor biológico. El objetivo del presente
trabajo fue aprovecharlo como fuente de péptidos bioactivos aplicables en el
desarrollo de un yogurt funcional mediante un proceso tecnológico accesible a
pequeños y medianos productores nacionales. La metodología de trabajo se
fundamentó en cinco etapas: 1) desarrollo del ingrediente funcional mediante la
concentración e hidrólisis de proteínas lactoséricas bovinas y caprinas, evaluación de
la actividad antihipertensiva in vitro y el escalado del proceso en planta piloto, 2)
incorporación de ese ingrediente en la formulación de un yogurt funcional, 3)
incremento de la capacidad antioxidante mediante adición de fruta no tradicional, 4)
determinación de la vida útil y 5) comprobación de actividad antihipertensiva
mediante estudio clínico doble-ciego con 39 pacientes hipertensos. El ingrediente
funcional desarrollado demostró buena actividad inhibidora de la enzima convertidora
de la angiotensina in vitro (IC50=10,54 g/mL), identificándose 7 péptidos de la -LG,
pero con baja capacidad antioxidante (ORAC=0,265 Moles Trolox/mg). Al
incorporarlo en la formulación de un yogurt natural de leche de cabra (Capra hiricus)
se obtuvo una aceptabilidad del 51%. Al agregarle 25% de mermelada elaborada
con tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) se mejoró hasta 71%, la
aceptabilidad y se aumentó la capacidad antioxidante (ORAC=0,500 Moles
Trolox/mg). En el estudio clínico el consumo del yogurt desarrollado redujo la presión
arterial sistólica en ambos grupos “tratamiento” y “placebo”, en 6 y 9 mmHg
respectivamente, pero sin diferencia significativa entre ellos (p>0,05); por lo cual, el
efecto benéfico se atribuyó a propiedades intrínsecas del yogurt de leche de cabra y
no al ingrediente funcional en la dosis aplicada (224 mg/día). Se concluye que el
consumo de yogurt de leche de cabra tiene efecto antihipertensivo per se,
independientemente de la incorporación de péptidos bioactivos.
Palabras clave: yogurt funcional, péptido bioactivo, lactosuero, ingrediente funcional.

vii
ÍNDICE GENERAL
APROBACIÓN DEL JURADO ..................................................................................... ii

VEREDICTO .............................................................................................................. iii
DEDICATORIA ............................................................................................................ iv
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. v
RESUMEN .................................................................................................................. vi
ÍNDICE GENERAL ..................................................................................................... vii
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... x
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
CAPÍTULO I ................................................................................................................ 7
MARCO TEÓRICO...................................................................................................... 7
1.1. Lactosuero ........................................................................................................ 7
1.1.1. Tipo de lactosuero según método de fabricación ....................................... 8
1.1.2. Composición del lactosuero ...................................................................... 10
1.1.3. Secuencia teórica de aminoácidos de las proteínas del lactosuero .......... 13
1.2. Recuperación de las proteínas del lactosuero ................................................ 15
1.3. Liberación de péptidos del lactosuero ............................................................. 17
1.3.1. Proteasa de Aspergillus oryzae ................................................................ 22
1.4. Actividad biológica de los péptidos del lactosuero .......................................... 23
1.4.1. Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) 24
1.4.2. Actividad Antioxidante............................................................................... 29
1.5. Identificación de la secuencia de aminoácidos en péptidos bioactivos ........... 34
1.6. Desarrollo de alimentos funcionales ............................................................... 37
CAPÍTULO II ............................................................................................................. 42
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 42
2.1. Desarrollo del ingrediente funcional ................................................................ 42
2.1.1. Procesamiento de la leche y obtención del lactosuero ............................. 43
2.1.2. Caracterización física y química de las muestras de leche y suero .......... 45
2.1.3. Descremado ............................................................................................. 45
2.1.4. Electroforesis ............................................................................................ 45
2.1.5. Concentración de proteínas del lactosuero ............................................... 47
viii
2.1.6. Hidrólisis del lactosuero ............................................................................ 49

2.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados...................................................... 53
2.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS ........................... 56
2.1.9. Producción el ingrediente funcional a nivel de Planta Piloto (Escalado) ... 57
2.1.10. Caracterización del ingrediente funcional ............................................... 60
2.2. Desarrollo de yogurt natural funcional ............................................................. 60
2.2.1. Exploración inicial para la formulación ...................................................... 60
2.2.2. Escalado de producción del yogurt funcional ............................................ 61
2.2.3. Evaluación sensorial del yogurt natural .................................................... 61
2.2.4. Caracterización del yogurt natural funcional ............................................. 62
2.3. Desarrollo del yogurt saborizado..................................................................... 62
2.3.1. Evaluación del Concepto .......................................................................... 63
2.3.2. Criterios de formulación y tamaño de la ración ......................................... 63
2.3.3. Elaboración de la mermelada de fruta ...................................................... 63
2.3.4. Elaboración del Yogurt de cabra saborizado ............................................ 64
2.3.5. Caracterización del yogurt saborizado ...................................................... 65
2.3.6. Actividad antioxidante del yogurt saborizado ............................................ 65
2.3.7. Contenido de polifenoles .......................................................................... 65
2.3.8. Evaluación sensorial ................................................................................. 66
2.4. Vida útil del yogurt funcional ........................................................................... 67
2.5. Protocolo del estudio clínico ........................................................................... 68
2.6. Análisis estadístico .......................................................................................... 70
CAPÍTULO III ............................................................................................................ 72
RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 72
3.1. Desarrollo del ingrediente funcional ................................................................ 72
3.1.1. Caracterización de los lotes de leche ....................................................... 72
3.1.2. Caracterización de los lotes de lactosuero ............................................... 76
3.1.3. Caracterización de los lotes de suero descremado .................................. 78
3.1.4. Perfil electroforético de los lactosueros de cabra y vaca .......................... 80
3.1.5. Concentración del lactosuero ................................................................... 83
3.1.6. Hidrólisis del lactosuero ............................................................................ 87
ix
3.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados.................................................... 100

3.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS ......................... 106
3.1.9. Obtención del hidrolizado a nivel de Planta Piloto .................................. 110
3.1.10. Caracterización del ingrediente funcional (fórmula final) ...................... 112
3.2. Desarrollo del yogurt natural batido funcional ............................................... 114
3.2.1. Perfil descriptivo del yogurt ..................................................................... 115
3.2.2. Evaluación sensorial del yogurt natural con hidrolizado ......................... 119
3.2.3. Caracterización del yogurt natural funcional ........................................... 120
3.3. Desarrollo del yogurt saborizado................................................................... 121
3.3.1. Evaluación exploratoria inicial ................................................................. 121
3.3.2. Fórmula prototipo .................................................................................... 122
3.3.3. Actividad antioxidante ............................................................................. 124
3.3.4. Prueba de aceptabilidad ......................................................................... 126
3.4. Vida útil yogurt .............................................................................................. 127
3.5. Estudio clínico ............................................................................................... 132
CAPÍTULO IV .......................................................................................................... 139
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 139
4.1. Conclusiones................................................................................................. 139
4.2. Recomendaciones ........................................................................................ 140
REFERENCIAS ....................................................................................................... 141
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 – Composición de lactosuero bovino. Tomado de Yang y Silva (1995).......... 9
Tabla 2 – Contenido promedio de sólidos totales, proteínas, lactosa, grasa y

cenizas de lactosueros derivados de la fabricación de tres tipos de quesos
elaborados con leche de vaca en el Estado Zulia, Venezuela. Modificado de
Faría et al. (2002). ............................................................................................ 10
Tabla 3 - Propiedades básicas de las principales proteínas del lactosuero bovino.

Modificados de Madureira et al. (2007) y Ounis et al. (2008) ........................... 11
Tabla 4 – valores de los niveles de los factores seleccionados en el diseño

central compuesto 24 ........................................................................................ 50
Tabla 5 – Identificación de los Tratamiento de acuerdo a las variables: origen,

proceso de concentración y tipo de hidrólisis. .................................................. 52
Tabla 6 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de la reacción en el

ensayo para determinar la actividad de inhibición de la enzima ECA. .............. 54
Tabla 7 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de reacción en

cada pozo del ensayo por fluorescencia de la actividad ORAC. ....................... 55
Tabla 8 – Gradiente de elución empleado en la corrida HPLC-MS-MS. ................... 57
Tabla 9 – Análisis físicos y químicos de la leche de vaca utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso blanco pasteurizado y su rendimiento
quesero. ............................................................................................................ 73
Tabla 10 – Análisis físicos y químicos de la leche de cabra utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso pasteurizado y su rendimiento quesero. .... 74
Tabla 11 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta

Piloto de la FCV-UCV (expresados en base húmeda). ..................................... 77

Piloto de la FCV-UCV (expresados en base seca). .......................................... 78
Tabla 13 – Análisis físicos y químico de lactosueros descremados (expresados

en base húmeda) .............................................................................................. 79
Tabla 14 – Análisis físico-químico de lactosueros descremados (expresados en

base seca) ........................................................................................................ 79
Tabla 15 – Peso molecular promedio (kDa) y la proporción relativa (%), estimado

a partir de las bandas obtenidas en el gel SDS-PAGE, con el programa
digital ImageJ 1.42q (NIH, EE.UU.). ................................................................. 82
xi
Tabla 16 – Pesos moleculares promedio (kDa) de las proteínas del lactosuero,

reportados por otros autores. ............................................................................ 83
Tabla 17 – Contenido promedio de proteínas y sólidos totales del retenido y

permeado resultantes de la ultrafiltración de las muestras de lactosuero
descremado. ..................................................................................................... 85
Tabla 18 – Contenido promedio de proteínas (base húmeda y base seca) y

sólidos totales (base húmeda) de la solución de “ricotta”, obtenida por
termocoagulación de las muestras del lactosuero descremado........................ 86
Tabla 19 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado luego de 150 minutos de

incubación a 42°C, de acuerdo a las características de cada tratamiento
(concentración-especie) utilizando proteasa de Aspergillus oryzae.................. 91
Tabla 20 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado de acuerdo a las

características de cada tratamientos (concentración-especie) utilizando una
mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica. .................................... 92
Tabla 21 – Contenido de proteínas (% p/p) de los extractos solubles menores de

3 kDa secados por liofilización (promedio ± desviación estándar). ................... 96
Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso molecular, Da) presentes en los

extractos solubles menores de 3 kDa, determinadas por espectrometría
MALDI-TOF, en orden de mayor a menor “abundancia”, de los hidrolizados
de lactosuero caprino tomados a tres tiempos diferentes de incubación de
la hidrólisis enzimática con proteasa de A. oryzae. .......................................... 98
Tabla 23 - Identificación de la secuencia de los péptidos presentes en los

hidrolizados de lactosuero caprino, utilizando los valores de los pesos
moleculares determinados por MALDI-TOF para la búsqueda en la base de
datos UniPtrotKB/Swiss-Prot, en línea.............................................................. 99
Tabla 24 – Actividad inhibidora de la enzima ECA de extractos solubles menor a

3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro
tratamientos diferentes (resultados expresados como IC50 en g/mL) ........... 102
Tabla 25 – Factores y niveles utilizados en el análisis estadístico de los

resultados de la actividad inhibidora de la enzima ECA. ................................ 102
Tabla 26 - Valores promedio de la actividad antioxidantes (ORACFL, Moles

Trolox/mg sólidos solubles) de extractos solubles menor a 3kDa de los
hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos
diferentes (promedio ± desviación estándar). ................................................. 104
Tabla 27 – Masas moleculares observadas en espectros HPLC-MS-MS de los

ocho tratamientos, agrupados por tipo de lactosuero. .................................... 106
xii
Tabla 28 – Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el

extracto soluble <3kDa del Tratamiento 1 (lactosuero de cabra
termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL) .......................................... 107
Tabla 29– Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el

extracto soluble <3kDa del Tratamiento 4 (lactosuero de vaca
termocoagulado hidrolizado con proteasa + BAL) .......................................... 109
Tabla 30 – Recuperación promedio de la proteína en la elaboración de las

soluciones de ricotta en planta (promedio ± desviación estándar).................. 111
Tabla 31 – Composición promedio de los cuatro lotes de solución ricotta

elaborados a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación
estándar). ........................................................................................................ 112
Tabla 32 - Composición promedio de los siete lotes de hidrolizado, elaborados a

nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar). ............ 113
Tabla 33 – Actividad IECA (g/mL) y contenido total de proteínas (g) en el

extracto menor a 3 kDa (promedio ± desviación estándar), de los siete lotes
preparados de hidrolizado de la solución de ricotta (“ingrediente funcional”) . 113
Tabla 34 – Resumen de los descriptores propuestos para el perfil descriptivo del

yogurt. ............................................................................................................. 115
Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado

con diferentes fermentos Yo-Flex® (promedio ± desviación estándar)........... 117
Tabla 36 – Puntaje promedio (expresada en cm) correspondiente a cada

formulación evaluada por un panel semi-entrenado (promedio ± desviación
estándar). ........................................................................................................ 118
Tabla 37 – Análisis microbiológicos realizados en la muestra de la fórmula

prototipo. ......................................................................................................... 118
Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt
natural funcional (promedio ± desviación estándar)........................................ 121
Tabla 39 – Prueba no-paramétrica de Friedman (95 % de confianza), aplicada a

los valores obtenidos del panel de consumidores con los que se efectuó la
evaluación sensorial de diferentes formulaciones de yogurt. .......................... 122
Tabla 40 – Comparación de los análisis químicos (promedio ± desviación

estándar) aplicados a la leche cruda de cabra en el presente trabajo (2010)
con los obtenidos por Salvador et al. (2006). .................................................. 123
Tabla 41 – Composición de la fórmula prototipo con la proporción ajustada a 75

% yogurt: 25 % mermelada. ............................................................................ 123
xiii
Tabla 42 – Contenido de Polifenoles y actividad ORAC de la pulpa de tomate de

árbol antes y después del procesamiento (promedio ± desviación estándar). 124
Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada
de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar) .................................... 125
Tabla 44 – Distribución aleatoria de los participantes en el estudio clínico sobre

el efecto antihipertensivo de un yogurt funcional de leche de cabra ............... 132
Tabla 45 – Variación neta entre la presión arterial sistólica y diastólica de cada

participante al inicio y al final del estudio clínico. ............................................ 134
Tabla 46 – Prueba de t-student para la comparación de los valores promedio de

presión arterial sistólica entre los dos grupos del estudio clínico. ................... 134
Tabla 47 – Prueba de t-student de la comparación, dentro de cada grupo, de la

presión arterial sistólica al inicio del estudio con respecto a la última toma
de presión arterial. .......................................................................................... 135
Tabla 48 – Prueba de t-student de la comparación de los valores promedio de la

presión arterial diastólica entre los dos grupos del estudio clínico. ................ 135

presión arterial diastólica al inicio del estudio con respecto al final. ............... 136
Tabla 50 – PAS y PAD promedio de los 29 participantes en el estudio clínico, al

inicio y final ..................................................................................................... 137
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de las proteínas de

lactosuero bovino comparado con estándares de -LA, -LG, IgG y BSA.
Tomado de Lin et al.(2010). .............................................................................. 12
Figura 2 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de lactosuero de cabra

(bandas 3-6) comparadas con mezclas de estándares de las cuatro
proteínas de referencia-LA, -LG, IgG y SA a diferentes concentraciones
(4,16 y 2 g en las bandas 2,7 y 8, respectivamente). Tomado de Casper et
al. (1998). .......................................................................................................... 13
Figura 3 – Secuencia de la -lactoglobulina de ambas especies, tomadas de

ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes
en la de origen caprino. .................................................................................... 14
Figura 4 – Secuencia de la -Lactalbúmina de ambas especies, tomadas de

ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes
en la de origen caprino. .................................................................................... 14
Figura 5 – (A) Separación del producto de la digestión péptica de la S2-CN

ovina por cromatografía de intercambio iónico; (B y C) fraccionamiento por
RP-HPLC a escala semipreparativa de las fracciones C y D,
respectivamente; (D) espectro MS/MS del ión m/z 1119,3 derivado de la
fracción D obtenido por acoplamiento HPLC-ESI-IT-MS. La interpretación
de la secuencia sobre la base de los iones observados identificaron al
péptido como fragmento 181-208 de la S2-CN ovina (tomado de Contreras
et al., 2008) ....................................................................................................... 36
Figura 6 – Procesamiento de los lotes de leche para obtener lactosuero, y sus

subsecuentes tratamientos para seleccionar las condiciones de hidrólisis
óptimas. ............................................................................................................ 44
Figura 7 – a) Motor compresor del equipo de ultrafiltración DDS; b) Columna de

equipo de ultrafiltración DDS ensamblado con 12 membranas; c) Marco
separador de membranas; d) Soporte de membrana con salida para
permeado; e) Lámina de papel de filtro; f) Membrana semipermeable de
acetato de celulosa. .......................................................................................... 48
Figura 8 – Diagrama esquemático de la producción de “queso de suero”

(modificado de Madureira et al., 2009). ............................................................ 58
Figura 9 – Diagrama esquemático de la hidrólisis de la solución de ricotta. ........... 59
Figura 10 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt incorporando el

hidrolizado de lactosuero y cepa BAL (modificado de Güler-Akin y Akin,
2007). ................................................................................................................ 61
xv
Figura 11 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt saborizado con

mermelada de tomate de árbol (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007). ........ 64
Figura 12 - Gel de SDS-PAGE de los lactosueros descremados. Columna 1:

Marcadores de peso molecular (miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k,
ovoalbúmina 60k, anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y
lisozima 18,3k); Columnas 2-3-5-6: bovino (lactosuero de la 5 fue diluído
1:10); Columnas 4-7: caprino. .......................................................................... 81
Figura 13 - Muestras recolectadas del retenido y permeado del lactosuero de

vaca después de aplicar proceso de ultrafiltración. .......................................... 84
Figura 14 – Perfil de valores predichos y deseabilidad de los valores óptimos

para las cuatro variables incluidas en el modelo de superficie de respuesta
para la hidrólisis enzimática de lactosuero caprino con proteasa de
Aspergillus oryzae............................................................................................. 90
Figura 15- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del
lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por
proteasa de A. oryzae. ...................................................................................... 91
lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de
proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica ...................................................... 93
Figura 17 – Porción del gel PAGE-SDS (15% T; 6M úrea), correspondientes a: 1)

suero de cabra sin hidrólisis, 2) suero con E/S 3,0% a los 60 minutos, 3)
suero con E/S 3,0% a los 120 minutos, y 4) suero con E/S 3,0% a los 150
minutos. ............................................................................................................ 94
Figura 18 – Progreso de la hidrólisis de las principales proteínas del lactosuero

por la acción de la proteasa de Aspergillus oryzae bajo las condiciones
seleccionadas: T= 42°C, E/S= 3% y pH= 7 (Intensidad relativa (sin
unidades) vs tiempo en minutos) ...................................................................... 95
Figura 19 – Distribución de masas MALDI-TOF de los péptidos presentes en los

extractos solubles menores de 3 kDa de lactosuero caprino hidrolizado por
30, 90 y 150 minutos con proteasa de A. oryzae. ............................................. 98
Figura 20 – Secuencia P02756 (UniProtKB/Swiss-Prot) de la Lactoglobulina

de lactosuero de cabra (Capra hiricus). Se resaltan las secuencias
identificadas en la Tabla 23. ............................................................................. 99
Figura 21 – Curva de inhibición de la enzima ECA obtenida para diferentes

concentraciones (g/mL) de la Muestra 1 (extracto soluble menor de 3 kDa
de lactosuero de cabra). ................................................................................. 101
xvi
Figura 22 - Efecto de la interacción de tres factores, sobre la actividad IECA,

determinado por análisis factorial 23: factor T1 (método de concentración:
1-Ultrafiltración, 2-Termocoagulación), factor T2 (origen del lactosuero: 1-
caprino, 2-bovino) y factor T3 (tipo de hidrólisis: 1-enzimático, 2-enzima
mas BAL). ....................................................................................................... 103
Figura 23 – Análisis gráfico de la interacción entre el método de concentración

(T1:1-Ultrafiltración, T1:2-Termocoagulación) y: a) el origen del lactosuero
(T2:1- caprino, T2:2-bovino); b) el tipo de hidrólisis (T3:1-enzimático, T3:2-
enzima mas BAL)............................................................................................ 105
Figura 24- Perfil descriptivo de un yogur de cabra y uno de vaca. .......................... 116
Figura 25- Resultados de la prueba triangular, con 12 panelistas, para

determinar si el consumidor puede detectar diferencia entre dos yogurts de
leche de cabra distinguidos por la incorporación o no de hidrolizado de
lactosuero. ...................................................................................................... 119
Figura 26 – Diagrama de torta de la frecuencia de la aceptabilidad determinada

mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores. .............. 120
Figura 27 - Diagrama de torta de la frecuencia de los resultados de la

aceptabilidad determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con
100 consumidores........................................................................................... 127
Figura 28 – Evolución del pH en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y

saborizado) almacenado a 4°C ....................................................................... 128
Figura 29 – Crecimiento de coliformes, hongos y levaduras en muestras de

yogurt de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C .............. 129
Figura 30 – Recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL) en muestras de yogurt

de leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C ......................... 129
Figura 31 – Evolución de la actividad ORAC en muestras de yogurt de leche de

cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C ............................................. 130
Figura 32 – Evaluación sensorial mediante escala no estructurada de 15 cm (“Me

disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt natural con
hidrolizado de lactosuero. Total evaluadores por día=25................................ 131

disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt saborizado con
tomate de árbol. Total evaluadores por día=25. ............................................. 131
1
INTRODUCCIÓN
La tendencia a reducir grasas y calorías en los productos lácteos está siendo

reemplazada por la incorporación de funcionalidad como la principal ruta para el
posicionamiento dentro del creciente segmento de “salud y bienestar” del sector de
alimentos. Los ingredientes funcionales se han convertido en la vía principal para
introducir nuevos productos bajo una creciente tendencia a enfocarse en beneficios
específicos para la salud, especialmente en segmentos del sector lácteo como el de
yogurt y leches fermentadas (Brockman y Beeren, 2011). Y en este sentido, la
industria trata de aprovechar muchos de los “desechos” de su producción para la
obtención de ingredientes funcionales, que puedan luego ser incorporados en un
alimento “convencional” y convertirlo en funcional.
La industria quesera nacional desecha anualmente grandes volúmenes de

lactosuero, subproducto obtenido luego de separar la caseína coagulada durante la
elaboración de quesos. En el lactosuero se retienen alrededor del 55% de los
nutrientes originales de la leche, aproximadamente 6,3 g/L de leche si partimos de
una leche cruda con 12% de sólidos totales (Walstra et al., 2001). Históricamente
considerado un producto de desecho, el lactosuero es descartado de la forma más
económica posible y solo una pequeña proporción es procesada como lactosuero en
polvo o concentrado (WPC) o aislado de proteínas (WPI) (Chatterton et al., 2006).
Estos dos últimos no se producen comercialmente en el país, y son de elevado costo
para la pequeña y mediana industria.
A partir de los datos presentados en el informe de CAVILAC (2008) sobre la

producción lechera nacional, se puede deducir que para ese año, en Venezuela, se
produjeron alrededor de 750 millones de litros de lactosuero como resultado de la
actividad quesera nacional, que abarca los sectores de quesos industriales, semi-
2
industriales y artesanales. Esto representa cerca de 650 mil kilogramos de

proteínas. Históricamente, según Faría et al. (2002) sólo una cuarta parte del
volumen de lactosuero producido anualmente en el país, es utilizada en la
alimentación humana y/o animal; el resto se desecha directamente a los cuerpos de
agua, con los consecuentes problemas de contaminación. Actualmente, en el país,
solo un muy reducido número de plantas procesadoras elaboran productos derivados
del lactosuero: ricotta, requesón y suero completo en polvo. Esto contrasta con el
esfuerzo dedicado, tanto por la empresa privada como por instituciones de
investigación láctea, en Estados Unidos, Australia, Nueva Zelanda y Europa, para
entender los efectos del calor y procesamiento sobre la funcionalidad de las
proteínas, variaciones en la composición y el comportamiento físico y químico de los
principales componentes funcionales del lactosuero (Smithers, 2008); lo cual ha
llevado a la comercialización de una gran variedad de productos derivados del
lactosuero para satisfacer las diversas necesidades del mercado industrial.
Esta cantidad de lactosuero se deriva principalmente de leche de origen bovino,

seguida por la caprina. En todo caso, el perfil de proteínas lactoséricas es muy
similar en estas especies lecheras y pueden, por tanto, presentar funcionalidades
equivalentes, gran parte de ellas debido a secuencias particulares de aminoácidos
presentes en la estructura primaria de estas proteínas, que una vez “liberadas”, dan
origen a diferentes péptidos bioactivos que influyen directamente sobre numerosos
procesos biológicos responsables de diversas respuestas humorales,
gastrointestinales, hormonales, inmunológicas, neurológicas y nutricionales (Clare y
Swaisgood, 2000). Trabajando con lactosuero, varios autores han reportado la
identificación de péptidos con actividad antihipertensiva (Murakami et al., 2004;
Hernández-Ledesma et al., 2006; Otte et al., 2007a); antioxidante (Peña-Ramos y
Xiong, 2001; Bayram et al., 2008; Peng et al., 2009); opioide (Sipola et al., 2002; Ijäs
et al., 2004); antimicrobianos (Clare y Swaisgood, 2000; Rizzello et al., 2005;
Chatterton et al., 2006; López-Expósito y Recio, 2006); antitrombóticos (Clare y
Swaisgood, 2000; Thomä-Worringer et al., 2006); e inmunomoduladores (Mercier et
al., 2004; Saint-Sauveur et al., 2008).
3
En años recientes se han unificado esfuerzos de investigación para aprovechar el

lactosuero como valioso recurso por sus propiedades funcionales (Raynal-Ljutovac et
al. 2008). El principal problema en el desarrollo de estos trabajos, es el alto grado de
dilución que caracteriza al lactosuero, mas del 90% de agua, lo cual impone la
necesidad de concentrar las proteínas antes de su utilización. Para esto se han
empleado a nivel industrial técnicas de filtración con membranas como la
ultrafiltración, tecnologías estas que representan una elevada inversión para las
queseras semi-industriales y artesanales, generadoras también de un volumen
considerable de lactosuero. Sin embargo, estas queseras pueden recurrir a
procesos alternativos mas económicos, como la termocoagulación, para precipitar las
proteínas y separarlas del suero desproteinizado (Faría et al., 2003; Monsalve y
González, 2005).
Una vez concentrada la proteína del lactosuero, el procedimiento de obtener, aislar e

identificar péptidos con actividad biológica es muy similar entre los distintos trabajos
revisados: en primer lugar a la solución de proteínas se le adiciona una enzima
específica y se incuba por un tiempo determinado para obtener el grado de hidrólisis
deseado. Luego se fracciona el hidrolizado por cromatografía, seleccionándose la
fracción con mayor actividad in vitro y finalmente se identifica la secuencia de los
péptidos responsable de dicha actividad aplicando espectrometría de masas
(MS/MS) y/o secuenciación N-terminal (Hernández-Ledesma et al., 2004; Otte et al.,
2007b; Tsai et al., 2008). Esta bioactividad se evalúa in vivo en un modelo animal o
en ensayos clínicos con humanos. Ahora bien, los hidrolizados son mezclas
complejas y pueden contener hasta cientos de diferentes moléculas, por lo cual,
localizar péptidos bioactivos en este tipo de muestras ha sido comúnmente una tarea
difícil y que requiere mucho tiempo y dedicación. Las fracciones usualmente
contienen aún múltiples compuestos que requieren ciclos adicionales de
fraccionamiento, concentración y evaluación de bioactividad para lograr identificar la
molécula responsable de dicha actividad (van Elswijk et al., 2003). Por esta razón,
para su aplicación en alimentos se puede optar entre dos opciones: 1) utilizar
4
tecnologías industriales disponibles actualmente para la producción comercial de

péptidos lácteos bioactivos basados en métodos de separación por membranas y de
cromatografía de intercambio iónico (Korhonen y Pihlanto, 2006) procedimiento de
alto costo, sobre todo por la inversión inicial; o 2) determinar la actividad biológica del
hidrolizado completo, o una fracción de él, para luego incorporarlo directamente al
alimento que se le desea conferir de la propiedad de “funcional”.
En la actualidad, los péptidos bioactivos son constituyentes fundamentales de

algunos productos comercializados como “Alimentos Funcionales” o “Nutraceuticos”,
en los cuales son añadidos o enriquecidos modificando los procesos usuales de
manufactura. Estos alimentos funcionales que contienen péptidos bioactivos, se
pueden desarrollar mejorando la bio-disponibilidad de los mismos en productos
lácteos existentes o “creando” nuevos a través de la adición o fortificación de
fracciones aisladas de estos péptidos (Hartmann y Meisel, 2007). Por otra parte, se
han encontrado una variedad de péptidos naturalmente formados en productos
lácteos fermentados, tales como yogurt, crema agria y queso, cuyo beneficio para la
salud no ha sido establecido.
En el país, el producto lácteo fermentado de mayor producción y consumo es el

yogurt, el cual mantiene una tendencia al crecimiento en un mercado que produce 40
millones de kilos y mueve 1,8 millones BsF. Sin embargo, el consumo per cápita de
1,7 Kg/año es bajo si se compara con otras naciones, como Colombia, Estados
Unidos y Europa con 4, 8 y 10 Kg/año, respectivamente. El mercado de yogurt en
Venezuela está dividido en tres categoría principales: yogurt firme 25%, yogurt
líquido 60% y yogurt con cereal 15% (Anónimo, 2006). El yogurt comercializado a
nivel nacional se elabora totalmente con leche de vaca. Sin embargo, si se
aprovechan las propiedades nutricionales y terapeuticas que posee la leche de cabra
(mayor digestibilidad y menor alergenicidad, entre otras) se pueden introducir al
mercado productos atractivos para muchos consumidores con necesidades
especiales o intolerantes a la leche de vaca.
5
En general, en el país los yogurts saborizados tienen mayor demanda que los
“naturales”, y todos los fabricantes ofrecen presentaciones con frutas tradicionales
(fresa, piña, ciruela, durazno, etc.); ninguna marca comercial o artesanal incluye
como ingrediente una fruta no tradicional como, por ejemplo, el tomate de árbol
(Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur América
se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,
eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,
afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre
intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis
químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -
caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y
Moreno-Alvarez, 2000). Los compuesto fenólicos presentes en la fruta de C. betacea
Sendt protegen a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) de la oxidación y a los
cultivos de células neuronales PC12 del daño inducido por el estrés oxidativo (Kou et
al., 2009). Por estas razones, Han et al. (2011) propusieron incrementar la
funcionalidad de los productos lácteos mediante la suplementación con polifenoles,
con el objetivo de desarrollar nuevos productos que tengan un impacto positivo en el
bienestar y salud del consumidor.
Hasta el presente, en Venezuela no se han realizado estudios que permitan

aprovechar ese gran volumen de lactosuero como fuente de péptidos bioactivos en
el desarrollo de ingredientes y alimentos funcionales. La importancia que
actualmente se le atribuye a los péptidos bioactivos para la salud humana hace del
presente trabajo un aporte significativo a la investigación para cuantificar y
aprovechar el potencial del lactosuero como ingrediente funcional en el desarrollo de
nuevos productos.
6
Objetivo general
Obtener, caracterizar y aislar péptidos a partir del lactosuero derivado de la

elaboración de quesos de leche de vaca y de cabra; a los fines de identificar péptidos
con actividad antihipertensiva y/o antioxidante que puedan ser aplicados en el
desarrollo de un yogurt saborizado y con propiedades funcionales, mediante un
proceso tecnológico accesible a pequeños y medianos productores nacionales.
Objetivos específicos:
1. Recolectar y caracterizar muestras de lactosuero provenientes de la producción

de quesos blancos frescos elaborados a partir de leche, tanto bovina como caprina.
2. Concentrar las proteínas presentes en el lactosuero.
3. Hidrolizar los concentrados de proteínas bajo condiciones establecidas

experimentalmente.
4. Determinar actividad antihipertensiva y antioxidante in vitro de las fracciones

menores de 3 kDa de los hidrolizados proteicos.
5. Identificar secuencia de aminoácidos de péptidos presentes en los hidrolizados

con mayor actividad antihipertensiva.
6. Obtener cantidades suficientes de la fracción peptídica, identificada por su

actividad biológica, para el proceso de formulación.
7. Desarrollar y caracterizar un yogurt saborizado funcional, incorporando los

péptidos bioactivos identificados.
8. Determinar vida útil del yogurt funcional.
9. Medir aceptabilidad en consumidores del yogurt funcional.
10. Evaluar, mediante ensayo clínico, la bioactividad del producto funcional

desarrollado
7
CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO
Virtualmente todas las innovaciones en desarrollo de nuevos productos en el

mercado lácteo internacional pueden ser clasificadas, por lo menos, bajo uno de
cuatro tópicos clave: 1) salud y bienestar; 2) autogratificación e indulgencia; 3)
conveniencia y “antojos”; y 4) estilo de vida y ética. En el primero, el foco de atención
ha ido cambiando en los últimos años hacia la adición de ingredientes en lugar de la
remoción, por ejemplo, la tendencia a reducir grasas y calorías en los productos
lácteos está siendo continuamente reemplazada por la de incorporar funcionalidad
como la principal ruta para un posicionamiento en salud y bienestar. Así se tiene que
los ingredientes funcionales se han convertido en la vía principal, en segmentos del
sector lácteo como el de yogurt y leches fermentadas, al ser estos considerados muy
buenos portadores de tales ingredientes, para introducir nuevos productos bajo una
creciente tendencia a enfocarse en beneficios específicos para la salud (Brockman y
Beeren, 2011). Y en este sentido, la industria trata de aprovechar muchos de los
desechos de su producción para la obtención de ingredientes funcionales, que
puedan luego ser incorporados en un alimento “convencional” y convertirlo en
funcional.
1.1. Lactosuero
El lactosuero es el líquido de color amarillo-verdoso residual de la transformación de

la leche en queso (Jakymec et al., 2001) cuyas características físico-químicas
variarán dependiendo del método de fabricación empleado, tipo de leche (bovina,
caprina, ovina, etc.), época del año, tipo de alimentación del rebaño y etapa de la
lactación promedio (Gómez et al., 1999; Madureira et al., 2007).
8
Según Muñi et al. (2005) se obtienen aproximadamente 9 Kg de lactosuero por cada

kilogramo de queso producido, lo cual representa casi un 90% del volumen original
de leche empleado como materia prima, y a donde pasa el 55% de los nutrientes que
no son retenidos en la cuajada. Ese contenido de nutrientes, hacen del lactosuero
desechado en los cuerpos de agua, un enorme contaminante debido a la elevada
demanda biológica de oxígeno generada. Por tanto, se hace imperativo su
aprovechamiento, tanto desde el punto de vista alimenticio como de protección
ambiental.
En la actualidad el lactosuero bovino es apreciado como una fuente de componentes

bioactivos y se aplican tecnologías modernas para recuperar sus fracciones proteicas
con elevada calidad. En el caso de las leches de oveja y cabras, dedicadas
principalmente a la elaboración de quesos, también se debería incentivar una mayor
investigación para aprovechar los lactosueros generados en esa actividad
(Michaelidou, 2008).
1.1.1. Tipo de lactosuero según método de fabricación
La coagulación de las caseínas, etapa básica en la elaboración de todos los quesos,

depende del sistema empleado para desestabilizar esas proteínas y formar la
cuajada. Según Henning et al. (2006) esta desestabilización se logra mediante uno
de estos tres métodos: acidificación directa o mediante cultivo iniciador, proteólisis
limitada empleando enzimas o por una combinación de ambos. En la elaboración
de quesos por acidificación de la leche se obtiene una cuajada sin fosfato cálcico y
un suero ácido con mayor contenido de minerales, cuyo pH será ≤ 4,6 si la
acidificación se realiza por adición directa de algún ácido orgánico o mineral, o será ≤
5,6 si la acidificación se logra por la acción de bacterias ácido lácticas (BAL). Ambos
sueros se agrupan como sueros “ácidos”. Cuando participan enzimas en la
desestabilización de las micelas de caseínas, la cuajada obtenida está formada
principalmente por paracaseína y el suero se caracteriza por poseer un pH≥5,6 por lo
cual se le identifica como suero “dulce”.
9
Las diferencias en ambos tipos de suero, dulce y ácido, han sido ampliamente
estudiadas. Algunos autores señalan que el suero dulce además de presentar un pH
mas elevado, también posee mayor contenido de sólidos totales, proteínas, lactosa y
lípidos, pero menor de calcio y fósforo que los suero ácidos. De igual forma, en el
suero dulce habría mayor contenido de péptidos y aminoácidos debido a la
proteólisis producida por el cuajo (Schmidt et al., 1984).
En general, la principal diferencia en ambos tipos de lactosuero, según se muestra

en la Tabla 1, lo constituye el grado de acidez titulable como ácido láctico y el
contenido de cenizas. Los rangos de valores para el resto de los componentes en
ambos lactosueros se superponen. Se puede observar también que la lactosa
constituye el componente mayoritario del total de sólidos, siguiendo en orden de
abundancia las proteínas, minerales y grasas. La importancia de estos componentes
del lactosuero ha sido reconocida en los últimos años (Walzem et al., 2002).
Tabla 1 – Composición de lactosuero bovino. Tomado de Yang y Silva (1995).
Tipo de Composición (% en base seca)

lactosuero Lactosa Proteína Ac. Láctico Cenizas Cloruros Grasa
Dulce 74-81 12,8-15,2 1,8-2,2 8,0 2,5 1,0
Ácido 65-80 9,9 – 15,5 7 – 10 7,0 -19,4 2,5 1,0
Con respecto a estudios realizados en Venezuela, en la Tabla 2 se presentan los

resultados del trabajo de Faría et al. (2002) sobre la evaluación del efecto de la
tecnología aplicada en la elaboración de tres tipos de quesos elaborados en la
ciudad de Maracaibo, estado Zulia (queso fresco “Blanco Criollo”, queso de mano, y
queso madurado tipo “Parmesano”) sobre la composición del lactosuero. Estos
autores concluyeron que la tecnología quesera afecta la composición del suero
lácteo. Al comparar esos valores con los presentados en la Tabla 1, se tiene que a
pesar de las diferencias en el procesamiento de los tres tipos de quesos, sus
lactosueros son considerados todos como del tipo dulce.
10
Tabla 2 – Contenido promedio de sólidos totales, proteínas, lactosa, grasa y cenizas

de lactosueros derivados de la fabricación de tres tipos de quesos elaborados
con leche de vaca en el Estado Zulia, Venezuela. Modificado de Faría et al.
(2002).
Composición en % base húmeda (% base seca)

Tipo de
Sólidos Ac.
lactosuero Proteínas Lactosa Grasa Cenizas
totales Láctico
de queso
1,06 ± 0,33 5,51 ± 0,92 1,04 ± 0,49 0,40 ± 0,10 0,11 ± 0,09
blanco 8,01 ± 1,46
(13,2) (68,8) (13,0) (5,0) (1,4)
fresco
de queso 1,07 ± 0,41 5,64 ± 1,26 0,78 ± 0,12 0,41 ± 0,08 0,18 ± 0,08
7,90 ± 1,37
de mano (13,5) (71,4) (9,9) (5,2) (2,3)
de queso 1,02 ± 0,40 5,17 ± 0,94 0,70 ± 0,17 0,36 ± 0,09 0,12 ± 0,06
7,25 ± 0,84
madurado (14,1) (71,3) (9,7) (5,0) (1,7)
mezcla de 1,00 ± 0,28 5,48 ± 0,23 0,86 ± 0,23 0,39 ± 0,08 0,13 ± 0,04
7,70 ± 0,98 (5,1)
lactosueros (13,0) (71,2) (11,2) (1,7)
1.1.2. Composición del lactosuero
Los principales nutrientes presentes en el lactosuero son la lactosa (4,5-5% p/v),

proteínas solubles (0,6-0,8% p/v), lípidos (0,4-0,5% p/v) y sales minerales (8-10% de
extracto seco) (Muñi et al., 2005).
Entre las proteínas solubles de la leche liberadas en el suero, las proteínas

globulares -lactoglobulina (-LG) y -lactalbúmina (-LA), en una relación 3:1
representan alrededor del 70%, y junto con los constituyentes minoritarios
seroalbúmina, inmunoglobulinas, lactoferrina, proteosas-peptonas y transferrina
representan mas del 80% de la proteína soluble, 6 g por cada litro de leche completa
empleada como materia prima en la fabricación de quesos (Bordin et al., 2001;
Prudencio et al., 2008; Smithers, 2008).
En la Tabla 3 se presentan el peso molecular, número de aminoácidos y punto

isoeléctrico de las 7 principales proteínas encontradas en el lactosuero bovino.
11
Tabla 3 - Propiedades básicas de las principales proteínas del lactosuero bovino.

Modificados de Madureira et al. (2007) y Ounis et al. (2008)
Número de
Peso Molecular
Proteína residuos de pI
(kDa)
amino ácidos
18,3 (monómero)
-Lactoglobulina 162 5,2
36 (dímero)
-Lactalbúmina 14,2 123 4,5-4,8
Seroalbúmina (SBA) 66,3 582 4,7-4,9
22,0-27,0 (“cadena
ligera”) +
Inmunoglobulinas - 5,5-8,3
50,0–70,0 (“cadena
pesada”)
Lactoferrina 80,0 700 8,0-9,0
Lactoperoxidasa 70,0 612 -
Glicomacropéptido 6,7 64 -
La última de las proteínas mencionadas en la Tabla 3, se corresponde con la porción

hidrosoluble de la -caseína conocida como Glicomacropéptido (GMP) liberada en el
lactosuero por la acción de la quimosina. Esta enzima (cuajo) rompe,
preferentemente, el enlace Phe-Met (105-106) de la -caseína de la leche,
liberándose dos fracciones: el GMP, porción hidrofílica de carácter ácido, constituido
por 64 aminoácidos (f106-169), y una porción hidrofóbica, de carácter básico,
compuesta por 105 aminoácidos, llamada paracaseína-, que pasa a formar parte
integral de la cuajada a partir de la cual se obtienen los distintos tipos de quesos
(Galindo-Amaya et al., 2006). El rango de peso molecular del GMP va de 6 a 8 kDa,
dependiendo de la variante genética de la k-caseína de donde provenga (Rojas et al.,
2009). El GMP representa alrededor de un 20% de la proteína total presente en el
lactosuero (Thomä-Worringer et al. 2006).
La técnica de electroforesis por SDS-PAGE es ampliamente utilizada para el análisis

de las proteínas del lactosuero puesto que tienen un rango de peso molecular mucho
12
mas amplio que las caseínas, las cuales muestran una baja resolución en estos
geles (Chevalier, 2011). Basch et al. (1985) describieron el patrón de proteínas por
el sistema SDS-PAGE del lactosuero dializado como conformado por tres bandas
claras en la parte superior del gel y dos bandas intensamente coloreadas en la parte
inferior, las primeras se corresponden con la lactoferrina (86 kDa), seroalbúmina (67
kDa) e inmunoglobulina de cadena pesada (~55 kDa), y las segundas con la -
lactoglobulina (18,4 kDa) y la -lactalbúmina (14,3 kDa). En las Figuras 1 y 2 se
muestran los patrones electroforéticos para lactosuero bovino y caprino,
respectivamente. En ambas se observan esas bandas, aunque ninguna de las dos
figuras identifica a la lactoferrina, esta banda se puede observar, en las muestras de
lactosuero (banda “raw” de la Figura 1; y las bandas 3-6 de la Figura 2) sobre las
bandas identificadas como seroalbúmina (BSA o SA).
Figura 1 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de las proteínas de lactosuero

bovino comparado con estándares de -LA, -LG, IgG y BSA. Tomado de Lin et
al.(2010).
Los autores de estas figuras sólo identifican la cadena pesada (“heavy chain”) de la
inmunoglobulina G, justo debajo de la seroalbúmina, y no la banda de la cadena
ligera (“light chain”) de la inmunoglobulina G, que se observa en ambos geles en la
zona central.
13
Figura 2 – SDS-PAGE, en condiciones reductoras, de lactosuero de cabra (bandas

3-6) comparadas con mezclas de estándares de las cuatro proteínas de
referencia-LA, -LG, IgG y SA a diferentes concentraciones (4,16 y 2 g en
las bandas 2,7 y 8, respectivamente). Tomado de Casper et al. (1998).
Casper et al. (1998) señalaron que el lactosuero caprino mostró una proporción
relativa de SA, IgG y -LG menor que la del bovino, pero mayor en el caso de la -
LA. Según Pesic et al. (2011) esta variación también se observó entre diferentes
trabajos y se reportó como la principal causa al efecto del período de lactación sobre
la distribución de las principales proteínas en el lactosuero caprino.
1.1.3. Secuencia teórica de aminoácidos de las proteínas del lactosuero
A modo de recolectar información sobre las dos principales proteínas encontradas en

los lactosueros, para facilitar la discusión posterior, a continuación se resumen datos
pertinentes sobre su tamaño y secuencia de aminoácidos (Figuras 3 y 4), tomadas
de la base de datos disponible en el servidor ExPASy Proteomic
(http://www.expasy.ch/).
14
CABRA (Capra hiricus)

Secuencia:P02756. . Longitud: 180 AA. Masa: 19,976 Da
10 20 30 40 50
MKCLLLALGL ALACGIQAII VTQTMKGLDI QKVAGTWYSL AMAASDISLL
60 70 80 90 100
DAQSAPLRVY VEELKPTPEG NLEILLQKWE NGECAQKKII AEKTKIPAVF
110 120 130 140 150
KIDALNENKV LVLDTDYKKY LLFCMENSAE PEQSLACQCL VRTPEVDKEA
160 170 180
LEKFDKALKA LPMHIRLAFN PTQLEGQCHV
VACA (Bos taurus)

Secuencia: P02754. Longitud: 178 AA. Masa: 19,883 Da
10 20 30 40 50
MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA
60 70 80 90 100
QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI
110 120 130 140 150
DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE
160 170
KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHI
Figura 3 – Secuencia de la -lactoglobulina de ambas especies, tomadas de
ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la
de origen caprino.
CABRA (Capra hiricus)

Secuencia: P00712. Longitud: 142 AA. Masa: 16,255 Da.
10 20 30 40 50
MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKCEVFQK LKDLKDYGGV SLPEWVCTAF
60 70 80 90 100
HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDQNPHSRN ICNISCDKFL
110 120 130 140
DDDLTDDIVC AKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL
VACA (Bos taurus)

Secuencia: P00711. Longitud: 142 AA. Masa: 16,247 Da.
10 20 30 40 50
MMSFVSLLLV GILFHATQAE QLTKCEVFRE LKDLKGYGGV SLPEWVCTTF
60 70 80 90 100
HTSGYDTQAI VQNNDSTEYG LFQINNKIWC KDDQNPHSSN ICNISCDKFL
110 120 130 140
DDDLTDDIMC VKKILDKVGI NYWLAHKALC SEKLDQWLCE KL
Figura 4 – Secuencia de la -Lactalbúmina de ambas especies, tomadas de
ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/). Se subraya los aa diferentes en la
de origen caprino.
15
Se puede observar que la secuencia de aminoácidos de estas proteínas, en ambas

especies, es bastante similar: la -LG caprina posee 2 aminoácidos (AA) mas que la
bovina y difiere en la posición de 13 AA (subrayados en la secuencia). La -LA
caprina posee el mismo número de AA que la bovina, pero difiere en la posición de 7
AA (subrayados en la secuencia). La homología de ambas proteínas entre las dos
especies animales, hace predecible suponer que las principales proteínas del
lactosuero caprino también pueda ser fuente de péptidos bioactivos, como se ha
demostrado en numerosos estudios con las de origen bovino (Hernández-Ledesma
et al., 2011).
1.2. Recuperación de las proteínas del lactosuero
Diversas técnicas han sido empleadas para la recuperación de las proteínas

lactoséricas (Vázquez-Puente et al., 2010). La aplicación de procesos industriales
actuales permite la recuperación de las proteínas y péptidos del lactosuero, sin
desnaturalización y conservando su actividad biológica. Algunos de los procesos
unitarios empleados para la concentración, transformación, fraccionamiento y
deshidratación del suero incluyen: 1) técnicas de electrodiálisis y nanofiltración para
su desmineralización y aplicación como ingrediente en formulaciones especiales
infantiles y para pacientes clínicos; 2) otros procesos de membrana, incluyendo
microfiltración y ultrafiltración (MF/UF), para el desarrollo de ingredientes funcionales
de suero, altos en proteínas y bajos en grasa; y 3) diversos procesos de secado
(Smithers, 2008; Yorgun et al., 2008). La composición del producto final dependerá
de la tecnología empleada en la concentración de las proteínas del suero. Por
ejemplo, en la producción comercial de aislado de proteína de suero (WPI) mediante
cromatografía de intercambio iónico (IEC) se obtiene un producto con una menor
proporción de inmunoglobulinas y glicomacropéptido (GMP), en comparación con los
WPI obtenidos por procesos de MF/UF (Ounis et al., 2008).
La tecnología de mayor aplicación a nivel mundial hace uso de membranas para

concentrar macromoléculas. Esta incluye la Ultrafiltración (UF), mediante la cual una
16
membrana permite el paso, hacia una corriente de “permeado”, de sales disueltas,

vitaminas y lactosa, pero retiene las proteínas del suero y los glóbulos de grasa,
estos compuestos se acumulan en la corriente de “retenido” (Zeman y Zydney,
1996). El procedimiento resumido de UF se inicia con la clarificación del suero crudo
por centrifugación, seguido por pasteurización y finalmente sometido de 3 a 10 ciclos
de UF hasta lograr un retenido con un contenido de sólidos entre 22 y 24%, de los
cuales 85% o mas corresponden a las proteínas del suero (Cheryan ,1998). La
proteína así obtenida se caracteriza por no estar desnaturalizada y teóricamente
conserva su actividad biológica intacta, sin embargo, esto la hace un blanco difícil
para la acción de las enzimas; por ejemplo, Peña-Ramos y Xiong (2001) señalaron
que la -LG nativa es poco afectada por la pepsina, mientras que al ser
desnaturalizado por calor, es extensamente degradada a un fragmento principal de 5
kDa después de solo media hora de hidrólisis enzimática.
A nivel de la mediana y pequeña industria nacional, la aplicación de la tecnología de

membranas se ve limitada por su elevado costo de inversión y, en general, ha tenido
muy poca o limitada aceptación (Faría et al., 2003). Por esta razón, se debe buscar
otro procedimiento mas económico para concentrar o separar las proteínas del
lactosuero. Una alternativa viable en este sentido lo constituye la coagulación de las
seroproteínas por la aplicación de calor, termocoagulación o “tratamiento
termoácido”. Esta forma de recuperar las proteínas solubles de suero de leche ha
sido empleada tradicionalmente en la elaboración de quesos de suero (requesón y
ricotta); y constituye una alternativa económica para la pequeña industria lechera. En
los últimos años, se ha evaluado el aprovechamiento de estos quesos, además de su
papel en la nutrición, como alimentos funcionales, especialmente con la
incorporación de especies de bacterias probióticas las cuales muestran una mejor
viabilidad en presencia de proteínas del lactosuero (Madureira et al., 2009)
A nivel de laboratorio este procedimiento se ha aplicado para la obtención de suero

desproteinizado mediante una reducción del pH del lactosuero hasta 4,5 con ácido
fosfórico o acético, seguido de calentamiento hasta 90°C durante 15 a 20 minutos,
17
enfriamiento y separación de la seroproteína precipitada mediante fitración en papel

whatman 42 (Jakymec et al., 2001; Ramírez y Rivas, 2003). A nivel industrial, se
aplica un procedimiento similar en la elaboración de ricotta, pero con un ajuste inicial
del pH a 6,6 antes de calentar a 85-90°C por 10 minutos con agitación constante y
reajuste del pH hasta 4,65 para precipitar las proteínas, las cuales se recolectan por
filtración una vez enfriada la solución (Monsalve y González, 2005).
Ahora bien, la recuperación mediante este procedimiento de termocoagulación está

entre un 50 y 60 % de la proteína originalmente presente en el lactosuero empleado
como materia prima, ya que este porcentaje corresponde a la proteína coagulable
presente en el lactosuero derivado de la elaboración de quesos o de caseínas. Este
porcentaje se corresponde con las principales proteínas del lactosuero: -LG, -LA,
seroalbúmina, lactoferrina e inmunoglobulinas. La porción no coagulable por calor lo
constituyen compuestos nitrogenados precipitables por ácido tricloroacético de
naturalesa peptona o proteosa, además de otras sustancias simples como crestina,
creatinina, úrea, ácido úrico y aminoácidos (Webb y Whittier, 1948). La estabilidad al
calor de las principales proteínas del lactosuero están en el siguiente orden: -LA >
-LG > SA > Ig; sin embargo, el grado de desnaturalización de estas proteínas se
determina por el grado de desnaturalización de la -LG, puesto que representa cerca
del 50% de todas las proteínas del lactosuero (Jovanovic et al., 2007).
1.3. Liberación de péptidos del lactosuero
La investigación sobre componentes bioactivos alimenticios constituye un área focal

clave en la investigación de cómo mejorar la salud humana a través de la nutrición
(Bauman et al., 2006). La leche está entre los alimentos más estudiados, contiene
una abundante cantidad de proteínas que han sido relacionadas tanto con la
nutrición como con el control metabólico (Hironaka et al., 1997). En general, es una
excelente y bien balanceada fuente de nutrientes, que además exhibe un rango de
actividades biológicas que afectan la digestión, respuestas metabólicas a los
nutrientes absorbidos, crecimiento y desarrollo de órganos específicos, y resistencia
18
a enfermedades. La mayoría de estas actividades biológicas se deben a los péptidos

presentes en la leche, conocidos como péptidos bioactivos. Parte de la actividad
biológica de estos compuestos está en estado latente, cuando están formando parte
de una estructura proteica más compleja, y es activada solamente por acción
proteolítica: bien sea, durante la digestión de la leche en el tracto gastrointestinal, o
durante el procesamiento y fermentación de la leche (Haque y Chand, 2006). Los
péptidos bioactivos han sido definidos como fragmentos específicos de proteínas que
tienen un impacto positivo sobre ciertas funciones o condiciones corporales y que
pueden definitivamente influir sobre la salud (Korhonen y Pihlanto, 2006). De igual
forma, el término “péptido bioactivo derivado de alimento” se refiere a los diferentes
péptidos de origen animal o vegetal que pueden tener una función reguladora en el
sistema humano, más allá de una nutrición normal y adecuada (Hartmann y Meisel,
2007). A los péptidos bioactivos se le atribuyen diversas propiedades bioquímicas y
fisiológicas, incluyendo actividad opiácea, inmunomoduladora y cardiovascular
(Sipola et al., 2002). Muchos péptidos bioactivos tienen en común propiedades
estructurales que incluyen una cadena corta de aminoácidos (de 2 a 9 aminoácidos),
residuos aminoácidos hidrofóbicos en adición a grupos prolina, lisina o arginina,
también resistencia a la acción de peptidasas digestivas (Kitts y Weiler, 2003).
Estos péptidos son inactivos dentro de la secuencia de la molécula proteica original y

se hacen biológicamente activos al ser liberados por: 1) hidrólisis enzimática durante
la digestión gastrointestinal; 2) fermentación de la leche por cultivos iniciadores
proteolíticos aplicados durante el procesamiento; o 3) hidrólisis por enzimas
proteolíticas derivadas de microorganismo o plantas (Haque y Chand, 2006;
Korhonen y Pihlanto, 2006). Sobre la base de estos dos últimos se han desarrollado
procesos tecnológicos para el aislamiento y enriquecimiento de péptidos bioactivos;
básicamente sometiendo a las proteínas lácteas a la acción de a) mezclas
proteolíticas grado alimenticio derivadas de plantas, hongos, bacterias o enzimas
digestivas; o b) fermentos lácticos proteolíticos (Ruiz-Giménez et al., 2012). Sin
embargo, siempre se debe tener presente que el primer proceso mencionado, la
digestión gastrointestinal, es la que en última instancia define la expresión o no de la
19
potencial función biológica que pueda tener un péptido una vez que entre en el tracto
digestivo. Un péptido con una secuencia apropiada y con un elevado potencial para
ejercer una función biológica específica, comprobada mediante ensayo in vitro,
puede no mostrar ningún efecto esperado en un ensayo in vivo, ya que después de
su ingestión oral, las enzimas gastrointestinales pueden cortar este péptido en otros
péptidos menores con una secuencia poco favorable para interactuar con los demás
elementos involucrados en determinado proceso biológico. Pudiendo también ocurrir
lo contrario, que esos fragmentos menores tengan una mayor potencia que el péptido
original (Miguel et al., 2010)
La aplicación de cultivos iniciadores proteolíticos ha sido exitosa en la liberación de

péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la leche durante la elaboración de
quesos y otros productos lácteos fermentados (Pihlanto et al., 2010). Sin embargo,
casi la totalidad de los péptidos así derivados provienen de las caseínas y no de las
proteínas solubles del lactosuero. Korhonen y Pihlanto (2006), por ejemplo,
presentan una lista de 11 estudios experimentales sobre la liberación de péptidos
bioactivos luego de la fermentación de leche empleando diferentes microorganismos
proteolíticos: solo uno de ellos reportó una secuencia peptídica derivada de las
proteínas del lactosuero.
Por el contrario, con la aplicación de enzimas proteolíticas se han alcanzado mejores

resultados en la obtención de péptidos bioactivos a partir de la hidrólisis de las
proteínas del lactosuero. En la actualidad, el principal reto en la producción de
péptidos bioactivos mediante la hidrólisis enzimática in vitro es encontrar la enzima
adecuada y las condiciones que puedan favorecer la bioactividad y su rendimiento en
la producción (Ortiz-Chao et al., 2009). El resultado final del proceso de reacción en
estos sistemas enzimáticos lo determinan los siguientes parámetros: pH,
temperatura, relación enzima-sustrato (E/S) y el tiempo de hidrólisis (Li-jun et al.
2008). El seguimiento o control de este proceso se puede realizar determinando el
grado de hidrólisis (GH) definido como el porcentaje de enlaces peptídicos rotos en
una proteína que ha sido sometida a hidrólisis enzimática (García-Gómez et al.
20
2009). El desarrollo de la hidrólisis es similar en la mayoría de los sistemas

enzimáticos descritos en la literatura: inicialmente se produce un rápido incremento
en el GH, para después disminuir la velocidad gradualmente, debido posiblemente a
la competencia entre la proteína no-hidrolizada y los péptidos formados
constantemente durante la hidrólisis (Kong et al. 2008).
Se han aplicado una gran diversidad de enzimas en el tratamiento del lactosuero.

Peng et al. (2009) aplicaron alcalasa sobre un aislado de suero (pH 8,5 a 65°C, 8
horas, E/S 2:100) encontrando que el GH se incrementó linealmente en las dos
primeras horas y luego se estabilizó alrededor del 30%. Mercier et al. (2004)
hidrolizaron soluciones al 10% de diferentes fracciones de WPI con una mezcla de
tripsina:quimotripsina (1:1) a un pH de 8,8 a 42°C y con una relación E/S de 1:200 y
los GH se estabilizaron en un rango de 12 a 17%; ellos señalaron que mas del 91%
de los péptidos obtenidos tenían un peso molecular menor a 5 kDa. Saint-Sauveur et
al. (2008) aplicaron una mezcla de tripsina:quimotripsina sobre WPI (pH 8 a 42°C, 4
horas, E/S 1:200), y observaron un aumento en el GH durante la primera hora, para
luego estabilizarse lentamente en valores alrededor de 10%; este digerido enzimático
se caracterizó por tener 94% de sus componentes proteicos con un peso molecular
menor a 5 kDa. Li-jun et al. (2008) emplearon alcalasa (pH 8 a 50°C, E/S 3%) sobre
una solución de 200 g/L, de un concentrado de proteína de suero, y obtuvieron un
hidrolizado proteico conformado principalmente por péptidos de peso molecular
menor a 1 kDa. García-Gómez et al. (2009) emplearon proteasas de A. oryzae , de
dos fuentes diferentes (una preparada por fermentación en el laboratorio y otra de
origen comercial “Flavourzyme® 500 MG” de Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca),
para hidrolisar una solución al 1% de proteína de pescado (pH 8 a 50°C, 1 hora, E/S
1:5 para el fermentado y 1:100 para Flavourzyme® 500 MG ), reportaron que aunque
ambas demostraron una rápida hidrólisis en los primeros 30-40 minutos, la proteasa
obtenida por fermentación en el laboratorio alcanzó un GH de 22,2% mientras que el
de la marca comercial Flavourzyme® 500 MG fue de 9,1%.
21
Ahora bien, el GH alcanzado en un determinado momento es el que define el nivel de

la actividad biológica de los péptidos resultantes, por lo cual, se debe determinar el
tiempo de duración de la reacción enzimática en el cual se alcanza la mayor
actividad, ya que, como lo han demostrado los siguientes estudios, éste no coincide
con el máximo GH que puede alcanzar un determinado sistema enzimático. Guo et
al. (2009) en un ensayo con un extracto crudo de proteinasas de L. helveticus,
aplicado por 28 horas a un concentrado de proteínas del lactosuero, encontraron que
la actividad inhibidora ACE se incrementó en el periodo de 0 a 8 horas, para luego
disminuir paulatinamente hasta el final del ensayo; esos autores trabajando con un
tiempo de hidrólisis de 8 horas, alcanzaron niveles de GH de hasta 49,5%, sin
embargo, el GH óptimo para obtener la mayor actividad inhibidora ACE de dicho
hidrolizado fue de 19,3%, alcanzado a un pH de 9,18 a 38,9°C con un E/S de 0,60.
Marambe et al. (2008) encontraron que la actividad inhibidora ACE, del hidrolizado
de proteínas de linasa (Linum usitatissimum) con Flavourzyme®, disminuye
significativamente cuando el grado de hidrólisis es mayor de 25%, el cual se alcanzó
en un período de incubación de 4 horas, con una relación enzima:sustrato de 15 U/g
de proteína.
La principal desventaja de la hidrólisis enzimática, es la liberación de péptidos

amargos, lo cual limita significativamente su potencial aplicación en alimentos, ya
que solo podrán ser incorporados a muy bajas concentraciones para evitar el
rechazo del consumidor (Spellman et al. 2009). Por esta razón, es necesario evaluar
la acción de diversas enzimas sobre las proteínas del suero, de forma de obtener
mayor actividad biológica y, al mismo tiempo, el menor grado de amargor posible. La
mayoría de los trabajos reportados hasta la fecha sobre la obtención de péptidos
bioactivos a partir de hidrolizados de las proteínas de la leche, tales como los arriba
citados, han aplicado una o varias de las siguientes enzimas: pepsina, tripsina,
alcalasa, coralasa y flavouryzyme®. Ésta última es una mezcla de proteasas (endo y
exopeptidasas) crudas, obtenidas de A. oryzae, entre las cuales se encuentran las
carboxipeptidasas responsables de la reducción del amargor en los hidrolizados de
soya, según lo resumido por (Li et al. 2008). Peña-Ramos y Xiong (2001) reportaron
22
que la proteasa F, o Flavouryzyme®, al actuar sobre una solución al 2% de aislado

de proteína de suero (WPI) por 0,5 y 1 hora, obtuvieron un hidrolizado con mayor
actividad antioxidante en comparación con los obtenidos aplicando proteasas de
Bacillus licheniformis.
Por tanto, numerosos autores han demostrado que las propiedades funcionales de
una proteína que pueden ser alteradas por la hidrólisis dependen en gran medida del
grado hasta el cual dicha proteína ha sido hidrolizada (Spellman et al., 2003). Así se
tiene por una parte, estudios recientes han demostrado que después de la hidrólisis,
ciertos péptidos resultantes pueden ser empleados como antioxidantes naturales en
productos alimenticios (Peña-Ramos y Xiong, 2001); mientras que por otra, estudios
como el de Rizzello et al. (2005) han señalado que proteólisis intensas por largo
tiempo pueden ocasionar la hidrólisis de las secuencias biológicamente activas
haciéndolas perder su actividad.
Existen numerosos métodos para la estimación del GH. Se puede cuantificar

determinando la cantidad de nitrógeno liberada durante la hidrólisis mediante el
método de Kjeldahl o por determinación espectrofotométrica en la región visible
luego de una reacción colorimétrica (Spellman et al., 2003). También se puede
cuantificar determinando los grupos amino liberados durante la hidrólisis mediante la
titulación con formol (Taylor, 1957) o empleando compuestos que reaccionan
específicamente con grupos aminos tales como el ácido trinitrobezenosulfónico
(TNBS), p-phthaldialdehido (OPA), ninhidrina o fluorescamina (Adler-Nissen, 1982).
También se puede utilizar osmometría, calculando los cambios en osmolaridad
mediante la depresión del punto de congelación. Midiendo la liberación de protones
durante la hidrólisis mediante titulación por el método de pH stat (Rutherfurd, 2010).
1.3.1. Proteasa de Aspergillus oryzae
El complejo de proteasa-endopeptidasa producido por Aspergillus oryzae,

comercializado bajo el nombre de Flavourzyme ®, según Rossini et al. (2009) es mas
23
efectiva que la Alcalasa (proteasa de Bacillus licheniformis) en la producción de

péptidos pequeños según lo demostraron mediante ensayos de cromatografía en gel
y patrón electroforético de los hidrolizados. Esos péptidos a su vez exhibieron una
mayor actividad biológica (Hogan et al., 2009). Flavourzyme® se ha aplicado en la
hidrólisis de proteína de soya (Kong et al., 2008) y en hidrólisis de la leche para
obtener los lactotripéptidos IPP y VPP (Mizuno et al., 2004), también se ha evaluado
en otros productos alimenticios como gluten de maíz (Suh et al., 2003), en desecho
de semillas de linaza luego de la extracción de aceite (Marambe et al., 2008) y en
productos de desecho, como los derivados del procesamiento de camarones (Rossini
et al., 2009; Cheung y Li-Chan, 2010). Tsai et al. (2008) han recomendado el uso de
Flavourzyme® para facilitar la fermentación de la leche por Streptococcus
thermophilus y Lb. Bulgaricus, y obtener así una fracción de lactosuero con una
mayor actividad biológica. Esta proteasa tiene la ventaja adicional de que los
péptidos producidos gracias a su acción hidrolítica tienen un bajo grado de amargor
en comparación con los productos de otras enzimas como la Alcalasa (Cheung y Li-
Chan, 2010).
1.4. Actividad biológica de los péptidos del lactosuero
Muchos de los procesos fisiológicos en un organismo son mediados por péptidos: el

cuerpo humano sintetiza péptidos antimicrobianos como defensinas y endorfinas
opioides; la presión sanguínea es regulada por péptidos como la angiotensina II o la
bradykinina; y péptidos endógenos están involucrados en la respuesta inmune
(Martínez-Maqueda et al., 2012). La variedad de compuestos nitrogenados (proteínas
y péptidos) presentes en el lactosuero, exhiben un rango de actividades biológicas
que afectan procesos como la digestión, las respuestas metabólicas a los nutrientes
absorbidos, el crecimiento y desarrollo de órganos específicos, y la resistencia a
enfermedades. Los estudios sobre la actividad biológica de las proteínas de la leche
han sido recopilados en diversas revisiones, tal como la presentada por Madureira et
al. (2007). Estas proteínas contienen dentro de su secuencia de aminoácidos
precursores de péptidos bioactivos que pueden ser liberados por reacciones
24
hidrolíticas. Estos péptidos influencian directamente numerosos procesos biológicos

que provocan diversas respuestas humorales, gastrointestinales, hormonales,
inmunológicas, neurológicas y nutricionales (Clare y Swaisgood, 2000).
1.4.1. Actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA)
La inhibición de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) involucra la

modulación del sistema renina-angiotensina (RAS), el cual es un importante
regulador del tono vascular, el balance de agua y sodio y de la presión sanguínea; un
RAS intacto es crucial para el desarrollo normal del riñón (Dent et al., 2007). La
enzima conocida como ECA (Enzima Convertidora de la Angiotensina;
peptidildipéptido hidrolasa, EC 3.4.15.1) juega un papel importante en la regulación
de la presión sanguínea y el balance salino de los fluidos en mamíferos, catalizando
la conversión de la angiotensina I (un decapéptido) en el potente vasoconstrictor
angiotensina II (un octapéptido) y al mismo tiempo inactivando al vasodilatador
bradykinina (Hartmann y Meisel, 2007; Erdmann et al., 2008). La angiotensina II
causa un incremento en la presión sanguínea y, de esta forma, la inhibición de la
enzima ECA puede disminuir la presión sanguínea (Tuomilehto et al., 2004). El sitio
activo de la enzima ECA está constituido por tres subsitios (S1, S1’, S2’) en los
cuales se acoplan los tres residuos hidrofóbicos C-terminales de su sustrato, la
angiotensina I, donde son luego “cortados” los dos últimos residuos aminoácidos
produciendo la angiotensina II. De acuerdo a la evidencia acumulada hasta el
momento, los péptidos que muestran actividad inhibidora de la ACE poseen residuos
hidrofóbicos, tales como triptófano (Trp), tirosina (Tyr) o fenilalanina (Phe), en por lo
menos una de las tres posiciones C-terminales con los cuales se unen a los sitios
activos de la enzima ECA, bloqueando su actividad (Abubakar et al., 1998; Murakami
et al., 2004; Otte et al., 2007a; Vinderola et al., 2008). Se ha observado que
secuencias de péptidos de cadena corta que portan residuos de prolina (Pro), en
combinación o no con residuos hidrofóbicos, también tienen actividad inhibidora de la
enzima ECA (Murakami et al., 2004; Hartmann y Meisel, 2007). Adicionalmente, la
potencia inhibidora se puede incrementar con la presencia, en esta posición terminal,
25
de las cargas positivas de Lys (grupo -amino) y Arg (grupo guanidino) (Hernández-
Ledesma et al., 2008). En general, se reconoce que los péptidos que ofrecen
consistentemente una mayor actividad inhibidora de la enzima ECA: a) son de peso
molecular menor a 3 kDa (Lignitto et al., 2010); b) de cadena corta, de 3 a 20
residuos de aminoácidos por molécula; y c) frecuentemente portadores de residuos
polares como la prolina (Korhonen y Pihlanto-Leppälä, 2003; Hartmann y Meisel,
2007).
Numerosas proteínas alimenticias tienen secuencias de péptidos con potencial

actividad inhibidora de la enzima ECA (Murakami et al., 2004). Tsai et al. (2008)
señalaron que estudios clínicos han demostrado que los inhibidores de la enzima
ECA, reducen significativamente la morbilidad y mortalidad de pacientes con
problemas cardíacos; indicaron además que se han aislado varios péptidos
inhibidores de la enzima ECA a partir de hidrólisis enzimática de proteínas lácteas
(tipo Val-Arg-Tyr-Leu) y de la fermentación de la leche con bacterias ácido lácticas
(tipo Ile-Pro-Pro y Val-Pro-Pro). En general, la “potencia” de los péptidos inhibidores-
ECA va a depender del tipo de enzima y/o bacteria láctica utilizada en la hidrólisis
(Pihlanto et al., 2010).
1.4.1.1. Péptidos del lactosuero con Actividad IECA
Otte et al. (2007a) obtuvieron cuatro potentes péptidos inhibidores de la enzima ECA
a partir de un hidrolizado de -lactalbúmina catalizado con termolisina, todos ellos
contenían la misma secuencia Pro-Glu-Trp en su extremo C-terminal. En estudio
realizado con la -Lactoglobulina (-Lg), Murakami et al. (2004) identificaron un
tetrapéptido conformado por los residuos de aminoácidos Ala-Leu-Pro-Met (f 142-
145) al cual denominaron “-lactosina B” para distinguirla del péptido “-lactosina A”
proveniente del f(78-80), previamente identificado en la misma proteína. La -
lactosina B mostró una fuerte actividad hipotensiva al ser administrado por via oral a
ratas espontáneamente hipertensivas (SHR), atribuida por los autores al residuo de
prolina presente en el tetrapéptido. En general, se ha encontrado que calentando la
26
-Lg durante los tratamientos enzimáticos (60 a 80°C) se favorece la formación de

péptidos con actividad inhibidora de la enzima ECA, y como un ejemplo de esto se
menciona al fragmento Leu-Glu-Lys-Trp obtenido bajo esta condiciones y que ha sido
descrito como un potente inhibidor de la enzima ECA (Hernández-Ledesma et al.,
2006).
Un potente péptido ECA-inhibidor formado por el fragmento 108-110 del GMP, el cual
corresponde a Ile-Pro-Pro, ha sido purificado a partir de una bebida láctea japonesa;
y en estudios controlados, se ha encontrado que la presión sanguínea de pacientes
hipertensos disminuyó significativamente después de 4-8 semanas de ingesta diaria
de 95 mL de leche agria conteniendo este péptido junto con otro derivado de la -
caseína (Silva y Malcata, 2005). Se ha reportado así que, en comparación con el
GMP intacto, los hidrolizados trípticos del GMP exhibieron niveles más altos de
actividad inhibidora-ECA (Thomä-Worringer et al., 2006).
Los resultados de los ensayos de Tsai et al. (2008) indicaron que al fermentar leche
con bacterias ácido lácticas en combinación con una proteasa, obtuvieron una mayor
producción de péptidos activos inhibidores de la actividad de la enzima ECA, entre
los cuales resaltó como el de mayor bioactividad al péptido Tyr-Pro-Tyr-Tyr.
Concluyeron así que el suero de leche fermentado de esta forma puede ser
empleado en la elaboración de alimentos funcionales formulados para prevenir la
hipertensión.
Mullally et al. (1997) reportaron la secuencia Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg obtenida de

la hidrólisis de la -LG (fragmento 142-148) con tripsina, como un potente péptido
inhibidor de la enzima ECA. Ortiz-Chao et al. (2009) reportaron un producto de la
hidrólisis de la -LG usando proteasa de N-Amano, una preparación comercial grado
alimenticio, como una mezcla de péptidos con potente actividad inhibitoria de la
enzima ECA. Al fraccionar esa mezcla, lograron aislar un péptido correspondiente al
fragmento 36-42 de la -LG que mostró un IC50 de 8 M, el cual según los autores,
es el péptido inhibidor de la enzima ECA mas potente reportado hasta esa fecha.
27
Este novel péptido tiene la secuencia de Ser-Ala-Pro-Leu-Arg-Val-Tyr, es decir, que

en extremo C-terminal posee tres aminoácidos hidrofóbicos, y uno de ellos
aromático.
Recientemente, Pan et al. (2012) reportaron un nuevo dipéptido con buena actividad
IECA in vitro, cuya secuencia fue confirmada como Leu-Leu con una masa de 226,85
Da correspondiente con el fragmento 4-5 de la -LG, obtenido mediante la hidrólisis
con tripsina. Como se puede observar, este péptido no contiene residuos de Pro,
Lys, Arg ni residuos aromáticos, pero cumple con la condición de poseer un
aminoácido hidrofóbico en el extremo C-terminal, la leucina. Mediante un modelo
computarizado ellos evaluaron el mecanismo molecular de “anclaje” del dipéptido en
el sitio activo de la enzima ECA, y encontraron que la interacción del péptido Leu-Leu
con el Zn2+ y los residuos de His383, Glu411 y His387, presentes en el sitio activo,
estabilizan el complejo péptido inhibidor-enzima, inactivando por tanto a la enzima
ECA. Ellos confirmaron la actividad IECA mediante un modelo animal con ratas
espontánemente hipertensas (SHR).
1.4.1.2. Métodos para determinar actividad IECA
Hasta hace pocos años, la gran mayoría de los trabajos sobre péptidos
antihipertensivos, determinaban su actividad mediante el método del ácido hipúrico
(Cushman y Cheung, 1971) basado en la hidrólisis del péptido sintético hippuryl-L-
histidina-L-leucina (Hip-His-Leu) por la acción de la enzima ECA, con la liberación del
ácido hipúrico, como uno de los productos de la reacción, y su posterior extracción
con etil acetato, para luego determinar su concentración por espectrofotometría a
228 nm. El resultado se expresa como IC50, la concentración de péptidos ECA-
inhibidores que reducen la actividad de la enzima ECA en 50% (Murakami et al.,
2004; Hernández-Ledesma et al., 2007). Tsai et al. (2008) utilizaron el mismo
principio pero antes de la medición espectrofotométrica incorporaron una separación
por RP-HPLC.
28
Ahora bien, el método del ácido hipúrico tiene importantes limitaciones, tales como el
requisito de la extracción con un solvente, lo cual restringe el número de muestras
que pueden ser analizadas por día e introduce una fuente adicional de error. En vista
de esto, Sentandreu y Todrá (2006) desarrollaron un protocolo para una
determinación precisa, rápida y sensible de la actividad de la enzima ECA. Este
método se basa en el tripéptido intramolecularmente fluorescente o-
aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanila-L-prolina (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) desarrollado
por Carmel y Yaron (1978). La hidrólisis del sustrato por la acción de la enzima ECA,
genera el producto fluorescente o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly), el cual puede ser
cuantificado fluorimétricamente usando las longitudes de onda de excitación y
emisión apropiadas. La reacción se puede realizar en una placa de 96 pocillos y
leerse en un fluorímetro de microplacas. Este protocolo involucra solo una reacción
de una solo etapa, evitando posteriores derivatizaciones, extracciones con solventes
orgánicos o serparaciones cromatográficas de los productos de reacción.
1.4.1.3. Estudios in vivo para evaluar actividad IECA
Debido a la falta de correlación entre las pruebas in vitro de la actividad IECA y la

acción in vivo, la evidencia sobre los efectos beneficiosos de los péptidos
antihipertensivos tiene que estar basada a datos clínicos (Martínez-Maqueda et al.,
2012). El meta-análisis realizado por Pripp (2008) resalta el hecho de que la gran
mayoría de los trabajos sobre el efecto hipotensivo de los péptidos bioactivos se han
basado en ensayos in vitro y con cierta extensión en experimentos con animales de
laboratorio (modelo animal). Este autor evaluó 15 estudios clínicos controlados por
placebo sobre el efecto de péptidos derivados de proteínas alimenticias sobre la
presión sanguínea, publicados en revistas internacionales calificadas. Estos estudios
fueron seleccionados de un total de 227 publicaciones, 212 de las cuales no se
incluyeron por no estar dirigidos al efecto sobre la presión arterial. El promedio de
duración de estas intervenciones fue de 7,4 semanas, con una intervención mínima
de 4 semanas. Mas de la mitad de estos ensayos utilizaron la intervención con los
péptidos IPP y VPP, derivados de la caseína; y del resto solo tres intervinieron con
29
péptidos derivados de proteínas del lactosuero. En la mayoría de los ensayos los

participantes fueron adultos mayores a 50 años en promedio, con una mayor
proporción de hombres que de mujeres. El resultado de este análisis demostró que el
consumo de péptidos derivados de proteínas alimenticias pueden reducir
significativamente las PAS y PAD, con un efecto promedio de 5,13 mmHg por debajo
del valor inicial (intervalo de confianza 95%: 3,14 a 7,12 mmHg) y 2,42 mmHg menos
(intervalo de confianza 95%: 1,03 a 3,82 mmHg), respectivamente.
En otro meta-análisis (Xu et al., 2008) de 12 ensayos clínicos, tomados a partir de un

total de 1561 artículos identificados en buscadores electrónicos, también se reportó
la reducción promedio en PAS y PAD de 4,8 y 2,2 mmHg, respectivamente. Todos
esos ensayos se realizaron con la intervención de los tripéptidos de la caseína, IPP y
VPP, en pacientes hipertensos y tuvieron una duración mínima de 4 semanas.
Ambos trabajos señalaron no poder establecer una dosis recomendada para el
consumo de estos péptidos a partir de los estudios analizados, ya que se requieren
mas estudios epidemiológicos basados tanto en poblaciones normales como
hipertensas para poder determinar la cantidad apropiada de péptidos lácteos para
humanos.
Por otra parte, Dent et al. (2007) no encontraron evidencia de toxicidad al suministrar
dosis entre 500 y 4000 mg/Kg/dia a animales de laboratorio durante 90 días,
trabajando con soluciones de 0,21 mg/mL, 0,84 mg/mL y 1,68 mg/mL de los
lactotripéptidos IPP y VPP. Un estudio mas reciente por Ponstein-Simarro et al.
(2009) obtuvo resultados similares, confirmando que el consumo de productos
lácteos con hidrolizados proteicos, como fuente del lactotripéptido IPP, no tiene
efectos tóxicos.
1.4.2. Actividad Antioxidante
Uno de los mas potentes y peligrosos gases sobre la tierra es el oxígeno. Los
sistemas vivos están protegidos contra la oxidación mientras estén vivos, pero se
30
enfrentan al ataque constante de las sustancias conocidas como especies reactivas

al oxígeno, o ROS, por sus siglas en inglés (Koolman y Roehm, 2005). Estas ROS
pueden causar daños en el ADN, aumentando el riesgo de contraer cáncer; oxidar
ácidos grasos poli-insaturados, contribuyendo a la aparición de enfermedades
cardiovasculares; y puede dañar proteínas, interrumpiendo procesos vitales
(Erdmann et al., 2008).
Actualmente existe una creciente conciencia de que la protección contra los estragos
del oxígeno puede tener un efecto muy beneficioso sobre la salud, por lo cual, en la
última década se han cuadruplicado el número de publicaciones sobre antioxidantes
y estrés oxidativo (Huang et al., 2005). No existe duda que al incrementar el
consumo de antioxidantes se consigue prevenir tanto el cáncer como las
enfermedades cardíacas, pero no está claro cuales antioxidantes son los mas
efectivos (F.A.I.A., 2002).
Se ha propuesto la hipótesis de que el principal causante de estas enfermedades son

las sustancias reactivas oxidativas (ROS), las cuales se generan a través de
metabolismo normal y en respuesta al estrés e infección, al igual que a la exposición
a sustancias químicas tóxicas. Cualquier componente de la dieta capaz de actuar
como un antioxidante o de inducir mecanismos de protección antioxidante se
esperaría que pueda ofrecer protección contra los efectos dañinos de las ROS en
células o tejidos susceptibles (Lindsay, 2000).
Péptidos antioxidantes son aquellos péptidos, de 4 a 20 kDa, que tienen la habilidad

de inhibir los daños causados por la oxidación lipídica. Esta habilidad parece estar
relacionada con la presencia de ciertos residuos de aminoácidos, tales como tirosina,
metionina, histidina, lisina y triptófano, los cuales pueden quelar iones metálicos pro-
oxidantes (Virtanen et al., 2007), capturar radicales libres y/o extinguir el oxígeno
reactivo (Erdmann et al., 2008).
31
1.4.2.1. Péptidos del lactosuero con actividad antioxidante
Algunos componentes lácteos poseen capacidad antioxidante, esto es, son activos
en la prevención de la peroxidación lipídica y mantienen la calidad de la leche, e
incluso pueden ser usados como ingredientes en alimentos y fármacos para mejorar
la salud de los consumidores. Diversos autores han reportado que la capacidad
antioxidante total de la leche se debe principalmente a las caseínas (Hartmann y
Meisel, 2007; Zulueta et al., 2009b). Péptidos antioxidantes pueden ser liberados a
partir de la hidrólisis de las caseínas durante la fermentación de la leche por cepas
BAL proteolíticas, como el Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus (Korhonen y Pihlanto,
2006). Adicionalmente, se ha encontrado que la disminución en la oxidación de las
grasas lácteas se debe a las propiedades antioxidantes de los compuestos
sulfhidrilos formados naturalmente durante el tratamiento térmico de la leche
(Alvarez, 2009).
Peña-Ramos y Xiong (2001) encontraron que en un hidrolizado de proteína de suero

están presentes péptidos tanto antioxidantes como pro-oxidantes, por lo que el efecto
esperado como antioxidante se ve reducido por el antagonismo de ambos
compuestos. Ellos recomendaron continuar estudios para lograr separar ambos y
evaluar mejor el efecto de cada fracción. Según Virtanen et al. (2007), hasta la fecha
solo unos pocos péptidos antioxidantes han sido identificados en productos lácteos
fermentados. Peng et al. (2009) obtuvieron, hidrolizando un aislado de proteína de
suero (WPI) mediante tratamiento enzimático con Alcalasa, cuatro fracciones con
péptidos de diferentes pesos moleculares. La fracción con péptidos en el rango de
0,1 a 2,8 kDa mostró un efecto reductor de radicales libres significativamente mayor
que las otras fracciones con péptidos de mayor tamaño. Estos autores están
trabajando actualmente en la identificación de la secuencia de aminoácidos de estos
péptidos. Se ha mencionado que la actividad antioxidante de los péptidos derivados
del lactosuero esté relacionada con la presencia de cisteína la cual promueve la
síntesis de glutationato, un potente antioxidante intracelular (Erdmann et al., 2008).
Bayram et al. (2008) obtuvieron resultados similares comparando la actividad
32
antioxidante de las proteínas del suero con la de sus hidrolizados. Sus resultados
sugieren que la actividad antioxidante es inherente a la secuencia de péptidos en la
-Lactoglobulina.
1.4.2.2. Actividad antioxidante de las frutas
Existe una base de datos consistente que sugiere que aquellos consumidores que
tienen un alto consumo de alimentos de origen vegetal, poseen una incidencia mas
baja de cáncer y, probablemente, de otras enfermedades relacionadas con el
ambiente. En los alimentos vegetales, los sistemas neutralizadores de los ROS
incluyen a las vitaminas (E y C), las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa,
glutatión peroxidasa) y otros captadores de radicales no-vitamínicos, entre los que
destacan los polifenones (Espín y Tomás-Barberán, 2007). Por esta razón, los
polifenoles se incluyen entre los componentes o ingredientes considerados como
“funcionales”. Los compuestos fenólicos poseen diferentes actividades biológicas,
además de su capacidad antioxidante y por tanto, se consideran potenciales
reductores del riesgo de aparición de enfermedades cardiovasculares y de otras
enfermedades crónicas (Robles-Sánchez et al., 2007; Vasco et al., 2008).
El tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) pertenece a la familia de las

Solanaceae, y en Venezuela su cultivo está limitado a los estados andinos y el
estado Aragua; se ha descrito la utilización de la pulpa en la elaboración de jaleas,
néctares y la combinación con productos lácteos (Hernández y Moreno-Alvarez,
2000). Desde el punto de vista nutricional, constituye una buena fuente de vitaminas
A, B6, C y E, y minerales como el hierro; además de un bajo contenido de
carbohidratos y menos de 40 calorías por cada 100 g (Márquez et al., 2007). Muñoz-
Jáuregui et al. (2007) realizaron un estudio con nueve frutas del Perú, consideradas
por ellos como recursos “promisorios”, evaluando su actividad antioxidante mediante
diversos métodos, y como conclusión presentaron una clasificación, de acuerdo a la
actividad antioxidante de estos frutos, en: “muy elevada” (Myrciaria dubia y Passiflora
mollisima), “elevada” (Prunus serotina, Morinda citrifolia y Smallanthus sonchifolius),
33
“moderada” (Averrhoa carambola, Physalis peruviana y Cyphomandra betacea

Sendt), “baja” (Passiflora quadrangularis). Repo y Encina (2008) reportaron los
siguiente valores para el fruto del tomate de árbol: DPPH 853 ± 52 g equivalente
Trolox/g de tejido; ABTS 838± 35 g equivalente Trolox/g de tejido; compuestos
fenólicos 130 ± 52 mg equivalente ácido gálico/100g de muestra; ácido ascórbico
16,09 ± 52 mg ácido ascórbico/100g de muestra; carotenos 4,00 ± 0,01 mg -
caroteno/100g de muestra. En un estudio realizado por Kou et al. (2009) se
demostró que los compuesto fenólicos de la fruta de Cyphomandra betacea Sendt
(“tomate de árbol” o “tamarillo”) protegen a las lipoproteínas de baja densidad (LDL)
de la oxidación y a los cultivos de células neuronales PC12 del daño inducido por el
estrés oxidativo; por esa razón, esos autores concluyen que el consumo de tomate
de árbol puede conferir cierta protección contra la ateroesclerosis y las
enfermedades neurodegenerativas.
1.4.2.3. Métodos para determinar actividad antioxidante
De acuerdo con la revisión realizada por Huang et al. (2005), hasta el momento, no
se ha desarrollado un método analítico único y conveniente para la rápida
cuantificación de la efectividad antioxidante in vitro de un compuesto en la
prevención de enfermedades, sino que por el contrario se han propuesto un
sinnúmero de ellos. Estos autores clasificaron los numerosos métodos publicados,
dependiendo de las reacciones involucradas, en dos tipos: ensayos basados en la
transferencia de un átomo de hidrógeno (ensayos HAT) y ensayos basados en la
transferencia de electrones (ensayos ET). Estos últimos han tenido mayor aplicación
en la cuantificación de la capacidad antioxidante de los péptidos derivados de las
proteínas lácteas. A) Entre los ensayos HAT, aplicados en este campo, está el
empleado por Peña-Ramos y Xiong (2001), peroxidación de lípidos. Ellos
determinaron la habilidad inhibitoria de los péptidos contra la peroxidación de lípidos
en la membrana celular, empleando liposomas como sustrato para peroxidación. B)
Entre los ensayos ET, el primer ensayo reportado fue el TEAC (Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity Assay) y actualmente se ha popularizado el uso de su versión
34
mejorada, el ABTS (ácido 2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolino-6-sulfónico). Éste es

un método de decoloración, donde el ABTS es oxidado para formar el radical
coloreado ABTS•+ el cual es reducido nuevamente a un compuesto incoloro si la
muestra de interés contienen antioxidantes donadores de hidrógenos (Hernández-
Ledesma et al., 2007; Quirós 2007; Virtanen et al., 2007).
En vista de la dificultad que se presenta al momento de comparar resultados de los

diferentes estudios de capacidad antioxidante basados en diferentes metodologías
de determinación, Prior et al. (2005) propusieron utilizar una metodología
estandarizada para determinar la capacidad antioxidante y compuestos fenólicos en
los alimentos. La metodología propuesta consiste de la aplicación de por lo menos
dos ensayos: el ORAC, por el lado de los métodos HAT y el Folin-Ciocalteu, por el de
los ensayos ET. El método ORAC modificado por Ou et al. (2001) mide la inhibición
antioxidante de las reacciones de oxidación inducidas por radicales peróxido, es
decir, rompiendo la reacción en cadena de transferencia de átomos de hidrógeno
(Cao y Prior, 1998). Entre las ventajas del ORAC está el proveer una fuente
controlable de radicales libres, que se puede cambiar, junto con el solvente, según
se desee detectar antioxidantes hidrofílicos o hidrofóbicos; el mecanismo de reacción
es similar al de los oxidantes fisiológicos; y el uso de un pH fisiológico de forma tal
que los antioxidantes reaccionan con una carga y estado de protonación similar a
aquella en el cuerpo humano (Bisby et al., 2008). El método de Folin-Ciocalteu,
aunque no es muy específico, este protocolo da una buena idea del contenido total
de compuestos fenólicos (Tabart et al., 2009)
1.5. Identificación de la secuencia de aminoácidos en péptidos bioactivos
La actividad biológica de los péptidos hasta ahora tratados depende del orden o
secuencia de los aminoácidos que los conforman, de allí la importancia de conocer
dicha secuencia para poder dilucidar el mecanismo molecular por el cual un péptido
en particular ejerce su efecto IECA (Pan et al., 2012) o antioxidante. El procedimiento
de obtener, aislar e identificar péptidos con actividad biológica, incluyendo la IECA y
35
la antioxidante, en general, es muy similar entre los distintos trabajos revisados: en

primer lugar se trabaja con una solución de 1 a 20% de proteínas del suero, a la cual
se le adiciona una enzima específica y se incuba por un tiempo determinado para
obtener el grado de hidrólisis deseado. Luego se fracciona el hidrolizado por
cromatografía de exclusión (SEC) y/o por cromatografía líquida semi-preparativa en
fase inversa (RP-HPLC), seleccionándose la fracción con mayor actividad in vitro y
finalmente se identifica la secuencia de los péptidos responsable de dicha actividad
aplicando espectrometría de masas (LC-MS/MS) y/o secuenciación N-terminal
(Hernández-Ledesma et al., 2004; Otte et al., 2007a; Tsai et al., 2008). En la Figura 5
se muestra un ejemplo de la secuencia seguida en el procesamiento de los datos
obtenidos por esta rutina de trabajo para identificar la secuencia de los péptidos
bioactivos.
Ahora bien, los hidrolizados son mezclas complejas y pueden contener hasta cientos
de diferentes moléculas, por lo cual, localizar péptidos bioactivos en este tipo de
muestras ha sido comúnmente una tarea difícil y que requiere mucho tiempo y
dedicación. Las fracciones usualmente contienen aún múltiples compuestos que
requieren ciclos adicionales de fraccionamiento, concentración y evaluación de
bioactividad para lograr identificar la molécula responsable de dicha actividad (van
Elswijk et al., 2003).
La espectrometría de masas se convierte en una importante herramienta para la

identificación y caracterización de proteínas. A continuación se resume la revisión
presentada por Contreras et al. (2008): a principios de los 80’s, la aplicación de
nuevas técnicas de desorción en los mecanismos de ionización, permitieron la
formación de gases de iones de proteínas o grandes péptidos sin fragmentación, lo
cual fue utilizado para desarrollar técnicas como el FAB (“fast atom bombardment”).
Mediante la combinación de FAB con un analizador de masas (doble enfoque, 4-
sectores o triple quadrupole): FAB-MS/MS, se caracterizaron diversos péptidos
presentes en los extractos solubles de diversos quesos (cheddar, grana-padano,
36
Figura 5 – (A) Separación del producto de la digestión péptica de la S2-CN ovina

por cromatografía de intercambio iónico; (B y C) fraccionamiento por RP-HPLC
a escala semipreparativa de las fracciones C y D, respectivamente; (D) espectro
MS/MS del ión m/z 1119,3 derivado de la fracción D obtenido por acoplamiento
HPLC-ESI-IT-MS. La interpretación de la secuencia sobre la base de los iones
observados identificaron al péptido como fragmento 181-208 de la S2-CN ovina
(tomado de Contreras et al., 2008)
37
parmigiano-reggiano, comté y quesos de suero) y de productos comerciales de

lactosuero. En la actualidad, los métodos basados en FAB están siendo desplazados
por el empleo de interfaces de ionización a presión atmosférica como ESI (ionización
por “electrospray”). ESI ha sido utilizado en combinación con todos los analizadores
de masas comunes, siendo los mas empleados el triple-quadrupole y la trampa de
iones (IT). Mediante una interface se ha podido adaptar la etapa de cromatografía
con la de ionización-analizador de masas, de esta forma el análisis de fracciones
bioactivas por RP-HPLC-ESI-IT-MS/MS ha permitido conocer las secuencias de
numerosos péptidos con propiedades antihipertensivas, antioxidantes, opioides o
antimicrobianas. La otra técnica que se ha aplicado con éxito recientemente es la de
MALDI-TOF (“matrix-assisted laser desorption ionization – time of fly”), pero que por
manejar la muestra en una matriz sólida no puede ser acoplado a la interface
cromatográfica.
1.6. Desarrollo de alimentos funcionales
El desarrollo de nuevos productos es una actividad esencial en el crecimiento y

mantenimiento de la industria en general, y de la agroindustria en particular. Ésta
última debe ajustar el portafolio de productos a las cambiantes necesidades de sus
clientes para poder permanecer en un mercado muy competido. El desarrollo y
lanzamiento de nuevos productos, a criterio de Earle et al. (2001) involucra desde el
desarrollo del concepto hasta la formulación final del producto, pasando por
diferentes etapas en las cuales se evalúan prototipos, se diseñan especificaciones,
se mide la aceptabilidad del consumidor y se determina su factibilidad económica.
Esto constituye la etapa exploratoria del desarrollo, la cual continúa con la etapa
avanzada conformada por: análisis financiero, escalado de la formulación a nivel de
línea de producción, pruebas de mercado y comercialización. El desarrollo de
productos es el proceso secuencial de encontrar ideas para nuevos bienes y
servicios y convertirlos en productos comercialmente exitosos, es decir, que son
seguros, proveen beneficios para el consumidor y pueden ser manufacturados de
manera rentable por la empresa (Dalrymple y Parsons, 1990). La incorporación de
ingredientes funcionales en productos lácteos, como el yogurt y leches fermentadas,
38
se han convertido en la vía principal para introducir nuevos productos bajo una
creciente tendencia a enfocarse en beneficios específicos para la salud (Brockman y
Beeren, 2011).
El desarrollo de un nuevo producto funcional es un proceso costoso y laborioso; la

industria debe tomar en consideración muchas variables para desarrollar o aplicar
reingeniería a productos funcionales, tales como aceptación sensorial, estabilidad,
precio, propiedades químicas y funcionales, y conveniencia. Se necesitan una gran
variedad de técnicas para cubrir metas y expectativas en el área de alimentos
funcionales. El efecto funcional de un alimento o ingrediente alimenticio depende de
que el componente activo gane acceso al sitio o “blanco” funcional; sin embargo,
como la mayoría de los alimentos son mezcla complejas de componentes que
pueden atrapar el compuesto activo, modular su liberación o inhibir su actividad, se
hace necesaria la selección y desarrollo de la matriz apropiada para mantener la
forma molecular activa del compuesto funcional hasta el momento de su consumo y
transporte hasta el blanco fisiológico dentro del organismo (Betoret et al., 2011)
En general, el término de alimento funcional se refire a un alimento que ha sido

modificado de alguna forma para hacerlo “funcional”. La funcionalidad de los
productos lácteos se incrementa con la incorporación de péptidos bioactivos o la
liberación de estos por la proteólisis de sus proteínas en los productos fermentados
(Shah, 2007). Con respecto a los estos últimos, la producción de péptidos bioactivos
con actividades multifuncionales, en el mismo alimento, es una meta atractiva puesto
que esto confiere un efecto saludable positivo adicional a productos lácteos que ya
tienen una imagen de “saludable” y que tienen una larga historia de producción
segura e inocua (Michaelidou, 2008).
La fabricación de ingredientes funcionales con péptidos bioactivos tiene el potencial

de poder ser usados en la formulación de alimentos funcionales, cosméticos y como
potentes drogas con efectos farmacológicos bien definidos. Con el aumento en el
número de cuestionamientos realizados por parte de los consumidores sobre los
39
efectos negativos de los conservantes químicos y el aumento en la preferencia por

los compuestos naturales, las sustancias bioactivas derivadas de la leche pueden
tener una aplicación importante en la conservación de alimentos y como nutracéutico
(Haque y Chand, 2006). Estos alimentos funcionales que contienen péptidos
bioactivos, se pueden desarrollar mejorando la bio-disponibilidad de los mismos en
productos lácteos existentes o “creando” nuevos a través de la adición o fortificación
de fracciones aisladas de estos péptidos (Korhonen y Pihlanto, 2006; Hartmann y
Meisel, 2007). Sobre la base de esto, se puede considerar al suero de leche con
péptidos bioactivos como un ingrediente funcional.
El reto tecnológico de llevar al consumidor un producto funcional basado en péptidos

bioactivos se soporta, según la revisión realizada por López-Expósito y Recio (2006),
en: a) la elaboración de un producto lácteo fermentado con una elevada
concentración de ciertos péptidos bioactivos, o sus precursores, a partir de los cuales
serían liberados durante la digestión en el tracto gastrointestinal; y b) la producción
de hidrolizados de proteínas lácteas con un elevada concentración de péptidos de
bioactividad específica, y con una funcionalidad que los hace convenientes como
ingredientes en otros alimentos, incluyendo otros productos lácteos. El primero se
logra mediante la fermentación de un producto lácteo con una cepa de Bacterias
Ácido Lácticas (BAL) altamente proteolítica. En este grupo, el Lactobacillus
helveticus ha sido el microorganismo fermentativo de preferencia empleado en la
búsqueda de un producto efectivo inhibidor de la enzima ECA. Este proceso de
fermentación debe ser seguido por una concentración de los péptidos producidos, lo
cual se ha logrado mediante ultrafiltración con membranas de puntos de corte de 3 o
5 kDa, así como también mediante cromatografía de fase reversa HPLC. Según esos
mismos autores, los dos productos comerciales producidos de esta forma y que han
sido más ampliamente evaluados son Calpis en Japón y Evolus en Finlandia. Ambos
son productos de leche fermentada, inoculada con una cultivo que contiene L.
helveticus. En el caso de Calpis, adicionalmente se le incorpora una cepa de S.
cerevisiae. Evolus se comercializa como de doble efecto, ya que, por una parte
ayuda a reducir el colesterol, por la acción de un fitoesterol añadido, y por otra,
40
reduce la presión arterial, gracias a los tripéptidos IPP y VPP derivados de la

proteólisis de las proteínas de la leche (Korhonen y Pihlanto, 2006; Shah, 2007).
En el país, el producto lácteo fermentado de mayor producción y consumo es el

yogurt, el cual mantiene una tendencia al crecimiento en un mercado que produce 40
millones de kilos y mueve 1,8 millones BsF. Sin embargo, el consumo per cápita de
1,7 Kg/año es bajo si se compara con otras naciones, como Colombia, Estados
Unidos y Europa con 4, 8 y 10 Kg/año, respectivamente. El mercado de yogurt en
Venezuela está dividido en tres categoría principales: yogurt firme 25%, yogurt
líquido 60% y yogurt con cereal 15% (Anónimo, 2006).
La norma COVENIN 2393:2001 define al yogurt como el “producto coagulado

obtenido por fermentación láctica de la leche o mezcla de ésta con derivados lácteos,
mediante la acción de las bacterias lácticas Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus
y Streptococcus salivarius subsp thermophylus, pudiendo estar acompañadas de
otras bacterias ácido lácticas que por su actividad le confieren las características al
producto terminado; estas bacterias deben ser viables y activas desde su inicio y
durante toda la vida útil del producto. Puede ser adicionado o no de los ingredientes
y aditivos indicados en esta norma.”
El yogurt comercializado a nivel nacional se elabora totalmente con leche de vaca.

Sin embargo, si se aprovechan las propiedades nutricionales y terapeuticas que
posee la leche cabra, se pueden introducir al mercado productos atractivos para
muchos consumidores con necesidades especiales o intolerantes a la leche de vaca.
En este sentido, la principal aplicación de la leche de cabra es su consumo
terapeutico por personas con alergias alimentarias a las proteínas de la leche de
vacas; Haenlein (2004) reseñó diversos estudios donde, por una parte, reportaron la
incidencia de este tipo de alergia, con una prevalencia de 2,5% en niños menores de
3 años, pero que alcanzó hasta un 20% en algunas zonas; y por otra parte,
reportaron que hasta 40% de estos problemas de alergias se resolvieron con el
tratamiento de leche de cabra.
41
La otra ventaja del consumo de leche de cabra es a nivel nutricional. Como lo

señalaron Vargas et al. (2008) la principal diferencia entre la leche de ambas
especies se relaciona con: a) diferentes proporciones de los diferentes tipos de
caseínas, la de cabra es mas pobre o carece totalmente de s1-caseína; b) en la
estructura, las micelas de caseína caprina tienen mayor tasa de dispersión, mayor
mineralización y un nivel mas bajo de hidratación; y c) tamaños de los glóbulos de
grasa y las micelas de proteínas, la leche de cabra se le llama “naturalmente
homogeneizada” debido a la predominancia de glóbulos de grasa de pequeño
tamaño, esto le confiere una mayor digestibilidad.
En el Pais hay mucha aceptacion por los yogures saborizados con frutas, pero no
existe ninguna marca comercial o artesanal que incluya como ingrediente al tomate
de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur
América se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,
eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,
afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre
intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis
químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -
caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y
Moreno-Alvarez, 2000). También posee contenidos altos de potasio, magnesio,
fósforo, así como pectinas y flavonoides. Estos últimos comprenden los flavonoles,
antocianidoles y flavonas (todos presentes en el tomate de árbol), los cuales son
colorantes naturales con acción antioxidante que constituyen el grupo más
importante de la familia de polifenoles; estos compuestos protegen el sistema
cardiovascular y activan las enzimas glutation peroxidasa y catalasa, antioxidantes
presentes en nuestro organismo (Robles-Sánchez et al., 2007).
42
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo se dividió en cinco etapas: en primer lugar se desarrolló un

ingrediente funcional con actividad IECA, obtenido de la hidrólisis aplicada bajo
condiciones determinadas experimentalmente. En segundo lugar, se desarrolló un
yogurt natural funcional, incorporando el hidrolizado bioactivo. Tercero, se desarrolló
un yogurt saborizado funcional, incorporando una mermelada de tomate de árbol (C.
betacea Sendt) para aumentar capacidad antioxidante. Cuarto, se determinó la vida
útil de ambos productos funcionales. Y por último, se realizó estudio clínico para
confirmar “funcionalidad” del yogurt natural con el hidrolizado bioactivo.
2.1. Desarrollo del ingrediente funcional
Como criterio de formulación se estableció que el hidrolizado funcional debería tener

una consistencia ligeramente espesa para que pueda ser incorporado al yogurt
natural, y contener una dosis “adecuada” de péptidos con actividad IECA. Sin
embargo, como ya se reseñó, los meta-análisis realizados por Pripp (2008) y Xu et
al. (2008) señalaron no poder establecer una dosis recomendada para el consumo
de estos péptidos a partir de todos estudios analizados, ya que se requieren mas
estudios epidemiológicos basados tanto en poblaciones normales como hipertensas
para poder determinar la cantidad apropiada de péptidos lácteos para humanos. Por
tanto, se procedió a obtener un hidrolizado con la mayor actividad IECA posible,
seleccionado a partir de un análisis factorial 2 3 con las siguientes variables: especie
lechera (vaca vs cabra), método de concentración (ultrafiltración vs
termocoagulación) y tipo de hidrólisis (enzimática vs fermentación ácido-láctica
asistida por enzima).
43
2.1.1. Procesamiento de la leche y obtención del lactosuero
El primer paso en el presente trabajo fue seleccionar la fuente de la proteína sérica

entre las dos opciones disponibles: vacuna y caprina. Para su obtención se
realizaron seis (06) procesos de fabricación de queso blanco pasteurizado: tres (03)
con leche de vaca y tres (03) con leche de cabra. Los primeros se obtuvieron de un
rebaño Holstein puro, ubicado en la Estación Experimental Santa María, Cagua,
Edo. Aragua. Los de leche de cabra, de un rebaño de cabras mestizas Canarias 3/4
y 5/8, pertenecientes a la Unidad Experimental de Producción Caprina (UNEXCA)
Maracay, Edo. Aragua. Ambos rebaños pertenecientes a la Facultad de Ciencias
Veterinarias de la UCV, y manejados bajo régimen de estabulación. Los lotes de
leche fueron recolectados y procesados en diferentes momentos del año, los dos
primero lotes de cada rebaño se tomaron dentro de la época de sequía (diciembre-
mayo), mientras que el tercero fue en la época de lluvias (junio-noviembre). El
procesamiento de los seis lotes de leche se llevó a cabo en las instalaciones de la
Planta piloto de la FCV UCV, núcleo Maracay, Edo. Aragua, utilizando dos tanques
doble camisa de acero inoxidable, cada uno de 200 L de capacidad, según
flujograma presentado en la Figura 6.
Con la leche de vaca se elaboraron quesos blancos pasteurizados, mientras que la

de cabra se destinó a quesos para madurar. En la elaboración de ambos tipos de
quesos se siguieron los mismos pasos básicos: recepción y toma de muestra de la
leche para su caracterización; filtrado; pasteurización; adición de fermento láctico
(Choozit MM100 LYO, Danlac Canada Inc., Alberta, Canada) y cuajo (Marschall
M2.5/100, Danisco, Bogotá, Colombia) en una proporción de 3,5 g y 2,5 g por cada
100 L de leche, respectivamente; reposo por 40 minutos para permitir coagulación;
cortado y separación de la cuajada; recolección del lactosuero. De cada proceso se
tomaron cerca de 4 L de lactosuero, además de las muestras para su
caracterización. Luego del descremado y filtrado, cada lote de lactosuero se dividió
en tres porciones iguales.
44
Leche de vaca o cabra
Muestras para Análisis

Físico y químico
Filtrar, pasteurizar, agregar cuajo y

fermento láctico (BAL), reposo 40 min.
Cuajada Corte y separación

de la cuajada
Muestras para Análisis

Suero completo Físicos y Químicos
Descremar y filtrar Muestras para Análisis

Físicos y Químicos
PORCIÓN I: PORCIÓN II: PORCIÓN III:

Selección de Concentrado por Concentrado por
condiciones de ultrafiltración. termo-coagulación.
Hidrólisis (pH, T,
E/S, t) con
proteasa de A. HIDRÓLISIS HIDRÓLISIS
oryzae
EXTRACTO <3kDa EXTRACTO <3kDa

Obtención de
patrón de
Medir actividad Medir actividad
proteínas por
biológica e biológica e
electroforesis SDS-
identificar péptidos identificar péptidos
PAGE
Figura 6 – Procesamiento de los lotes de leche para obtener lactosuero, y sus

subsecuentes tratamientos para seleccionar las condiciones de hidrólisis
óptimas.
45
2.1.2. Caracterización física y química de las muestras de leche y suero
A cada lote de leche y suero se le determinó su densidad (Fondonorma, 1997f) y

contenidos de proteínas (Fondonorma, 1997d), grasas (Fondonorma, 1997b),
cenizas (Fondonorma, 1997a), carbohidratos (por diferencia), humedad y sólidos
totales (Fondonorma, 1997c).
2.1.3. Descremado
Para eliminar la interferencia de la grasa láctea en los análisis posteriores y eliminar

las partículas de cuajada remanente, los lotes de lactosuero se centrifugaron a 20000
g por 30 minutos a 4°C en una centrífuga RC-5 SuperSpeed Refrigerated Centrifuge
(Sorvall Dupont Instruments, EEUU). Luego de lo cual se retiró con cuidado la capa
superior de grasa cristalizada y se filtró el sobrenadante a través de gaza.
Los lactosueros procesados de esta forma fueron luego caracterizados según se

describió en el punto anterior. Los lactosuero descremados se separaron en las tres
porciones señaladas en la Figura 6.
2.1.4. Electroforesis
Para comparar el patrón de distribución de las proteínas de ambos tipos de

lactosuero, caprino y ovino, se aplicó a una alícuota de la Porción I, de cada lote de
suero, una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) según el método de
Laemmli (1970) con un gel de separación al 15% y un gel de apilamiento al 3%, bajo
condiciones reductoras, es decir, en presencia de 2-mercaptoetanol y úrea.
Materiales: 1) solución madre de 30% p/v Acrilamida (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
EEUU); 2) solución buffer 1,5M Tris (pH 8,8) 27,23 g de Tris-base y agua destilada
c.s.p. 150 mL, ajustando pH a 8,8 con HCl; 3) solución buffer 1,0M Tris (pH 6,8)
12,0 g Tris-base y agua destilada c.s.p. 100 mL, ajustando pH a 6,8 con HCl;
46
4)solución 0,125M TrisHCl (pH 6,8) 1,5g Tris-base y agua destilada c.s.p.
100mL,ajustando pH a 6,8 con HCl;5)solución 10% SDS; 6) solución 10% persulfato
de amonio (APS); 7) Tetramethylethylenediamine (TEMED); 8) Úrea; 9) Glicerol; 10)
-Mercaptoetanol; 11) solución buffer de corrida 0,25M (electrodos) 3,03 g de Tris-
base, 18,77 g Glicina y 10 mL solución 0,1 % SDS; 12) solución buffer de carga,
4% SDS, 20% glicerol, 10% -mercaptoetanol, 0,625 mL solución 0,125 TrisHCl (pH
6,8), 0,002 azul de bromofenol; 13) gel de separación (15%): 16 mL solución madre
acrilamida 30%, 7,5 mL buffer de separación, 6M úrea, 10% SDS,10% APS, 0,012
mL TEMED; 14) gel de apilamiento (3%): 0,4 mL solución madre acrilamida 30%,
0,52 mL buffer de apilamiento, 0,04 mL 10% SDS, 0,04 mL 10% APS, 0,004 mL
TEMED, agua c.s.p. 4 mL; 15) solución de tinción: 100 mL sol. 0,1% Coomassie
Blue, 67,5 mL ácido acético, 360 mL metanol, 472,5 mL agua; 16) solución de
decoloración: 75 mL ácido acético, 50 mL metanol, 875 mL agua; 17) patrón de peso
molecular (BlueRanger prestained protein molecular weight marker mix, de Pierce,
Rockford, EEUU: miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k, ovoalbúmina 60k,
anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima 18,3k). Equipos: 1)
Equipo de electroforesis vertical (V20-EB-GRM de GIBCO BRL, Life Technologies,
Gaithersburg, EEUU); 2) Fuente de Poder; 3) Micropipetas de 1000 L, 100 L y 20
L. Procedimiento: 1) se prepararon 30 mL del gel de separación, vertiéndose
inmediatamente en el molde; una vez polimerizado, se prepararon 4 mL del gel de
apilamiento y se vertieron sobre el gel de separación, colocándose el peine para
formar los pozos para las muestras; 2) se mezclaron 15 L de cada muestra con 10
L del buffer de carga, en un tubo eppendorf de 1,5 mL, se incubaron a 37°C por 15
minutos; 3) una vez polimerizados ambos geles, aproximadamente 45 minutos, se
retiró el peine, se llevó el conjunto ensamblado con el gel al soporte del equipo; 4) se
vertió el buffer de corrida en las cavidades de los electrodos, asegurándose de cubrir
los pozos de descarga de muestra; 5) se cargaron 20L de cada mezcla de muestra
en los pozos, el marcador de peso molecular se cargó en el primer pozo; 6) se
ensambló el equipo y se conectó, dentro de una cava refrigeradora a 2°C, a la fuente
de poder; 7) se aplicaron las siguientes condiciones de corrida: 30 V constantes
hasta que la línea de corrida alcanzó el borde inicial del gel de separación, a partir de
47
allí se aumentó el voltaje a 90V hasta el final de la corrida (6,5 horas); 8)

posteriormente, se retiró el gel del molde y se colocó en bandeja rectangular para
cubrirlo con la solución de tinción, dejándose en reposo toda la noche; 9) al día
siguiente, se eliminó la solución de tinción, se enjuagó el gel con agua, y se colocó
nuevamente en la bandeja, cubriendo el gel con la solución de decoloración por seis
horas. Para estimar el peso molecular de las bandas en las muestras se procede en
primer lugar a graficar el logaritmo del peso molecular de los marcadores vs la
distancia de migración relativa correspondiente a cada marcador en el gel. Luego se
mide la migración de la banda problema y se traslada a la curva de los patrones y se
obtiene el peso molecular al cual corresponde esa distancia.
2.1.5. Concentración de proteínas del lactosuero
Debido al bajo contenido de proteínas del lactosuero, es necesario concentrarlo para

que su procesamiento sea mas eficiente y de mayor rendimiento. Con las porciones II
y III de cada lactosuero (Figura 3), para ambos tipos de leche (bovina y caprina), se
evaluaron dos procesos para concentrar las proteínas: ultrafiltración y
termocoagulación.
2.1.5.1. Ultrafiltración del lactosuero
La porción II se concentró por ultrafiltración empleando equipo DDS Lab. Módulo 20-
0,36-LAB marca RANNIE, ubicado en el Instituto de Química de FAGRO UCV,
Maracay. Este equipo consta de dos secciones principales: la columna donde se
ensamblan las membranas (Figura 7b) y el motor compresor (Figura 7a). El módulo
de membranas ensamblado en la columna consiste de 20 marcos separadores
(Figura 7c), 10 soportes de membrana con salida para permeado (Figura 7d), 20
láminas de papel filtro (Figura 7e) y 20 membranas semipermeables de acetato de
celulosa tipo 600 cm con área efectiva de 0,36 m2 (Figura 7f). Las condiciones de
trabajo aplicadas fueron las señaladas por Giardina (1995): a) caudal de 8
litros/minuto; b) rango de presión de entrada de 10 a 15 atm; c) rango de presión de
salida de 15 a 20 atm; d) presión hidráulica como contrapresión de 20 Ton. Se
48
descartó el permeado y el retenido se almacenó a -20°C hasta el momento de su

procesamiento.
a b
c d e f
Figura 7 – a) Motor compresor del equipo de ultrafiltración DDS; b) Columna de

equipo de ultrafiltración DDS ensamblado con 12 membranas; c) Marco
separador de membranas; d) Soporte de membrana con salida para permeado;
e) Lámina de papel de filtro; f) Membrana semipermeable de acetato de
celulosa.
2.1.5.2. Termocoagulación del lactosuero
La porción III de cada lactosuero se concentró por termocoagulación, separación de

las proteínas del suero por tratamiento termo-ácido, siguiendo el procedimiento
descrito por Ramírez y Rivas (2003), con ciertas modificaciones. En primer lugar, se
determinó el pH inicial del lactosuero, si éste resultó menor a 6,3 se procedió a
ajustarlo dentro del rango 6,3 a 6,5 con una solución de NaOH 2,6M.
Seguidamente se inició el calentamiento a una tasa de aproximadamente

1,7°C/minuto con agitación continua hasta llegar a los 85°C hasta flocular las
49
proteínas, en ese punto se añadió ácido acético hasta reducir pH hasta 4,6; se
mantuvo la agitación y el calentamiento por 20 minutos. Se colocó en baño de maría
invertido hasta alcanzar una temperatura entre 40 y 45°C, y luego de lo cual se filtró
a través de papel de filtro (Whatman N°1). La proteína retenida en el papel de filtro se
pesó, se empacó en envase hermético y se almacenó a -20° C. El escalado de este
procedimiento, a nivel de planta semi-industrial, se describe mas adelante en una
sección posterior.
2.1.6. Hidrólisis del lactosuero
Para “liberar” los péptidos bioactivos que pudiesen estar contenidos en algunas de
las secuencias de aminoácidos contenidos en las proteínas del lactosuero es
necesario aplicar una hidrólisis enzimática. Ésta hidrólisis debe ser parcial, puesto
que se desean obtener péptidos entre 3 y 20 residuos de aminoácidos, por lo cual se
hace necesario, en primer lugar, determinar las condiciones de temperatura, pH,
relación enzima/sustrato y tiempo de incubación, para obtener un grado de hidrólisis
entre 10 y 20%, para luego hidrolizar los concentrados de lactosuero obtenidos en la
sección anterior.
2.1.6.1. Condiciones óptimas para hidrólisis enzimática
Las condiciones de la hidrólisis se determinaron empleando la metodología de

superficie de respuesta con diseño central compuesto 2 4: 16 corridas centrales, 8
corridas axiales y 7 corridas de punto central, con dos réplicas de cada uno (ver
anexo 1) para un total de 93 experimentos. En la Tabla 4 se muestran los niveles de
los cuatro factores seleccionados (pH, Temperatura, relación Enzima/Sustrato y
tiempo) para la hidrólisis con la proteasa obtenida de A. oryzae en una concentración
de 500 U/mL (Sigma–Aldrich Chemical Co., EEUU).
50
Tabla 4 – valores de los niveles de los factores seleccionados en el diseño

central compuesto 24
Factor -a -1 0 1 A
(A) pH 5 6 7 8 9
(B) T °C 26 34 42 50 58
(C) E/S % p/p 1 2 3 4 5
(D) t minutos 30 60 90 120 150
La variable dependiente fue el grado de hidrólisis (GH) calculado según la técnica de

titulación con formol descrita por Taylor (1957) a partir del volumen de NaOH añadido
para liberar el formol enlazado a los enlaces péptidicos libres producto de la hidrólisis
enzimática:
GH = [VB NB (1/Mp) (1/ (1/htot)] 100
donde, GH: grado de hidrólisis (%)
VB: volumen de la base muestra – volumen de base del blanco (mL)
NB: normalidad de la base
Mp: masa de proteína (g)
1/: tasa promedio de disociación de los grupos -NH2 (que se calcula

por el cociente (10(pH-pK))/(1+10(pH-pK)). Este valor es dependiente de
la temperatura, por lo que para cada corrida se tomaron los valores
señalados por Prieto-Velasco (2007): 1,16 para 26°C; 1,13 para
34°C; 1,06 para 40°C; 1,04 para 50°C; y 1,03 para 58°C.
htot: número total de enlaces peptídicos en la proteína sustrato (para las

proteínas del suero Adler-Nissen (1982) recomienda utilizar un valor
de 8,8 meqv./g de proteína, sobre la base de su composición de
aminoácidos)
Para cada corrida se estabilizó la temperatura del baño de María a la temperatura

correspondiente, una hora antes de iniciar el ensayo. Paralelamente, se vertieron 100
mL del lactosuero en un beaker de 250 mL, introduciendo en él una barra magnética.
Se colocó sobre el agitador magnético y se le midió el pH original al suero, para
luego ajustarlo al pH de la corrida con NaOH o HCl, según fuese el caso. Se tapó el
beaker con papel de aluminio y se colocó en el baño de María. Una vez alcanzada la
51
temperatura especificada, se sacó el envase del baño de María y se colocó

nuevamente sobre la plancha de agitación y se añadió la enzima en la proporción de
3% del contenido de proteína del lactosuero, una vez mezclado bien, se retornó el
beaker tapado al baño de María, y se mantuvo en incubación el tiempo especificado
para la corrida. Cada media hora, hasta el final de cada corrida, se tomó una alícuota
de 5 mL para determinar el GH mediante la titulación con formol: se colocó en una
cápsula de cerámica, se mezclaron con 3 gotas de fenolftaleína y se ajustó el pH a
8,5 (punto final de la titulación) con una solución 0,1N de NaOH. Seguidamente se
añadieron 4 mL de solución de formol al 35% previamente neutralizado a un pH de
8,5. Esta mezcla se incubó por un minuto a temperatura ambiente y luego se tituló
nuevamente, registrándose el volumen de NaOH empleado en esta segunda
titulación, para calcular el GH según la fórmula arriba descrita. Para cada corrida se
titula un blanco: 5 mL del lactosuero (sin enzima ni cepa BAL) se procesa de igual
manera que las muestras, y el volumen de NaOH de la segunda titulación se utiliza
en la fórmula como el volumen de base del blanco.
2.1.6.2. Hidrólisis de los lactosueros concentrados
Una vez definidas las condiciones de pH, temperatura, relación enzima/sustrato y

tiempo, para obtener una hidrólisis parcial moderada (10-20%) de las proteínas del
lactosuero, se procedió a hidrolizar los lactosueros concentrados. Para esto se aplicó
un diseño factorial 23, es decir, se toman en consideración tres factores con dos
niveles cada uno (Tabla 5): origen del lactosuero (bovino o caprino), cómo fue
concentrado (ultrafiltración o termocoagulación) y tipo de hidrólisis (solo enzimática o
combinación enzima-cepa ácido-láctica). Para las muestras tratadas por la
combinación enzima-cepa ácido-láctica (BAL), se utilizó una mezcla de cultivos
termófilos de L. helveticus y St. Salivarius var thermophilus (FD-DVS-TCC-20 de Chr
Hansen, Biotécnica Catalina, Venezuela), en una proporción de 0,02%. La
determinación del GH se realizó mediante la titulación con formol descrito
anteriormente. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado.
52
Tabla 5 – Identificación de los Tratamiento de acuerdo a las variables: origen,

proceso de concentración y tipo de hidrólisis.
LACTOSUERO BOVINO LACTOSUERO CAPRINO

Ultrafiltración Termocoagulación Ultrafiltración Termocoagulación
Enzima Tratamiento 8 Tratamiento 5 Tratamiento 7 Tratamiento 6
Enzima
+ BAL Tratamiento 2 Tratamiento 4 Tratamiento 3 Tratamiento 1
2.1.6.3. Extracto soluble menor a 3 kDa de cada hidrolizado
Puesto que el producto deseado de la hidrólisis parcial moderada, lo constituyeron

péptidos conformados por 3 a 20 aminoácidos, con peso molecular menor a los 3
kDa, fue necesario separarlos del resto de los componentes proteicos del lactosuero,
para luego poder concentrarlos y poder determinar adecuadamente su actividad
biológica. Para esto, cada uno de los ocho hidrolizados obtenidos en el paso anterior
se ultrafiltró a través de una membrana de celulosa regenerada de 3000 Da de
tamaño de poro y 4,5x10-3 m2 de área efectiva (Millipore Corporation, Bedford, MA,
USA), instalada en equipo de ultrafiltración con agitación (modelo 8400, Millipore).
Luego, cada permeado fue deshidratado por liofilización en un equipo Labconco
LIPH-LOCK 6 (LABCONCO Corp., Kansas City, EEUU) y se almacenó a -20°C, hasta
su posterior procesamiento. El contenido de péptidos se estimó mediante el
procedimiento para determinar proteínas por Kjeldahl, descrito anteriormente.
Para evaluar la presencia de péptidos en los extractos se realizó corrida preliminar en

un espectrómetro de masas prOTOF® 2000 MALDI O-TOF (PerkinElmerSciex,
Conneticut, EE.UU.) ubicado en los laboratorios de la Fundación IDEA. Esta técnica
detecta los péptidos basado en sus relación masa/carga (m/z), generando una
“huella digital” que puede ser única para una proteína o péptido dado. Las muestras
de cada extracto soluble fueron cargadas en una placa MALDI (“matrix-assisted laser
desorption ionization”) usando 1 L de la muestra mezclada en una proporción 1:1
con una solución matriz (solución saturada de ácido -ciano-4-hidroxicinnamico en
53
0,1% ácido trifluoroacético-acetonitrilo). El procesamiento de los datos obtenidos y la

generación de la lista de “picos” se realizó mediante el programa TOFworks 1.0
(PerkinElmer Science). Los valores de la relación m/z de los picos mas intensos se
cargaron en el motor de búsqueda de la base de datos SwissProt para identificar la
secuencia de los péptidos correspondientes.
2.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados
A cada uno de los extractos solubles menores de 3 kDa se les determinó la actividad
inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) y la capacidad
antioxidante determinada por el método ORAC. Posteriormente se seleccionó al
hidrolizado con mayor actividad biológica.
2.1.7.1. Actividad inhibidora de la enzima ECA (IECA)
Para determinar la actividad IECA, se siguió el protocolo descrito por Sentandreu y

Toldrá (2006) debido a que tiene un número de ventajas en comparación con el
método de Cushman y Cheung (1971), tales como, involucrar una reacción de una
sola etapa, que no requiere extracción con solventes orgánicos o separaciones
cromatográficas, la detección de la fluorescencia de los productos de reacción resulta
en una alta sensibilidad y precisión, y se pueden procesar un mayor número de
muestras en menor tiempo. Reactivos: a) o-aminobenzoylglycyl-p-nitro-L-
phenylalanyl-L-proline (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) (cat. no. M-1100, de
Bachem,EE.UU.); b) Enzima convertidora de la angiotensina (ECA) de pulmón de
conejo (cat. no. A-6778, de Sigma, EE.UU.); c) cloruro de zinc; y d) cloruro de sodio.
Soluciones de trabajo: enzima ECA stock (se diluyó la enzima ECA de pulmón de
conejo en glicerol 50% en buffer 300 mM Tris pH 8,2 y 2 M ZnCl2 para hacer una
concentración aproximada de 150 g/mL, se dividió en porciones de 200 L en tubos
eppendorf, para facilitar su manipulación y conservación); buffer A (se pesaron 11,82
g de Tris-base HCl en agua destilada desionizada hasta un volumen de 500 mL,
ajustándose el pH a 8,3 con NaOH); buffer B (se diluyeron 8,22 g de NaCl en buffer A
54
hasta un volumen de 150 mL); solución base de ZnCl 2 (13,6 mg en 1 mL agua);

solución 20M de ZnCl2 (diluir 20 L de la solución base en 100 mL de agua); buffer
C (diluir 50 L de la solución 20M de ZnCl2 en 10 mL de buffer A); solución sustrato
(diluir 5,4 mg de Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro en 25 mL de buffer B); solución trabajo ECA
(diluir 1 volumen de enzima stock en 24 volúmenes de buffer C); cinco diluciones de
cada muestra a analizar (1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024). Procedimiento: En la
Tabla 6 se muestra cómo se distribuyeron los distintos componentes en la placa
multipocillos. La microplaca se llevó a un fluorómetro FLUOstar OPTIMA (BMG
Labtechnologies GmbH, Offengurg, Alemania), con filtros de 350 nm excitación y 420
nm emisión. Una vez completada la medición, se tomaron los valores
correspondientes a los 30 minutos. En una hoja de Excel, se calculó el IC 50 a partir
de la curva de regresión obtenida al graficar la fluorescencia de cada concentración
de la muestra.
Tabla 6 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de la reacción en

el ensayo para determinar la actividad de inhibición de la enzima ECA.
Se adiciona
Estos se añaden primero y se
luego de la
incuba a 37°C por 10 minutos
incubación
Tris Sol.
agua Muestra Sol. Sustrato
ZnCl2 ECA
Control 40 0 40 0 160
Blanco 40 40 0 0 160
Blanco
0 40 0 40 160
muestra
Muestra 0 0 40 40 160
2.1.7.2. Capacidad antioxidante ORACFL
Para determinar la capacidad antioxidante se seleccionó el método ORACFL, según el

procedimiento de Ou et al. (2001) modificado por Dávalos et al. (2004) quienes
demostraron la aplicabilidad de éste método en la evaluación de la actividad
antioxidante de diversas muestras de alimentos, resaltando su simplicidad y
55
sensibilidad. Reactivos: a) Trolox®, ácido 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametmetilcroman-2-

carboxílico (Sigma–Adrich, Steinheim, Germany); b) fluoresceina (Sigma–Adrich,
Steinheim, Germany); c) AAPH, 2,2’-Azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro
(Sigma–Adrich, Steinheim, Germany). Procedimiento: La reacción se llevó a cabo
en 75 mM bufer fosfato pH 7,4 (PBS) y el volumen de reacción final fue de 200 L.
Se preparó un blanco usando bufer fosfato en lugar del antioxidante y se prepararon
ocho soluciones de Trolox® (0,2-1,6 nmoles, contenido final en mezcla de reacción).
Comunmente el Trolox®, un análogo de la vitamina E soluble en agua, es empleado
como estándar de calibración, debido a su capacidad de “secuestrar” radicales libres.
Las diluciones de los hidrolizados (20 L) y la fluoresceina (FL; 120L de 70 nM de
concentración final) fueron colocadas en los pozos de una microplaca negra de 96
pozos fondo plano y luego preincubadas por 10 minutos a 40°C. Luego, rápidamente
con una pipeta multicanal se dosificaron, en cada pozo, 60 L de una solución 12
mM, de concentración final, de AAPH, el cual es empleado como el generador de
radicales libres. Todas las mezclas de los estándares, blanco y control se colocaron
en la microplaca por duplicado, y las muestras por triplicado. En la Tabla 7 se
resume la distribución de los componentes de la reacción en cada pozo.
Tabla 7 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de reacción en

cada pozo del ensayo por fluorescencia de la actividad ORAC.
Se
Estos se añadieron primero y se
adiciona
incubaron a 40°C por 10 minutos
luego de la
incubación
PBS Trolox® Sol. FL Muestra Sol. AAPH
Control 80 0 120 0 0
Blanco 20 0 120 0 60
Trolox® (cada
0 20 120 0 60
patrón)
Muestra 0 0 120 20 60
Inmediatamente, la microplaca se llevó a un fluorímetro FLUOstar OPTIMA (BMG

Labtechnologies GmbH, Offengurg, Alemania) con filtros de 485 nm excitación y 520
56
nm emisión. La temperatura se mantuvo controlada a 40°C y la fluorescencia se

registró durante 137 minutos (104 ciclos), con 10 segundos de agitación antes de
cada lectura por ciclo, según lo recomendado por Contreras et al. (2011). Los datos
brutos fueron exportados del equipo a una página de Excel para los cálculos
posteriores. Se calcularon las áreas bajo la curva (AUC) para cada muestra de
hidrolizado y cada estándar de Trolox®; luego se normalizaron esos valores
restándoles el AUC promedio de los blancos. Con los AUC netos de los estándares
de Trolox® se construyó una curva de calibración, a partir de la cual se obtuvo la
pendiente de la ecuación lineal de regresión; de igual forma, se construyó gráfica
para el AUC de cada muestra vs su contenido en proteínas en la mezcla de reacción.
Los valores ORACFL para cada muestra se calcularon dividiendo la pendiente de la
muestra entre la pendiente del Trolox®. Los resultados finales se expresaron como
moles de Trolox®/ mg de sólidos solubles.
2.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS
El hidrolizado con mayor actividad biológica fue analizado mediante espectrometría

de masas para tratar de identificar secuencias de aminoácidos que pudiesen ser
responsables de dicha actividad. Unos 300 L de la muestra se dispensaron en un
vial y se colocó en el carril del inyector automático de un equipo HPLC Agilent 1100
(Agilen Tech., EEUU) conectado en serie con un MS Esquire 3000 quadrupole-ion
trap (Bruker Daltonik, Alemania) con una column RP C18 (250x4,6 mm, 5m de
tamaño de partícula; Bio-Rad, Richmond, CA, USA).
En el orden de inyección se incluyó un blanco (fase A 100%) al principio y al final del

proceso. El volumen inyectado fue de 100 L y el flujo se ajustó a 0,2 mL/min. La
composición de las fases para la elución de la columna, fue la siguiente: A (100%
agua – 0,037% TFA) y B (100% acetonitrilo – 0,027% TFA); aplicándose el gradiente
de elución descrito en la Tabla 8. Los datos registrados se analizaron mediante el
software: Esquire 5.0 build 169, Biotools 2.1 y SequenceEditor 2.1 (Bruker Daltonik,
Alemania).
57
Tabla 8 – Gradiente de elución empleado en la corrida HPLC-MS-MS.

TIEMPO FASES
(minutos) A B
0–5 100 0
65 60 40
70 30 70
80 30 70
85 100 0
95 100 0
Los resultados obtenidos de este experimento sirvieron para decidir con cual tipo de
lactosuero se realizarían las siguientes etapas de este trabajo.
2.1.9. Producción el ingrediente funcional a nivel de Planta Piloto (Escalado)
Sobre la base de los resultados del análisis factorial 23, se procedió a seleccionar el
hidrolizado funcional para ser elaborado a mayor escala a nivel de planta piloto, de
forma de contar con suficiente producto para las otras etapas de este trabajo.
2.1.9.1. Concentración por termocoagulación
El procedimiento aplicado a nivel de laboratorio para la desnaturalización de las

proteínas del lactosuero con aplicación de calor, utiliza el ajuste del pH mediante
aplicación de ácidos y álcalis, lo cual representa un paso que a nivel artesanal es,
por una parte, difícil de controlar en el sentido de que sea constante en todos los
lotes a producir y, por otra, puede constituir un riesgo potencial para el personal que
lo maneja. Por esta razón, para llevar el proceso de termocoagulación a nivel de
planta piloto, se siguió el procedimiento para la “producción de matrices de queso de
suero” descrito por Madureira et al. (2009), en el cual se parte de suero “dulce” con
pH mayor a 6,3 y sin acidificación del medio una vez alcanzado el calentamiento. Se
aplicaron dos modificaciones: 1) no se añadió leche puesto que el objetivo fue
elaborar ricotta y no requesón; y 2) la recolección de la proteína se realizó una vez
precipitada, luego del enfriamiento.
58
Para obtener cantidades suficientes del hidrolizado a nivel de Planta Piloto fue
necesaria la contratación de los servicios de una empresa privada para realizar las
siguientes modificaciones a una marmita doble camisa, de 70 litros de capacidad,
existente en la planta: instalación de agitador con motor y de línea de agua a la
cámara interna de la marmita para permitir el enfriamiento del producto procesado.
Una vez completadas estas modificaciones, se procedió a establecer las condiciones

de trabajo para hidrolizar el lactosuero en la Planta Piloto, en base al esquema
descrito en la Figura 8. Cada lote de lactosuero fue previamente descremado en
descremadora eléctrica de 165 L/h marca AGRITECH (Agritech, Barquisimeto,
Venezuela).
Verter suero lácteo (descremado, Ph >6,0) en marmita
Agitar suavemente
Calentar a 4°C/min hasta 90ºC)
Mantener calentamiento (90-95ºC) durante 20 min
Enfriar hasta 40°C
Retirar 85% (en peso) del lactosuero
Mezclar resto con agitación suave
Recolectar solución de proteína coagulada

en moldes de plástico
Llevar a siguiente etapa: hidrolizado
Figura 8 – Diagrama esquemático de la producción de “queso de suero”

(modificado de Madureira et al., 2009).
59
2.1.9.2. Hidrolizado de la suspensión de proteínas (ricotta)
A la solución de ricotta obtenida en el paso anterior se le determinó el contenido de

proteínas por Kjeldahl y sólidos totales en estufa (ambos procedimientos descritos
anteriormente). A partir del contenido de proteínas, se procedió a calcular la cantidad
de enzima necesaria para una relación enzima/sustrato de 3% del contenido de
proteína, establecido en paso anterior. Utilizando la misma marmita, se aplicó el
esquema presentado en la Figura 9 para hidrolizar la solución de ricotta.
Verter solución de ricotta en marmita
Agitar suavemente
Calentar hasta 42ºC
Añadir proteasa A. oryzae al 3%
Añadir fermento FD-DVS-TCC-20 de Chr Hansen, al 0,02%
Mezclar por 10 minutos con agitación suave
Mantener calentamiento a 42°C por 150 minutos
Calentar hasta 90°C

por 10 minutos, para detener la hidrólisis
Enfriar y colocar en envase plástico, congelar a -20°C
Figura 9 – Diagrama esquemático de la hidrólisis de la solución de ricotta.
Iniciando con el calentamiento de la ricotta hasta 42°C, enseguida se incorporó la

enzima y la cepa BAL, se mantuvo durante 150 minutos el calentamiento a 42°C, se
hizo seguimiento al progreso de la hidrólisis mediante la titulación con formol, según
se describió anteriormente, cada 30 minutos, como se indica a continuación: 5 mL de
la solución de ricotta se colocaron en una cápsula de cerámica, se mezclaron con 3
gotas de fenolftaleína y se ajustó el pH a 8,5 (punto final de la titulación) con una
solución 0,1N de NaOH. Seguidamente se añadieron 4 mL de solución de formol al
35% previamente neutralizado a un pH de 8,5. Esta mezcla se incubó por un minuto
60
a temperatura ambiente y luego se tituló nuevamente, registrándose el volumen de

NaOH empleado en esta segunda titulación. El GH se determinó según la fórmula
descrita en la página 37, con el factor 1/ = 1,06 (correspondiente a una temperatura
de 42°C al pH final de la titulación 8,5).
2.1.10. Caracterización del ingrediente funcional
Al ingrediente funcional elaborado en la etapa anterior se le realizaron los análisis

descritos en la sección 2.1.2 y adicionalmente se le determinó la actividad IECA a
los extractos solubles menores de 3 kDa de cada lote elaborado.
2.2. Desarrollo de yogurt natural funcional
El criterio de formulación aplicado en esta segunda etapa fue la de obtener un yogurt

natural de leche de cabra como base para incorporar el hidrolizado funcional
desarrollado en la etapa anterior.
Se seleccionó la leche de cabra debido a los beneficios reportados en la revisión de

la literatura en comparación con la leche de vaca: mayor digestibilidad, menor
alergenicidad y mayor biodisponibilidad del calcio.
2.2.1. Exploración inicial para la formulación
Previo a la elaboración de las fórmulas prototipo, se procedió a realizar una sesión de

grupo con un panel semi-entrenado, conformado por 10 adultos con edades entre 38
y 50 años, con el objetivo de seleccionar descriptores que permitieran comparar un
perfil descriptivo de un yogurt elaborado con leche de cabra y otro elaborado con
leche de vaca. Posteriormente, se prepararon ambos yogures y se les presentaron a
los mismos panelistas para calificarlas sobre la base de los descriptores
seleccionados (ver planilla en Anexo 8).
61
2.2.2. Escalado de producción del yogurt funcional
Para obtener el yogurt se siguió el procedimiento descrito por Güler-Akin y Akin

(2007). Se fabricaron dos formulaciones del producto: fórmula A, yogurt natural sin
hidrolizado; y fórmula B, yogurt natural incorporándole hidrolizado bioactivo (Figura
10). El producto obtenido se caracterizó según procedimiento descrito en apartado
2.1.2.
Leche cruda fresca de cabra
Pasteurizar (90°C/10 minutos)
Enfriar hasta 42-45°C (a la fórmula B: agregar el hidrolizado)
Inocular cultivo BAL liofilizado DVS (0,02%)
Incubar a 42°C por 4 horas
Almacenar a 4°C hasta el momento del consumo (evaluación sensorial)
Figura 10 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt incorporando el

hidrolizado de lactosuero y cepa BAL (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007).
2.2.3. Evaluación sensorial del yogurt natural
Se realizó una Prueba Triangular presentando a los panelistas el yogurt natural sin el
hidrolizado (A) y el yogurt con el hidrolizado (B) según planilla correspondiente
(Anexo 10). Se trató de determinar si la incorporación del hidrolizado era detectada
por el consumidor. El panel estuvo constituido por 12 evaluadores semi-entrenados,
62
los cuales realizaron dos ensayos cada uno en orden diferente de presentación (AB,
BA). Para un total de 24 ensayos. El análisis estadístico se realizó aplicando la tabla
“Número mínimo de juicios correctos para establecer la significancia a varios niveles
de probabilidad para la prueba de triángulo de una cola” publicada por Roessler et al.
(1978), a un nivel de significancia de 0,05.
Se realizó prueba afectiva del yogurt natural con hidrolizado para determinar la
aceptabilidad del producto, con 100 consumidores con edades comprendidas entre
19 y 45 años (miembros del núcleo de la UCV, Maracay) a los que se les presentó el
producto en vasos plásticos desechables, y se les pidió registrasen su respuesta en
una planilla en la que se les debían marcar su apreciación del producto en una
escala hedónica no-estructura de 15 cm de largo, cuyos extremos estaban marcados
como “me disgusta mucho” y “me gusta mucho”; se les indicó que el punto central (a
7,5 cm) corresponde a una respuesta “indiferente”. Las respuestas fueron tabuladas
y expresadas en centímetros (Stone y Sidel, 1993).
2.2.4. Caracterización del yogurt natural funcional
El producto final obtenido se caracterizó sobre la base de los análisis descritos en la

sección 2.1.2 y adicionalmente se le determinó la actividad IECA.
2.3. Desarrollo del yogurt saborizado
Una vez comprobada la aceptabilidad del yogurt natural funcional de leche de cabra,
se inició el desarrollo de un yogurt de cabra saborizado como opción para mejorar
esa aceptabilidad. Se siguieron todos las etapas de un Desarrollo Exploratorio en la
elaboración de un yogurt a partir leche de cabra (Capra hiricus), saborizado con una
mermelada de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), con lo cual se
esperaba incrementar la capacidad antioxidante del yogurt gracias a su contenido de
polifenoles, y otros componentes bioactivo. A continuación se describen dichas
etapas:
63
2.3.1. Evaluación del Concepto
Mediante una encuesta con 25 consumidores, en un intervalo de edad de 24 a 55

años, se evaluó el concepto del producto a desarrollar (ver planilla en Anexo 7).
2.3.2. Criterios de formulación y tamaño de la ración
El criterio asumido para establecer la formulación del producto se basó en los

requisitos establecidos en la norma COVENIN 2393:2001, estos son: 1) El color, olor,
sabor y consistencia deben ser característicos de un yogurt batido; 2) Por ser un
yogurt saborizado, debe contener como mínimo un 70% de yogurt en el producto
terminado; 3) Requisitos físicos y químicos, contenido mínimo de: grasa (< 3,2% p/p);
sólidos no grasos de la leche (10% p/p, de los cuales 3% deben ser de proteínas).
Acidez (mínimo 0,7 % ácido láctico); 4) Requisitos microbiológicos: mohos y
levaduras (< 1,0x10 UFC/g); coliformes totales (< 11 NMP/g); S. aureus (< 1,0 x103
2
UFC/g); 5) Recuentos de L. acidophilus, St. Salivarius subsp. thermophilus, L.

delbrueckii subsp. bulgaricus no menor de 106 UFC/g, durante todo el periodo de
vida útil. La determinación del tamaño de la ración se realizó sobre la base de la
observación en diversos comercios distribuidores al detal de yogurt, para registrar el
tamaño más común entre las diferentes marcas de yogurt batido, y luego seleccionar
el de mayor frecuencia.
2.3.3. Elaboración de la mermelada de fruta
Puesto que no existe en el mercado local una mermelada de tomate de árbol, se

procedió a aplicar procedimiento de elaboración desarrollado sobre la base de
experiencias previas. Se adquirieron tomates de árbol de diferentes grados de
maduración en un comercio local. Cada lote se pesó antes de proceder al pelado
manual, el cual se realizó primero sumergiendo los frutos en agua hirviendo durante
2 minutos y luego en baño de agua fría, para facilitar el desprendimiento de la piel.
Los frutos ya pelados se colocaron en envase con 250 mL de agua, se llevaron a
ebullición, se añadió el peso de azúcar (calculado sobre la base de 40 partes de
64
azúcar por 60 partes de fruta), manteniendo el calentamiento hasta alcanzar una

temperatura de 100 °C, se pasó la pulpa por un Tamiz, descartándose las semillas;
se envasó en frascos previamente esterilizados, luego del tapado y enfriado, se
almacenó a 4° C.
2.3.4. Elaboración del Yogurt de cabra saborizado
En el siguiente Flujograma (Figura 11) se resume el proceso de obtención del yogurt

de leche de cabra, de acuerdo a la metodología utilizada por Güler-Akin y Akin
(2007) incluyendo la incorporación de la mermelada de tomate de árbol.
Leche de cabra
Pasteurizar (90°C/10 minutos)
Enfriar hasta 42-45°C (agregar el hidrolizado)
Inocular cultivo liofilizado DVS (0,02%)
Incubar a 42°C por 4 horas
Refrigerar a 4°C por 18 horas
Mezclar con mermelada en proporción 75:25
Refrigerar a 4°C
Figura 11 – Diagrama esquemático de la elaboración de yogurt saborizado con

mermelada de tomate de árbol (modificado de Güler-Akin y Akin, 2007).
65
2.3.5. Caracterización del yogurt saborizado
Tanto a la leche de cabra como al yogurt se le aplicaron los siguientes análisis:

contenido de grasas (Fondonorma 1997b), proteínas (Fondonorma 1997d); sólidos
totales (Fondonorma 1997c), acidez (Fondonorma 1997e). Al yogurt saborizado se le
realizaron adicionalmente: recuento microbiológico de mohos y levaduras
(Fondonorma 1990), coliformes (Fondonorma 1996), S. aureus (Fondonorma 1989).
Recuento de bacterias ácido lácticas (B.A.L.) en medio MRS, incubado
aeróbicamente a 37ºC por 48 horas. La viscosidad se midió utilizando un
viscosímetro de Brookfield DV-I+ (Brookfield Engineering Lab, Inc., Middleboro, MA,
EEUU) con sistema “Helipath”, aguja T-D (código S94), a una velocidad de 2,0 RPM,
a 18°C. Los registros se expresaron en centipoise (cP).
2.3.6. Actividad antioxidante del yogurt saborizado
Los análisis de la actividad o capacidad antioxidante, se realizaron en el Laboratorio

de Biología Molecular, de la Universidad Simón Bolívar. Todas las muestras fueron
centrifugadas a 5000 g x 10 minutos en una centrífuga refrigerada Sorvall® RC-5 (E.
I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, USA) para obtener los
extractos acuosos. El ensayo ORACFL fue aplicado a los extractos solubles de las
siguientes muestras: a) pulpa de tomate de árbol sin procesar; b) mermelada de
tomate; c) yogurt de cabra con fermento seleccionado y d) yogurt batido saborizado
con tomate de árbol. La evaluación de la actividad ORACFL se realizó de igual forma
como se señaló anteriormente.
2.3.7. Contenido de polifenoles
Adicionalmente a las muestras de pulpa de tomate de árbol y su mermelada, se les

determinó el contenido de polifenoles totales con el reactivo de Folin-Ciocalteu,
siguiendo la metodología descrita por Payet et al. (2006): se preparó serie de siete
soluciones patrón de ácido gálico (de 0,2 a 0,8 mg/mL) para construcción de curva
66
de calibración, a partir de una solución de 402,6 mg en 50 mL de agua. De igual

forma, cada tratamiento de la pulpa fue disuelta en agua para obtener una
concentración de 0,31 g/mL. Se mezclaron en tubos de ensayos, 100 L de muestra
o solución patrón, 5 mL de solución acuosa al 10% del reactivo de Folin-Ciocalteu y
3,5 mL de solución de 11,5% de carbonato de sodio; se agitaron en vortex y se
colocaron en incubación a 30°C por una hora en baño de María; luego de lo cual, se
leyó la absorbancia de cada mezcla a 765 nm. Se construyó curva de calibración a
partir de la cual se calculó el contenido total de fenoles expresados como mg GAE /
Kg muestra.
2.3.8. Evaluación sensorial
En el presente trabajo se aplicaron dos tipos de pruebas sensoriales: analíticas con

panel semi-entrenado para evaluar las fórmulas prototipo a nivel de laboratorio, y
afectivas con consumidores no entrenados tomados al azar para determinar la
aceptabilidad de la formulación seleccionada. Para las primeras, se conformó un
panel de evaluadores con voluntarios pertenecientes a la comunidad de trabajadores
del núcleo Maracay de la UCV. Inicialmente se invitaron a participar a 25 personas,
bajo los siguientes criterios: edad entre 25 y 55 años, no fumadores, consumidores
de productos lácteos y con disposición de asistir a las sesiones programadas para el
panel. Previo a la recolección de datos, se realizaron sesiones de tres horas de
entrenamiento para familiarizar a los panelistas con las diferencias en atributos
sensoriales (gustos básicos, umbral) y el empleo de escalas de evaluación, de
acuerdo a los lineamientos señalados por Wittig de Penna (2001). Con los resultados
de estas dos sesiones, se seleccionaron 19 panelistas, de los cuales 4 se retiraron
por motivos personales. Para todas las sesiones del presente trabajo siempre se
contó con un mínimo de 11 panelistas del total de 15.
Con el objetivo de seleccionar una de las fórmulas prototipo, se aplicó un análisis

discriminativo mediante una comparación múltiple escalar no estructurada con el
panel semi-entrenado. A los panelistas se les solicitó ubicar en una escala hedónica,
67
no-estructurada de 15 cm, la posición relativa de cada una de las tres muestras

presentadas en un orden específico. Sólo se presentaron los extremos de la escala:
“me disgusta mucho” (extremo izquierdo) y “me gusta mucho” (extremo derecho). Las
muestras fueron codificadas con tres dígitos, asignándose tres códigos a cada una y
los órdenes de presentación fueron los siguientes: ABC, ACB, BAC, BCA, CBA, CAB.
Se aseguró que cada orden de presentación le correspondió al menos a un panelista,
para de esta forma reducir el error causado al evaluar primero la misma muestra
(Stone y Sidel, 1993).
La prueba afectiva, con consumidores para determinar la aceptabilidad de la fórmula

seleccionada se realizó con 100 personas a las que se le presentó el producto en
vasos plásticos desechables, y se les pidió registrasen su respuesta en una planilla
en la que se les debían marcar su apreciación del producto en una escala hedónica
no-estructura de 15 cm de largo, cuyos extremos estaban marcados como “me
disgusta mucho” y “me gusta mucho”; se les indicó que el punto central (a 7,5 cm)
corresponde a una respuesta “indiferente”. Las respuestas fueron tabuladas y
expresadas en centímetros (Stone y Sidel, 1993).
2.4. Vida útil del yogurt funcional
Para la determinación de la vida útil se aplicó lo que Fernández-Molina y García-

Rujano (2010) denominaron “estudio de almacenamiento”. Este procedimiento
experimental se basa en almacenar el producto, bajo condiciones controladas a la
temperatura de comercialización, hasta que sus características de calidad indiquen
que su vida útil ha llegado a su fin. Durante ese periodo se midieron las variables
consideradas mas importantes, a intervalos definidos, hasta el fin del estudio. El día
“0”, se elaboraron dos lotes de yogurt de cabra: uno saborizado con mermelada de
tomate de árbol y otro “natural” adicionado con el hidrolizado de lactosuero de cabra,
se envasó en recipientes similares a los utilizados en la comercialización normal del
yogurt, se colocaron en nevera con un rango de temperatura de 4 a 6°C. En los días
1, 7, 14, 21 y 28, se tomó un envase y se le evaluaron las siguientes variables: pH,
68
acidez, evaluación sensorial, actividad antioxidante ORACFL y recuento de Bacterias

ácido lácticas (BAL) en medio MRS. Los días 1 y 28, se le determinó la actividad
IECA al yogurt natural con hidrolizado. La evaluación sensorial se realizó con panel
de 25 consumidores mediante escala no estructurada gusto/disgusto de 15 cm.
2.5. Protocolo del estudio clínico
Siguiendo los lineamientos establecidos por el programa CONSORT 2010 (Schulz, et

al., 2010), se aplicó un ensayo clínico Fase II para determinar la evidencia de
“actividad” del hidrolizado proteico en la reducción de la presión arterial, mediante la
comparación de dos grupos de pacientes moderadamente hipertensos, en un ensayo
aleatorizado doble ciego controlado. Los participantes se seleccionaron a partir de
los resultados del programa “Estudio Médico Integral 2011” del Instituto de Previsión
del Profesorado de la UCV, campus Maracay, donde participaron profesores y
empleados de la institución. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: adulto,
hombre o mujer, entre 35 y 65 años; presión arterial sistólica ≥ 130 mmHg y/o
presión arterial diastólica ≥ 80 mmHg, con o sin medicación; consumidor de
productos lácteos en general; buen estado de salud general, aparte del cuadro de
hipertensión; y que no presentaron ninguno de los estados descritos en los criterios
de exclusión (en caso de estar recibiendo medicación antihipertensiva, tener menos
de un año de iniciado el tratamiento clínico contra la hipertensión; enfermedad
coronaria crónica; diabetes mellitus; enfermedad maligna; abuso de alcohol; alergia a
la leche o productos lácteos en general; preñez o en período de lactancia). A cada
paciente elegible se le explicó detalladamente, en primer lugar, en qué consistía el
estudio y cuáles eran los pasos a seguir; en segundo lugar, se le solicitó que, en
caso de aceptar participar, entregase el “consentimiento firmado”; y en tercer lugar,
se le asignó aleatoriamente a uno de los dos grupos que formaron parte del estudio:
“tratamiento” y “placebo”. Los integrantes del grupo “tratamiento” recibieron raciones
de yogurt batido en los cuales se incorporó el hidrolizado proteico con propiedades
antihipertensivas; mientras que los del grupo “placebo” recibieron el yogurt batido sin
el hidrolizado. Como bien explicó Fluegel et al. (2010) un placebo “como debe ser”
69
para una bebida láctea viscosa incluiría azúcares y/o edulcorantes artificiales,
carbohidratos y/o espesantes; todos estos componentes podrían tener un efecto
sobre la hipertensión creando un placebo “activo” lo cual confundiría los resultados
del estudio. Para asegurar grupos con una conformación semejante entre sí, se
aplicó un proceso de aleatorización estratificado, ejecutado por la Cátedra de
Bioestadística de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UCV, núcleo Maracay.
Además de la aleatorización, y para evitar que la interpretación de los resultados
fuese influenciada por expectativas previas, ni el paciente ni el médico, encargado de
la toma de la presión arterial, conocieron a qué grupo fue asignado (condición “doble
ciego” del estudio clínico).
Los participantes en el estudio recibieron semanalmente siete raciones de 150 g del

yogurt batido natural (sin saborizar), debidamente codificado. Cada porción fue
consumida durante seis semanas, en su hogar, en el momento mas conveniente
para cada participante, pero se les pidió que siempre fuese el mismo durante las 42
tomas.
La variable respuesta del estudio fue la presión arterial registrada (por triplicado) a
cada participante en tres momentos: el día anterior al inicio del consumo del yogurt,
luego al final de la tercera y sexta semanas. La toma de la presión arterial se realizó,
para todos los participantes, con el mismo equipo (Kit de Presión profesional
Lumiscope, de tamaño de brazalete de 11" - 15", libre de látex) y por la misma
Médico Internista asignada para el estudio. Esta variable es continua, y se
compararon las medias de los dos grupos para determinar si se rechazaba o no la
hipótesis nula (Ho: ambas medias eran iguales) con respecto a la hipótesis alternativa
(Ha: ambas medias eran diferentes, prueba de dos colas). Considerando que el
estudio de Del Campo (2010) realizado en el Hospital Universitario Ramón y Cajal de
la ciudad de Madrid, España, logró determinar una diferencia () de por lo menos
15,2 mmHg en la presión sistólica de los dos grupos experimentales, con una
desviación estándar () de la reducción promedio de 14,6 mmHg, se procedió a
calcular el tamaño de la muestra aplicando la fórmula:
70
2n = (4(Z + Z)2 2)/ 2

Donde Z se tomó de las tablas estadística para un =0,05 y un (1-)=90. Se obtuvo
así un n de 19 pacientes en cada grupo.
Este estudio clínico, se realizó con el financiamiento de FUNDACITE ARAGUA

(proyecto N° 3524, titulado “Valoración de las propiedades antihipertensivas de un
yogurt funcional de leche de cabra”).
2.6. Análisis estadístico
Utilizando el programa Statistica 7® (Stat Soft, Tulsa, EEUU) se realizaron los

siguientes análisis:
2.6.1. Estadística descriptiva (promedio y desviación estándar) para la mayoría de los

resultados;
2.6.2. Análisis no-paramétrico de Kruskal-Wallis y prueba de medias por Chi2 (Siegel

y Castellan, 1995) para el análisis de los resultados físicos y químicos, cuyos datos
no cumplieron con los supuestos de normalidad. Prueba de t-student para comparar
concentración de proteínas por dos métodos.
2.6.3. Metodología de superficie de respuesta con diseño central compuesto 2 4 para

determinar las condiciones óptimas de la hidrólisis de los lactosueros, utilizando el
siguiente modelo:

Donde:
Y: grado de hidrólisis (GH)
: coeficientes estimados por el modelo
: niveles de la variable independiente
: término del error aleatorio
71
2.6.4. Análisis de varianza con un diseño factoria 23 (Tabla 5) para la selección del
hidrolizado con mayor actividad biológica: IECA y ORACFL;
Yijkl = µ + i + j +k +()ij + ()ik + ()jk + ()ijk +ijkl
Donde:
Yij: puntaje del producto en escala no estructurada
µ: media global
i: efecto fijo del i-ésimo nivel factor “método de concentración”.
j: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “origen del lactosuero”
k: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “tipo de hidrólisis”
ijkl: término del error aleatorio
2.6.5. Prueba no-paramétrica de Friedman (95% de confianza) con una prueba de χ2

para el perfil descriptivo inicial en el desarrollo del yogurt funcional;
2.6.6. Análisis ANOVA con diseño de bloques al azar, determinando la diferencia

entre medias mediante la prueba de Tukey (Montgomery y Runger, 2004) para la
selección de la fórmula definitiva utilizando el siguiente modelo:
Yij = µ + i + j + ij
Donde:
Yij: puntaje del producto en escala no estructurada
µ: media global
i: efecto fijo del i-ésimo nivel tratamiento formulación-tipo fermento.
j: efecto fijo del j-ésimo bloque (panelista)
ij: término del error aleatorio
2.6.7. Análisis estadístico utilizando la prueba T-Student para grupos independientes,

una vez recopilados todos los resultados para el estudio clínico.
72
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Desarrollo del ingrediente funcional
En esta primera etapa se desarrolló un ingrediente funcional: un hidrolizado de

lactosuero con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina
(IECA). Se utilizaron como materia prima dos tipos de lactosueros, provenientes de la
elaboración de quesos fabricados a partir de leche de vaca y de cabra. Con ambos
se trabajaron todas las etapas de concentración, hidrolizado y evaluación de la
actividad IECA. Puesto que la recuperación de proteínas fue significativamente
mayor con el lactosuero caprino, se utilizó este como materia prima en la producción
del ingrediente funcional a nivel de planta piloto, con el cual se obtuvieron cantidades
suficientes para completar las etapas posteriores del presente trabajo.
3.1.1. Caracterización de los lotes de leche
Como se mencionó anteriormente, la composición del lactosuero varía de acuerdo al

procedimiento aplicado durante la elaboración de los distintos tipos de quesos y al
tipo de leche empleada como materia prima, cuya composición depende, entre otros
factores, de la especie de la cual provenga: vacuna, bufalina, ovina y caprina
(Monsalve y González, 2005; Quiles et al., 1994). En esta sección se trató lo
referente a la comparación de la materia prima disponible, sobre la base de la raza
de origen de la leche: bovina o caprina. En las Tablas 9 y 10 se resumen los
resultados de los análisis físicos y químicos aplicados a ambas, respectivamente. A
pesar de que se ha reportado que la leche de cabra es comparable con la de vaca
(Storry et al., 1983), los resultados aquí obtenidos muestran que los contenidos de
proteína, grasa, sólidos totales y sólidos no grasos de la leche de cabra son
ligeramente superiores a los de la leche del rebaño de vaca Holstein. Esto se debe
73
principalmente a que la leche de esta raza bovina, a pesar de ser la mayor

productora a nivel mundial, se caracteriza por ser la de menor contenido de sólidos
entre las razas lecheras bovinas (Walstra y Jenness, 1987).
Tabla 9 – Análisis físicos y químicos de la leche de vaca utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso blanco pasteurizado y su
rendimiento quesero.
LOTE 9/02/10 LOTE 3/03/10 LOTE 3/06/10
Proteínas (%) 2,93 ± 0,01 2,92 ± 0,06 3,22 ± 0,04
Grasa (%) 3,28 ± 0,01ab 3,00 ± 0,10b 3,60± 0,10a
Cenizas (%) 0,74 ± 0,01 0,70 ± 0,02 0,71± 0,03
Lactosa (%) 4,19 ± 0,01 4,81 ± 0,27 4,80± 0,02
Humedad (%) 88,87 ± 0,02 88,57 ± 0,32 87,65± 0,36
b ab
Sól.totales (%) 11,13 ± 0,02 11,40 ± 0,10 12,35± 0,05a
Sól. No Grasos (%) 7,86 ± 0,01b 8,43 ± 0,21ab 8,73± 0,06a
Densidad 1,02732 ± 1,03063 ± 1,02943±
(g/mL, a 20°C) 0,00002b 0,00055a 0,00074ab
Peso de leche (Kg) 137 103 103
Volumen de leche (L) 133 100 100
Peso de Queso (Kg) 12 9,5 9,8
Rendimiento 8,8 9,2 9,5
(Kg de queso/ 100 Kg
de leche)
Lactosuero (Kg) 125 (91,2 %) 93,5 (90,8%) 93,8 (91,1)
a,b: superíndices diferentes indican grupos significativamente diferentes
(p<0,05) ver Anexo 1a.
El bajo contenido de proteínas en los tres lotes de leche de vaca, aunque cercano al
valor mínimo de 3,02% reportado por Wendorff y Paulus (2011), estuvo en el límite
inferior del rango de 2,85-3,84 reportado para ese mismo rebaño por Alvarado (2001)
y no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los lotes para este
renglón.
La disminución en la ración de alimento concentrado, debido a recortes

presupuestarios en la E.E. Santa María, pudo haber sido la causa del bajo contenido
de proteínas.
74
De acuerdo a lo señalado por Alvarado (2001), se observa el efecto de la época del

año sobre la composición de la leche: el tercer lote (3/06/10), tomado en época de
lluvias, resultó con contenidos de grasa, sólidos totales y SNG significativamente
mayores (p=0,0265; 0,0273 y 0,0257 respectivamente) que los de la época seca. Sin
embargo, el valor de los tres lotes está por debajo del valor de 3,70% reportado por
Wendorff y Paulus (2011), incluso el segundo lote de leche de vaca (3/03/2010) no
cumplió con el mínimo de 3,2% establecido por la norma COVENIN 903. La mayor
densidad de ese lote del 3/03 (p=0,0429) concuerda con su bajo nivel en grasa.
Tabla 10 – Análisis físicos y químicos de la leche de cabra utilizada en la

elaboración de tres lotes de queso pasteurizado y su rendimiento
quesero.
LOTE 15/4/10 LOTE 20/4/10 LOTE 3/6/10
b a
Proteínas (%) 3,34 ± 0,02 3,67 ± 0,01 3,48 ± 0,04ab
Grasa (%) 3,93 ± 0,01b 4,49 ± 0,02a 4,18 ± 0,07ab
Cenizas (%) 0,74 ± 0,01 0,79 ± 0,01 0,75 ± 0,05
Lactosa (%) 4,33 ± 0,03 4,40 ± 0,03 4,52 ± 0,04
Humedad (%) 87,66 ± 0,04 86,65 ± 0,01 87,06 ± 0,12
Sól. Totales (%) 12,34 ± 0,05b 13,35 ± 0,01a 12,94 ± 0,12ab
Sól. No Grasos (%) 8,41 ± 0,04b 8,86 ± 0,02a 8,76 ± 0,05ab
Densidad 1,02480 ± 1,02623 ± 1,0300± 0,0023a
(g/mL, a 20°C) 0,00012a 0,00005a
Peso de leche (Kg) 119,5 195,0 100
Volumen de leche (L) 116,6 190,0 97,1
Peso de Queso (Kg) 18,5 30,4 16,1
Rendimiento 15,5 15,6 16,1
(Kg de queso/ 100 Kg de
leche)
Lactosuero (Kg) 99,0 (82,8%) 164,6 (84,4) 83,9 (83,9%)
a,b: superíndices diferentes indican grupos significativamente diferentes (p<0,05)
ver Anexo 1b.
En el caso de la leche de cabra, el contenido de proteínas de los tres lotes estuvo

en el límite inferior del rango de 3,23 – 4,55% reportado para el mismo rebaño por
Salvador et al. (2006). Esto pudo deberse en parte a las dificultades económicas
que ha presentado el manejo de este rebaño desde finales del año 2009, que ha
75
llevado a una disminución significativa en la ración de heno y alimento concentrado

en las dietas de los animales.
El contenido de grasa estuvo dentro del rango reportado por Salvador et al. (2006) y
no se observó efecto de la época del año, puesto que este rebaño está estabulado y
no recibe pasto fresco en ninguna época del año. Las diferencias entre los dos lotes
del mes de abril, pudieron deberse a cambios puntuales en la alimentación.
Para la leche de cabra no existe en el país una normativa oficial sobre su

composición, pero al comparar el contenido de sólidos totales con lo reportado por
Guo et al. (2004) se observó que la media de todos los lotes de leche de cabra de
12,88 ± 0,51% fue ligeramente superior a la reportada por esos autores de 12,38 ±
0,71%. También resultó superior al promedio de 11,62 ± 0,64% obtenido para los
lotes de leche de vaca de la Tabla 10.
El rendimiento quesero de los dos tipos de leche estuvo dentro de lo esperado de

acuerdo a los resultados químicos ya mencionados, principalmente el contenido de
Sólidos Totales (ST). Según Guo et al. (2004) el contenido de ST es la principal
variable, entre los componentes de la leche, empleada para predecir el rendimiento
quesero de la leche. En el caso de la leche de vaca, por pertenecer a un rebaño de
raza Holstein, caracterizado como de mayor producción lechera pero de menor
contenido de sólidos totales, siempre se obtienen bajos rendimientos en comparación
con otras razas bovinas (Hurtaud et al., 2009; Walstra y Jenness, 1987; Walstra et
al., 2001). Las razas Jersey, Guernsey y Pardo Suiza son conocidas por una menor
producción de leche en comparación con Holstein, sin embargo, su mayor contenido
de sólidos totales, proteínas y grasa, permite obtener un mayor rendimiento en la
producción de quesos (Wendorff y Paulus, 2011). Según Formaggioni et al. (2008) el
rendimiento quesero va desde un mínimo de 9,67 Kg de queso/100 Kg de leche con
2,38% de caseína (Holstein) hasta un máximo de 11,33 Kg de queso/100 Kg de
leche con 2,86% de caseína (Jersey). El rendimiento de 8,8 a 9,5 Kg de queso/100
Kg leche, obtenido en los tres lotes de leche de vaca Holstein, está por debajo de
76
éste mínimo y se corresponde con un nivel de sólidos totales menor al 12% (Tabla
9). Con respecto a la leche de cabra, se obtuvo un rendimiento entre 15,5 y 16,1 Kg
de queso/100 Kg leche, el cual se corresponde con el rango reportado por Guo et al.
(2004) para leche de cabra entre 15,3 y 19,1 Kg de queso/100 Kg de leche. Este
mayor rendimiento de la leche de cabra con respecto al de vaca, se refleja también
en una menor cantidad de lactosuero recolectado: el de la leche de vaca representó
el 91% del peso de la leche inicial (Tabla 9), mientras que el de la leche de cabra fue
el 83% (Tabla 10).
3.1.2. Caracterización de los lotes de lactosuero
Como ya se mencionó, la otra variable que afecta la composición del lactosuero es el

procedimiento aplicado en la elaboración de los quesos. En esta etapa se evaluó
dicho efecto. En las tablas 11 y 12 se resumen los resultados de los análisis físicos y
químicos aplicados a los lotes de lactosuero de vaca y cabra, expresados en base
húmeda y base seca, respectivamente. Considerando el contenido de ácido láctico
en base seca y comparando ese valor con el de la Tabla 1 página 9, se tiene que
ambos lactosueros son del tipo “dulce” (Yang y Silva, 1995). Esto era de esperar,
puesto que se obtuvieron de una coagulación enzimática de las caseínas.
Según Hernández et al. (1992) hasta un 20% del contenido de proteína total de la
leche corresponde a las proteínas solubles del suero, por tanto, los lactosueros de
vaca y cabra de este trabajo debieron tener un contenido de proteínas máximo de
0,60% y 0,70%, respectivamente, equivalentes al 20% de la proteína total de la leche
empleada como materia prima. Pero los contenidos promedio aquí obtenidos para
ambos lactosueros fueron 1,33 y 1,36 %, respectivamente. El exceso de proteína en
el lactosuero se consideran así pérdidas en caseínas, ya que esa porción debería
estar formando parte del queso. En el presente trabajo, estas pérdidas fueron de
27% y 14%, para vaca y cabra, respectivamente. En el caso de las grasas, también
se observaron pérdidas, en el orden de 9% y 24%, respectivamente; ya que esa
cantidad debería estar formando parte del queso. Estas pérdidas se pueden atribuir a
77
deficiencias en los procesos de fabricación, tales como, exceso de agitación y

deficiente desuerado, según lo reportado por Barroso (2008) como la causa principal
de pérdidas en caseína y grasa en el lactosuero obtenido en la Planta Piloto de la
FCV UCV, Maracay. La autora señaló pérdidas de caseína en el orden de 2,67 ±
2,32 % y 3,06 ± 2,45 %, y de grasa de 10,42 ± 1,30 % y 12,06 ± 4,18 % en los
procesos de queso palmita y de cabra, respectivamente. En ambos casos, los
valores están por debajo de los encontrado en el presente trabajo, por lo que cabe
deducir que las condiciones de fabricación de estos quesos no han mejorado.

Piloto de la FCV-UCV (expresados en base húmeda).
BOVINO CAPRINO
Proteínas (%) 1,33 ± 0,19 a 1,36 ± 0,11 a
Grasa (%) 0,31 ± 0,14 b 0,67 ± 0,29 a
Cenizas (%) 0,60 ± 0,02 a 0,60 ± 0,02 a
Lactosa (%) 4,46 ± 0,02 4,16 ± 0,21
Humedad (%) 93,41 ± 0,01 93,6 ± 0,28
a
Sól.totales (%) 6,98 ± 0,27 6,58 ± 0,28 a
Sól. No Grasos (%) 6,67 ± 0,03 a 5,92 ± 0,30 a
Acidez (% ác. Láctico) 0,144 ± 0,013 a 0,146 ± 0,009a
a,b: superíndices diferentes indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1c y d.
Sin embargo, por lo menos para el caso del lactosuero bovino, estas pérdidas
parecen ser frecuentes ya que la literatura reporta los siguientes valores para el
contenido de proteína en lactosuero: 0,83 % (Monsalve y González, 2005; Vázquez-
Puente et al., 2010); 0,94% (Jakymec et al., 2001); 1,20% (Quintero et al., 2001); y
1,34% (Uribarrí et al., 2004). Siendo estos dos últimos similares a los aquí obtenidos.
Ambos tipos de lactosuero difirieron entre ellos, en el contenido de grasa, lo cual es

consistente con el mayor contenido original de grasa en la leche de cabra comparada
con la de vaca. Ambos lactosueros requirieron ser sometidos a un descremado para
78
evitar la interferencia de la grasa en los procesos de concentración y análisis que se

aplicaron posteriormente.

Piloto de la FCV-UCV (expresados en base seca).
Bovino Caprino
Proteínas (%) 19,56 20,67
Grasa (%) 3,92 10,18
Cenizas (%) 8,77 9,16
Lactosa (%) 67,70 60
Humedad (%) - -
Sól.totales (%) 100 100
Sól. No Grasos (%) 96,08 89,87
Acidez (% ác. Láctico) 2,10 2,62
3.1.3. Caracterización de los lotes de suero descremado
En las tablas 13 y 14 se resumen los resultados de los análisis físicos y químicos

aplicados a los lotes de lactosuero descremado de vaca y cabra, expresados en
base húmeda y base seca, respectivamente. Los contenidos de grasa de todos los
lotes quedaron por debajo del rango de detección del método de Babcock, por lo que
se reportaron como menos de 0,05%. De esta forma, el proceso de descremado
llevó los valores de composición a los rangos señalados por Yang y Silva (1995) para
los lactosueros “dulce” en base seca: proteínas entre 12,8 y 15,2%, lactosa 74 y
81%, cenizas 8%.
Como se puede observar, la reducción en el contenido de proteínas estuvo en el

orden de 5 puntos porcentuales en base seca, debido a que las partículas sólidas de
caseína que pasaron al lactosuero fueron descartadas en el precipitado luego de la
centrifugación aplicada para descremar los sueros. Esto además confirma lo
79
mencionado, en el apartado anterior, sobre las pérdidas de caseína y grasa como

alterantes del perfil de los lactosueros obtenidos.
Tabla 13 – Análisis físicos y químico de lactosueros descremados (expresados

en base húmeda)
Bovino Caprino
Proteínas (%) 1,06 ± 0,15 a 1,03 ± 0,02 a
Grasa (%) < 0,05 < 0,05
Cenizas (%) 0,61 ± 0,04 a 0,63 ± 0,07 a
Lactosa (%) 5,35 ± 0,06 a 5,73 ± 0,06 a
Humedad (%) 92,96 ± 0,02 92,5 ± 0,01
Sól.totales (%) 7,03 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a
Sól. No Grasos (%) 7,02 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a
a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1e y f.
Tabla 14 – Análisis físico-químico de lactosueros descremados (expresados en

base seca)
Bovino Caprino
Proteínas (%) 14,98 14,96
Grasa (%) < 0,05 < 0,05
Cenizas (%) 8,72 8,91
Lactosa (%) 74,16 76,04
Humedad (%) - -
Sól.totales (%) 100 100
Sól. No Grasos (%) 100 100
Así que al final de este proceso se obtuvieron lactosueros de ambas especies con
una composición en proteínas, cenizas, lactosa y sólidos totales, similar a la
conseguida por Muñi et al. (2005) en el lactosuero dulce prefiltrado y centrifugado
antes de la aplicación de un proceso de concentración por ultrafiltración: proteína
0,83%, lactosa 4,95%, cenizas 0,52% y sólidos totales 6,31%.
80
La similitud de ambos sueros también ha sido reportado por Casper et al. (1998)
quienes señalaron que los resultados de la composición del lactosuero de cabra,
obtenido de la manufactura de un queso tipo cheddar, fueron comparables con los
del lactosuero bovino proveniente del proceso del mismo tipo de queso.
A pesar del mayor de contenido de proteínas de la leche de cabra, los lactosueros

resultantes de la fabricación de los dos tipos de quesos, una vez descremados,
resultaron con una composición similar, por lo cual, hasta este punto cualquiera de
los dos lactosueros puede ser empleado para la formulación del ingrediente
funcional.
3.1.4. Perfil electroforético de los lactosueros de cabra y vaca
Continuando con la caracterización de los dos tipos de lactosueros como fuente de

proteínas para la hidrólisis, se procedió a determinar el perfil de las proteínas
presentes en ellos utilizando la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE), bajo condiciones reductoras. Según Fong et al. (2008) la fracción de
proteínas del lactosuero, como cualquier matriz compleja, está dominada por un
pequeño número de las llamadas “proteínas principales” (-Lactoglobulina y -
lactalbúmina, principalmente, junto con la lactoferrina, seroalbúmina e
inmunoglobulinas), las cuales constituyen el 80% de las proteínas del suero. Estas
fueron las proteínas que se buscaron identificar en el perfil electroforético. Basch et
al. (1985) describieron el patrón de proteínas observado en el sistema SDS-PAGE,
para el lactosuero dializado, como conformado por tres bandas claras en la parte
superior del gel y dos bandas intensamente coloreadas en la parte inferior, las
primeras se corresponden con la lactoferrina ( 86 kDa), sero albúmina (67 kDa) e
inmunoglobulina de cadena pesada (~55 kDa), y las segundas con la -lactoglobulina
(18,4 kDa) y la -lactalbúmina (14,3 kDa). La proporción relativa de las proteínas
individuales del lactosuero caprino en comparación con el bovino, es que el primero
tiene menos sero-albúmina, inmunoglobulina G y -LG, pero es mas elevada en -LA
(Casper et al., 1998). En la Figura 12 se muestra la distribución de las proteínas del
81
lactosuero en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Para facilitar el análisis de los geles

se identificaron cuatro zonas, desde arriba hacia abajo, comunes para ambos tipos
de lactosueros: bovino (columnas 2, 3, 5, 6) y caprino (columnas 4,7).
LF
SA
Ig(CP)
Ig(CL)
- LG
- LA
1 2 3 4 5 6 7
Figura 12 - Gel de SDS-PAGE de los lactosueros descremados. Columna 1:

Marcadores de peso molecular (miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k,
ovoalbúmina 60k, anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima
18,3k); Columnas 2-3-5-6: bovino (lactosuero de la 5 fue diluído 1:10);
Columnas 4-7: caprino.
Se observa la similitud en el perfil de proteínas de ambos tipos de lactosueros. En la

primera zona, se identificaron tres bandas: superior con un peso molecular promedio
76,5 ± 8,0 kDa (vaca) y 85,4 ± 4,6 kDa (cabra) correspondiente a la lactoferrina, cuyo
valor reportado oscila alrededor de los 80 kDa (Conesa et al., 2008); la media, con
pesos de 62,5 ± 3,4 kDa (vaca) y 65,4 ± 0,8 kDa (cabra), correspondiendo a
seroalbúmina de 60 kDa (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008); y la inferior, de
53,5 ± 0,1 kDa (vaca) y 49,3 ± 1 kDa (cabra), identificada como inmunoglobulina G
(cadena pesada o “heavy chain”), que cuando se corre en gel bajo condiciones
reductoras aparece como una banda “pesada” de 50 kDa y otra banda “ligera” de 25
kDa (Powell y Wines, 2004). En la siguiente zona se encuentra la cadena ligera de
las inmunoglobulinas (LCI, “light chain”) con pesos de 28,7 ± 0,1 kDa (vaca) y 28,3 ±
0,3 kDa (cabra). En la tercera, una sola banda en cada columna con pesos de 22,5 ±
82
0,1 kDa (vaca) y 21,0 ± 0,1 kDa (cabra), correspondiente a la -Lactoglobulina de

20,6 kDa (Vermeirssen et al., 2004). En la última, también una sola banda con pesos
de 15,5 ± 0,1 kDa (vaca) y 15,1 ± 0,1 kDa (cabra), correspondiente a la -
Lactalbúmina de 16,5 kDa (Vermeirssen et al., 2004). Esta distribución coincide con
lo reportado en otros estudios, tales como el de Lin et al. (2010) mostrado en la
Figura 1 página 12 (perfil de proteínas de lactosuero bovino) y el de Casper et al.
(1998) en la Figura 2 página 13 (perfil de proteínas de lactosuero caprino).
En la Tabla 15 los resultados de los cálculos de peso molecular realizados de

acuerdo a la migración de las bandas en el gel. Casper et al. (1998) señalaron que el
lactosuero caprino mostró una proporción relativa de SA, IgG y LG menor que la
del bovino, pero mayor en el caso de la LA.
Tabla 15 – Peso molecular promedio (kDa) y la proporción relativa (%),

estimado a partir de las bandas obtenidas en el gel SDS-PAGE, con el
programa digital ImageJ 1.42q (NIH, EE.UU.).
Proporción Proporción
banda vaca Cabra Identificación
relativa (%) relativa (%)
1 76,5 ± 8,0 2 85,4 ± 4,6 3 Lactoferrina
2 62,5 ± 3,4 7 65,4 ± 0,8 4 Sero-Albúmina
3 53,5 ± 0,1 3 49,3 ± 1,1 8 Ig(Cadena pesada)
4 28,7 ± 0,1 11 28,3 ± 0,3 12 Ig (Cadena ligera)
5 22,5 ± 0,1 54 21,0 ± 0,1 49 -LG
6 15,5 ± 0,1 23 15,1 ± 0,1 23 -LA
En el presente trabajo, la proporción relativa de SA y LG coincidió con los

resultados de esos autores, no así la IgG que en este caso resultó mayor la caprina,
mientras que la LA resultó igual en ambos lactosueros. Todos los pesos
moleculares calculados en el presente trabajo son bastante cercanos a los
reportados en la literatura (Tabla 16), las diferencias pudieron deberse a errores en la
medición del desplazamiento, al definir el punto de medida en cada banda de
proteínas.
83
Tabla 16 – Pesos moleculares promedio (kDa) de las proteínas del lactosuero,

reportados por otros autores.
banda vaca Cabra referencia
Lactoferrina 80 (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008)
78,06 77,36 ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/)
Sero-Albúmina 66,0 (Sabeena et al., 2010)

68,71 (Vermeirssen et al., 2004)
Ig(Cadena pesada) 50-70 (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008)

Ig (Cadena ligera) 22-27 (Madureira et al., 2007; Ounis et al., 2008)
-LG 18,00 - (Sabeena et al., 2010; Singh, 2011)
18,30 18,30 (Hernández-Ledesma et al., 2011)
-LA 14,0 ~14 (Sabeena et al., 2010; Hernández-Ledesma

et al., 2011)
La similitud de los patrones confirma que ambos lactosueros constituyen una fuente
similar de proteínas para la hidrólisis.
3.1.5. Concentración del lactosuero
Para mejorar la eficiencia de los procesos aplicados a los lactosueros obtenidos, se

hizo necesario reducir el elevado contenido de agua característico de este producto.
A nivel industrial se aplican procesos de membrana para lograr este objetivo y
aumentar así el contenido de proteína; sin embargo, a nivel de la pequeña y mediana
industria la aplicación de ese proceso tecnológico representa una elevada inversión.
Por esta razón, en el presente trabajo se evaluó la alternativa del mecanismo de
termocoagulación como procedimiento para precipitar las proteínas séricas y de esta
forma aumentar su concentración al eliminar gran parte del agua del lactosuero.
3.1.5.1. Ultrafiltración (UF)

84
A las muestras de suero descremadas se les sometió a un ciclo de ultrafiltración,

separándolas en dos porciones: retenido y permeado (Figura 13). A simple vista, se
observan las características del lactosuero permeado como líquido de color amarillo-
verdoso con mayor contenido de lactosa y minerales, mientras que el lactosuero
retenido obtiene apariencia lechosa por la concentración de las proteínas.
Figura 13 - Muestras recolectadas del retenido y permeado del lactosuero

de vaca después de aplicar proceso de ultrafiltración.
En la Tabla 17 se resumen los resultados promedio obtenidos para las fracciones

(retenido y permeado) en un solo ciclo de ultrafiltración de los lotes de suero
descremado de las dos especies: el contenido de proteína se incrementó un 18 y
79% en los lactosueros bovinos y caprinos, respectivamente, es decir, con factores
de concentración de 1,18 y 1,79; pero el retenido contiene todavía un considerable
porcentaje de lactosa y minerales, ya que la relación proteína/sólidos totales osciló
entre 22 y 25%. La concentración de proteínas de ambos lactosueros resultó similar
(p>0,05) de acuerdo a una prueba t-student aplicada a ambos grupos de datos; pero
la recuperación de las proteínas en el retenido resultó significativamente mayor
(p>0,05) con el lactosuero caprino.
Giardina (1995) logró una mayor concentración con el mismo equipo aplicando
tres ciclos de ultrafiltración y diafiltración, alcanzando un valor cercano al 23% de
proteínas, que representó una relación de proteína/sólidos totales entre 35 y 38%.
85
Tabla 17 – Contenido promedio de proteínas y sólidos totales del retenido y

permeado resultantes de la ultrafiltración de las muestras de
lactosuero descremado.
Retenido Permeado Recuperación de

Proteína Sólidos Proteína Sólidos proteínas en el
(%) totales (%) (%) totales (%) retenido (%)
Vaca 2,60 ± 0,12 a 11,72±0,15 a 0 2,80±0,26b 93,2 ± 0,5 b
Cabra 2,87 ± 0,19 a 11,48±0,33 a 0 3,63±0,16a 98,8 ± 0,7 a

a,b: superíndices diferentes, en columnas, indican grupos significativamente
diferentes (p<0,05)
McDonough et al. (1971) realizaron una concentración secuencial, primero

reduciendo un 50% el volumen original y luego un 90%, obtuvieron una
concentración de proteínas de 1,52 y 8,42%, respectivamente, las cuales
representan una relación proteínas/sólidos totales de 17,1 y 37,7%. Los valores aquí
obtenidos para esta relación de 22 y 25% de los dos retenidos caen dentro de ese
rango, y por tanto, se corresponden a una reducción mayor al 50% del volumen
original.
Para el objetivo del presente trabajo fue suficiente con la concentración lograda, ya
que los factores de concentración concuerdan con el 1,4 recomendado por Sola
(2007) en la elaboración de productos lácteos. La proteína concentrada de esta
forma se caracteriza por no estar desnaturalizada, manteniendo muchas de sus
propiedades funcionales intactas. Sin embargo, es necesario comprobar su
susceptibilidad a la hidrólisis tanto por concentrados enzimáticos como por las
enzimas con las que cuentan las bacterias ácido-lácticas.
3.1.5.2. Termocoagulación (TC)
En el país la aplicación de los procesos de membrana en la industria láctea, y en la

industria de alimentos en general, ha tenido muy poca o limitada aceptación (Faría et
86
al., 2003). Por esta razón, en el presente trabajo se evaluó otra opción para
concentrar las proteínas, tomando una segunda porción de ambos lactosueros para
procesarla por termocoagulación. En una primera instancia se siguió el
procedimiento recomendado por Ramírez y Rivas (2003) de bajar el pH hasta 4,5
antes de inciar el calentamiento, pero se observó poca floculación de la proteína,
lográndose una recuperación de apenas 11,4%. Se decidió entonces modificar esta
etapa ajustando el pH a 6,4 mínimo con una solución de hidróxido de sodio 2,5M y
luego iniciar el calentamiento con agitación moderada hasta 90° C, en ese momento
se añadió ácido acético hasta un pH final de 4,6 y se mantuvo calentamiento por 30
minutos. De esta forma si se obtuvo una mayor floculación de las proteínas,
recuperándose 38,8% de la proteína bovina y 54,4% de la caprina (Tabla 18).
Tabla 18 – Contenido promedio de proteínas (base húmeda y base seca) y

sólidos totales (base húmeda) de la solución de “ricotta”,
obtenida por termocoagulación de las muestras del lactosuero
descremado.
Proteína Sólidos Recuperación de
(%) totales (%) proteínas (%)
Vaca 6,47 ± 0,58a 9,19 ± 0,69 a 38,8 ± 4,5 b
(70,40% bs)
Cabra 7,43 ± 0,19 a 9,51 ± 0,20 a 54,4 ± 6,7 a

(78,13% bs)
a,b: superíndices diferentes, en columnas, indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05)
Esto confirma lo señalado por Vázquez-Puente et al. (2010) quienes concluyeron que
para obtener un máximo rendimiento en “quesos de suero” (requesón y ricotta) se
debe calentar el lactosuero a una temperatura de 93°C, bajar el pH y mantener el
calentamiento de 30 a 40 minutos. La recuperación de proteínas fue
significativamente mayor con el lactosuero caprino (p<0,05).
Al comparar el contenido de proteínas en base seca, 70,40% y 78,13% para las

soluciones de ricotta bovina y caprina, respectivamente, con el contenido en base
seca de 42,86% calculado a partir de la información publicada por Lucey (2011) para
87
la ricotta baja en grasa con 72% de humedad y 12% de proteínas, se tiene que
ambos valores son mayores a 1,6 veces el contenido de proteínas normal de los
“quesos de suero”.
Sin embargo, la recuperación de proteínas en ambos casos está por debajo del
logrado por la ultrafiltración, y esto se debe a que la desnaturalización de todas las
proteínas del lactosuero no es completa, sino que unas son mas sensibles que otras
al efecto del calor, y por tanto, el contenido final de proteínas final variará de acuerdo
a las variables del proceso aplicado para la coagulación: concentración, pH,
temperatura, tiempo y acidez (Nicolai et al., 2011). Según Webb y Whittier (1948)
mediante este procedimiento de termocoagulación se debe recuperar, como proteína
desnaturalizada, solo entre 50 y 60 % de la proteína originalmente presente en el
lactosuero empleado como materia prima, ya que este porcentaje corresponde a la
proteína coagulable del lactosuero derivado de la elaboración de quesos o de
caseínas.
Como se puede observar, en el caso del lactosuero caprino se logró llegar a ese
nivel de recuperación. En el caso del lactosuero bovino es posible que el bajo
rendimiento se deba a la raza de donde se originó la leche con la cual se elaboró el
queso, como se mencionó anteriormente de bajo rendimiento quesero, aunado a los
problemas de manejo del rebaño. La proteína obtenida de esta forma, está
desnaturalizada y en los pasos posteriores se evaluó el efecto de esta condición
sobre la hidrólisis enzimática.
En resumen, la recuperación de proteínas en ambos métodos fue mayor con el

lactosuero caprino, lo cual representa una ventaja para la elaboración del ingrediente
funcional a partir de este tipo de materia prima.
3.1.6. Hidrólisis del lactosuero

88
Antes de aplicar la hidrólisis con el complejo proteasa/peptidasa de Aspergillus

oryzae a los concentrados de lactosueros bovino y caprino, fue necesario determinar
las condiciones óptimas para obtener un grado de hidrólisis moderado entre 10 y
20%, para lo cual se aplicó un análisis de superficie de respuesta.
3.1.6.1. Condiciones óptimas para hidrólisis enzimática
La metodología de superficie de respuesta (MSR) ha sido exitosamente aplicada

para optimizar las condiciones de hidrólisis que resulten en la máxima actividad
biológica de los péptidos generados en diferentes hidrólisis enzimáticas (Contreras et
al., 2011;Guo et al., 2009). Esta máxima actividad generalmente se consigue en un
rango de hidrólisis (GH) entre 10 y 20% (Li-jun et al., 2008). Para conseguir una
hidrólisis en este rango con el complejo proteasa/peptidasa de Aspergillus oryzae se
combinaron los niveles descritos en la Tabla 4 (página 51) para los cuatro factores:
pH, Temperatura, relación Enzima/Sustrato y tiempo, para un total de 93 ensayos,
los cuales fueron ejecutados en el orden aleatorio provisto por el programa Statistica
7. La tabla del análisis ANOVA se muestra en el Anexo 2; para la variable
dependiente GH. Se obtuvo un R2= 0,83 con un error por falta de ajuste no
significativo (P>0,01); van der Ven et al. (2002) en un estudio similar obtuvieron un
R2= 0,822 el cual consideraron indicativo de que el modelo estuvo bien adaptado a
los resultados obtenidos, a pesar de haber presentado una falta de ajuste
significativa.
Sobre la base de este análisis, dentro de los rangos evaluados, resultaron

significativas las interacciones lineales: 1) temperatura*relación-enzima/sustrato: a
mayor E/S y mayor temperatura, se obtendrá un mayor GH , 2) pH*tiempo: en el
rango de pH de 6-7, al incrementar el tiempo se obtiene un mayor GH; y 3)
pH*temperatura: en un rango de pH de 5 a 8, al incremento de temperatura en el
rango de 25 a 60°C, produce un mayor GH. Y también los cuatro factores
individuales lineales resultaron significativos: Temperatura, tiempo, pH y relación
enzima/sustrato. Estos se analizan a continuación en el perfil dinámico con la función
de deseabilidad. Los datos generados por este análisis permitieron obtener el perfil
89
dinámico descrito en la Figura 14. Los valores óptimos en el eje de las x son los que
están en rojo y el valor óptimo de la respuesta es 12,372 % de grado de hidrólisis
(GH) en un rango de 0,85 a 24,32. Este resultado concuerda con los de van der Ven
et al. (2002) quienes obtuvieron un GH promedio de 12% en un rango de 0 a 35% en
un diseño central compuesto para determinar el GH de la hidrólisis de un
concentrado de lactosuero con la enzima Corolasa PP. La función de deseabilidad
obtenida fue de 0,982, cuyo valor es considerado como muy bueno cuando se acerca
a 1 (Montgomery y Runger, 2004). Se observa que la respuesta óptima esta en el
rango que indica la función de deseabilidad.
El perfil de tiempo indica que se requirió un mínimo de 150 minutos de hidrólisis para
estar en el rango deseado de hidrólisis. En el perfil E/S, se observa que el
incrementar la relación enzima/sustrato de 1% hasta 5%, solo produce un ligero
aumento en GH.
Ahora bien, si se observan los perfiles de pH y temperatura (T), se tiene que el GH

aumenta moderadamente tanto al disminuir el pH de 7 a 5, como al incrementar T de
34° hasta 50°. Esto resulta importante para la consideración posterior del escalado
en planta piloto del proceso de hidrólisis, donde la operación del ajuste de pH
representa un paso adicional que incrementa el costo de operación, sobre todo
considerando que al acompañar la acción enzimática con el crecimiento de una cepa
ácido-láctica en el lactosuero, se reduce el pH del medio de 7 a 5, debido a la
fermentación de la lactosa.
Por otra parte, ya que en el proceso de hidrólisis en planta se empleó la combinación

de la proteasa con una cepa ácido-láctica cuya temperatura óptima de crecimiento
fue de 42°C, se planteó utilizar esta temperatura en lugar de los 34°C señalados por
el modelo estadístico.
90
Profiles for Predicted Values and Desirability

Replicat pH T E/S t Desirability
30,000
24,320
0,
12,585
1,
DH
12,372
,85000
0,
-5,000
,98186
Desirability
1, 3, 5, 7, 9, 26, 58, 1, 3, 5, 30, 150,
34,
Figura 14 – Perfil de valores predichos y deseabilidad de los valores óptimos para

las cuatro variables incluidas en el modelo de superficie de respuesta para la
hidrólisis enzimática de lactosuero caprino con proteasa de Aspergillus oryzae.
Se tiene entonces que según la metodología de superficie de respuesta, las

condiciones ideales para obtener un grado de hidrólisis intermedio (12,585%) se
logran a pH 7, temperatura de 34°C, relación E/S 3% y tiempo de hidrólisis de 150
minutos. Sin embargo, como se señaló anteriormente, para la siguiente etapa la
temperatura se ajustó a 42°C y el pH se dejó oscilar de 7 a 5 durante los 150 minutos
de incubación.
3.1.6.2. Hidrólisis de los lactosueros concentrados
Las condiciones iniciales de hidrólisis seleccionadas para aplicar el complejo

proteasa/peptidasa al lactosuero concentrado, fueron por tanto: pH 7, temperatura
42°C, relación Enzima/Sustrato 3% y tiempo de incubación 150 minutos. Al
implementar estas condiciones de hidrólisis en las cuatro combinaciones propuestas
en el presente trabajo (UF-enzima, UF-enzima+BAL, TC-enzima, TC-enzima+BAL)
91
se obtuvieron cuatro hidrolizados de cada tipo de lactosuero, para un total de ocho

tratamientos. En la Tabla 19 se resumen los cálculos de la masa de proteínas (Mp)
de las muestras manejadas en cada uno de los tratamientos en los que se aplicó
una hidrólisis solo por la acción de la proteasa, para determinar así la cantidad de
enzima necesaria en cada caso asegurando una relación enzima-sustrato del 3%.
Tabla 19 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado luego de 150 minutos de

incubación a 42°C, de acuerdo a las características de cada tratamiento
(concentración-especie) utilizando proteasa de Aspergillus oryzae.
Vaca Cabra
Ultrafiltración tratamiento 8 tratamiento 7
Peso (g) 90,7 57,3
Conc. Proteínas (%) 2,58 2,6
Mp (g proteína/ muestra) 2,3 1,5
3% enzima (L) 70 45
GH (%) 7,37 ± 0,22 10,8 ± 1,97
Termocoagulación tratamiento 5 tratamiento 6
Peso (g) 90,7 95,7
3% enzima (L) 198 221
GH (%) 10,2 ± 1,73 9,61 ± 1,63
11,00
Grado de hidrólisis (%)
9,00
7,00
5,00
3,00
1,00
30 60 90 120 150
Tiempo de incubación (minutos)
lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por
proteasa de A. oryzae.
En los cuatro tratamientos se obtuvo un grado de hidrólisis moderado entre 7,37 y

10,8%, similar al rango de 7,5 a 12% obtenido por Kim et al. (2007) para 150 minutos
92
de hidrólisis con flavourzyme®. En la Figura 15 se muestra una curva ejemplo de la

evolución del GH, determinado por el procedimiento de titulación con formol, durante
la incubación a 42°C. Se observan que hasta los 150 minutos un incremento
moderado en el grado de hidrólisis, sin embargo, según Kim et al. (2007) este
incremento se desacelera luego de ese tiempo para mantenerse mas o menos
alrededor de un valor máximo, que en este caso pareciera estar alrededor del 11%.
Según lo reportado por Tsai et al. (2008) la acción combinada de una proteasa con
una cepa ácido-láctica con actividad proteolítica, permite alcanzar un mayor
contenido en péptidos bioactivos, en el mismo tiempo de incubación que un proceso
con la acción única de la proteasa. Por esta razón, se decidió incluir en este ensayo
la hidrólisis combinada de ambos mecanismos. En la Tabla 20 se resumen los
cálculos de Mp y cantidad de enzima, así como el grado de hidrólisis GH promedio
obtenido al aplicar una hidrólisis por la acción combinada de la proteasa y una cepa
ácido-láctica. Se observa un mayor GH en comparación con el proceso solo
enzimático.
Tabla 20 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado de acuerdo a las

características de cada tratamientos (concentración-especie) utilizando una
mezcla de proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica.
Vaca Cabra
Ultrafiltración tratamiento 2 tratamiento 3
Peso (g) 204,3 50,7
3% enzima (uL) 169 46
GH (%) 20,04± 3,18 13,71± 3,97
Termocoagulación tratamiento 4 tratamiento 1
Peso (g) 50,3 116,8
3% enzima (uL) 91 253
GH (%) 16,96± 3,83 19,65± 2,32
93
En la Figura 16 se muestra una curva ejemplo de la evolución del GH, determinado

con el método de titulación con formol, durante la incubación a 42°C. Igual a la figura
anterior, pareciera que la velocidad de la hidrólisis aumenta a medida que transcurre
el tiempo de incubación, estimándose se estabilizaría posteriormente alrededor de un
GH del 21%.
21,00
Grado de hidrólisis
16,00
11,00
(%)
6,00
1,00
30 60 90 120 150
Tiempo de incubación (minutos)
lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de
proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica
Para evaluar el grado de hidrólisis alcanzado en los diversos tratamientos aplicados,

se realizó una corrida de electroforesis PAGE-SDS, con el mismo procedimiento
aplicado anteriormente. Luego de coloreado, el gel se evaluó con el programa
ImageJ 1.42q (National Institute of Health, EE.UU.) tanto para estimar los pesos
moleculares como la intensidad relativa de las bandas. En la Figura 17 se muestra el
suero de cabra sin hidrolizar (línea 1) y a distintos tiempos de hidrólisis (60, 120 y
150 minutos, en las líneas 2,3 y 4, respectivamente). En la línea 1, se identificaron
las mismas bandas señaladas anteriormente en la Figura 12 página 82: lactoferrina
LF (71,6 kDa), seroalbúmina SA (66,5 kDa), IgG “cadena pesada” (61,7 kDa), IgG
“cadena ligera” (31,1 kDa), -lactoglobulina (21,8 kDa) y -lactalbúmina (15,5 kDa).
Es decir, al no haber acción enzimática, el perfil de proteínas se mantuvo intacto,
apareciendo todas las bandas señaladas por Basch et al. (1985).
Por el contrario, en las siguientes tres líneas, no se observan las dos primeras
bandas (lactoferrina y seroalbúmina), pero aparecen dos bandas debajo de la IgG
pesada, con PM estimados de 56,1 y 53,2 kDa, y otras dos debajo de la -LA, con
PM estimados de 14 y 13 kDa. Tanto estas nuevas bandas como las originales
94
disminuyeron en intensidad a los 120 y 150 minutos, indicando su degradación por la

acción de la proteasa.
1 2 3 4
Lactoferrina (71,6 kDa)
Seroalbúmina (66,5
kDa)
IgG pesada (61,7 kDa)
IgG ligera (31,1 kDa)
-lactoglobulina (21,8 kDa)
lactalbúmina (15,5
kDa)
Polipéptido (14 kDa)
Polipéptido (13 kDa)
Figura 17 – Porción del gel PAGE-SDS (15% T; 6M úrea), correspondientes a: 1)

suero de cabra sin hidrólisis, 2) suero con E/S 3,0% a los 60 minutos, 3)
suero con E/S 3,0% a los 120 minutos, y 4) suero con E/S 3,0% a los 150
minutos.
Kim et al. (2007) presentaron un patrón electroforético para demostrar el avance de

la hidrólisis utilizando Flavourzyme® al 2%, a 50°C y por 30, 60, 90, 120, 150, 180 y
240 minutos. En ese patrón, las tres bandas superiores (lactoferrina, seroalbúmina e
IgG) desaparecen casi completamente a partir de los primeros 30 minutos, mientras
que la -LG y -LA disminuyeron en intensidad a medida que transcurrió el tiempo de
hidrólisis. Esto coincide con lo observado en este trabajo, a excepción de la cadena
pesada de la IgG, la cual no desaparece en los primeros 30 minutos, sino que se
reduce ligeramente en intensidad. En los gráficos de la Figura 18 se ilustra la
evolución de estas bandas durante el curso de la hidrólisis: en el caso de las
95
Inmunoglobulina HC 61,7 kDa A Polipéptido 56,1 kDa. B
25000
25000
Intensidad
20000 20000
Intensidad
15000
15000 10000
5000
10000 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.)
Tiempo de incubación (min.)
Polipéptido 53,2 kDa. C D

Inmunoglobulina LC 31,1 kDa
25000 15000
20000
Intensidad
Intensidad
15000 10000
10000
5000
5000
0 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.) Tiempo de incubación (min.)
-LG 21,8 kDa E F

40000
-LA 15,5 kDa
40000
30000
Intensidad
30000
Intensidad
20000
20000
10000
10000
0
0
0 60 120 150
0 60 120 150
poliéptido 14 kDa. G H
20000 poliéptido 13 kDa.
20000
15000
Intensidad
15000
Intensidad
10000 10000
5000 5000
0 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Figura 18 – Progreso de la hidrólisis de las principales proteínas del lactosuero por

la acción de la proteasa de Aspergillus oryzae bajo las condiciones
seleccionadas: T= 42°C, E/S= 3% y pH= 7 (Intensidad relativa (sin
unidades) vs tiempo en minutos)
96
proteínas, que provienen originalmente de la leche IgG “cadena pesada”, IgG

“cadena ligera”, -LG y -LA (Figuras 18A, 18D, 18E y 18F, respectivamente) la
intensidad relativa de la banda disminuye progresivamente al transcurrir la
hidrólisis, mientras que las bandas nuevas (Figuras 18B, 18C, 18G y 18H) muestran
un aumento importante en la intensidad a medida que transcurre la hidrólisis, hasta
llegar a un punto en el cual comienza a disminuir en señal de que a su vez pasan a
ser blanco de la hidrólisis enzimática. No se presentan las gráficas para LF y SA,
puesto que ambas bandas casi desaparecen desde los primeros 30 minutos, tal
como mostraron Kim et al. (2007).
3.1.6.3. Extracto soluble menor a 3 kDa de cada hidrolizado
Según se demostró en diversos estudios, los extractos solubles que contienen

péptidos de bajo peso molecular, menor a 3 kDa, poseen una mayor actividad
biológica in vitro en comparación con la matriz completa de donde provienen (van der
Ven et al., 2002; Gómez-Ruiz et al., 2002; Hernández-Ledesma et al., 2007;
Contreras et al., 2008; Lignitto et al., 2010). A partir de los tres hidrolizados
realizados para cada tratamiento, se obtuvo un “pool” para someterlo a ultrafiltración
con membrana de 3 kDa, el permeado obtenido se liofilizó y al concentrado obtenido
se le determinó el contenido de proteínas mediante Kjeldahl (Tabla 21). Estos
resultados fueron posteriormente utilizados en los cálculos de la actividad biológica.
Tabla 21 – Contenido de proteínas (% p/p) de los extractos solubles menores de 3

kDa secados por liofilización (promedio ± desviación estándar).
Enzima 12,4 ± 1,3 7,7 ± 0,18 19,5 ± 0,54 14,3 ± 0,20
Enzima +
9,30 ± 1,15 12,90 ± 0,25 19,00 ± 1,00 7,20 ± 0,06
BAL
La discusión que se presenta a continuación, referente a las etapas donde se buscó

definir las variables del proceso, solo se basa en los resultados obtenidos con el
97
lactosuero de cabra, ya que algunos de estos análisis representaron un elevado

costo en el proyecto. En las etapas decisivas si se analizaron ambos lactosueros.
Se realizó evaluación preliminar de la presencia de péptidos en el lactosuero de

cabra mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En la Tabla 22 se resumen,
por orden decreciente de abundancia, los valores de las masas de los péptidos
encontrados en los extractos solubles de los hidrolizados de lactosuero caprino. Se
observa, en primer lugar que efectivamente las muestras analizadas contienen
péptidos cuyas masas están por debajo de los 3 kDa. En segundo lugar, que el
tamaño de dichos péptidos disminuye a medida que transcurre la hidrólisis: a los 30
minutos los péptidos mas abundantes tienen masas que oscilan entre 3,6 y 1,5 kDa;
mientras que a partir de los 90 minutos la masa de los péptidos mas abundantes es
menor 1 kDa. A los 150 minutos se observa un reordenamiento en la abundancia o
intensidad relativa de esos péptidos menores.
En la Figura 19 se presenta el espectro de masas obtenido para cada uno de esos

tres tiempos de hidrólisis, 30, 90 y 150 minutos; en ellos se observa mas claramente
lo antes expuesto en cuanto a los cambios en la intensidad relativa de los péptidos
registrados: disminuye la intensidad de los péptidos largos y aumenta la de los
péptidos de menor tamaño. En el trabajo de Ortiz-Chao et al. (2009), utilizando un
complejo proteinasa-peptidasa N Amano, propusieron una hipótesis para explicar un
fenómeno similar. Según esta hipótesis la hidrólisis ocurre en dos etapas, la primera
correspondiente a los primeros 60 minutos, la proteinasa N Amano hidroliza la -LG
y se producen péptidos de cadena larga; en la segunda etapa, después de esos
primeros 60 minutos, la peptidasa hidroliza los péptidos largos en otros mas
pequeños. Los péptidos largos de la primera etapa pueden causar inhibición
competitiva de la segunda etapa al convertirse en un sustrato mas específico para la
proteasa N Amano que la -LG, por lo cual se reduce la velocidad de la hidrólisis. Por
tanto, después de una hora de hidrólisis, los péptidos de cadena larga son
preferencialmente hidrolizados sobre la -LG, lo cual resulta en la producción de
péptidos de cadena corta potencialmente con mayor bioactividad.
98
pH 7 T 42 E/S 3% 30 min.
Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso
molecular, Da) presentes en los
extractos solubles menores de 3
kDa, determinadas por espectro-
metría MALDI-TOF, en orden de
mayor a menor “abundancia”, de
los hidrolizados de lactosuero
caprino tomados a tres tiempos
diferentes de incubación de la
hidrólisis enzimática con proteasa
de A. oryzae.
pH 7 T 42 E/S 3% 90 min.
T = 30 min t = 90 min t = 150 min
1717.9517 893.0328 893.1105
2104.8232 877.0569 877.1475
1505.8056 908.9984 861.1718
1618.8898 832.3036 909.0888
1880.9981 930.9570 915.1118
1755.8836 915.0104 1506.0226
1488.7705 899.0357 2105.1369
1782.9319 1104.0258 1430.9347
1656.8267 1718.9623 1414.9088
1589.7336 703.9876 1445.9569
1392.7170 1543.8126 1392.9321
1543.7510 862.3191 1527.9956
1668.8438 1142.0028 1718.1748
2413.2746 1082.1856 pH 7 T 42 E/S 3% 150 min.
3600.6427 931.0956
1838.8817 1120.1442
2186.1276 1098.1724
1700.9055 899.2117
Figura 19 – Distribución de masas MALDI-TOF

de los péptidos presentes en los
extractos solubles menores de 3 kDa de
lactosuero caprino hidrolizado por 30, 90
y 150 minutos con proteasa de A. oryzae.
99
En la revisión de la literatura, en la búsqueda de reportes de péptidos bioactivos con

masas moleculares como las de la Tabla 22, solo se encontraron referencias
coincidentes con fragmentos de la -LG. Los pesos moleculares resaltados en la
Tabla 22 coinciden con las masas reportadas de péptidos con actividad IECA (Ortiz-
Chao et al., 2009; Contreras et al., 2011) obtenidos a partir de la hidrólisis de
lactosuero bovino con proteasa N Amano. La secuencia de estos péptidos se
muestran en la Tabla 23 y se identificaron dentro de la secuencia de la LG
publicada en la página web de ExPASy Proteomic (http://www.expasy.ch/) en la
Figura 20.
Tabla 23 - Identificación de la secuencia de los péptidos presentes en los

hidrolizados de lactosuero caprino, utilizando los valores de los pesos
moleculares determinados por MALDI-TOF para la búsqueda en la base de
datos UniPtrotKB/Swiss-Prot, en línea.
Peso Posición dentro
Secuenciaa Referencia
Molecular (Da) de la proteína
877.1475 IVTQTMKG (-LG f20-27) (Ortiz-Chao et al., 2009)
899.2117 ALNENKVL ( -LG f104-111) (Ortiz-Chao et al., 2009)
915.1118 KIDALNEN ( -LG f101-108) (Ortiz-Chao et al., 2009)
931.0956 DTDYKKY ( -LG f114-120) (Ortiz-Chao et al., 2009)
1082.1856 IIAEKTKIPA ( -LG f89-98) (Contreras et al., 2011)
1098.1724 VEELKPTPEG ( -LG f61-70) (Ortiz-Chao et al., 2009)
1120.1442 DAQSAPLRVY ( -LG f51-60) (Ortiz-Chao et al., 2009)
(a) Nomenclatura abreviada de una letra por aminoácido (UniProtKB/Swiss-Prot)
10 20 30 40 50
MKCLLLALGL ALACGIQAII VTQTMKGLDI QKVAGTWYSL AMAASDISLL
60 70 80 90 100
DAQSAPLRVY VEELKPTPEG NLEILLQKWE NGECAQKKII AEKTKIPAVF
110 120 130 140 150
KIDALNENKV LVLDTDYKKY LLFCMENSAE PEQSLACQCL VRTPEVDKEA
160 170 180

LEKFDKALKA LPMHIRLAFN PTQLEGQCHV
Figura 20 – Secuencia P02756 (UniProtKB/Swiss-Prot) de la Lactoglobulina de

lactosuero de cabra (Capra hiricus). Se resaltan las secuencias identificadas en
la Tabla 23.
100
Para estimar la potencial actividad IECA de los siete péptidos identificados en la

Figura 20 se procedió a evaluar los últimos tres aminoácidos del extremo C-terminal,
de todos ellos, para determinar el cumplimiento o no de las siguientes “condiciones”
establecidas por numerosos estudios (Abubakar et al., 1998; Korhonen y Pihlanto-
Leppälä, 2003; Murakami et al., 2004; Hartmann y Meisel, 2007; Otte et al., 2007a;
Vinderola et al., 2008): poseer residuos hidrofóbicos, tales como triptófano (Trp),
tirosina (Tyr) o fenilalanina (Phe), en por lo menos una de estas posiciones y/o
portar residuos de prolina (Pro), en combinación o no con residuos hidrofóbicos y/o
presentar las cargas positivas de lisina (Lys, grupo -amino) y arginina (Arg, grupo
guanidino). El péptido KIDALNEN (Lys-Ile-Asp-Ala-Leu-Asn-Glu-Asn) no cumple con
ninguna de ellas; los péptidos ALNENKVL (Ala-Leu-Asn-Glu-Asn-Lys-Val-Leu) y
IVTQTMKG (Ile-Val-Thr-Gln-Thr-Met-Lys-Gly) poseen solo una Lys acompañada por
dos aminoácidos hidrofóbicos; IIAEKTKIPA (Ile-Ile-Ala-Glu-Lys-Thr-Lys-Ile-Pro-Ala) y
VEELKPTPEG (Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Thr-Pro-Glu-Gly) poseen un residuo de
Pro; y los péptidos con mayor potencial serían DTDYKKY (Asp-Thr-Asp-Tyr-Lys-Lys-
Tyr) y DAQSAPLRVY (Asp-Ala-Gln-Ser-Ala-Pro-Leu-Arg-Val-Tyr), el primero por
poseer dos Lys acompañadas por un residuo aromático y el segundo por presentar
también un residuo aromático pero acompañado de una Arg. De hecho, éste último
péptido contiene la secuencia SAPLRVY que fue reportada por Ortiz-Chao et al.
(2009) como el mas potente inhibidor de la enzima ECA derivado de la -LG.
3.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados
Para seleccionar el tratamiento a ser aplicado en el desarrollo final del ingrediente

funcional, se procedió a determinar las actividades IECA y antioxidante ORACFL de
los ocho extractos solubles menores a 3 kDa.
3.1.7.1. Actividad inhibidora de la enzima ECA (IECA)
A partir de cada liofilizado, de las ocho fracciones menores de 3 kDa, se prepararon

cinco diluciones seriadas (1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024). Estas se llevaron a la
101
placa multipocillo para medir la actividad IECA, por fluorescencia. Las lecturas del
fluorómetro se cargaron en una hoja de excel y se obtuvieron las curvas de
inhibición, a partir de la ecuación de la curva (y=a ln(x)+b) se obtuvo el IC50 mediante
la siguiente fórmula IC50 = EXP((50-b)/a). En el Anexo 4 se tabulan estos
coeficientes. En la Figura 21 se presenta un ejemplo de las curvas obtenidas.
80
70
60
% de inhibición
50
40 y = 18,699ln(x) + 7,4944
30 R² = 0,937
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentración de los péptidos (g/mL)
Figura 21 – Curva de inhibición de la enzima ECA obtenida para diferentes

concentraciones (g/mL) de la Muestra 1 (extracto soluble menor de 3
kDa de lactosuero de cabra).
Todos los hidrolizados mostraron actividad inhibidora de la enzima ECA (Tabla 24)
considerándose, por ejemplo, que en el estudio de van der Ven et al. (2002) con 46
hidrolizados de lactosuero con “buena” actividad IECA in vitro, obtuvieron un rango
de IC50 de 170 a 880 g/mL. El hidrolizado con mayor actividad fue el que necesitó
menor concentración de proteínas para inhibir el 50% de la actividad de la enzima
(IC50): 4,27 g/mL del hidrolizado proveniente del lactosuero bovino termocoagulado
tratado con la mezcla de proteasa+BAL, seguido por el caprino bajo las mismas
condiciones de concentración e hidrólisis con 10,54 g/mL.
Estos resultados fueron analizados estadísticamente mediante diseño factorial 2 3

(Tabla 25) utilizando paquete estadístico Statistica 7. Se analizaron dos niveles de
102
cada factor: método de concentración (ultrafiltración o termocoagulación), origen

(bovino o caprino) y tipo de hidrólisis (enzimática o mezcla enzimática-bacteriana).
Tabla 24 – Actividad inhibidora de la enzima ECA de extractos solubles menor a

3kDa de los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro
tratamientos diferentes (resultados expresados como IC50 en g/mL)

Proteasa 238,90 ± 26,95 b 153,39 ± 13,23 b 87,98 ± 5,16 b 66,18 ± 4,48 b
Proteasa
5,77 ± 0,33 a 4,27 ± 0,52 a 10,78 ± 0,18 a 10,54 ± 0,72 a
+ BAL
a,b: superíndices diferentes, en la misma columna, indican grupos significativamente
diferentes (p < 0,05).
Tabla 25 – Factores y niveles utilizados en el análisis estadístico de los resultados de

la actividad inhibidora de la enzima ECA.
Factor Descripción Nivel Descripción
T1 Método de concentración 1 Ultrafiltración

2 Termo-coagulación
T2 Origen 1 Cabra
2 Vaca
T3 Hidrólisis 1 Sólo enzimática
2 Enzimática + fermento BAL
En la Tabla ANOVA (Anexo 3a) se observa que la interacción de los tres factores fue
significativa, por tanto, el análisis final de estos resultados se hizo sobre la base de
esa interacción. Como se muestra en la Figura 22, cuando T3 se mantiene constante
en el nivel 2 (hidrólisis enzimática + fermento BAL) se obtiene la mayor actividad
inhibidora de la enzima ECA en cualquiera de los niveles de los otros dos factores
(método de concentración y origen del suero). Mientras que con la aplicación de
sólo hidrólisis enzimática (T3:1) se obtiene mayor inhibición con el suero de cabra
(T2:1) tanto ultrafiltrado como termo-coagulado.
103
El análisis estadístico demostró que el método de concentración no afecta la

actividad inhibidora de la enzima ECA de los hidrolizados, mientras que el método
aplicado para la hidrólisis (sólo enzimático o combinación enzimático y fermentación
BAL) sí tuvo un efecto significativo sobre esa actividad independientemente del
método de concentración empleado.
"T1"*"T2"*"T3"; LS Means
Current effect: F(1, 16)=12,325, p=,00290
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
300
250
200
150
IACE
100
50
0
T1
-50 1
T2: 1 2 T2: 1 2 T1
2
T3: 1 T3: 2
Figura 22 - Efecto de la interacción de tres factores, sobre la actividad IECA,

determinado por análisis factorial 23: factor T1 (método de concentración: 1-
Ultrafiltración, 2-Termocoagulación), factor T2 (origen del lactosuero: 1- caprino,
2-bovino) y factor T3 (tipo de hidrólisis: 1-enzimático, 2-enzima mas BAL).
La acción conjunta de la enzima y la cepa ácido-láctica mostró una actividad

inhibidora de la enzima ECA significativamente mayor (p<0,05) que cuando los
hidrolizados se obtuvieron solo por la acción de la enzima. Esto coincide con los
resultados obtenidos por Chen et al. (2007) y por Tsai et al. (2008) donde el IC50 del
hidrolizado se redujo de 1180 y 515 g/mL en la hidrólisis enzimática a 240 y 226
g/mL con la combinación de la fermentación ácido-láctica con la hidrólisis mediante
Flavourzyme®, respectivamente. Ellos concluyeron que la fermentación asistida por
proteasa acelera la producción de péptidos bioactivos con actividad in vitro inhibidora
de la enzima ECA, y que por tanto, podría permitir obtener del lactosuero un
104
ingrediente útil en alimentos fisiológicamente funcionales para la prevención de la

hipertensión arterial.
3.1.7.2. Capacidad antioxidante ORACFL
En la Tabla 26 se resumen los resultados obtenidos para la medición de la actividad

ORAC de los hidrolizados, en general, se observa que los mismos tienen una
capacidad antioxidante moderada.
Tabla 26 - Valores promedio de la actividad antioxidantes (ORACFL, Moles

Trolox/mg sólidos solubles) de extractos solubles menor a 3kDa de los
hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos bajo cuatro tratamientos
diferentes (promedio ± desviación estándar).
Proteasa 0,557 ± 0,006a 0,495 ± 0,031a 0,494 ± 0,026a 0,142 ± 0,029a
Proteasa
0,388 ± 0,039b 0,601 ± 0,063a 0,495 ± 0,021a 0,265 ± 0,034a
+ BAL
a,b: superíndices diferentes, en la misma columna, indican grupos significativamente
diferentes (p < 0,05).
Estos resultados fueron analizados estadísticamente mediante diseño factorial 2 3

utilizando paquete estadístico Statistica 7, y los resultados de la Tabla ANOVA se
muestran en el Anexo 3b. En este caso, resultaron significativas las interacciones
entre el factor T1 (método de concentración) y cada uno de los otros dos factores,
por lo cual se procedió a analizar ambas interacciones. No hubo interacción
significativa entre los factores T2 (tipo de lactosuero) y T3 (tipo de hidrólisis), y con
respecto al efecto individual de ambos, sólo resultó significativo el efecto del factor
T2. La actividad ORAC del lactosuero bovino resultó significativamente mayor
(p<0,05) que la del caprino: 0,510 vs 0,349 Moles Trolox/mg, respectivamente.
Con respecto al tipo de hidrólisis, a pesar de que en el caso específico del lactosuero
bovino ultrafiltrado hubo una actividad ORAC significativamente mayor cuando fue
105
hidrolizado solo con la proteasa, en general, el modelo demostró que el tipo de

hidrólisis, por sí solo, no tiene efecto significativo (p>0,05) sobre la actividad ORAC.
En la Figura 23a se muestra la interacción entre el método de concentración y el tipo

de lactosuero: con el proceso de ultrafiltración (T1:1), la actividad antioxidante es
similar en los dos tipos de suero (caprino y bovino); mientras que con la termo-
coagulación (T1:2) se obtuvo mayor actividad antioxidante con el suero bovino
(T2:2). Este resultado pareciera indicar que las proteínas lactoséricas caprinas
pierden mayor actividad antioxidante, por efecto de la temperatura, que las bovinas.
En la Figura 23b se muestra la interacción entre el método de concentración y el tipo

de hidrólisis: con la hidrólisis enzimática + fermento BAL (T3:2), la actividad
antioxidante es similar en los dos métodos de concentración; mientras que con la
hidrólisis enzimática, se obtiene mayor actividad antioxidante del suero concentrado
por ultrafiltración. Sobre la base de esto, se tiene que en general la desnaturalización
térmica de las proteínas del lactosuero reduce su capacidad antioxidante.
"T1"*"T2"; LS Means "T1"*"T3"; LS Means

Current effect: F(1, 16)=239,86, p=,00000 Current effect: F(1, 16)=51,405, p=,00000
Effective hypothesis decomposition Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,7 0,60
0,55
0,6
0,50
0,5
0,45
ORAC
ORAC
0,4
0,40
0,3
0,35
0,2 0,30
T2 T3
0,1 1 0,25 1
1 2 T2 1 2 T3
2 2
T1 T1
Figura 23 – Análisis gráfico de la interacción entre el método de concentración (T1:1-

Ultrafiltración, T1:2-Termocoagulación) y: a) el origen del lactosuero (T2:1-
caprino, T2:2-bovino); b) el tipo de hidrólisis (T3:1-enzimático, T3:2-enzima
mas BAL).
106
3.1.8. Identificación de péptidos bioactivos por HPLC-MS-MS
Los extractos solubles < 3kDa de los ocho tratamientos fueron analizados por HPLC-
MS-MS para identificar los péptidos que pudiesen ser responsables por la actividad
observada. En el Anexo 5 se muestran los espectros de masas de cada uno de
ellos. En la Tabla 27 se señalan las masas moleculares de los cinco péptidos mas
abundantes en cada tratamiento, se observa en general que los pesos moleculares
oscilan entre 800 y 1300 Da. Para determinar si había diferencias entre los distintos
tratamientos en cuanto a la distribución de estos pesos moleculares, se aplicó un
ANOVA en un diseño factorial 23 con los tres factores manejados hasta este punto:
método de concentración, tipo de lactosuero y tipo de hidrólisis. La tabla ANOVA se
muestra en el Anexo 6, donde se observa que el único factor que parece tener efecto
sobre la distribución de las masas moleculares es el tipo de lactosuero: la media de
los pesos moleculares de los péptidos en el lactosuero bovino fue significativamente
menor (p<0,05) que la de los del caprino.
Tabla 27 – Masas moleculares observadas en espectros HPLC-MS-MS de los ocho

tratamientos, agrupados por tipo de lactosuero.
Bovino Caprino
T2 T4 T5 T8 T1 T3 T6 T7
988,3 1039,3 1001,4 1001,5 1108,3 1114,2 1103,5 1070,5
950,3 877,4 1041,4 1041,4 1264,5 1264,5 1070,4 1340,5
1131,3 1110,4 887,4 887,4 1215,3 970,2 855,4 1232,5
1167,3 986,3 806,3 1259,5 919,2 877,3 1210,5 1017,4
877,3 948,4 1103,5 1158,5 1375,5 1070,4 1005,4 1270,6
A continuación se presenta la identificación de las secuencias de aminoácidos

correspondientes a los tratamientos que resultaron con mayor actividad IECA: el
número 1 (lactosuero caprino termocoagulado hidrolizado con mezcla enzima-cepa
BAL, Tabla 28) y el número 4 (lactosuero bovino termocoagulado hidrolizado con
mezcla enzima-cepa BAL, Tabla 29). Es de hacer notar que ninguno de los péptidos
107
identificados se corresponden con los arriba mencionados como mas abundantes,

esto se debe a que ninguno de estos dio un buen fraccionamiento en la trampa de
iones del equipo de masas, no pudiéndose identificar una secuencia con reducido
margen de error.
En el caso de tratamiento 1 (Tabla 28), de los péptidos derivados de la -LG, dos de

las secuencias coinciden con las identificadas previamente por MALDI-TOF:
DAQSAPLRVY y ALNENKVL. Como se mencionó anteriormente (página 101) estos
dos péptidos cumplen con las condiciones para inhibir la actividad de la enzima ECA.
Aplicando el análisis del extremo C-terminal, se tiene que el resto de los péptidos
identificados para la -LG, si cumplen con por lo menos una de esas condiciones.
Tabla 28 – Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto

soluble <3kDa del Tratamiento 1 (lactosuero de cabra termocoagulado
hidrolizado con proteasa + BAL)
DERIVADOS DE LA β-Lactoglobulina
Ion MS/MS Masa
m/z Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia
1347,5 (1) 1347,7 β-Lg cabra f(51-62) DAQSAPLRVYVE

1119,4(1) 1119,6 β-Lg cabra f(51-60) DAQSAPLRVY
1565,6 (1) 1565,8 β-Lg cabra f(63-76) ELKPTPEGNLEILL
1452,5 (1) 1452,8 β-Lg cabra f(63-75) ELKPTPEGNLEIL
1097,3 (1) 1097,6 β-Lg cabra f(63-72) ELKPTPEGNL
900,3 (1) 900,5 β-Lg cabra f(104-111) ALNENKVL
922,3 (1) 922,5 β-Lg cabra f(158-165) LKALPMHI
829,3(1) 829,4 β-Lg cabra f(116-121) DYKKYL
DERIVADOS DE LA Lactoferrina
Ion MS/MS Masa
m/z Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia
891,3 (1) 891,5 Lactoferrina cabra f(123-129) FQLDQLQ

873,31) 873,5 Lactoferrina cabra f(273-281) AVVARSVDG
El fragmento 158-165 (LKALPMHI) contiene el tetrapéptido Ala-Leu-Pro-Met

reportado por Murakami et al. (2004) como un poderoso inhibidor de la enzima ECA
108
al reducir la presión arterial en 21,4 mmHg, a pesar de no haber mostrado una buena
actividad in vitro, sugiriendo que el proceso de digestión intestinal lo corta en
dipéptidos Ala-Leu y Pro-Met, que al ser absorbidos pudieron ser los responsables
de tal reducción.
En el caso de los dos fragmentos derivados de la lactoferrina, ambos poseen un

aminoácido hidrofóbico, Leu o Gly, pero esto puede no otorgar ninguna ventaja para
interactuar con el sitio activo de la enzima ECA si los otros dos aminoácidos no
cumplen con uno de los requisitos señalados anteriormente (Tavares et al., 2011).
De igual forma, esas secuencias completas no aparecen reseñadas en la literatura
con alguna actividad biológica.
Con respecto al tratamiento 4 (Tabla 29) se identificaron fragmentos derivados de

tres proteínas del lactosuero: -LA, -LG y lactoferrina. La secuencia LDDDLTDD
apareció reportada por N'Negue et al. (2006) como fragmento de la -LA
correspondiente al dominio enlazador de calcio; y por Otte et al. (2007a) como parte
de un hidrolizado de esta proteína con Thermolysin® que demostró una moderada
actividad IECA.
El fragmento de la -LG DAQSAPLRVY ha sido obtenida utilizando otras enzimas:

proteasa N Amano (Ortiz-Chao et al., 2009) y proteasas extraidas de las flores de
Cynara cardunculus (Tavares et al., 2011); en ambos casos, han reportado una muy
buena actividad IECA in vitro.
La secuencia DTDYKKY de la -LG fue reportada por Ortiz-Chao et al. (2009) en una
de las fracciones con baja actividad IECA obtenidas de la hidrólisis de esta proteína
con proteasa N Amano.
Al igual que en lactosuero caprino, los fragmentos identificados como derivados de la

lactoferrina no cumplen con las condiciones para poseer actividad IECA y tampoco
aparecen reseñados en la literatura.
109
Tabla 29– Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el extracto

soluble <3kDa del Tratamiento 4 (lactosuero de vaca termocoagulado
hidrolizado con proteasa + BAL)
DERIVADOS DE LA α-Lactalbúmina
Fragmento
Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie proteina Secuencia
1141,3 (1) 1141,5 α-LA Vaca f(62-71) KDDQHPHSSN

921,1 (1) 921,4 α-LA Vaca f(81-88) LDDDLTDD
583,1 (1) 583,2 α-LA Vaca f(35-39) GYDTQ
1234,4 (1) 1234,6 α-LA Vaca f(14-25) DLKYGGVSLPE
658,1 (1) 658,3 α-LA Vaca f(19-25) GGVSLPE
DERIVADOS DE LA β-Lactoglobulina
Fragmento
Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie proteina Secuencia
1245,4 (1) 1245,6 β-Lg vaca f(125-135) TPEVDDEALEK

932,3(1) 932,4 β-Lg vaca f(96-102) DTDYKKY
1324,5 (1) 1324,7 β-Lg vaca f(47-58) KPTPEGDLEILL
743,1(1) 743,3 β-Lg vaca f(47-53) KPTPEGD
760,2 (1) 760,3 β-Lg vaca f(49-55) TPEGDLE
958,2 (1) 958,4 β-Lg vaca f(152-159) NPTQLEEQ
830,2 (1) 830,4 β-Lg vaca f(152-158) NPTQLEE
1119,4 (1) 1119,8 β-Lg vaca f(33-42) DAQSAPLRVY
DERIVADOS DE LA Lactoferrina
Ion MS/MS m/z Masa Calculada Proteina Especie Fragmento proteina Secuencia
1589,7 (1) 1589,8 Lactoferrina vaca f(413-426) ENRKSSKHSSLDCV

873,3(1) 873,4 Lactoferrina vaca f(420-427) HSSLDCVL
Hasta este punto, los lactosuero de ambas especies presentaron características

similares para ser consideradas como materia prima para el desarrollo del
ingrediente funcional. Ambos demostraron una buena actividad IECA al ser
hidrolizados mediante la combinación de proteasa y fermentación ácido láctica,
independientemente del método empleado para concentrar las proteínas. Pero con
110
respecto a la actividad ORAC, el lactosuero bovino hidrolizado demostró mayor

capacidad antioxidante.
Según Ribeiro y Ribeiro (2010) muchos autores han identificado a la leche de cabra
como un ingrediente funcional, gracias a sus propiedades para mantener la salud,
reducción de riesgos de enfermedades crónicas y modificación positiva de las
funciones fisiológicas. Por esta razón y por su potencial actividad IECA, se
seleccionó el lactosuero caprino para las últimas etapas del presente trabajo; para
compensar la deficiencia en la capacidad antioxidante, se evaluó la incorporación de
una fruta rica en polifenoles y otros antioxidantes en la formulación del producto
funcional.
Una consideración importante a tomar en cuenta en el desarrollo del ingrediente

funcional, fue señalada por van der Ven et al. (2002) sobre el hecho de que la
inhibición de la enzima ECA mediante el consumo de hidrolizados proteicos es el
resultado de la acción inhibitoria de varios péptidos presentes en ellos, por lo cual,
ellos propusieron, como la vía mas adecuada para mejorar la actividad IECA de un
hidrolizado, optimizar la composición peptídica completa de todo el hidrolizado, en
lugar de aislar los mejores y aplicarlos como concentrados individuales.
En este mismo sentido Didelot et al. (2006) sugirieron que la ingestión oral de un
péptido bioactivo purificado es menos efectivo que el consumo del hidrolizado
completo, puesto que la digestión gastro-intestinal puede liberar péptidos bioactivos
de este último, pero haría perder su actividad del péptido purificado. Sobre la base de
esto, el desarrollo del ingrediente funcional se realizó en función del hidrolizado
completo, y no de péptidos aislados, con buena actividad IECA in vitro.
3.1.9. Obtención del hidrolizado a nivel de Planta Piloto
Para el escalado en planta se seleccionó el tratamiento 1: lactosuero de cabra,

termocoagulado, hidrolizado por combinación proteasa-fermento ácido-láctico. A
111
partir de las modificaciones realizadas en la línea de producción se desarrollaron los

siguientes procedimientos:
3.1.9.1. Termocoagulación de la proteína soluble del lactosuero
Se trabajó con lotes de 60 Kg de lactosuero descremado. Se aseguró de que el pH

inicial del suero fuese mayor a 6,00 ya que de lo contrario no se produce la
coagulación de la proteína. Esto se logró procesando el lactosuero inmediatamente
después de retirarlo del tanque durante el desuerado de la cuajada en la elaboración
del queso. La suspensión final de proteínas (solución ricotta) resultó con una
concentración promedio de proteínas de 5,1% ± 0,4% (Tabla 31), para una
recuperación de 49,2% ± 4,3% de la proteína originalmente presente en el suero
(Tabla 30). Esta recuperación es menor que la obtenida a nivel de laboratorio
(7,43%), debido principalmente al cambio realizado en el escalado al no bajar el pH
una vez alcanzada la temperatura de desnaturalización; pero este cambio aseguró
una mayor solubilidad de la proteína desnaturalizada para evitar la sensación de
grumos en el producto final. El rendimiento promedio de 14,3 % en solución ricotta es
muy cercano al esperado de 15%, puesto que se estableció como paso en el proceso
de elaboración el retirar el 85% en peso del volumen original del lactosuero
procesado, de esta forma se buscó obtener un producto con una composición
estandarizada de una forma sencilla, considerando que el procedimiento se estuvo
diseñando para el productor artesanal, que cuenta con limitados recursos técnicos de
laboratorio.
Tabla 30 – Recuperación promedio de la proteína en la elaboración de las soluciones

de ricotta en planta (promedio ± desviación estándar).
Promedio ± desv. estándar
Peso suero (Kg) 55,0 ± 14,2
Peso ricotta (kg) 7,8 ± 2,1
% Rendimiento en solución ricotta 14,3 ± 1,1
Peso proteína en suero (Kg) 0,809 ± 0,295
Peso proteína en ricotta (Kg) 0,395 ± 0,136
% Recuperación de proteína en ricotta 49,2 ± 4,3
pH final de la ricotta 6,24 ± 0,08
112
En cuanto al contenido de lactosa se observa una reducción significativa, en vista de

que gran parte de ella se pierde en el suero retirado del tanque. El bajo nivel de la
grasa original se incrementó ligeramente, en la solución de ricotta, debido a que la
grasa tiende a quedar atrapada en la red de proteínas (Tabla 31).
Tabla 31 – Composición promedio de los cuatro lotes de solución ricotta elaborados

a nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar).
Lactosuero Sol. Ricotta
Sólidos Totales (%) 6,8 ± 0,3 9,1 ± 0,6
Proteínas (%) 1,5 ± 0,3 5,1 ± 0,4
Grasa (%) <0,5 0,6 ± 0,1
Cenizas (%) 0,61 ± 0,04 0,67 ± 0,05
Lactosa (%) 4,7 ± 0,1 2,7 ± 0,2
Humedad (%) 93,2 ± 0,4 90,9 ± 0,6
3.1.9.2. Hidrolizado de la suspensión de proteínas
En el paso anterior se obtuvo un total de 30,6 Kg de solución de ricotta, con un

contenido total de proteínas de 1,561 Kg, para lo cual fue necesario aplicar 46,8
gramos de proteasa, para una relación enzima/sustrato del 3% del peso de las
proteínas, y 5,9 gramos de la cepa BAL liofilizada para una proporción de 0,02% de
peso total de la mezcla con la solución de ricotta. El hidrolizado final, luego del
proceso térmico para desnaturalizar a la enzima y detener el proceso de hidrólisis,
presentó un pH promedio de 5,2 ± 0,1. El producto final se dividió en 7 partes
iguales, para tener porciones de 4,3 Kg del ingrediente funcional para la siguiente
etapa.
3.1.10. Caracterización del ingrediente funcional (fórmula final)
La composición porcentual promedio de los siete lotes de solución de ricotta

hidrolizada (Tabla 32), es muy similar a la de la solución original, las ligeras pérdidas
113
en agua y sólidos se debieron a procesos de evaporación y de adherencia de sólidos

en las paredes de la marmita debido al proceso térmico aplicado.
Tabla 32 - Composición promedio de los siete lotes de hidrolizado, elaborados a

nivel de escalado en planta piloto (promedio ± desviación estándar).
Sólidos Totales (%) 8,9 ± 0,9
Proteínas (%) 5,0 ± 0,4
Grasa (%) 0,6 ± 0,1
Lactosa (%) 2,6 ± 0,7
Cenizas (%) 0,72 ± 0,05
Humedad (%) 89,7 ± 4,1
La actividad IECA promedio de los siete lotes se muestra en la Tabla 33, así como
también el contenido de proteínas total de los extractos menores a 3 kDa, de cada
lote, de acuerdo a la determinación de N total por Kjeldahl, lo cual representa el
contenido de péptidos principalmente derivados de la hidrólisis. La actividad IECA,
expresada como IC50, del ingrediente funcional es de 13,66 ± 1,25 g/mL, es decir
que con esta concentración de péptidos se inhibe el 50% de la actividad de la enzima
ECA, y cada lote de 4,3 Kg de hidrolizado contiene en promedio 66,27 ± 1,23 g de
péptidos.
Tabla 33 – Actividad IECA (g/mL) y contenido total de proteínas (g) en el extracto

menor a 3 kDa (promedio ± desviación estándar), de los siete lotes preparados
de hidrolizado de la solución de ricotta (“ingrediente funcional”)
Extracto < 3kDa
IC50(g/mL) (g proteína/4300 g
hidrolizado)
Lote 1 11,84 ± 0,81 64,65 ± 0,71
Lote 2 15,02 ± 0,91 65,04 ± 1,27
Lote 3 12,02 ± 1,66 66,47 ± 0,62
Lote 4 15,29 ± 1,10 64,58 ± 1,63
Lote 5 12,97 ± 1,28 67,73 ± 1,72
Lote 6 13,89 ± 1,31 68,62 ± 1,62
Lote 7 14,60 ± 1,66 66,81 ± 1,02
114
Los hidrolizados de proteínas del lactosuero son considerados productos seguros y

no están sujetos a restricción alguna para su aplicación en alimentos (Contreras et
al., 2011). Se tiene así que el ingrediente desarrollado hasta este punto puede ser
aplicado en la formulación de un alimento funcional.
3.2. Desarrollo del yogurt natural batido funcional
Una vez obtenido el ingrediente funcional en cantidad suficiente para su

incorporación en el yogurt base, se procedió con la segunda etapa: la elaboración del
yogurt funcional y paralelamente del yogurt natural sin el hidrolizado.
El aspecto mas importante en esta formulación fue definir el contenido del

“ingrediente activo” a nivel de la ración diaria. Según se mencionó anteriormente, los
meta-análisis realizados por Pripp (2008) y Xu et al. (2008) no pudieron señalar una
dosis recomendada sobre la base de todos los estudios evaluados, ya que como
reportaron Seppo et al. (2003) la dosis empleada en los estudios clínicos publicados
varía desde 2,6 mg hasta 20000 mg, llegando a la conclusión de que la dosis de los
péptidos alcanza su máxima eficiencia en cantidades bien pequeñas, y que una dosis
mayor no necesariamente garantiza una mejor respuesta. Jauhiainen et al. (2010)
demostraron una reducción en la presión arterial con una dosis de 50 mg/día y una
tendencia a bajarla cuando la dosis fue de 5 mg/día.
En el presente trabajo se realizaron los cálculos para determinar la dosis que fue
factible alcanzar con la disponibilidad de hidrolizado fabricado. Al añadir 4,3 Kg del
hidrolizado fabricado, con un promedio de 66,27 g de péptidos, a un lote de 40 Kg de
leche de cabra, se consiguió que cada ración de 150g de yogurt natural alcanzara un
contenido medio de 224,4 ± 4,2 mg de péptidos, lo cual está dentro del rango
señalado por Seppo et al. (2003).
115
3.2.1. Perfil descriptivo del yogurt
En Tabla 34 se resumen los descriptores mencionados en la sesión de grupo con

panel semi-entrenado. Para cada atributo se seleccionó un descriptor. En la Figura
24, se muestra el perfil descriptivo de ambas muestras. Solo hubo diferencias
significativas para el atributo “cremosidad” (según prueba no-paramétrica de
Friedman, 95 % de confianza). Este resultado confirma lo señalado por Farnsworth et
al. (2006) sobre la dificultad de elaborar yogurt a partir de leche de cabra con una
consistencia comparable con el preparado usando leche de vaca. Ellos se lo
atribuyeron al bajo contenido de caseína S1 en la leche de cabra. Esta caseína
juega un papel primordial en la coagulación de la leche.
Tabla 34 – Resumen de los descriptores propuestos para el perfil descriptivo

del yogurt.
ATRIBUTO DESCRIPTORES MENCIONADOS
(* DESCRIPTOR SELECCIONADO)
APARIENCIA HOMOGENEIDAD*, firmeza-cremosidad, sinéresis
COLOR Uniforme, BLANCO*, brillo
OLOR Natural, ÁCIDO*, fresco, agradable
SABOR ÁCIDO*, dulzor
CONSISTENCIA Firmeza, CREMOSIDAD*, cuerpo, homogeneidad, grumosidad
Martín-Diana et al. (2003) al comparar los mismos tipos de yogurt, igualmente

obtuvieron una mejor calificación para la textura del yogurt elaborado con leche de
vaca en comparación con el de cabra y una calificación similar para la apariencia de
ambos. Sin embargo, en cuanto a las otras características evaluadas (aroma, sabor y
aceptabilidad general) ellos obtuvieron menor calificación para el yogurt de cabra, lo
cual difiere con el presente trabajo, cuyos resultados permiten afirmar que el yogurt
de cabra, en general, fue tan aceptado como el elaborado con leche de vaca.
116
homogeneidad
8
6
4
cremosidad blanco
2
cabra
0
vaca
sabor ácido olor ácido
Figura 24- Perfil descriptivo de un yogur de cabra y uno de vaca.
Este perfil descriptivo coincide con el elaborado por Vargas et al. (2008) sólo en
relación a la percepción del sabor ácido y a la consistencia en boca (o cremosidad).
En cuanto a ésta última propiedad, los autores le atribuyen la diferencia entre ambos
yogures a las variaciones en la micro-estructura de los geles. El de cabra presenta
un gel con menor grado de contracción, y por tanto, con poros más abiertos; esto se
lo atribuyeron a una menor intensidad de las fuerzas de atracción entre las micelas
de la leche de cabra, en comparación con las de la leche de vaca. Con respecto a las
otras características, sus resultados difieren de los del presente trabajo en: 1)
homogeneidad, señalaron que el de cabra presentaba menos grumosidad (mayor
homogeneidad), 2) sabor ácido, registraron una percepción similar para ambos tipos,
y 3) color blanco, señalaron que el color del de cabra se percibió mucho más blanco.
Es difícil llegar a una conclusión en cuanto al resto de los resultados de ambos
estudios, ya que las mismas se pueden deber tanto a factores intrínsecos de la
materia prima y del producto terminado, como por las condiciones en que se
realizaron los ensayos, incluyendo el panel y el entrenamiento recibido.
Martín-Diana et al. (2003) propusieron que para mejorar la textura del yogurt se debe
aumentar el contenido de sólidos no grasos de la leche y/o emplear fermentos
lácticos productores de exo-polisacáridos (EPS). Puesto que para este prototipo no
se pudieron incrementar los sólidos de leche de cabra, y adicionalmente, se deseaba
evitar el uso de estabilizantes no proteicos, se decidió buscar y seleccionar entre los
117
fermentos disponibles en el mercado, aquel con el cual se obtuviese un yogurt de

cabra con una consistencia lo mas cercana posible a la del yogurt elaborado con
leche de vaca, dentro de los parámetros de la norma COVENIN 2393:2001.
Para la selección del fermento láctico, se evaluaron las características de los yogures
elaborados con tres fermentos YoFlex® diferentes: YC-180, YC-280 y YC-380. En la
Tabla 35, se muestran los resultados obtenidos para la consistencia de cada yogurt,
así como su pH y acidez.
Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado con
diferentes fermentos Yo-Flex® (promedio ± desviación estándar).
Fermento YoFlex pH Acidez Consistencia (cP)
YC180 4,29 ± 0,01 a 1,15 ± 0,04 a 81975 ± 1703 a
YC280 4,50 ± 0,01 a 0,90 ± 0,05 a 58106 ± 2299 b
YC380 4,14 ± 0,01 a 0,92 ± 0,04 a 54413 ± 1095 b
(a,b) superíndices diferentes, en cada columna, indican diferencias significativas (p<0,05)
determinadas mediante prueba de rango no-paramétrica de Kruskal-Wallis.
El yogurt elaborado con YC-180 resultó con mayor consistencia, mientras que los
otros dos presentaron una consistencia menor, pero similar entre ellos. Estos
resultados no concuerdan con lo señalado por el proveedor, según el cual, el orden
de consistencia final, de mayor a menor, sería YC-280 > YC-180 > YC-380 (Chr.
Hansen A/S, Dinamarca). Sin embargo, se debe tomar en cuenta que esa
información se basa en ensayos realizados con leche de vaca, por lo cual, era de
esperar un comportamiento diferente considerando lo anteriormente mencionado
sobre las diferencias de la leche de cabra con respecto a la de vaca, especialmente
en el contenido de caseína S1. Por otra parte, mediante la evaluación sensorial de
las fórmulas prototipo, se observó que algunas de las características sensoriales si
coincidieron con las reseñadas por el proveedor (Chr. Hansen A/S, Dinamarca). El
yogurt YC-180, por tener un sabor “a yogurt” menos marcado presentó un mayor
sabor “a leche de cabra”, no detectable en las otras dos formulaciones; el YC-280
presentó buen sabor “a yogurt” pero la consistencia fue ligeramente filante; el YC-380
118
presentó un sabor “a yogurt” más intenso, pero a su vez se percibió como el más
ácido. Las formulaciones así elaboradas para cada tipo de fermento fueron
evaluadas mediante un panel semi-entrenado; en el Tabla 36 se resumen los
resultados. La formulación que recibió mejor puntuación fue la YC-380, con una
ponderación de 12,3 cm cercana al máximo de 15 cm (“me gusta mucho”). Las otras
dos formulaciones recibieron una puntuación cercana al punto medio (7,5 cm) el cual
se considera que denota indiferencia hacia ellos, ni gusto ni disgusto marcados.
Güler-Akin y Akin (2007) también obtuvieron alto puntaje en la evaluación sensorial
de un yogurt de cabra elaborado con el fermento láctico YoFlex® YC-380 de Chr.
Hansen (Peyman-Chr. Hansen, Turquía).
Tabla 36 – Puntaje promedio (expresada en cm) correspondiente a cada formulación

evaluada por un panel semi-entrenado (promedio ± desviación estándar).
Formulación Evaluación promedio
YC-380 12,3 ± 2,2 a
YC-280 7,6 ± 4,7 b
YC-180 6,8 ± 4,7 b
(a,b) superíndices diferentes indican diferencias
significativas (p<0,05) prueba de medias de Tukey.
En el Tabla 37 se muestran los resultados de los análisis microbiológicos para la

formulación YC-380. En este caso, también se observa que el prototipo cumplió con
los criterios microbiológicos de formulación.
Tabla 37 – Análisis microbiológicos realizados en la muestra de la fórmula prototipo.
Resultado Criterio de Formulación
Mohos y levaduras (UFC/g) < 10 < 103

Coliformes (NMP/g) 0,3 < 11
S. aureus (UFC/g) 6 < 103
B.A.L. (UFC/g) 2,8 x 108 > 106
UFC: unidades formadoras de colonias. NMP: número más probable.
119
Utilizando el fermento láctico YoFlex® YC-380, se elaboraron en total siete lotes de

yogurt natural con el hidrolizado y otros siete sin el ingrediente activo, con los cuales
de realizaron la evaluación sensorial, el estudio de vida útil y el estudio clínico.
3.2.2. Evaluación sensorial del yogurt natural con hidrolizado
En primer lugar, se planteó aplicar una prueba para determinar si los consumidores
podían detectar diferencias entre los dos lotes de yogurt elaborados, mediante una
prueba de Triángulo, con las siguientes hipótesis: Ho: A = B; Ha: A ≠ B. En la Figura
25 se muestran los resultados de la prueba triangular aplicada a dos muestras: A
(yogurt natural de cabra sin hidrolizado) y B (yogurt natural de cabra con hidrolizado).
Llevando estos resultados a la Tabla de Roessler et al. (1978), bajo la columna de
nivel de significancia de 0,05 se tiene que, para un total de 24 evaluaciones, se
requiere un mínimo de 13 aciertos para rechazar la hipótesis nula de que no hay
diferencia entre las muestras. Puesto que solo hubo 9 aciertos, se concluye que no
existe suficiente evidencia muestral para rechazar Ho, y por tanto, el panel no
detectó diferencias entre ambos yogurts.
ACIERTOS
9
ERRADOS
15
Figura 25- Resultados de la prueba triangular, con 12 panelistas, para determinar si

el consumidor puede detectar diferencia entre dos yogurts de leche de cabra
distinguidos por la incorporación o no de hidrolizado de lactosuero.
Una vez determinado que el yogurt con el hidrolizado no se diferenciaba al yogurt

natural sin hidrolizado se procedió a aplicar una prueba con 100 consumidores, a los
cuales se les suministró una muestra de yogurt natural de leche de cabra con
hidrolizado de lactosuero. La evaluación promedio, en una escala de 0 cm “me
120
disgusta mucho” a 15 cm “me gusta mucho”, fue de 11,19 ± 2,80 cm “me gusta un
poco”. Es decir que un 51% de los evaluadores le dieron al producto una evaluación
mayor a 11,3 cm; lo cual indica una buena aceptabilidad del producto. La principal
objeción entre el 49% que le dio una menor evaluación es el “sabor a cabra”,
“aguado” y el “alto” grado de acidez (Figura 26).
Aceptabilidad
6
Me disgusta un poco
23 13
Indiferente
Me gusta un poco
30
28
Me gusta
Me gusta mucho
Figura 26 – Diagrama de torta de la frecuencia de la aceptabilidad determinada

mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores.
3.2.3. Caracterización del yogurt natural funcional
Los lotes de cada tipo (con o sin hidrolizado) resultaron significativamente diferentes
(p<0,05) en los contenidos de humedad, sólidos totales y proteínas; pero no hubo
diferencias en grasa ni cenizas (Tabla 38). El contenido similar de grasa en ambos,
permitió enmascarar las diferencias en los otros componentes, ya que como se
demostró anteriormente la mayoría de los evaluadores no lograron diferenciar ambos
productos, a pesar de las ligeras diferencias en humedad y proteínas.
121
Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt
natural funcional (promedio ± desviación estándar).
sin hidrolizado con hidrolizado
Humedad (%) 88,44 ± 0,52b 86,33 ± 0,60a
Sólidos Totales (%) 11,56 ± 0,52b 13,67 ± 0,60a
Proteínas (%) 4,49 ± 0,37b 5,23 ± 0,30a
Grasa (%) 3,06 ± 0,06a 3,00 ± 0,06a
Cenizas (%) 0,71 ± 0,02a 0,76 ± 0,09a
a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05
3.3. Desarrollo del yogurt saborizado
El yogurt natural funcional de leche de cabra obtuvo una aceptabilidad promedio de

“me gusta un poco”, y adicionalmente la capacidad antioxidante del hidrolizado
seleccionado fue menor que el bovino.
En la tercera etapa de este trabajo, para mejorar la aceptabilidad del yogurt y para
aumentar la capacidad antioxidante del producto, se propuso la incorporación de un
saborizante natural no tradicional con moderada capacidad antioxidante: la fruta del
tomate de árbol (C. betacea Sendtn.).
3.3.1. Evaluación exploratoria inicial
La evaluación del concepto es una parte crítica del sistema de inteligencia de

mercado que ayuda a mejorar la toma de decisiones gerenciales suministrando
información relevante para el desarrollo de nuevos productos (Aaker y Day, 1990).
Los resultados estadísticos de la consulta sobre la intención de compra basada solo

en el concepto presentado, mostró una intención promedio de 4 (“probablemente SI
lo compraría”). Se observó además que un 84 % señaló que si lo compraría, bien sea
“probablemente” o “definitivamente”. Los que dieron respuestas negativas, lo hicieron
principalmente por el rechazo que sienten por el sabor de la leche de cabra.
122
Esta alta aceptabilidad del concepto puede deberse en parte al hecho señalado por
Huang et al. (2005) de que el término “antioxidante” se está haciendo muy popular en
la sociedad moderna gracias a la mayor cobertura que los medios de comunicación
están dando a los beneficios a la salud de aquellos que consumen mayores
cantidades de compuestos con capacidad antioxidante. Así, que sobre la base de
esta respuesta se pudo proseguir con la siguiente etapa del desarrollo.
3.3.2. Fórmula prototipo
Se realizó la evaluación preliminar de tres proporciones diferentes del yogurt base y

la mermelada. En el Tabla 39, se observa que la formulación de yogurt con menor
aceptabilidad (“me disgusta ligeramente”, p < 0,05) fue la de 90 % yogurt – 10 %
saborizante (T3). La que resultó con mayor aceptabilidad fue T1 (70 % yogurt – 30 %
saborizante) con una evaluación promedio de “me gusta ligeramente”. Al analizar la
composición de la formulación seleccionada 70:30 (yogurt:saborizante) se encontró
que la misma no cumplió con el criterio de formulación establecido previamente en
cuanto al contenido de proteínas. Al evaluar la composición de la materia prima
(Tabla 40) se encontró que el contenido de proteínas y grasas de la leche en el año
2010, a pesar de provenir del mismo rebaño, eran menores que los de años
anteriores. La razón para esta marcada disminución obedece a cambios en la
alimentación del rebaño.
Tabla 39 – Prueba no-paramétrica de Friedman (95 % de confianza), aplicada a los

valores obtenidos del panel de consumidores con los que se efectuó la
evaluación sensorial de diferentes formulaciones de yogurt.
Porción yogurt Porción Evaluación
Tratamiento x
(%) saborizante (%) promedio
T1 70 30 4
T2 80 20 3
T3 90 10 2
x
: Leyenda: 1 Me disgusta mucho; 2 Me disgusta ligeramente; 3 No me
gusta NI me disgusta; 4 Me gusta ligeramente y 5 Me gusta mucho
123
Tabla 40 – Comparación de los análisis químicos (promedio ± desviación estándar)

aplicados a la leche cruda de cabra en el presente trabajo (2010) con los
obtenidos por Salvador et al. (2006).
Año 2006(+) Año 2010(++)
Grasa (%) 4,82 ± 1,02 4,49 ± 0,02
Proteínas (%) 3,89 ± 0,66 3,17 ± 0,01
Lactosa (%) - 4,90 ± 0,01
Cenizas (%) 0,70 ± 0,99 0,79 ± 0,01
Humedad (%) 86,25 ± 1,58 86,65 ± 0,01
Sól.totales (%) 13,64 ± 1,58 13,35 ± 0,01
Sól. No Grasos (%) 8,80 ± 1,16 8,86 ± 0,02
(+) Rango de mediciones mensuales registradas durante todo el año 2006.
(++) Promedio de las mediciones (por duplicado) realizadas sobre la materia
prima utilizada en la elaboración del yogurt.
En vista de estos resultados, se procedió a ajustar la formulación a una proporción

75:25, no muy diferente a la seleccionada originalmente de 70:30. La nueva fórmula
presentó valores dentro de los criterios planteados al inicio del trabajo. En el Tabla 41
se muestran los resultados de la composición para esa formulación y se observa que
ésta cumplió con los criterios de formulación, en cuanto a grasa, sólidos no grasos de
la leche y acidez.
Tabla 41 – Composición de la fórmula prototipo con la proporción ajustada a 75 %

yogurt: 25 % mermelada.
Resultado Criterio de Formulación
Humedad (% p/p) 77,46 -

Proteína (% p/p) 3,03 ≥ 3,0
Grasa (% v/v) 3,15 < 3,2
S.N.G.L. (% p/p) 10,95 > 10
Carboh. (% p/p) 15,6 -
Cenizas (% p/p) 1,26 -
Acidez (% ac. L.) 1,05 > 0,7
124
3.3.3. Actividad antioxidante
Una vez seleccionada la formulación definitiva del yogurt saborizado se procedió a

evaluar la actividad antioxidante tanto de los productos en proceso (yogurt base y la
mermelada de tomate de árbol) como del producto final. En primer lugar se
determinó la actividad antioxidante del tomate de árbol, antes y después del
procesamiento aplicado para obtener la mermelada (Tabla 42). Se ha reseñado que
los compuestos fenólicos tienen la habilidad de secuestrar radicales libres debido a la
presencia de grupos hidroxilo en su estructura (Gulcın et al., 2003), por lo cual se
asume que la cuantificación del contenido de estos compuestos puede indicar el
grado de actividad antioxidante que puede poseer un vegetal determinado.
Tabla 42 – Contenido de Polifenoles y actividad ORAC de la pulpa de tomate de

árbol antes y después del procesamiento (promedio ± desviación estándar).
Polifenoles ORACFL
(mg GAE/ Kg muestra) (Moles Trolox/mg ss)
Pulpa Fresca 1512 ± 47 a 0,580 ± 0,083 a
Mermelada 792 ± 35 b 0,469 ± 0,033 b
(a,b) superíndices diferentes indican diferencias significativas (p<0,05)
GAE: gallic acid equivalents (equivalentes de ácido gálico).
ORACFL: Oxygen Radical Antioxidant CapacityFluorescein.
En el presente trabajo, el contenido de estos compuestos en la pulpa fresca de

tomate de árbol resultó mayor a los informados por Muñoz-Jáuregui et al. (2007) y
Vasco et al. (2008), de 627,1 y 810 mg GAE/kg de muestra, respectivamente; pero
menor al indicado por Ordóñez et al. (2010) de 2050 mg GAE/kg de muestra. La
divergencia en estos resultados se debe principalmente al tratamiento previo
aplicado a la muestra, en el caso de Muñoz-Jáuregui et al. (2007) realizaron una
extracción en etanol al 60 % y luego una concentración por rotoevaporación,
mientras que Ordóñez et al. (2010) homogenizaron la fruta fresca con agua destilada,
y posteriormente separaron el extracto acuoso por centrifugación a 4500 g x 10
minutos, de forma similar a la realizada en el presente trabajo. Mertz et al. (2009)
125
encontraron que el contenido de compuestos fenólicos en extractos con 70 %

acetona del tomate de árbol oscilaba entre 385 y 712 mg GAE/kg de muestra. Sólo
uno de los trabajos realizados con tomate de árbol presentó resultados de la
actividad ORACFL de extractos crudos similares a los preparados en el presente
trabajo. En la investigación de Mertz et al. (2009) los tomates de árbol amarillo y rojo
mostraron una actividad ORACFL de 6,5 y 10,0 μM Trolox equivalentes/g fruta fresca,
respectivamente. Estos autores resaltan así la mayor capacidad antioxidante del
tomate de árbol rojo en comparación con el amarillo, el cual no posee las
antocianinas presentes en la variedad roja. Sin embargo, resultó difícil la
comparación con los resultados del presente trabajo puesto que están expresados en
miligramos de sólidos solubles y no sobre el peso de la fruta fresca. Luego del
tratamiento térmico, el contenido de polifenoles se redujo en un 48 % con respecto a
la pulpa fresca sin procesar. Sin embargo, ese valor todavía es considerado como un
contenido moderado de compuestos fenólicos acorde a la clasificación presentada
por Muñoz-Jáuregui et al. (2007). La actividad ORACFL, por su parte, se vio reducida
en un 19 %. En cuanto a la actividad antioxidante del yogurt base, en el Tabla 43 se
observa que fue baja. Diversos autores han señalado que la capacidad antioxidante
total de la leche se debe principalmente a las caseínas (Hartmann y Meisel, 2007;
Zulueta et al., 2009a y 2009b). En la actividad ORACFL del yogurt batido con pulpa de
tomate de árbol, se observa que la incorporación de 25 % de mermelada de tomate
de árbol al yogurt, incrementó su actividad ORACFL en un 71 %.
Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada
de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar)
Yogurt ORACFL
(uMoles Trolox/mg ss)
Base (natural) 0,293 ± 0,016b

Batido con tomate de árbol 0,500 ± 0,049 a
(a,b) superíndices diferentes indican diferencias significativas (p<0,05)
ORACFL: Oxygen Radical Antioxidant CapacityFluorescein.
126
Se obtuvo así un producto con una moderada actividad antioxidante gracias a la

incorporación de los polifenoles presentes en la pulpa de tomate de árbol. Este
resultado concuerda con la propuesta de Han et al. (2011) de incrementar la
funcionalidad de los productos lácteos mediante la suplementación con polifenoles,
con el objetivo de desarrollar nuevos productos que tengan un impacto positivo en el
bienestar y salud del consumidor.
3.3.4. Prueba de aceptabilidad
Con la finalidad de conocer el efecto del agregado de fruta al yogurt para mejorar su
sabor, se realizó una prueba de aceptabilidad. A 100 consumidores se les suministró
una muestra de la formulación de yogurt elaborada con el fermento YC-380, y
mezclada con mermelada de tomate de árbol en una proporción 75:25.
La evaluación promedio, en una escala de 0 cm “me disgusta mucho” a 15 cm “me

gusta mucho”, fue de 12,44 ± 1,92 cm “me gusta”. Es decir que el 73% de los
evaluadores le dieron al producto una evaluación mayor a 11,3 cm; lo cual indica una
buena aceptabilidad del producto. La principal objeción entre el 27% que le dio una
menor evaluación es el “sabor a cabra” y el “alto” grado de acidez (Figura 27).
Se logró por tanto mejorar la aceptabilidad del yogurt, al incorporarle la mermelada

de tomate de árbol, al aumentar de 51% (en el yogurt natural) a 71% de los
evaluadores que calificaron el producto entre “me gusta” y “me gusta mucho”. Las
objeciones el sabor de cabra y grado de acidez, se redujeron de 49% a un 27% de
los consumidores.
127
Aceptabilidad
1
4
31 22 Me disgusta un poco
Indiferente
Me gusta un poco
Me gusta
Me gusta mucho
42
Figura 27 - Diagrama de torta de la frecuencia de los resultados de la aceptabilidad

determinada mediante escala no-estructurada de 15 cm con 100 consumidores.
3.4. Vida útil yogurt
En la cuarta etapa se realizó estudio para determinar la vida útil del yogurt funcional
de leche de cabra tanto natural como saborizado, durante el almacenamiento
refrigerado a 4°C durante 28 días. El pH del yogurt natural se redujo 0,18 unidades
entre el inicio y el final del ensayo, mientras que el saborizado se incrementó en 0,66
unidades (Figura 28). El comportamiento del yogurt natural fue el esperado; según
Güler-Akin y Akin (2007) el tiempo de almacenamiento afecta significativamente el
nivel de acidez del yogurt de leche de cabra: la acidez titulable aumenta mientras que
el pH disminuye. Ellos reportaron reducciones por el orden de unas 0,2 unidades de
pH en “bioyogurt” de leche de cabra. En el caso del yogurt saborizado, el incremento
del pH denota un cambio en la microbiología del producto.
128
7,00
6,00
Yogurt Natural
5,00
pH 4,00
3,00 Yogurt
Saborizado
2,00
1,00
d1 d7 d14 d21 d28
Días de almacenamiento
Figura 28 – Evolución del pH en muestras de yogurt de leche de cabra (natural y

saborizado) almacenado a 4°C
En la Figura 29 se muestra que la carga de coliformes totales se mantuvo por debajo

de 1 Log UFC/mL en ambos productos durante los 28 días de almacenamiento, y el
mismo nivel mantuvieron los hongos y levaduras en el caso del yogurt natural. El
yogurt saborizado mostró un recuento inicial de 1,5 Log UFC/mL, menor al máximo
de 3 log UFC/mL permitido según la norma Covenin 2393, pero a partir de los 21
días de almacenamiento el recuento supera los 2,7 Log UFC/mL. Este incremento en
la carga de levaduras puede explicar el cambio detectado en el pH de esta muestra.
Según Suriyarachchi y Fleet (1981) la introducción de azúcar y frutas en el yogurt
hace del yogurt un medio de crecimiento menos selectivo, pudiendo entonces
soportar el crecimiento de varias especies de levaduras. Ellos reportaron que 45% de
las muestras comerciales evaluadas presentaron cargas de levaduras superiores a 3
Log UFC/mL, y con una vida útil de alrededor de 20 días a 5°C y de menos de 12
días a 20°C. Una evaluación posterior del proceso de fabricación, aplicado en la
elaboración de las muestras del presente trabajo, reveló una contaminación del
producto por levaduras debido al equipo donde se realizó el mezclado de la
mermelada con el yogurt natural, ya que ni el yogurt natural ni la mermelada de
tomate de árbol, almacenados como testigos, mostraron presencia de levaduras.
129
7
6
Yogurt Natural (coliformes)
5
Log UFC/mL
4 Yogurt Saborizado
(coliformes)
3
Yogurt Natural (hongos y
2
levaduras)
1 Yogurt Saborizado (hongos y
0 levaduras)
d1 d7 d14 d21 d28
días de almacenamiento
Figura 29 – Crecimiento de coliformes, hongos y levaduras en muestras de yogurt de

leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C
En la Figura 30 se observa como el nivel de las BAL en el yogurt natural se mantiene

sobre los 6 Log UFC/mL exigido por la norma COVENIN 2393, mientras que en el
saborizado a los 28 días ya presentaba un nivel ligeramente inferior. Esto último va
en concordancia con el cambio en la flora bacteriana referido anteriormente en este
yogurt.
10
Recuento de BAL (Log UFC/mL)
9
8
7
6
5
4 Yogurt Natural
3 Yogurt Saborizado
2
1
0
d1 d7 d14 d21 d28
Figura 30 – Recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL) en muestras de yogurt de

leche de cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C
130
La actividad ORAC se mantuvo relativamente constante en ambos productos (Figura

31).
0,7
ORAC ( mg/g sólidos solubles)
0,6
0,5
0,4
0,3 ORAC Yogurt Natural
0,2 ORAC Yogurt Saborizado
0,1
0
d1 d7 d14 d21 d28
Figura 31 – Evolución de la actividad ORAC en muestras de yogurt de leche de

cabra (natural y saborizado) almacenado a 4°C
Solo se pudo determinar la actividad IECA en el yogurt natural los días 1 y 28,
obteniéndose los valores de IC50 de 10,24 ± 0,41 g/mL y 24,19 ± 5,74 g/mL,
respectivamente. Esto representa una ligera disminución en dicha actividad, pero
todavía muy superior al IC50 reportado por Tsai et al. (2008) de 240 a 226 g/mL
obtenido con la combinación de la fermentación ácido-láctica con la hidrólisis
enzimática. En un estudio de vida útil de una bebida con lactosuero hidrolizado,
después de seis semanas de almacenamiento a 4°C, se encontró que el producto
retuvo el 92% de la actividad IECA (Fluegel et al., 2010).
En las Figuras 32 y 33 se refleja la evolución de la aceptabilidad de yogurt natural y

el saborizado, respectivamente. En el primero, se observa que se mantiene una
buena aceptabilidad a lo largo de todo el ensayo, mientras que el saborizado ya
presenta un nivel de rechazo mayor el día 21, por lo cual se suspendió su
degustación en ese momento. Un total de tres (12%) evaluadores señalaron un sabor
“piche” o “pasado” del producto; un 56% lo evaluó a nivel de “me es indiferente” o por
debajo. Por lo tanto, se le dio una vida útil de solo 14 días al yogurt saborizado,
fabricado bajo las condiciones del presente estudio. Pero esa condición se puede
131
mejorar significativamente controlando el proceso térmico de la fruta y los puntos de

contaminación en la línea de fabricación.
15,0
14,0
13,0
12,0
11,7
Puntuación (cm)
11,5 11,3
11,0
10,0 10,1 10,2
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28

disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt natural con hidrolizado
de lactosuero. Total evaluadores por día=25.
15,0
14,0
13,0
12,0 11,4
Puntuación (cm)
11,3
11,0
10,0 9,6
9,0
8,0
7,5
7,0
6,0
5,0
DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28

disgusta mucho”=0 a “Me gusta mucho”=15) del yogurt saborizado con tomate
de árbol. Total evaluadores por día=25.
132
En el caso del yogurt natural, se confirma una vida útil de por lo menos 28 días, ya
que mantuvo sus propiedades organolépticas, microbiológicas y bioactivas durante
todo el periodo de evaluación. En vista de este resultado, se tomó la decisión de
realizar el estudio clínico con el yogurt natural.
3.5. Estudio clínico
La última etapa de este trabajo consistió en la ejecución de un estudio clínico para

evaluar el efecto antihipertensivo del yogurt funcional desarrollado en las etapas
anteriores. A partir de los resultados del Estudio Médico Integral (EMI-2011)
realizado en el IPP-APUCV, campus Maracay, se seleccionaron 54 pacientes
hipertensos que cumplieron con los criterios de selección. A todos se les convocó a
una reunión para explicarles los alcances del estudio, y al final de la misma, 39
accedieron participar voluntariamente, firmando el correspondiente consentimiento
escrito, y se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (Tabla 44). Mediante la
asignación aleatoria realizada por un estadístico, externo al presente trabajo, se
lograron obtener dos grupos equilibrados y semejantes en la distribución de sexo,
edad, talla y peso.
Tabla 44 – Distribución aleatoria de los participantes en el estudio clínico sobre el

efecto antihipertensivo de un yogurt funcional de leche de cabra a
GRUPO n HOMBRES HOMBRES MUJERES MUJERES

(n/rango de (Talla/ (n/Rango de (Talla/
edades)b Peso) b edades) Peso)b
Amarillo
(yogurt con 1,72±0,05 1,63±0,09
21 11 (32-64) 10 (36-62)
hidrolizado) 92±13 74±13
Anaranjado
(yogurt sin 18 11 (31-62) 1,72±0,06 7 (39-58) 1,59±0,07
hidrolizado) 87±5 73±6
(a) El grupo Amarillo representa el grupo “Tratamiento”, mientras que el Anaranjado
el grupo “Placebo”. (b) Edad en años; talla en m; peso en Kg.
133
A mitad del ensayo se retiró una de las participantes del grupo placebo, quien por
razones personales debía estar fuera de la ciudad de Maracay mas de dos semanas,
quedando por tanto este grupo conformado por 17 participantes y se descartaron los
datos correspondientes a la persona retirada.
Mediante una encuesta completada al final del estudio por cada participante (Anexo
9) se obtuvo la siguiente información con respecto al cumplimiento de las normas
acordada al inicio del ensayo, con respecto a la toma del producto. A la pregunta de
si consumieron su ración diaria los 42 días del ensayo, un 71% en el grupo placebo y
un 81% en el grupo tratamiento respondieron que sí; el resto dejaron de hacerlo de
uno a cuatro días en total. Con respecto al momento del día para la toma del yogurt,
en el grupo placebo un 77% lo tomó en la mañana, un 6% en la tarde y un 17% en la
noche, mientras que en el grupo tratamiento fue 52%, 24% y 24%, respectivamente.
Una persona en cada grupo varió un día el momento del consumo.
A la pregunta de haber sufrido molestias estomacales durante el ensayo, dos (11%)

personas en el grupo placebo y uno (5%) en el grupo tratamiento, manifestaron algún
grado de acidez, gases y/o cólicos. Sin embargo, ninguno le atribuyó estos síntomas
al consumo del producto. El 88% de los participantes del grupo placebo y el 100%
del grupo tratamiento manifestaron haberse sentido bien durante todo el ensayo.
Adicionalmente, se les solicitó evaluar la aceptabilidad general del producto, el 53%

del grupo placebo seleccionó “me gusta mucho”, 35% “me gusta” y 12% “me gusta
un poco”; para el grupo tratamiento fueron 33%, 43% y 24%, respectivamente. Esto
indica que el yogurt “placebo” obtuvo una mejor aceptabilidad que el yogurt con
hidrolizado (tratamiento). La única observación “negativa” manifestada por algunos
de los participantes fue con respecto a la consistencia del producto, al preferirlo un
poco mas firme. Sobre la base de lo expresado en esta encuesta, con respecto a la
falta de regularidad en el consumo de la ración diaria por parte de un 29% de los
participantes en el grupo placebo y 19% en el grupo tratamiento, correspondiente a
un total de 9 participantes, se procedió a determinar la variación neta en la presión
134
arterial entre la primera toma y la última para cada participante; los resultados se
muestran en la Tabla 45. Ese grupo de 9 personas mostró un incremento promedio
de 13 mmHg en la PAS y de 3 mmHg en la PAD. Por esta razón se procedió a excluir
todos los datos de estos 9 participantes de sus correspondientes grupos para los
análisis estadísticos.
Tabla 45 – Variación neta entre la presión arterial sistólica y diastólica de cada

participante al inicio y al final del estudio clínico*.
Grupo Participantes ΔPAS ΔPAD

(n) (mmHg) (mmHg)
Tratamiento
(Yogurt con hidrolizado) 17 Reducción 6 ± 6 Reducción 5 ± 5
Placebo
(Yogurt sin hidrolizado) 12 Reducción 9 ± 8 Reducción 6 ± 5
Eliminados 9 Aumento 13 ± 8 Aumento 3 ± 3

(*) El grupo Eliminados representa a los individuos que fueron excluidos del ensayo.
ΔPAS: variación de la presión arterial sistólica; ΔPAD: variación de la presión arterial
diastólica. Los valores de presión se representan como la media ± la desviación
estándar.
De esta forma, para el análisis final de los resultados del estudio clínico se
mantuvieron los datos de presión arterial de 17 personas en el grupo que recibió el
yogurt con el hidrolizado de lactosuero (grupo Tratamiento) y 12 personas en el
grupo que recibió el yogurt sin hidrolizado (grupo placebo). Al comparar ambos grupo
(Tabla 46), en cada día de toma de presión (DTP), se observa que no hay diferencias
significativas (p>0,05) entre las medias de la presión arterial sistólica (PAS). En el
Anexo 11 se resumen los análisis estadísticos aplicados.
Tabla 46 – Prueba de t-student para la comparación de los valores promedio de

presión arterial sistólica entre los dos grupos del estudio clínico.
Tratamiento Placebo p
(mmHg) (mmHg)
Inicio 136 ± 8,6 139 ± 9,3 0,2093
Final 130 ± 9,5 130 ± 10,7 0,8919
135
En la Tabla 47 se hace una comparación de las medias, pero dentro de cada grupo,
entre los valores PAS del día inicial vs la medición final, respectivamente. En ambos
grupo se observan diferencias significativas (p<0,05) entre el inicio y el final del
estudio. En el grupo que recibió el yogurt con hidrolizado la reducción de la PAS fue
de 6 mmHg, mientras que en el grupo que recibió el placebo fue de 9 mmHg.

presión arterial sistólica al inicio del estudio con respecto a la última toma de
presión arterial.
Promedio
Grupo (mmHg) p
Inicio 136 ± 8,6
Tratamiento
Final 130 ± 9,5 0,000930
Inicio 139 ± 9,3
Placebo
Final 130 ± 10,7 0,000371
En el caso de la presión arterial diastólica (PAD), al comparar la media de los dos

grupos en cada sesión de medición (Tabla 48), se observa que al principio existieron
diferencias significativas (p<0,05) entre ambos grupos, siendo la PAD media del
grupo tratamiento menor que la del grupo placebo, pero al final del ensayo las
medias de ambos grupos fueron similares (p>0,05).
Tabla 48 – Prueba de t-student de la comparación de los valores promedio de la

presión arterial diastólica entre los dos grupos del estudio clínico.
Tratamiento Placebo
(mmHg) (mmHg) p
Inicio 86 ± 6,6 90 ± 5,1 0,0128
Final 82 ± 4,5 84 ± 4,6 0,0591
Dentro de cada grupo se observa una disminución significativa de la PAD al final del
ensayo (Tabla 49), el grupo tratamiento se obtuvo una reducción de 4 mmHg en la
PAD, mientras en el grupo placebo fue de 6 mmHg. Tuomilehto et al. (2004)
obtuvieron un resultado similar y se lo atribuyeron al “acostumbramiento” de los
136
participantes con las mediciones de la presión sanguínea y con el personal del

estudio. Sin embargo, este no parece ser el caso en el presente estudio.

presión arterial diastólica al inicio del estudio con respecto al final.
Promedio
p
Grupo (mmHg)
Tratamiento Inicio 86 ± 6,6
Final 82 ± 4,5 0,000090
Placebo Inicio 90 ± 5,1

Final 84 ± 4,6 0,000002
La reducción significativa de la PAS y PAD en ambos grupos indica que un factor

común en ambos productos es responsable de esta reducción: un componente
presente originalmente en la leche de cabra con la cual se elaboraron ambos
productos o liberado durante el proceso de fermentación del yogurt. Datos
epidemiológicos han encontrado una asociación entre el consumo de proteínas
lácteas y la reducción de la presión sanguínea (Liu et al., 2002). La fermentación de
la leche, además de incrementar su valor nutricional, mejora la biodisponibilidad de
los nutrientes y la producción de sustancias que tienen funciones biológicas;
adicionalmente el contenido de calcio y fósforo se ha asociado con la reducción de la
presión sanguínea (Pihlanto et al., 2010). Hata et al. (1996) demostraron en un
estudio de 8 semanas con 30 pacientes hipertensos, bajo medicación, que el
consumo de leche fermentada disminuyó significativamente tanto la PAS como la
PAD. Ellos argumentaron que a pesar del reconocido efecto del calcio sobre la
presión arterial, en su estudio el grupo placebo recibió una leche, artificialmente
acidificada con el mismo contenido de calcio que el tratamiento, y no presentó una
reducción en este parámetro. Por tanto, ellos concluyeron que los efectos
hipotensivos se debían a otros factores diferentes al calcio, como por ejemplo
péptidos derivados de la fermentación láctica.
De los 15 estudios evaluados por Pripp (2008), solo en uno no hubo reducción en la
presión arterial; en el cual se utilizó un hidrolizado de lactosuero. Como señalan
137
estos autores, los péptidos antihipertensivos tienen la limitación de que son

susceptibles a degradación por enzimas presentes en el tracto digestivo.
Fluegel et al. (2010) tampoco encontraron una diferencia significativa en el cambio de

la presión arterial entre los dos grupos que participaron en un estudio clínico donde la
intervención consistió en una bebida láctea suplementada con hidrolizado de la
lactosuero para el grupo tratamiento, y una bebida similar sin el hidrolizado para el
grupo placebo. Sin embargo, al integrar los resultados de los dos grupos encontraron
una reducción significativa en ambas presiones, PAS (8 mmHg) y PAD (8,6 mmHg),
en los pacientes prehipertensos y solo en la PAS (3,8 mmHg) en pacientes con etapa
1 de hipertensión. Según ellos, ese resultado sugirió que la reducción en la presión
arterial se puede deber a otro factor diferente al péptido añadido, mencionando
también el hecho de haberse demostrado que el consumo de productos lácteos per
se tiene efecto antihipertensivo, probablemente porque la digestión gastro-intestinal
de las proteínas lácteas libera directamente los péptidos bioactivos; por lo cual, el
simple incremento en el consumo de proteínas lácteas puede contribuir a reducir los
problemas de hipertensión arterial. Al integrar los resultados de los 29 participantes
(Tabla 50) efectivamente incluidos en el análisis de resultados del presente estudio
se obtuvo que las reducciónes de 7,2 y 5,2 en PAS y PAD, respectivamente, están
por el mismo orden de magnitud a los reportados por Fluegel et al. (2010).
Tabla 50 – PAS y PAD promedio de los 29 participantes en el estudio clínico, al

inicio y final
Inicio Final VARIACIÓN (Δ)
Presión arterial
sistólica 137,5 ± 8,9a 130,3 ± 9,9b Reducción (7,2)
(mmHg)
Presión arterial
diastólica 87,7 ± 6,2a 82,5 ± 4,6b Reducción (5,2)
(mmHg)
(a,b) superíndices diferentes, en la misma fila, indican diferencias significativas (p<0,05)
138
Al agruparlos de esta forma también se observó también que la reducción fue

significativamente mayor (p<0,05) en la PAS en las mujeres (10,5 mmHg) en
comparación con la de los hombres (5 mmHg), según se muestra en el Anexo 12.
Estudios epidemiológicos han demostrado que una disminución de PAS y PAD de 5

mmHg puede llevar a una disminución en la incidencia de enfermedades
cardiovasculares del 7% y 16%, respectivamente (Xu et al., 2008; Fluegel et al.,
2010).
Por lo tanto, a pesar de que la suplementación con hidrolizado de lactosuero de

demostrada actividad IECA in vitro, no manifestó actividad in vivo en la concentración
evaluada, la reducción en la presión arterial obtenida en el presente estudio, indica
que el consumo regular de yogurt de leche de cabra puede tener un impacto positivo
en la reducción del riesgo de enfermedades cardiovasculares.
139
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. Conclusiones
En el presente trabajo, los hidrolizados de lactosueros bovinos y caprinos

demostraron tener actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina
(ECA), lográndose identificar péptidos potencialmente responsables de dicha
actividad.
Estos hidrolizados bioactivos pudieron ser obtenidos a nivel de planta piloto

aplicando un proceso de termocoagulación, cuyas características tecnológicas lo
hacen accesible para el pequeño y mediano productor.
La aplicación de la proteasa de A. oryzae, en combinación con la fermentación

ácido-láctica, en la hidrólisis de los lactosueros bovinos y caprinos, demostró ser
efectiva en la liberación de péptidos antihipertensivos, sin el amargor característico
de los hidrolizados proteicos.
El ingrediente funcional desarrollado con lactosuero caprino pudo ser incorporado

efectivamente en la formulación de un yogurt natural funcional.
Se aprovechó la capacidad antioxidante de la mermelada de la fruta del tomate de

árbol C. betacea Sendt. para incrementar esa bioactividad en el yogurt natural de
leche de cabra, lográndose al mismo tiempo una mejora significativa en su
aceptabilidad.
A pesar de la demostrada actividad IECA in vitro del yogurt funcional de leche de

cabra desarrollado en el presente trabajo, la dosificación seleccionada de 224
140
mg/día para el ensayo clínico no resultó ser efectiva en la reducción de la presión

arterial de pacientes hipertensos. Sin embargo, el estudio clínico demostró que el
consumo de yogurt de leche de cabra redujo tanto la presión arterial sistólica como
la diastólica, pudiendo constituir una importante ayuda en el control de la
hipertensión.
4.2. Recomendaciones
Determinar la concentración efectiva de péptidos en el hidrolizado de lactosuero

para obtener una actividad IECA in vivo.
Establecer mejoras en la fabricación de la mermelada de tomate de árbol para

aumentar su vida útil.
Realizar estudios para comprobar la actividad antihipertensiva mostrada por el

yogurt natural de leche de cabra, determinar el agente responsable y si puede ser
sujeto a manipulación para aumentar de manera controlada su actividad.
Desarrollar proceso artesanal para obtener extracto de la proteasa de A. oryzae

como medida para reducir los costos de este producto que actualmente solo se
consigue en el país por importación.
141
REFERENCIAS
Aaker, D., and Day, G. (1990). Marketing Research (4ta ed.). N.Y., EEUU: John
Wiley and Sons, Inc.
Abubakar, A., Saito, T., Kitazawa, H., Kawai, Y., and Itoh, T. (1998). Structural
analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by
proteinase k digestion. J Dairy Sci , 81, 3131–3138.
Adler-Nissen, J. (1982). Limited enzymic degradation of proteins: A new approach in
the industrial application of hydrolysates. J. Chem. Technol. Biot. , 32, 138-156.
Alvarado, C. (2001). Variación de la producción y composición de la leche de vacas
holstein, debido a factores no genéticos, en la región central de venezuela.
Trabajo presentado para el Ascenso a la categoría de Asistente en el escalafón
Docente, de acuerod a lo pautado por la Ley de Universidades vigente, Facultad
de Ciencias Veterinarias UCV, Maracay.
Alvarez, V. (2009). Fluid milk and cream products. En S. Clark, M. Costello, M. Drake,
and F. Bodyfelt, The sensory evaluation of dairy products (pág. 573 p.). NY:
Springer Sc. and Business Media, LLC.
Anónimo. (2006). A comer yogurt. (N. 2. Revista Producto, Productor) Recuperado el
16 de 01 de 2011, de http://www.producto.com.ve/272/notas/occidente/
occidente16.html
Barroso, K. (2008). Evaluación de pérdidas de caseína y grasa en sueros de tres
diferentes tipos de quesos. Maracay: Facultad de Agronomía UCV.
Basch, J., Douglas, F., Procino, L., Holsinger, V., and Farrell, H. (1985). Quantitation
of caseins and whey proteins of processed milks and whey protein concentrates,
application of gel electrophoresis, and comparison with harland-ashworth
procedure. J Dairy Sci , 68, 23-31.
Bauman, D., Mather, I., Wall, R., and Lock, A. (2006). Major advances associated
with the biosynthesis of milk. J. Dairy Sci. , 89, 1235-1243.
Bayram, T., Pekmez, M., Arda, N., and Yalcin, A. (2008). Antioxidant activity of whey
protein fractions isolated by gel exclusion chromatography and protease
treatment. Talanta , 75, 705-709.
Betoret, E., Betoret, N., Vidal, D., and Fito, P. (2011). Functional foods development:
trends and technologies. Trend Food Sci. Tech. , 22, 498-508.
Bisby, R., Brooke, R., and Navaratnam, S. (2008). Effect of antioxidant oxidation
potential in the oxygen radical absorption capacity (orac) assay. Food Chem. ,
108, 1002-1007.
142
Bordin, G., Cordeiro-Raposo, F., de la Calle, B., and Rodriguez, A. (2001).

Identification and quantification of major bovine milk proteins by liquid
chromatography. J. Chrom. A , 928, 63-76.
Brockman, C., and Beeren, C. (2011). Consumer perceptions of additives in dairy
products. En J. Fuquay, P. Fox, and P. McSweeney, Encyclopedia of dairy
sciences (Segunda ed., pág. 4068 p.). Londres, Inglaterra: Academic Press.
Cao, G., and Prior, R. (1998). Comparison of different analytical methods for
assessing total antioxidant capacity of human serum. Clinical Chem. , 44 (6),
1309-1315.
Carmel, A., and Yaron, A. (1978). An intramolecularly quenched fluorescent tripeptide
as a fluorogenic substrate of angiotensin-I-converting enzyme and of bacterial
dipeptidyl carboxypeptidase. Eur. J. Biochem. , 87, 265-273.
Casper, J., Wendorff, W., and Thomas, D. (1998). Seasonal changes in protein
composition of whey from commercial manufacture of caprine and ovine
specialty cheeses. J Dairy Sci , 81, 3117 - 3122.
CAVILAC. (2008). La industria lechera en Venezuela: su evolución. Cámara
Venezolana de Industrias Lácteas.
Chatterton, D., Smithers, G., Roupas, P., and Brodkorb, A. (2006). Bioactivity of b-
lactoglobulin and a-lactalbumin - technological implications for processing. Int.
Dairy J. , 16, 1229-1240.
Chen, G., Tsai, J., and Pan, B. (2007). Purification of angiotensin I-converting
enzyme inhibitory peptides and antihypertensive effect of milk produced by
protease-factilitated lactic fermentation. Int. Dairy J. , 17, 641-647.
Cheryan, M. (1998). Ultrafiltration and microfiltration handbook. Boca Ratón, FL,
EEUU: CRC Press LLC.
Cheung, I., and Li-Chan, E. (2010). Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory
activity and bitterness of enzymatically-produced hydrolysates of shrimp
(Pandalopsis dispar) processing byproducts investigares by taguchi design.
Food Chem. , 122, 1003-1012.
Chevalier, F. (2011). Electrophoresis. En J. Fuquay, P. Fox, and P. McSweeney
(Edits.), Encyclopedia of dairy sciences (Segunda Edición ed., págs. 185-192).
Londres, Inglaterra: Academic Press.
Clare, D., and Swaisgood, H. (2000). Bioactive milk peptides: a prospectus. J. Dairy
Sci. , 83, 1187-1195.
Conesa, C., Rota, M., Pérez, M., Calvo, M., and Sánchez, L. (2008). Antimicrobial
activity of recombinant human lactoferrin from Aspergillus awamori, human milk
lactoferrin and theri hydrolysates. Eur Food Res Technol , 228, 205-211.
Contreras, M., Hernández-Ledesma, B., Amigo, L., Martín-Álvarez, P., and Recio, I.
(2011). Production of antioxidant hydrolyzates from a whey protein concentrate
with thermolysin: optimization by response surface methodology. LWT-Food Sci.
Tech. , 44, 9-15.
143
Contreras, M., López-Expósito, I., Hernández-Ledesma, B., Ramos, M., and Recio, I.
(2008). Application of mass spectrometry to the characterization and
quantification of food-derived bioactive peptides. J. AOAC Int. , 91 (4), 981-994.
Cushman, D., and Cheung, H. (1971). Spectrophotometric assay and properties of
the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung. Biochemical Pharmacology ,
20, 1637-1648.
Dalrymple, D., and Parsons, L. (1990). Marketing Management. N.Y., EEUU: John
Wiley and Sons, Inc.
Dávalos, A., Gómez-Cordovés, C., and Bartolomé, B. (2004). Extending applicability
of the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-Fluorescein) assay. J. Agric.
Food Chem. , 52, 48-54.
Del Campo, R. (2010). Valoración de las propiedades antihipertensivas de un
hidrolizado de leche de vaca obtenido por procedimientos alimentarios. Instituto
Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria, Madrid. Vigo, España: INNAVES S.A.
Dent, M., O'Hagan, S., Braun, W., Schaetti, P., Margurger, A., and Vogel, O. (2007).
A 90-day subchronic toxicity study and reproductive toxicity studies on ace-
inhibiting lactotripeptide. Food Chem. Toxicology , 45, 1468-1477.
Didelot, S., Bordenave-Juchereau, S., Rosenfeld, E., Fruitier-Arnaudin, I., Piot, J.,
and Sannier, F. (2006). Preparation of angiotensin-I-converting enzyme
inhibitory hydrolysates from unsupplemented caprine whey fermentation by
various cheese microflora. Int. Dairy J. , 16, 976-983.
Durán, M., y Moreno-Álvarez, M. (2000). Evaluación de algunas mezclas de
solventes en la extracción de carotenoides del pericarpio de tamarillo
(Cyphomandra betacea Sendt). Cienc. Tecnol. Alimentos , 3 (1), 34-38.
Earle, M., Earle, R., and Anderson, A. (2001). Food product development. EEUU:
Woodhead Pub.
Erdmann, K., Cheung, B., and Schroder, H. (2008). The possible roles of food-
derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease. J.
Nutritional Bioch. , 19 (10), 643-654.
Espín, J., y Tomás-Barberán, F. (2007). Constituyentes bioactivos no-nutricionales de
alimentos de origen vegetal y su aplicación en alimentos funcionales. En M.
Juárez, A. Olano, F. Morais, and F. E. (FECYT) (Ed.), Alimentos funcionales
(pág. 310 p.). Madrid.
F.A.I.A. (2002). In the mix: additivies and ingredients for healthy eating. Londres:
Food Additivies and Ingredients Association.
Faría, J., García, A., y García, A. (2003). Eficiencia en la concentración de la proteína
de lactosuero con una planta móvil de ultrafiltración y nanofiltración. Revista
Científica FCV-LUZ , XIII (5), 347-351.
Faría, J., García, A., y Hernández, A. (2002). Efecto de la tecnología quesera sobre
la composición del suero lácteo. Multiciencias , 2 (2), 126 - 130.
144
Farnsworth, J., Hendricks, G., and Guo, M. (2006). Effects of transglutaminase

treatment on funcional properties and probiotic culture survivability of goat milk
yogurt. Small Ruminant Res. , 65, 113-121.
Fernández-Molina, J., y García-Rujano, T. (2010). Vida útil de los alimentos. San
Carlos, Cojedes, Venezuela: Horizonte, C.A.
Fluegel, S., Shultz, T., Powers, J., Clark, S., Barbosa-Leiker, C., Wright, B., Freson,
T., Fluegel, H., Minch, J., Schwarzkopf, L., Miller, A., and Di Filippo, M. (2010).
Whey beverages decrease blood pressure in prehypertensive and hypertensive
young men and women. Int Dairy j , 20, 753-760.
Fondonorma. (1989). Alimentos. Detección y recuento de S. aureus. Caracas: Norma
Venezolana COVENIN (1292).
Fondonorma. (1990). Alimentos. Método de recuento de mohos y levaduras. Norma
Fondonorma. (1996). Determinación del número más probable de coliformes,
coliformes fecales y de E. coli. Norma Venezolana COVENIN (1104).
Fondonorma. (1997e). Leche y sus derivados. Determinación de acidez titulable.
Norma Venezolana COVENIN (658).
Fondonorma. (1997a). Leche y sus derivados. Determinación de cenizas. Norma
Fondonorma. (1997f). Leche y sus derivados. Determinación de densidad. Norma
Venezolana COVENIN (367) .
Fondonorma. (1997b). Leche y sus derivados. Determinación de grasa. Norma
Fondonorma. (1997c). Leche y sus derivados. Determinación de humedad. Norma
Fondonorma. (1997d). Leche y sus derivados. Determinación de proteínas. Norma
Fondonorma. (2001). Yogurt, 3ra Revisión. Norma Venezolana COVENIN (2393).
Fong, B., Norris, C., and Palmano, D. (2008). Fractionation of bovine whey proteins
and characterisation by proteomic techniques. Int. Dairy J. , 18, 23-46.
Formaggioni, P., Summer, A., Franceschi, P., Malacarne, M., and Mariani, P. (2008).
Cheese yield: factors of variation and predictive formulas. A review focused
particularly on grana type cheeses. Ann. Fac. Medic. Vet. di Parma (XXVIII),
211-232.
Galindo-Amaya, L., Valvuena-Colmenares, E., y Rojas-Villarroel, E. (2006).
Estandarización de la detección del glicomacropéptido por PAGE-SDS como
índice de adulteración de leche. Rev Científica , 16 (3), 308-314.
García-Gómez, M., Huerta-Ochoa, S., Loera-Corral, O., and Prado-Barragán, L.
(2009). Advantages of a proteolytic extract by Aspergillus oryzae from fish flour
over a commercial proteolytic preparation. Food Chemistry , 112, 604-608.
145
Giardina, G. (1995). Utilización de las proteínas del suero para el enriquecimiento de

pastas alimenticias. Trabajo de Grado para optar al título de Ingeniero
Agrónomo, Facultad de Agronomía, UCV . Maracay.
Gómez, R., González, G., Mejía, A., y Ramírez, A. (1999). Proceso biotecnológico
para la obtención de una bebida refrescante y nutritiva. Interciencia , 24 (2),
205-210.
Gómez-Ruiz, J., Ramos, M., and Recio, I. (2002). Angiotensin-converting enzyme-
inhibitory peptides in manchego cheeses manufactured with different starter
cultures. Int. Dairy J. , 12, 697-706.
Güler-Akin, M., and Akin, M. (2007). Effects of cysteine and different incubation
temperatures on the microflora, chemical composition and sensory
characteristics of bio-yogurt made from goat´s milk. Food Chem. , 100, 788-793.
Guo, M., Park, Y., Dixon, P., Gilmore, J., and Kindstedt, P. (2004). Relationship
between the yield of cheese (chevre) and chemical composition of goat milk.
Small Ruminant Res. , 52, 103-107.
Guo, Y., Pan, D., and Tanokura, M. (2009). Optimisation of hydrolysis conditions for
the production of the angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides
from whey protein using response surface methodology. Food Chemistry , 114,
328-333.
Haenlein, G. (2004). Goat milk in human nutrition. Small Ruminant Res. , 51, 155-
163.
Han, J., Britten, M., St-Gelais, D., Champagne, C., Furtier, P., Samieri, S., and
Lacroix, M. (2011). Polyphenolic compounds as functional ingredients in cheese.
Food Chem. , 124, 1589-1594.
Haque, E., and Chand, R. (2006). Milk protein derived bioactive peptides. (W. M.
Mullan, Ed.) Recuperado el 16 de 11 de 2007, de
http://www.dairyscience.info/biopeptides.htm
Hartmann, R., and Meisel, H. (2007). Food-derived peptides with biological activity:
from research to food applications. Current Opinion in Biotechnology , 18, 163-
169.
Hata, Y., Yamamoto, M., Ohni, M., Nakajima, K., Nakamura, Y., and Takano, T.
(1996). A placebo-controlled study of the effect of sour milk on blood pressure in
hypertensive subjects. Am J Clin Nutr , 64, 767-771.
Henning, D., Baer, R., Hassan, A., and Dave, R. (2006). Major advances in
concentrated and dry milk products, cheese and milk fat-based spreads. J. Dairy
Sci. , 89, 1179-1188.
Hernández, G., y Moreno-Alvarez, M. (2000). Efecto del secado y del ácido cítrico
sobre la degradación de los carotenoides de tamarillo (Cyphomandra betacea
Sendt). Ciencia y Tecnología Alimentaria , 2 (5), 228-233.
146
Hernández, M., Pérez, J., Faría, J., y Boscán, L. (1992). Variación de los valores
proteicos en muestras de leche de la región zuliana (Venezuela). Revista
Científica FCV LUZ , II (1), 49-52.
Hernández-Ledesma, B., Amigo, L., Ramos, M., and Recio, I. (2004). Application of
high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to the
identification of biologically active peptides produced by milk fermentation and
simulated gastrointestinal digestion. J. Chrom. A. , 1049, 107-114.
Hernández-Ledesma, B., Quirós, A., Amigo, L., and Recio, I. (2007). Identification of
bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin
and pancreatin. Int. Dairy J. , 17, 42-49.
Hernández-Ledesma, B., Ramos, M., and Gómez-Ruiz, J. (2011). Bioactive
components of ovine and caprine cheese whey. Small Ruminant Res , 101, 196-
204.
Hernández-Ledesma, B., Ramos, M., Recio, I., and Amigo, L. (2006). Effect of -
lactoglobulin hydrolysis with thermolysin under denaturing temperatures on the
release of bioactive peptides. J. Chrom. A , 1116, 31-37.
Hernández-Ledesma, B., Recio, I., and Amigo, L. (2008). -lactoglobulin as source of
bioactive peptides. Amino acids , 35, 257-265.
Hironaka, T., Ohishi, H., and Masaki, T. (1997). Identification and partial purification
of a basic fibroblast growth factor-like growth factor derived from bovine
colostrum. J. Dairy Sci. , 80, 488-495.
Hogan, S., Zhang, L., Li, J., Wang, H., and Zhou, K. (2009). Development of
antioxidant rich peptides from milk protein by microbial proteases and analysis
of their effects on lipid peroxidation in cooked beef. Food Chem , 117, 438-443.
Huang, D., Ou, B., and Prior, R. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity
assays. J. Agric. Food Chem. , 53, 1841-1856.
Hurtaud, C., Peyraud, J., Michel, G., Berhelot, D., and Delaby, L. (2009). Winter
feeding systems and dairy cow breed have an impact on milk composition and
flavour of two protected designation of origin french cheeses. Animal , 3 (9),
1327-1338.
Ijäs, H., Collin, M., Finckenberg, P., Pihlanto-Leppälä, A., Korhonen, H., Korpela, R.,
Vapaatalo, H. and Nurminen, M. (2004). Antihypertensive opioid-like milk
peptide -lactorphin: lack of effect on behavioural tests in mice. Int. Dairy J. , 14,
201-205.
Jakymec, M., Morán, H., Páez, G., Ferrer, J., Mármol, Z., y Ramones, E. (2001).
Cinética de la producción de ácido láctico por fermentación sumergida con
lactosuero como sustrato. Revista Científica FCV-LUZ , XI (1), 53-59.
Jauhiainen, T., Rönnback, M., Vapaatalo, H., Wuolle, K., Kautiainen, H., Groop, P.,
and Korpela, R. (2010). Long-term intervention with lactobacillus helveticus
fermented mikl reduces augmentation index in hypertensive subjects. European
J. Clinical Nut. , 64, 424-431.
147
Jovanovic, S., Barac, M., Macej, O., Vucic, T., and Lacnjevac, C. (2007). SDS-PAGE
analysis of soluble proteins in reconstituted milk exposed to different heat
treatments. Sensors , 7, 371-383.
Kim, S., Seo, I., Khan, M., Ki, K., Lee, W., Lee, H., Shin, H. and Kim, H. (2007).
Enzymatic hydrolysis of heated whey: iron-binding ability of peptides and
antigenic protein fractions. J. Dairy Sci. , 90, 4033-4042.
Kitts, D., and Weiler, K. (2003). Bioactive proteins and peptides from food sources.
Current Pharmaceutical Design , 9 (16), 1309-1323.
Kong, X., Guo, M., Hua, Y., Cao, D., and Zhang, C. (2008). Enzymatic preparation of
immunomodulating hydrolysates from soy proteins. Bioresource Tech. , 99,
8873-8879.
Koolman, J., and Roehm, K. (2005). Color atlas of biochemistry. NY, EEUU: Thieme
Stuttgart.
Korhonen, H., and Pihlanto, A. (2006). Bioactive peptides: production and
functionality. Int Dairy J , 16, 945-960.
Korhonen, H., and Pihlanto-Leppälä, A. (2003). Milk-derived bioactive peptides:
formation and prospects for health promotion. En C. Shortt, and J. O´Brien,
Handbook of functional dairy products (págs. 109-124). Boca Ratón, Florida,
EE.UU.: CRC Press LLC.
Kou, M., Yen, J., Hong, J., Wang, C., Lin, C., and Wu, M. (2009). Cyphomandra
betacea Sendt phenolics protect LDL from oxidation and PC12 cells from
oxidative stress. LWT - Food Sc. Tech. , 42, 458-463.
Laemmli, U. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. 227, 680-685.
Li, L., Yang, Z., Yang, X., Zhang, G., Tang, S., and Chen, F. (2008). Debittering effect
of Actinomucor elegans peptidases on soybean protein hydrolysates. J Ind
Microbiol Biotechnol , 35, 41-47.
Lignitto, L., Cavatorta, V., Balzan, S., Gabai, G., Galaverna, G., Novelli, E., Sforza, S.
and Segato, S. (2010). Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of
water-soluble extracts of asiago d'allevo cheese. Int. Dairy J. , 20, 11-17.
Li-jun, L., Chuan-he, Z., and Zheng, Z. (2008). Analyzing molecular weight distribution
of whey protein hydrolysates. Food Bioprod. Proc. , 86, 1-6.
Lin, S., Sun, J., Cao, D., Cao, J., and Jiang, W. (2010). Distinction of different heat-
treated bovine milks by native-PAGE fingerprinting of their whey proteins. Food
Chemistry , 121, 803-808.
Lindsay, D. (2000). Maximising the functional benefits of plant foods. En G. Gibson,
and C. Williams (Edits.), Functional foods (pág. 374 p.). Cambridge, England:
Woodhead Pub. Limited.
Liu, L., Ikeda, K., Sullivan, D., Ling, W., and Yamori, Y. (2002). Epidemiological
evidence of the association between dietary protein intake and blood pressure: a
meta-analysis of published data. Hypertens. Res. , 25, 689-695.
148
López-Expósito, I., and Recio, I. (2006). Antibacterial activity of peptides and folding
variants from milk proteins. Int. Dairy J. , 16, 1294-1305.
Lucey, J. (2011). Acid- and acid/heat coagulated cheese. En J. Fuquay, P. Fox, and
P. McSweeney, Encyclopedia of Dairy Sciences (pág. 960 pp). Londres,
Inglaterra: Academic Press.
Madureira, A., Pereira, C., Gómes, A., Pintado, M., and Malcata, F. (2007). Bovine
whey proteins - overview on their main biological properties. Food Res. Int. , 40,
1197-1211.
Madureira, A., Pintado, A., Gomes, A., Malcata, F., y Pintado, M. (2009).
Recuperación y revalorización del lactosuero para la producción de nuevos
productos con propiedades funcionales. En J. Fontecha, I. Recio, A. Pilosof, and
F. Fontecha (Ed.), Funcionalidad de componentes lácteos (pág. 400 pp).
Madrid, España: CEE Limencop, S.L.
Marambe, P., Shand, P., and Wanasundara, J. (2008). An in-vitro investigation of
selected biological activities of hydrolysed flaxseed (Linum usitatissimum L.)
proteins. J Am Oil Chem Soc , 85, 1155-1164.
Márquez, C., Otero, C., y Cortés, M. (2007). Cambios fisiológicos, texturales,
fisicoquímicos y microestructurales del tomate de árbol (Cyphomandra betacea
S.) en poscosecha. Vitae , 14 (2), 9.16.
Martín-Diana, A., Janer, C., Peláez, C., and Requena, T. (2003). Development of a
fermented goat´s milk containing probiotic bacteria. Int. Dairy J. , 13, 827-833.
Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., and Hernández-Ledesma, B. (2012).
Antihypertensive peptides from food proteins: a review. Royal Soc. Chemistry .
McDonough, F., Mattingly, W., and Vestal, J. (1971). Protein concentrate from cheese
whey by ultrafiltration. J Dairy Sci , 54 (10), 1406-1409.
Mercier, A., Gauthier, S., and Fliss, I. (2004). Immunomodulating effects of whey
proteins and theri enzymatic digests. Int. Dairy J. , 14, 175-183.
Mertz, C., Gancel, A., Gunata, Z., Alter, P., Dhuique-Mayer, C., Vaillant, F., Pérez, A.,
Ruales, J. and Brat, P. (2009). Phenolic compounds, carotenoids and
antioxidant activity of three tropical fruits. J. Food Comp. Analysis , 22, 381-387.
Michaelidou, A. (2008). Factors influencing nutritional and health profile of milk and
milk products. J. Small Rum. Res.
Miguel, M., Gómez-Ruiz, J., Recio, I., and Aleixandre, A. (2010). Changes in arterial
blood pressure after single oral administration of milk-casein-derived peptides in
spontaneously hypertensive rats. Mol. Nutr. Food Res. , 54, 1422-1427.
Mizuno, S., Matsuura, k., Gotou, T., and Yamamoto, N. (2004). Release of short and
proline-rich antihypertensive peptides from casein hydrolysate with an
Aspergillus oryzae protease. J. Dairy Sc. , 87, 3183-3188.
Monsalve, J., y González, D. (2005). Elaboración de un queso tipo ricotta a partir de
suero lácteo y leche fluida. Revista Científica FCV-LUZ , XV (6), 543-550.
149
Montgomery, D., y Runger, G. (2004). Probabilidad y estadística aplicadas a la

ingeniería. México: McGraw-Hill Interamericana Editores, S.A. de C.V.
Mullally, M., Meisel, H., and Fitzgerald, R. (1997). Identification of a novel
angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide correspondeing to a tryptic
fragment of bovine b-lactoglobulin. FEBS Letters , 402, 99-101.
Muñi, A., Páez, G., Faría, J., Ferrer, J., y Ramones, E. (2005). Eficiencia de un
sistema de ultrafiltración/nanofiltración tangencial en serie para el
fraccionamiento y concentración del lactosuero. Revista Científica FCV-LUZ ,
XV (4), 361-367.
Muñoz-Jáuregui, A., Ramos-Escudero, D., Alvarado-Ortiz, C., y Castañeda, B.
(2007). Evaluación de la capacidad antioxidante y contenido de compuestos
fenólicos en recursos vegetales promisorios. Rev Soc Quím Perú , 73 (3), 142-
149.
Murakami, M., Tonouchi, H., Takahashi, R., Kitazawa, H., Kawai, Y., Negishi, H., and
Saito, T. (2004). Structural analysis of a new anti-hypertensive peptide (-
lactosin B) isolated from a commercial whey product. J. Dairy Sci. , 87, 1967-
1974.
Nicolai, T., Britten, M., and Schmitt, C. (2011). -Lactoglobulin and wpi aggregates:
formation, structure and applications. Food Hydrocolloids , 25, 1945-1962.
N'Negue, M., Miclo, L., Girardet, J., Campagna, S., Mollé, D., and Gaillard, J. (2006).
Proteolysis of bovine a-lactalbumin by thermolysin during thermal denaturation.
Int. Dairy J. , 16 (10), 1157-1167.
Ordóñez, R., Cardozo, M., Zampini, I., and Isla, M. (2010). Evaluation of antioxidant
activity and genotoxicity of alcoholic and aqueous beverages and pomace
derived from ripe fruits of Cyphomandra betacea Sendt. J. Agric. Food Chem. ,
58, 331-337.
Ortiz-Chao, P., Gómez-Ruiz, J., Rastall, R., Mills, D., Cramer, R., Pihlanto, A.,
Korhonen, H. and Jauregi, P. (2009). Production of novel ACE inhibitory
peptides from b-lactoglobulin using protease N amano. Int Dairy J , 19, 69-76.
Otte, J., Shalaby, S., Zakora, M., and Nielsen, M. (2007a). Fractionation and
identification of ACE-inhibitory peptides from -lactalbumin and -casein
produced by thermolysin-catalysed hydrolysis. Int. Dairy J. , 17, 1460-1472.
Otte, J., Shalaby, S., Zakora, M., Pripp, A., and El-Shabrawy, S. (2007b).
Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates:
effect of substrate, enzyme and time of hydrolysis. Int. Dairy J. , 17 (5), 488-503.
Ou, B., Hampsch-Woodill, M., and Prior, R. (2001). Development and validation of an
improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the
fluorescent probe. J. Agric. Food Chem. , 49, 4619-4626.
Ounis, W., Gauthier, S., Turgeon, S., Roufik, S., and Pouliot, Y. (2008). Separation of
minor protein components from whey protein isolates by heparin affinity
chromatography. Int Dairy J , 18 (10-11), 1043 - 1050.
150
Pan, D., Cao, J., Guo, H., and Zhao, B. (2012). Studies on purification and the
molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein
hydrolysate. Food Chem. , 130, 121-126.
Payet, B., Cheong, S., and Smadja, J. (2006). Comparison of the concentrations of
phenolic constituents in cane sugar manufacturing products with their
antioxidant activities. Agric. Food Chem. , 54, 7270-7276.
Peng, X., Xiong, Y., and Kong, B. (2009). Antioxidant activity of peptide fractions from
whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance. Food
Chemistry , 113, 196-201.
Peña-Ramos, E., and Xiong, Y. (2001). Antioxidative activity of whey protein
hydrolysates in a liposomal system. J Dairy Sci , 84, 2577-2583.
Pesic, M., Barac, M., Vrvic, M., Ristic, N., Macej, O., Stanojevic, S. and Kostic, A.
(2011). The distributions of major whey proteins in acid wheys obtained from
caprine/bovine and ovine/bovine milk mixtures. Int. Dairy J , 21, 831-838.
Pihlanto, A., Virtanen, T., and Korhonen, H. (2010). Angiotensin I converting enzyme
(ace) inhibitory activity and antihypertensive effect of fermented milk. Int. Dairy J
, 20, 3-10.
Ponstein-Simarro, A., vd Wiel, J., and Jonker, D. (2009). Safety evaluation of an IPP
tripeptide-containing milk protein hydrolysate. Food Chem. Toxicology , 47, 55-
61.
Powell, M., and Wines, B. (2004). IgG purification. En M. Aguilar, HPLC of peptides
and proteins: methods and protocols (págs. 341-350). New Jersey, EE.UU.:
Human Press, Inc.
Prieto-Velasco, C. (2007). Diseño y optimización de un reactor de membrana
discontinuo para la hidrólisis enzimática de proteínas. Departamento de
Ingeniería Química. Granada, España: Editorial de la Universidad de Granada.
Prior, R., Wu, X., and Schaich, K. (2005). Standardized methods for the determination
of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric.
Food Chem. , 53, 4290-4302.
Pripp, A. (2008). Effect of peptides derived from food proteins on blood pressure: a
meta-analysis of randomized controlled trials. Recuperado el 10 de 08 de 2010,
de Food and Nutrition Research: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
Prudencio, I., Schwinden, E., Fortes, E., Tomazi, T., and Bordignon-Luiz, M. (2008).
Petit suisse manufactures with cheese whey retentate and application for
betalains and anthocyanins. LWT , 41, 905-910.
Quiles, A., Gonzalo, C., Barcina, Y., Fuentes, F., and Hevia, M. (1994). Protein
quality of spanish murciano-granadina goat milk during lactation. Small
Ruminant Res , 14, 67-72.
Quintero, H., Rodríguez-Marval, M., Páez, G., Ferrer, J., Mármol, Z., and Rincón, M.
(2001). Producción continua de proteína microbiana (K. fragilis) a partir de suero
de leche. Rev. Científica FCV-LUZ , XI (2), 87-94.
151
Quirós, A. (2007). Leches fermentadas con actividad antihipertensiva: identificación

de péptidos y evaluación de su biodisponibilidad. Madrid, España: Universidad
Autónoma de Madrid.
Ramírez, A., y Rivas, N. (2003). Producción y caracterización parcial de b-
galactosidasa de Kluyveromyces lactis preparada en suero de leche
desproteinizado. Archivos Latinoamericanos de Nutrición , 53 (2).
Raynal-Ljutovac, K., Lagriffoul, G., Paccard, P., Guillet, I., and Chilliard, Y. (2008).
Composition of goat and sheep milk products: an update. Small Ruminant Res
(79), 57 - 72.
Repo, R., y Encina, C. (2008). Determinación de la capacidad antioxidante y
compuestos bioactivos de frutas nativas peruanas. Rev. Soc. Química Perú , 74
(2), 108-124.
Reyes, R., y Sanabria, O. (1993). Tomate de árbol. Recuperado el 13 de marzo de
2008, de http://www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page13.html
Ribeiro, A., and Ribeiro, S. (2010). Specialty products made from goat milk. Small
Ruminant Res , 89, 225-233.
Rizzello, C., Losito, I., Bobbetti, M., Carbonara, T., De Bari, M., and Zamboni, P.
(2005). Antibacterial activities of peptides from the water-soluble extracts of
italian cheese varieties. J. Dairy Sci , 88, 2348-2360.
Robles-Sánchez, M., Gorinstein, S., Martín-Belloso, O., Astiazarán-García, H.,
gonzález-Aguilar, G., y Cruz-Valenzuela, R. (2007). Frutos tropicales
minimamente procesados: potencial antioxidante y su impacto en la salud.
Interciencia , 32 (4), 227-232.
Roessler, E., Pangborn, R., Sidel, J., and Stone, H. (1978). Expanded statistical
tables for estimating significance in paired-preference, paired-difference, duo-
trio and triangle tests. J. Food Sci , 52 (6), 1721-1725.
Rojas, E., Valvuena, E., Torres, G., García, A., Piñero, M., and Galindo, L. (2009).
Aislamiento y rendimiento del gmp mediante precipitación de lactosuero con
ácido tricloroacético. Rev. Científica FCV-LUZ , XIX (3), 295-302.
Rossini, K., Noren, C., Cladera-Olivera, F., and Brandelli, A. (2009). Casein peptides
with inhibitory activity on lipid oxidation in beef homogenates and mechanically
deboned poultry meat. LWT Food Sc. Tech. , 42, 862-867.
Ruiz-Giménez, P., Salom, J., Marcos, J., Vallés, S., Martínez-Maqueda, D., Recio, I.,
Torregrosa, G., Alborch, E. and Manzanares, P. (2012). Antihypertensive effect
of a bovine lactoferrin pepsin hydrolysate: identification of novel active peptides.
Food Chem. , 131, 266-273.
Rutherfurd, S. (2010). Methodology for determining degree of hydrolysis of proteins in
hydrolysates: a review. J. AOAC Int. , 93 (5), 1515-1522.
Sabeena, K., Baron, C., Skall, N., Otte, J., and Jacobsen, C. (2010). Antioxidant
activity of yoghurt peptides: part 2 - characterisation of peptide fractions. Food
Chem , 123, 1090-1097.
152
Saint-Sauveur, D., Gauthier, S., Boutin, Y., and Montoni, A. (2008).

Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and
peptide fractions. Int. Dairy J. , 18, 260-270.
Salvador, A., Martinez, G., Alvarado, C., y Hahn, M. (2006). Composición de leche de
cabras mestizas canarias en condiciones tropicales. Zootecnia Trop , 24 (3),
307 - 320.
Schmidt, R., Packard, V., and Morris, H. (1984). Effect of processing on whey protein
functionality. J Dairy Sci , 67, 2723-2733.
Schulz, K., Altman, D., and Moher, D. (2010). CONSORT 2010 statement: Updated
guidelines for reporting parallel group randomised trials. J. Pharmacology and
Pharmacotherapeutics , 1 (2), 100-107.
Sentandreu, M., and Toldrá, F. (2006). A fluorescence-based protocol for quantifying
angiotensin-converting enzyme activity. Nature Protocols , 1 (5), 2423-2427.
Seppo, L., Jauhiainen, T., Poussa, T., and Korpela, R. (2003). A fermented milk high
in bioactive peptides has a blood pressure lowering effect in hypertensive
subjects. Am. J. Clin. Nutr. , 77, 326-330.
Shah, N. (2007). Functional cultures and health benefits. Int. Dairy J , 17, 1262-1277.
Siegel, S., y Castellan, J. (1995). Estadística no paramétrica (4 ed ed.). México:
Trillas.
Silva, S., and Malcata, X. (2005). Caseins as source of bioactive peptides. Int. Dairy
J. , 15, 1-15.
Singh, H. (2011). Aspects of milk-protein-stablilised emulsions. Food Hydrocolloids ,
25, 1938-1944.
Sipola, M., Finckenberg, P., Vapaatalo, H., Pihlanto-Lappälä, A., Korhonen, H.,
Korpela, R., Korpela, R., and Nurminen, M. (2002). -lactorphin and -lactorphin
improve arterial function in spontaneuously hypertensive rats. Life Sciences , 71,
1245-1253.
Smithers, G. (2008). Whey and whey proteins - from 'gutter-to-gold'. Int Dairy J , 18,
695-704.
Sola, C. (2007). Diseño de una planta de producción de leche pasteurizada, yogur y
postres lácteos (Vol. Proyecto de fin de carrera Ingeniería Química). Cádiz,
España: Universidad de Cádiz.
Spellman, D., McEvoy, E., O´Cuinn, G., and FitzGerald, R. (2003). Proteinase and
exopeptidase hydrolysis of whey protein: comparison of the tnbs, opa and pH
stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int. Dairy J , 13, 447-453.
Spellman, D., O'Cuinn, G., and FitzGerald, R. (2009). Bitterness in Bacillus
proteinase hydrolysates of whey proteins. Food Chemistry , 114, 440-446.
Stone, H., and Sidel, J. (1993). Sensory evaluation practices. San Diego, California,
EEUU: 2nd E. Academic Press, INC.
153
Storry, J., Grandison, A., Millard, D., Owen, J., and Ford, G. (1983). Chemical
composition and coagulating properties of renneted milks from different breeds
and species of ruminant. J Dairy Res , 50, 215-229.
Suh, H., Whang, J., kim, Y., Bae, S., and Noh, D. (2003). Preparation of angiotensin I
converting enzyme inhibitor from corn gluten. Process Biochem. , 38, 1239-
1244.
Suriyarachchi, V., and Fleet, G. (1981). Ocurrence and growth of yeast in yogurts.
Applied and environmental microbiology , 42 (3), 574-579.
Tabart, J., Kevers, C., Pincemail, J., Defraigne, J., and Dommes, J. (2009).
Comparative antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various
tests. Food Chem. , 113, 1226-1233.
Tavares, T., Contreras, M., Amorin, M., Pintado, M., Recio, I., and Malcata, F. (2011).
Novel whey-derived peptides with inhibitory effect against angiotensin-
converting enzyme: in vitro effect and stability to gastrointestinal enzymes.
Peptides , 32 (5), 1013-1019.
Taylor, W. (1957). Formol titration: an evaluation of its various modifications. Analyst ,
82, 488-498.
Thomä-Worringer, C., Sorensen, J., and López-Fandiño, R. (2006). Health effects
and technological features of caseinomacropeptide. International Dairy J. , 16,
1324-1333.
Tsai, J., Chen, T., Pan, B., Gong, S., and Chung, M. (2008). Antihypertensive effect
of bioactive peptides produced by protease-facilitated lactic acid fermentation of
milk. Food Chem. , 106, 552-558.
Tuomilehto, J., Lindström, J., Hyyrynen, J., Korpela, R., Karhunen, M., Mikkola, L.,
Jauhiainen, T., Seppo, L., and Nissinen, A. (2004). Effect of ingesting sour milk
fermented using Lactobacillus helvetivus bacteria producing tripeptides on blood
pressure in subjects with mild hypertension. J Human Hypertension , 18, 795-
802.
Uribarrí, L., Vielma, A., Páez, G., Ferrer, J., Mármol, Z., y Ramones, E. (2004).
Producción de ácido láctico a partir de suero de leche, utilizando Lactobacillus
helveticus en cultivo continuo. Rev. Científica FCV-LUZ , XIV (4), 297-302.
van der Ven, C., Gruppen, H., de Bont, D., and Voragen, A. (2002). Optimisation of
the angiotensin converting enzyme inhibition by whey protein hydrolysates using
response surface methology. Int. Dairy J. , 12, 813-820.
van Elswijk, D., Diefenbach, O., van der Berg, S., Irth, H., Tjaden, U., and van der
Greef, J. (2003). Rapid detection and identification of angiotensin-converting
enzyme inhibitors by on-line liquid chromatography-biochemical detection,
couple to electrospray mass spectrometry. J. Chrom. A. , 1020, 45-58.
Vargas, M., Cháfer, M., Albors, A., Chiralt, A., and González-Martínez, C. (2008).
Physicochemical and sensory characteristics of yoghurt produced from mixtures
of cows' and goats' milk. I. Dairy J. , 18 (12), 1146-1152.
154
Vasco, C., Ruales, J., and Kamal-Eldin, A. (2008). Total phenolic compounds and
antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chem. , 111, 816-823.
Vázquez-Puente, F., Villegas-Arroyo, G., and Mosqueda-Frías, P. (2010).
Precipitación de proteínas lactoséricas en función de la acidez, temperatura y
tiempo, de suero producido en comonfort, guanajuato, méxico. Rev. Venezolan
de Ciencia y Tecnología de Alimentos , 1 (2), 157-169.
Vermeirssen, V., van der Bent, A., Van Camp, J., van Amerongen, A., and Verstraete,
W. (2004). A quantitative in silico analysis calculates the angiotensin I
converting enzyme (ACE) inhibitory activity in pea and whey protein digests.
Biochimie , 86, 231-239.
Vinderola, G., de LeBlanc, A., Perdigón, G., and Matar, C. (2008). Biologically Active
Peptides Released in Fermented Milk: Role and Functions. En E. Farnworth
(Ed.), Handbook of fermented funcional foods. Boca Ratón, FL, USA: CRC
Press.
Virtanen, T., Pihlanto, A., Akkanen, S., and Korhonen, H. (2007). Development of
antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteria. J.
Applied Microbiology , 102, 106-115.
Walstra, P., y Jenness, R. (1987). Química y física lactológica. Madrid, España:
Acribia.
Walstra, P., Geurts, T., Noomen, A., Jellema, A., y van Boekel, M. (2001). Ciencia de
la leche y tecnología de los productos lácteos (1a ed.). Zaragoza, España:
Editorial Acribia.
Walzem, R., Dillard, C., and German, J. (2002). Whey components: millennia of
evolucion crete functionalities for mamalian nutrition: what we know and what
we may be overlooking. . Critical Rev. Food Sci , 42 (4), 353-375.
Webb, B., and Whittier, E. (1948). The utilization of whey: a review. J. Dairy Sci. , 31,
139-164.
Wendorff, B., and Paulus, K. (2011). Impact of breed on the cheesemaking potential
of milk; volume vs content. Dairy Pipeline , 23 (1), 1-4.
Wittig, E. (2001). Evaluación sensorial: una metodología actual para tecnología de
alimentos. Recuperado el 14 de 06 de 2008, de Edición digital, Biblioteca Digital
Universidad de Chile: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/
ciencias_quimicas_y_ farmaceuticas/wittinge01/index.html
Xu, J., Qin, L., Wang, P., Li, W., and Chang, C. (2008). Effect of milk tripeptides on
blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials. Nutrition , 24,
933-940.
Yang, S., and Silva, E. (1995). Novel products and new technologies for use of a
familiar carbohydrate, milk lactose. J Dairy Sc , 78 (11), 2541-2562.
Yorgun, M., Balcioglu, I., and Saygin, O. (2008). Performance comparison of
ultrafiltration, nanofiltration and reverse osmosis on whey treatment.
Desalination , 229, 204-216.
155
Zeman, L., and Zydney, A. (1996). Microfiltration and ultrafiltration - principles and
applications. Boca Ratón, FL, EEUU: CRC Press LLC.
Zulueta, A., Esteve, M., and Frígola, A. (2009b). ORAC and TEAC assays
comparison to measure the antioxidant capacity of food products. Food Chem. ,
114, 310-316.
Zulueta, A., Maurizi, A., Frígola, A., Esteve, M., Coli, R., and Burini, G. (2009a).
Antioxidant capacity of cow milk, whey and deproteinized milk. Int. Dairy J. , 19,
380-385.
156
Anexo1a
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,694915 p =,0580
1 2 3
1 0,447214 1,788854
2 0,447214 2,236068
3 1,788854 2,236068
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,086997 1,937926
2 2,086997 0,149071
3 1,937926 0,149071
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping) variable:
Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,608746 1,416176
2 2,608746 1,192570
3 1,416176 1,192570
157
Anexo1b
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,086997 0,596285
2 2,086997 1,490712
3 0,596285 1,490712
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
1 2 3
1 2,236068 1,788854
2 2,236068 0,447214
3 1,788854 0,447214
158
Anexo1c
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero vaca completo) Independent
1 2 3
1 0,149071 2,086997
2 0,149071 1,937926
3 2,086997 1,937926
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca completo) Independent
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca completo) Independent
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca completo) Independent
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
159
Anexo1d
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra completo) Independent
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero cabra completo) Independent
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra completo) Independent
1 2 3
1 2,236068 1,788854
2 2,236068 0,447214
3 1,788854 0,447214
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra completo) Independent
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra completo) Independent
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
160
Anexo1e
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
1 2 3
1 1,490712 2,310604
2 1,490712 0,819892
3 2,310604 0,819892
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
161
Anexo1f
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
162
Anexo 2 - Tabla del análisis ANOVA para la variable dependiente GH. Se obtuvo un
R2= 0,83052 con un error por falta de ajuste no significativo (P>0,01).
SS df MS F p
Blocks 0,604 2 0,3022 0,1108 0,895691
(1)pH (L) 457,985 1 457,9851 167,9965 0,000000
pH (Q) 4,117 1 4,1172 1,5102 0,234927
(2)T (L) 233,028 1 233,0281 85,4785 0,000000
T (Q) 63,865 1 63,8654 23,4269 0,000131
(3)E/S(L) 92,866 1 92,8657 34,0647 0,000016
E/S(Q) 4,196 1 4,1958 1,5391 0,230679
(4)t (L) 517,079 1 517,0792 189,6732 0,000000
t (Q) 103,899 1 103,8990 38,1119 0,000008
1L by 2L 357,248 1 357,2480 131,0444 0,000000
1L by 3L 5,929 1 5,9291 2,1749 0,157556
1L by 4L 71,859 1 71,8586 26,3589 0,000070
2L by 3L 33,117 1 33,1170 12,1479 0,002641
2L by 4L 9,092 1 9,0915 3,3349 0,084459
3L by 4L 4,973 1 4,9730 1,8242 0,193555
Falta de ajuste 355,084 58 6,1221 2,2457 0,029884
Error Puro 49,071 18 2,7262
Total SS 2384,656 92
163
Anexo 3a - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados IECA
Univariate Tests of Significance for IACE (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)
Sigma-restricted parameterization
SS Degr. of MS F p
Effect Freedom
Intercept 125199,1 1 125199,11055,1230,000000
"T1" 4460,0 1 4460,0 37,587 0,000014
"T2" 19299,0 1 19299,0 162,643 0,000000
"T3" 99494,1 1 99494,1 838,492 0,000000
"T1"*"T2" 1582,9 1 1582,9 13,340 0,002148
"T1"*"T3" 4178,9 1 4178,9 35,218 0,000021
"T2"*"T3" 23325,8 1 23325,8 196,579 0,000000
"T1"*"T2"*"T3" 1462,5 1 1462,5 12,325 0,002897
Error 1898,5 16 118,7
Anexo 3b - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados ORAC
Univariate Tests of Signi ficance for ORAC (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)
Sigma-restricted parame terization
SS Degr. of MS F p
Effect Freedom
Intercept 4,431582 1 4,431582 3841,441 0,000000
"T 1" 0,069445 1 0,069445 60,197 0,000001
"T 2" 0,101010 1 0,101010 87,559 0,000000
"T 3" 0,001305 1 0,001305 1,132 0,303238
"T 1"*" T2" 0,276705 1 0,276705 239,857 0,000000
"T 1"*" T3" 0,059302 1 0,059302 51,405 0,000002
"T 2"*" T3" 0,001395 1 0,001395 1,210 0,287693
"T 1"*" T2"*"T3" 0,000273 1 0,000273 0,237 0,633004
Error 0,018458 16 0,001154
164
Anexo 4
2
Coeficientes y R de las ecuaciones de la recta (y=ax+b) obtenidas en ensayo IECA para cálculo
de los IC50
muestra a b R
2
IC50 ( g/mL)
1-1 20,858 0,0535 0,9637 10,96
1-2 21,117 -0,5135 0,9637 10,94
1-3 18,699 7,4944 0,937 9,71
2-1 22,312 9,5732 0,9407 6,12
2-2 19,539 16,79 0,94 5,47
2-3 20,536 14,151 0,9643 5,73
3-1 18,364 6,5051 0,9784 10,68
3-2 17,748 7,9902 0,9915 10,67
3-3 18,765 5,0215 0,9837 10,99
4-1 18,919 21,672 0,9791 4,47
4-2 19,235 20,415 0,984 4,66
4-3 16,146 28,963 0,9918 3,68
5-1 20,637 -54,116 0,9973 155,26
5-2 20,666 -55,593 0,9867 165,59
5-3 18,655 -42,096 0,8559 139,32
6-1 18,016 -24,807 0,9691 63,58
6-2 19,756 -34,311 0,942 71,35
6-3 17,915 -24,396 0,9853 63,61
7-1 17,577 -27,966 0,9721 84,41
7-2 17,984 -31,688 0,958 93,90
7-3 18,134 -30,697 0,9732 85,63
8-1 21,680 -70,22 0,9908 256,01
8-2 21,406 -68,436 0,9929 252,86
8-3 19,003 -51,414 0,9292 207,83
165
Anexo 5 – Espectros de masa compuestos de ocho tratamientos de hidrólisis:
Intens. +MS, 10.5-62.6min #(204-1386)

x10 4
1.0
1108.3
0.8
1264.5
1215.3
0.6
919.2
1375.5
1090.3
0.4 779.2
843.2 1005.3
230.0
1056.3
1454.4
710.1
0.2
681.2
611.1
1572.6
515.0
360.0
1814.4 1870.1
390.9
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Compound mass spectrum tratamiento T1

Intens. +MS, 16.8-63.5min #(347-1423)
x10 4
1.0
988.3
0.8
950.3
1131.3
0.6
1167.3
877.3
788.2
1264.4
833.3
0.4
229.9
1421.4
720.2
0.2
585.1 643.1
263.9 1591.6
545.1
2066.3
359.9 441.0
1664.4 2147.7
1751.7
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z
Compound mass spectrum Tratamiento 2

166
Anexo 5 – continuación.
Intens. +MS, 17.4-61.8min #(360-1392)
x10 4
1114.2
3
1264.5
970.2
877.3
1070.4
1005.3
843.2
935.3
1215.4
229.9
1017.3
778.1
1167.3
1
1344.4 1429.5
653.2
706.1
1377.4
761.1
518.0 582.1
1591.6
1506.5
360.0
1687.7 1790.6 1839.2 2069.3
2012.3
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Intens. +MS, 17.4-61.9min #(360-1389)

x10 4
1039.3
2.5
877.4
1110.4
986.3
948.4
2.0
229.9
1.5
1265.5
1375.5
830.2
1.0
730.2
1211.4
760.2
658.2
0.5
1486.6
263.9
1465.4
496.1 1689.7
309.0
355.0
2133.5
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

167
Intens. +MS, 17.4-61.8min #(360-1395)

x10 5
1001.4
1.25
1.00
0.75
0.50
1041.4
887.4
0.25
806.3 1103.5
927.3
1211.5 1526.7
1259.5
1158.4
756.3
1325.5
229.9
1427.5
439.1 1466.5
546.1 603.1
324.1360.0
0.00
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Intens. +MS, 17.3-61.9min #(360-1410)

x10 4
1103.5
1070.4
855.4
6
1210.5
1005.4
1258.5
1292.5
932.3 1429.6
2
546.2
786.3
756.3 1333.5
701.2
860.3
654.2 916.3
229.9
439.1 617.2 1566.7

1680.7
360.0 497.1
262.9 1839.7 1939.3
392.0 2132.9
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

168
Intens. +MS, 17.4-61.9min #(360-1407)

x10 5
1070.5
2.0
1.5
1340.5
1.0
0.5
1017.4 1232.5
1270.6
900.4
229.9 1446.5
773.3
461.8 715.2
1502.5 1767.7
276.0 624.2 1591.7
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Intens. +MS, 17.4-61.8min #(360-1403)

x10 5
2.0
1001.5
1.5
1.0
1041.4
887.4
0.5
1259.5
1158.5
806.3 1103.5
756.3 927.3
696.3
1504.7
546.2 1325.5 1426.6

698.2
439.1 583.3
569.1
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

169
Anexo 6 – Tabla ANOVA diseño factorial 23 de la distribución de masas de los cinco

picos mas abundantes en los espectrosgramas HPLC-MS-MS de los ocho
tratamientos de hidrolizados
Univariate Tests of Significance for Masa (Spreadsheet1 in HPLCMSMS) Sigma-restricted

parameterization Type III decomposition
SS Degr. of MS F p
Intercept 45048577 1 45048577 2736,114 0,000000
Tipo 73969 1 73969 4,493 0,041893
Conc 32064 1 32064 1,947 0,172470
Hidrol 5777 1 5777 0,351 0,557786
Tipo*Conc 3793 1 3793 0,230 0,634521
Tipo*Hidrol 80 1 80 0,005 0,944733
Conc*Hidrol 53049 1 53049 3,222 0,082103
Tipo*Conc*Hidrol 7439 1 7439 0,452 0,506288
Error 526862 32 16464
170
Anexo 7
PLANILLA DE EVALUACIÓN DEL CONCEPTO
Buen día: en la Planta de Leche estamos desarrollando un nuevo producto, cuya descripción sería la
siguiente:
Saliste corriendo de tu casa…, no te dio tiempo de desayunar, necesitas algo rápido,

nutritivo y de buen sabor… Ahora cuentas con un yogurt batido, rico en nutrientes naturales y
de fácil digestión, porque es elaborado con leche pasteurizada de cabra y con una rica jalea
de frutas exóticas que aportan antioxidantes…
¡Un vasito de este excelente yogurt te proveerá de la energía y las proteínas necesarias
para estar alerta el resto de la mañana!
Pronto estará a la venta en un vasito de 150 g por solo BsF. 2,00
¿Comprarías este producto?

1 Definitivamente NO lo compraría______
2 Probablemente NO lo compraría______
3 Indiferente______
4 Probablemente SI lo compraría______
5 Definitivamente SI lo compraría______
RESULTADO:
TOTAL PERSONAS ENCUESTADAS: 25
Statistix 8.0
Descriptive Statistics
Variable N Mean SD C.V.
compra 25 4.1200 1.2689 30.798
Frequency Distribution of compra

Cumulative
Value Freq Percent Freq Percent
1 2 8.0 2 8.0
2 2 8.0 4 16.0
4 8 32.0 12 48.0
5 13 52.0 25 100.0
Total 25 100.0
171
Anexo 8
PLANILLA DE EVALUACIÓN (ANÁLISIS DESCRIPTIVO)
Teniendo presente lo acordado en la sesión previa donde se seleccionaron los descriptores de yogurt,
favor evaluar en la siguiente muestra los atributos señalados, marcando en la línea contigua la
calificación que usted le otorga.
POCO MUCHO
1) HOMOGENEIDAD
2) BLANCO
3) OLOR ÁCIDO
4) SABOR ÁCIDO
5) CREMOSIDAD
172
Anexo 9
TITULO: “Valoración de las propiedades antihipertensivas de un yogurt funcional de

leche de cabra”
En primer lugar debo expresarles mi agradecimiento por su participación en el

estudio clínico. Favor completar (desarrollar respuesta o marcar con una X) la
siguiente encuesta que servirá para redactar el informe final del mismo:
Nombre: _______________________________ Edad:____ Sexo: F____ M____
¿Color de marca de la tapa del envase? Amarillo ____ Naranja____
Consumió el producto durante los 42 días del ensayo Si ____ No____

¿Cuántos días dejó de consumirlo?: ____ explique _________________________
____________________________________________________________________
¿En qué momento del día consumió el producto? _______________________

¿Siempre lo hizo en ese mismo momento? SI____ NO____ explique
________________________________________________________________
¿Durante el ensayo, sufrió de alguna molestia estomacal? Si ____ No____ explique:

________________________________________________
¿Le atribuye esa molestia al consumo del yogurt? Si ____ No ____
En general, ¿cómo se sintió, en su estado de salud general, durante el ensayo?

Bien ____ Regular ____ Mal _____ , explique: ___________________________
__________________________________________________________________
Su apreciación del producto en general, favor indicarla en la siguiente escala:

Me gustó mucho_______ Me gustó ______ Me gustó un poco______
Ni me gustó Ni me disgustó____
Me disgustó un poco____ Me disgustó _____ Me disgustó mucho ______
Si el producto sale a la venta, con un rango de precio entre Bs 15 y 25:

Definitivamente lo compraría _______ Posiblemente lo compraría ______
Posiblemente no lo compraría_______ Definitivamente no lo compraría ______
Comentario personal: (opcional)

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
__________________________________________________________________
173
Anexo 10
PLANILLA PARA PRUEBA TRIANGULAR
Instrucciones:
1. Se le presentan 02 series de 03 muestras cada una. Favor PRUEBE CADA SERIE POR
SEPARADO.
2. Cada serie contiene DOS muestras IGUALES y UNA muestra DIFERENTE.
3. Pruébelas en el orden en que se le indica
4. Favor MARQUE CON UNA X LA MUESTRA DIFERENTE EN CADA SERIE.
5. Asegúrese de enjuagarse la boca entre cada muestra.
SERIE 1 654 230 895
SERIE 2 151 295 301
Observaciones:__________________________________________________
__________________________________________________________
Nombre:_________________________________ fecha: ________________
LOS CÓDIGOS EMPLEADOS PARA LAS MUESTRAS FUERO:
CON HIDROLIZADO: 230, 895, 301, 682.

SIN HIDROLIZADO: 742, 654, 151, 295.
ORDEN DE PRESENTACIÓN A LOS PANELISTAS(serie 1-serie 2):
BAB-BAA, ABA-ABB, AAB-ABB, AAB-BAB, BAA-BAB, AAB-BBA, BBA-ABA.

174
Anexo 11
Análisis estadístico (t-student)
Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el primer día de toma de presión arterial:
T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean 2 Mean 1 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 138,91 136,47 1,2649 85 0,209 36 51 9,30 8,57 1,177 0,587 0,536 85 0,465
PAD 89,61 86,27 2,540 85 0,012 36 51 5,14 6,58 1,638 0,127 7,712 85 0,0067
Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el último día de toma de presión arterial:
T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
PAS 130,05 130,35 -0,136 85 0,891 36 51 10,73 9,50 1,27 0,423 0,467 85 0,495
PAD 83,61 81,72 1,913 85 0,0591 36 51 4,606 4,47 1,0606 0,836 0,095 85 0,758
Comparación dentro del grupo tratamiento, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión
arterial:
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
PAS 136,47 130,35 3,4126 100 0,0009 51 51 8,575 9,505 1,228 0,469 0,4636 100 0,4975
PAD 86,27 81,72 4,0810 100 0,00009 51 51 6,585 4,472 2,167 0,0071 8,5032 100 0,0043
Comparación dentro del grupo placebo, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión
arterial:
PAS 138,91 130,05 3,741 70 0,0003 36 36 9,305 10,73 1,33 0,401 0,343 70 0,559
PAD 89,61 83,61 5,213 70 0,000002 36 36 5,145 4,606 1,247 0,516 0,620 70 0,433
Integrando los datos de todos los participantes, comparación del primer día (1) con el último (3) de
toma de presión arterial:
PAS 137,48 130,22 5,06 172 0,000 87 87 8,914 9,97 1,25 0,299 0,870 172 0,352
PAD 87,65 82,50 6,21 172 0,000 87 87 6,222 4,60 1,83 0,0054 3,446 172 0,0650
175
Anexo 12
EFECTO SEXO
MUJERES: INICIO vs FINAL
Mean Mean
t-value df p Va lid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
INICIO FIN
PAS 136,25 125,77 4,271 70 0,00006 36 36 11,11 9,630 1,332 0,399 1,163 70 0,2844
PAD 86,61 81,94 2,975 70 0,0040 36 36 8,25 4,522 3,328 0,001 10,911 70 0,0015
HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DE LA PAS (10,5 mm de Hg) reducción de COMO DE
LA PAD (4,7 mm de Hg).
HOMBRES: INICIO vs FINAL
Mean INICIO Mean FIN t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 138,35 133,37 3,118 100 0,002 51 51 6,947 9,046 1,695 0,064 1,546 100 0,2165
PAD 88,39 82,90 6,257 100 0,000 51 51 4,195 4,652 1,229 0,467 0,790 100 0,376
HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DEL PAS ( 5 mm de Hg) COMO DE LA PAD ( 5,5 mm
de Hg).
COMPARACIÓN EL DÍA INICIAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES
T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean Mean
t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
MUJERES HOMBRES
PAS 136,25 138,35 -1,084 85 0,281 36 51 11,118 6,947 2,560 0,002 12,063 85 0,0008
PAD 86,61 88,39 -1,320 85 0,190 36 51 8,250 4,195 3,867 0,000 18,004 85 0,0001
NO HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN LAS PAS y PAD ENTRE HOMBRES Y MUJERES AL
INICIO DEL ENSAYO
COMPARACIÓN EL DÍA FINAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES
T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean Mean
t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
MUJERES HOMBRES
PAS 125,77 133,37 -3,754 85 0,0003 36 51 9,630 9,046 1,133 0,675 0,711 85 0,401
PAD 81,94 82,90 -0,956 85 0,3416 36 51 4,522 4,652 1,058 0,870 0,022 85 0,882

Tesis Lacto Suero

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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS

CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO

AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS

Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por

CARLOS ENRIQUE ALVARADO CARRASCO

como requisito parcial para optar al grado académico de

Doctor en Ciencia de los Alimentos

Con la asesoría de la Prof.

Para Thais, Alejandra, Aída y Francisco, razones

A mi familia por su constante apoyo, cariño e inspiración.

A todo el personal de la Cátedra de Industria de la Leche y de la Carne, por la

A los investigadores del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación

A Lesbia, Jenny y Adriana, por su apoyo con el estudio clínico.

Al CDCH-UCV, Postgrado de Medicina Veterinaria y Fundacite Aragua, por los

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

AISLAMIENTO Y APLICACIÓN DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS DEL

El lactosuero desechado de la producción quesera nacional constituye una

Palabras clave: yogurt funcional, péptido bioactivo, lactosuero, ingrediente funcional.

APROBACIÓN DEL JURADO ..................................................................................... ii

2.1.6. Hidrólisis del lactosuero ............................................................................ 49

3.1.7. Actividad biológica de los hidrolizados.................................................... 100

Tabla 1 – Composición de lactosuero bovino. Tomado de Yang y Silva (1995).......... 9

Tabla 2 – Contenido promedio de sólidos totales, proteínas, lactosa, grasa y

Tabla 3 - Propiedades básicas de las principales proteínas del lactosuero bovino.

Tabla 4 – valores de los niveles de los factores seleccionados en el diseño

Tabla 5 – Identificación de los Tratamiento de acuerdo a las variables: origen,

Tabla 6 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de la reacción en el

Tabla 7 – Distribución (en L) de los diferentes componentes de reacción en

Tabla 8 – Gradiente de elución empleado en la corrida HPLC-MS-MS. ................... 57

Tabla 9 – Análisis físicos y químicos de la leche de vaca utilizada en la

Tabla 10 – Análisis físicos y químicos de la leche de cabra utilizada en la

Tabla 11 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta

Tabla 12 – Análisis físico y químico de los lactosueros obtenidos de la Planta

Tabla 13 – Análisis físicos y químico de lactosueros descremados (expresados

Tabla 14 – Análisis físico-químico de lactosueros descremados (expresados en

Tabla 15 – Peso molecular promedio (kDa) y la proporción relativa (%), estimado

Tabla 16 – Pesos moleculares promedio (kDa) de las proteínas del lactosuero,

Tabla 17 – Contenido promedio de proteínas y sólidos totales del retenido y

Tabla 18 – Contenido promedio de proteínas (base húmeda y base seca) y

Tabla 19 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado luego de 150 minutos de

Tabla 20 – Grado de hidrólisis (GH) final alcanzado de acuerdo a las

Tabla 21 – Contenido de proteínas (% p/p) de los extractos solubles menores de

Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso molecular, Da) presentes en los

Tabla 23 - Identificación de la secuencia de los péptidos presentes en los

Tabla 24 – Actividad inhibidora de la enzima ECA de extractos solubles menor a

Tabla 25 – Factores y niveles utilizados en el análisis estadístico de los

Tabla 26 - Valores promedio de la actividad antioxidantes (ORACFL, Moles

Tabla 27 – Masas moleculares observadas en espectros HPLC-MS-MS de los

Tabla 28 – Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el

Tabla 29– Secuencias de péptidos identificados por HPLC-MS-MS, en el

Tabla 30 – Recuperación promedio de la proteína en la elaboración de las

Tabla 31 – Composición promedio de los cuatro lotes de solución ricotta

Tabla 32 - Composición promedio de los siete lotes de hidrolizado, elaborados a

Tabla 33 – Actividad IECA (g/mL) y contenido total de proteínas (g) en el

Tabla 34 – Resumen de los descriptores propuestos para el perfil descriptivo del

Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado

Tabla 36 – Puntaje promedio (expresada en cm) correspondiente a cada

Tabla 37 – Análisis microbiológicos realizados en la muestra de la fórmula

Tabla 39 – Prueba no-paramétrica de Friedman (95 % de confianza), aplicada a

Tabla 40 – Comparación de los análisis químicos (promedio ± desviación

Tabla 41 – Composición de la fórmula prototipo con la proporción ajustada a 75

Tabla 42 – Contenido de Polifenoles y actividad ORAC de la pulpa de tomate de