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TESIS DOCTORAL
POR
MAYO, 2012
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIA DE LOS
ALIMENTOS Y NUTRICIÓN
DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
MARISA GUERRA
MAYO, 2012
ii
iii
iv
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
A mi tutora, por haberme aceptado como tesista y guiado, con mano firme y
respetuosa, durante todo el trayecto del postgrado.
A las Profesoras Marisa Gonzatti y Alexia Torres, por haberme permitido trabajar en
los laboratorios que dirigen. A la Dra Nardy Diez y su grupo de trabajo en la
Fundación IDEA por su colaboración y apoyo.
RESUMEN
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt
natural funcional (promedio ± desviación estándar)........................................ 121
Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada
de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar) .................................... 125
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 15- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del
lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por
proteasa de A. oryzae. ...................................................................................... 91
Figura 16- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del
lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de
proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica ...................................................... 93
Figura 24- Perfil descriptivo de un yogur de cabra y uno de vaca. .......................... 116
INTRODUCCIÓN
En general, en el país los yogurts saborizados tienen mayor demanda que los
“naturales”, y todos los fabricantes ofrecen presentaciones con frutas tradicionales
(fresa, piña, ciruela, durazno, etc.); ninguna marca comercial o artesanal incluye
como ingrediente una fruta no tradicional como, por ejemplo, el tomate de árbol
(Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur América
se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,
eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,
afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre
intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis
químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -
caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y
Moreno-Alvarez, 2000). Los compuesto fenólicos presentes en la fruta de C. betacea
Sendt protegen a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) de la oxidación y a los
cultivos de células neuronales PC12 del daño inducido por el estrés oxidativo (Kou et
al., 2009). Por estas razones, Han et al. (2011) propusieron incrementar la
funcionalidad de los productos lácteos mediante la suplementación con polifenoles,
con el objetivo de desarrollar nuevos productos que tengan un impacto positivo en el
bienestar y salud del consumidor.
Objetivo general
Objetivos específicos:
CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO
1.1. Lactosuero
Las diferencias en ambos tipos de suero, dulce y ácido, han sido ampliamente
estudiadas. Algunos autores señalan que el suero dulce además de presentar un pH
mas elevado, también posee mayor contenido de sólidos totales, proteínas, lactosa y
lípidos, pero menor de calcio y fósforo que los suero ácidos. De igual forma, en el
suero dulce habría mayor contenido de péptidos y aminoácidos debido a la
proteólisis producida por el cuajo (Schmidt et al., 1984).
Número de
Peso Molecular
Proteína residuos de pI
(kDa)
amino ácidos
18,3 (monómero)
-Lactoglobulina 162 5,2
36 (dímero)
-Lactalbúmina 14,2 123 4,5-4,8
Seroalbúmina (SBA) 66,3 582 4,7-4,9
22,0-27,0 (“cadena
ligera”) +
Inmunoglobulinas - 5,5-8,3
50,0–70,0 (“cadena
pesada”)
Lactoferrina 80,0 700 8,0-9,0
Lactoperoxidasa 70,0 612 -
Glicomacropéptido 6,7 64 -
mas amplio que las caseínas, las cuales muestran una baja resolución en estos
geles (Chevalier, 2011). Basch et al. (1985) describieron el patrón de proteínas por
el sistema SDS-PAGE del lactosuero dializado como conformado por tres bandas
claras en la parte superior del gel y dos bandas intensamente coloreadas en la parte
inferior, las primeras se corresponden con la lactoferrina (86 kDa), seroalbúmina (67
kDa) e inmunoglobulina de cadena pesada (~55 kDa), y las segundas con la -
lactoglobulina (18,4 kDa) y la -lactalbúmina (14,3 kDa). En las Figuras 1 y 2 se
muestran los patrones electroforéticos para lactosuero bovino y caprino,
respectivamente. En ambas se observan esas bandas, aunque ninguna de las dos
figuras identifica a la lactoferrina, esta banda se puede observar, en las muestras de
lactosuero (banda “raw” de la Figura 1; y las bandas 3-6 de la Figura 2) sobre las
bandas identificadas como seroalbúmina (BSA o SA).
Los autores de estas figuras sólo identifican la cadena pesada (“heavy chain”) de la
inmunoglobulina G, justo debajo de la seroalbúmina, y no la banda de la cadena
ligera (“light chain”) de la inmunoglobulina G, que se observa en ambos geles en la
zona central.
13
Casper et al. (1998) señalaron que el lactosuero caprino mostró una proporción
relativa de SA, IgG y -LG menor que la del bovino, pero mayor en el caso de la -
LA. Según Pesic et al. (2011) esta variación también se observó entre diferentes
trabajos y se reportó como la principal causa al efecto del período de lactación sobre
la distribución de las principales proteínas en el lactosuero caprino.
potencial función biológica que pueda tener un péptido una vez que entre en el tracto
digestivo. Un péptido con una secuencia apropiada y con un elevado potencial para
ejercer una función biológica específica, comprobada mediante ensayo in vitro,
puede no mostrar ningún efecto esperado en un ensayo in vivo, ya que después de
su ingestión oral, las enzimas gastrointestinales pueden cortar este péptido en otros
péptidos menores con una secuencia poco favorable para interactuar con los demás
elementos involucrados en determinado proceso biológico. Pudiendo también ocurrir
lo contrario, que esos fragmentos menores tengan una mayor potencia que el péptido
original (Miguel et al., 2010)
Por tanto, numerosos autores han demostrado que las propiedades funcionales de
una proteína que pueden ser alteradas por la hidrólisis dependen en gran medida del
grado hasta el cual dicha proteína ha sido hidrolizada (Spellman et al., 2003). Así se
tiene por una parte, estudios recientes han demostrado que después de la hidrólisis,
ciertos péptidos resultantes pueden ser empleados como antioxidantes naturales en
productos alimenticios (Peña-Ramos y Xiong, 2001); mientras que por otra, estudios
como el de Rizzello et al. (2005) han señalado que proteólisis intensas por largo
tiempo pueden ocasionar la hidrólisis de las secuencias biológicamente activas
haciéndolas perder su actividad.
de las cargas positivas de Lys (grupo -amino) y Arg (grupo guanidino) (Hernández-
Ledesma et al., 2008). En general, se reconoce que los péptidos que ofrecen
consistentemente una mayor actividad inhibidora de la enzima ECA: a) son de peso
molecular menor a 3 kDa (Lignitto et al., 2010); b) de cadena corta, de 3 a 20
residuos de aminoácidos por molécula; y c) frecuentemente portadores de residuos
polares como la prolina (Korhonen y Pihlanto-Leppälä, 2003; Hartmann y Meisel,
2007).
Otte et al. (2007a) obtuvieron cuatro potentes péptidos inhibidores de la enzima ECA
a partir de un hidrolizado de -lactalbúmina catalizado con termolisina, todos ellos
contenían la misma secuencia Pro-Glu-Trp en su extremo C-terminal. En estudio
realizado con la -Lactoglobulina (-Lg), Murakami et al. (2004) identificaron un
tetrapéptido conformado por los residuos de aminoácidos Ala-Leu-Pro-Met (f 142-
145) al cual denominaron “-lactosina B” para distinguirla del péptido “-lactosina A”
proveniente del f(78-80), previamente identificado en la misma proteína. La -
lactosina B mostró una fuerte actividad hipotensiva al ser administrado por via oral a
ratas espontáneamente hipertensivas (SHR), atribuida por los autores al residuo de
prolina presente en el tetrapéptido. En general, se ha encontrado que calentando la
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Un potente péptido ECA-inhibidor formado por el fragmento 108-110 del GMP, el cual
corresponde a Ile-Pro-Pro, ha sido purificado a partir de una bebida láctea japonesa;
y en estudios controlados, se ha encontrado que la presión sanguínea de pacientes
hipertensos disminuyó significativamente después de 4-8 semanas de ingesta diaria
de 95 mL de leche agria conteniendo este péptido junto con otro derivado de la -
caseína (Silva y Malcata, 2005). Se ha reportado así que, en comparación con el
GMP intacto, los hidrolizados trípticos del GMP exhibieron niveles más altos de
actividad inhibidora-ECA (Thomä-Worringer et al., 2006).
Los resultados de los ensayos de Tsai et al. (2008) indicaron que al fermentar leche
con bacterias ácido lácticas en combinación con una proteasa, obtuvieron una mayor
producción de péptidos activos inhibidores de la actividad de la enzima ECA, entre
los cuales resaltó como el de mayor bioactividad al péptido Tyr-Pro-Tyr-Tyr.
Concluyeron así que el suero de leche fermentado de esta forma puede ser
empleado en la elaboración de alimentos funcionales formulados para prevenir la
hipertensión.
Recientemente, Pan et al. (2012) reportaron un nuevo dipéptido con buena actividad
IECA in vitro, cuya secuencia fue confirmada como Leu-Leu con una masa de 226,85
Da correspondiente con el fragmento 4-5 de la -LG, obtenido mediante la hidrólisis
con tripsina. Como se puede observar, este péptido no contiene residuos de Pro,
Lys, Arg ni residuos aromáticos, pero cumple con la condición de poseer un
aminoácido hidrofóbico en el extremo C-terminal, la leucina. Mediante un modelo
computarizado ellos evaluaron el mecanismo molecular de “anclaje” del dipéptido en
el sitio activo de la enzima ECA, y encontraron que la interacción del péptido Leu-Leu
con el Zn2+ y los residuos de His383, Glu411 y His387, presentes en el sitio activo,
estabilizan el complejo péptido inhibidor-enzima, inactivando por tanto a la enzima
ECA. Ellos confirmaron la actividad IECA mediante un modelo animal con ratas
espontánemente hipertensas (SHR).
Hasta hace pocos años, la gran mayoría de los trabajos sobre péptidos
antihipertensivos, determinaban su actividad mediante el método del ácido hipúrico
(Cushman y Cheung, 1971) basado en la hidrólisis del péptido sintético hippuryl-L-
histidina-L-leucina (Hip-His-Leu) por la acción de la enzima ECA, con la liberación del
ácido hipúrico, como uno de los productos de la reacción, y su posterior extracción
con etil acetato, para luego determinar su concentración por espectrofotometría a
228 nm. El resultado se expresa como IC50, la concentración de péptidos ECA-
inhibidores que reducen la actividad de la enzima ECA en 50% (Murakami et al.,
2004; Hernández-Ledesma et al., 2007). Tsai et al. (2008) utilizaron el mismo
principio pero antes de la medición espectrofotométrica incorporaron una separación
por RP-HPLC.
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Ahora bien, el método del ácido hipúrico tiene importantes limitaciones, tales como el
requisito de la extracción con un solvente, lo cual restringe el número de muestras
que pueden ser analizadas por día e introduce una fuente adicional de error. En vista
de esto, Sentandreu y Todrá (2006) desarrollaron un protocolo para una
determinación precisa, rápida y sensible de la actividad de la enzima ECA. Este
método se basa en el tripéptido intramolecularmente fluorescente o-
aminobenzoilglicil-p-nitro-L-fenilalanila-L-prolina (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro) desarrollado
por Carmel y Yaron (1978). La hidrólisis del sustrato por la acción de la enzima ECA,
genera el producto fluorescente o-aminobenzoilglicina (Abz-Gly), el cual puede ser
cuantificado fluorimétricamente usando las longitudes de onda de excitación y
emisión apropiadas. La reacción se puede realizar en una placa de 96 pocillos y
leerse en un fluorímetro de microplacas. Este protocolo involucra solo una reacción
de una solo etapa, evitando posteriores derivatizaciones, extracciones con solventes
orgánicos o serparaciones cromatográficas de los productos de reacción.
Por otra parte, Dent et al. (2007) no encontraron evidencia de toxicidad al suministrar
dosis entre 500 y 4000 mg/Kg/dia a animales de laboratorio durante 90 días,
trabajando con soluciones de 0,21 mg/mL, 0,84 mg/mL y 1,68 mg/mL de los
lactotripéptidos IPP y VPP. Un estudio mas reciente por Ponstein-Simarro et al.
(2009) obtuvo resultados similares, confirmando que el consumo de productos
lácteos con hidrolizados proteicos, como fuente del lactotripéptido IPP, no tiene
efectos tóxicos.
Uno de los mas potentes y peligrosos gases sobre la tierra es el oxígeno. Los
sistemas vivos están protegidos contra la oxidación mientras estén vivos, pero se
30
Actualmente existe una creciente conciencia de que la protección contra los estragos
del oxígeno puede tener un efecto muy beneficioso sobre la salud, por lo cual, en la
última década se han cuadruplicado el número de publicaciones sobre antioxidantes
y estrés oxidativo (Huang et al., 2005). No existe duda que al incrementar el
consumo de antioxidantes se consigue prevenir tanto el cáncer como las
enfermedades cardíacas, pero no está claro cuales antioxidantes son los mas
efectivos (F.A.I.A., 2002).
Algunos componentes lácteos poseen capacidad antioxidante, esto es, son activos
en la prevención de la peroxidación lipídica y mantienen la calidad de la leche, e
incluso pueden ser usados como ingredientes en alimentos y fármacos para mejorar
la salud de los consumidores. Diversos autores han reportado que la capacidad
antioxidante total de la leche se debe principalmente a las caseínas (Hartmann y
Meisel, 2007; Zulueta et al., 2009b). Péptidos antioxidantes pueden ser liberados a
partir de la hidrólisis de las caseínas durante la fermentación de la leche por cepas
BAL proteolíticas, como el Lb. Delbrueckii subsp. bulgaricus (Korhonen y Pihlanto,
2006). Adicionalmente, se ha encontrado que la disminución en la oxidación de las
grasas lácteas se debe a las propiedades antioxidantes de los compuestos
sulfhidrilos formados naturalmente durante el tratamiento térmico de la leche
(Alvarez, 2009).
antioxidante de las proteínas del suero con la de sus hidrolizados. Sus resultados
sugieren que la actividad antioxidante es inherente a la secuencia de péptidos en la
-Lactoglobulina.
Existe una base de datos consistente que sugiere que aquellos consumidores que
tienen un alto consumo de alimentos de origen vegetal, poseen una incidencia mas
baja de cáncer y, probablemente, de otras enfermedades relacionadas con el
ambiente. En los alimentos vegetales, los sistemas neutralizadores de los ROS
incluyen a las vitaminas (E y C), las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa,
glutatión peroxidasa) y otros captadores de radicales no-vitamínicos, entre los que
destacan los polifenones (Espín y Tomás-Barberán, 2007). Por esta razón, los
polifenoles se incluyen entre los componentes o ingredientes considerados como
“funcionales”. Los compuestos fenólicos poseen diferentes actividades biológicas,
además de su capacidad antioxidante y por tanto, se consideran potenciales
reductores del riesgo de aparición de enfermedades cardiovasculares y de otras
enfermedades crónicas (Robles-Sánchez et al., 2007; Vasco et al., 2008).
De acuerdo con la revisión realizada por Huang et al. (2005), hasta el momento, no
se ha desarrollado un método analítico único y conveniente para la rápida
cuantificación de la efectividad antioxidante in vitro de un compuesto en la
prevención de enfermedades, sino que por el contrario se han propuesto un
sinnúmero de ellos. Estos autores clasificaron los numerosos métodos publicados,
dependiendo de las reacciones involucradas, en dos tipos: ensayos basados en la
transferencia de un átomo de hidrógeno (ensayos HAT) y ensayos basados en la
transferencia de electrones (ensayos ET). Estos últimos han tenido mayor aplicación
en la cuantificación de la capacidad antioxidante de los péptidos derivados de las
proteínas lácteas. A) Entre los ensayos HAT, aplicados en este campo, está el
empleado por Peña-Ramos y Xiong (2001), peroxidación de lípidos. Ellos
determinaron la habilidad inhibitoria de los péptidos contra la peroxidación de lípidos
en la membrana celular, empleando liposomas como sustrato para peroxidación. B)
Entre los ensayos ET, el primer ensayo reportado fue el TEAC (Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity Assay) y actualmente se ha popularizado el uso de su versión
34
La actividad biológica de los péptidos hasta ahora tratados depende del orden o
secuencia de los aminoácidos que los conforman, de allí la importancia de conocer
dicha secuencia para poder dilucidar el mecanismo molecular por el cual un péptido
en particular ejerce su efecto IECA (Pan et al., 2012) o antioxidante. El procedimiento
de obtener, aislar e identificar péptidos con actividad biológica, incluyendo la IECA y
35
Ahora bien, los hidrolizados son mezclas complejas y pueden contener hasta cientos
de diferentes moléculas, por lo cual, localizar péptidos bioactivos en este tipo de
muestras ha sido comúnmente una tarea difícil y que requiere mucho tiempo y
dedicación. Las fracciones usualmente contienen aún múltiples compuestos que
requieren ciclos adicionales de fraccionamiento, concentración y evaluación de
bioactividad para lograr identificar la molécula responsable de dicha actividad (van
Elswijk et al., 2003).
se han convertido en la vía principal para introducir nuevos productos bajo una
creciente tendencia a enfocarse en beneficios específicos para la salud (Brockman y
Beeren, 2011).
En el Pais hay mucha aceptacion por los yogures saborizados con frutas, pero no
existe ninguna marca comercial o artesanal que incluya como ingrediente al tomate
de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), al cual en diversos países de Centro y Sur
América se le atribuyen propiedades medicinales, en la curación de heridas y llagas,
eliminación de parásitos intestinales, afecciones de la garganta, dolores musculares,
afecciones del hígado, gripe, afecciones cutáneas, diabetes, reumatismo, “fiebre
intestinal” y mordeduras de serpientes (Reyes y Sanabria, 1993). Los análisis
químicos revelan que el fruto fresco de C. betacea es una fuente importante de -
caroteno (pro-vitamina A), vitamina B6, vitamian C, vitamina E y Hierro (Durán y
Moreno-Alvarez, 2000). También posee contenidos altos de potasio, magnesio,
fósforo, así como pectinas y flavonoides. Estos últimos comprenden los flavonoles,
antocianidoles y flavonas (todos presentes en el tomate de árbol), los cuales son
colorantes naturales con acción antioxidante que constituyen el grupo más
importante de la familia de polifenoles; estos compuestos protegen el sistema
cardiovascular y activan las enzimas glutation peroxidasa y catalasa, antioxidantes
presentes en nuestro organismo (Robles-Sánchez et al., 2007).
42
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1.3. Descremado
2.1.4. Electroforesis
Materiales: 1) solución madre de 30% p/v Acrilamida (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
EEUU); 2) solución buffer 1,5M Tris (pH 8,8) 27,23 g de Tris-base y agua destilada
c.s.p. 150 mL, ajustando pH a 8,8 con HCl; 3) solución buffer 1,0M Tris (pH 6,8)
12,0 g Tris-base y agua destilada c.s.p. 100 mL, ajustando pH a 6,8 con HCl;
46
4)solución 0,125M TrisHCl (pH 6,8) 1,5g Tris-base y agua destilada c.s.p.
100mL,ajustando pH a 6,8 con HCl;5)solución 10% SDS; 6) solución 10% persulfato
de amonio (APS); 7) Tetramethylethylenediamine (TEMED); 8) Úrea; 9) Glicerol; 10)
-Mercaptoetanol; 11) solución buffer de corrida 0,25M (electrodos) 3,03 g de Tris-
base, 18,77 g Glicina y 10 mL solución 0,1 % SDS; 12) solución buffer de carga,
4% SDS, 20% glicerol, 10% -mercaptoetanol, 0,625 mL solución 0,125 TrisHCl (pH
6,8), 0,002 azul de bromofenol; 13) gel de separación (15%): 16 mL solución madre
acrilamida 30%, 7,5 mL buffer de separación, 6M úrea, 10% SDS,10% APS, 0,012
mL TEMED; 14) gel de apilamiento (3%): 0,4 mL solución madre acrilamida 30%,
0,52 mL buffer de apilamiento, 0,04 mL 10% SDS, 0,04 mL 10% APS, 0,004 mL
TEMED, agua c.s.p. 4 mL; 15) solución de tinción: 100 mL sol. 0,1% Coomassie
Blue, 67,5 mL ácido acético, 360 mL metanol, 472,5 mL agua; 16) solución de
decoloración: 75 mL ácido acético, 50 mL metanol, 875 mL agua; 17) patrón de peso
molecular (BlueRanger prestained protein molecular weight marker mix, de Pierce,
Rockford, EEUU: miosina 215k, fosforilasa B 120k, BSA 84k, ovoalbúmina 60k,
anhidrasa carbónica 39,2k, inhibidor de tripsina 28k y lisozima 18,3k). Equipos: 1)
Equipo de electroforesis vertical (V20-EB-GRM de GIBCO BRL, Life Technologies,
Gaithersburg, EEUU); 2) Fuente de Poder; 3) Micropipetas de 1000 L, 100 L y 20
L. Procedimiento: 1) se prepararon 30 mL del gel de separación, vertiéndose
inmediatamente en el molde; una vez polimerizado, se prepararon 4 mL del gel de
apilamiento y se vertieron sobre el gel de separación, colocándose el peine para
formar los pozos para las muestras; 2) se mezclaron 15 L de cada muestra con 10
L del buffer de carga, en un tubo eppendorf de 1,5 mL, se incubaron a 37°C por 15
minutos; 3) una vez polimerizados ambos geles, aproximadamente 45 minutos, se
retiró el peine, se llevó el conjunto ensamblado con el gel al soporte del equipo; 4) se
vertió el buffer de corrida en las cavidades de los electrodos, asegurándose de cubrir
los pozos de descarga de muestra; 5) se cargaron 20L de cada mezcla de muestra
en los pozos, el marcador de peso molecular se cargó en el primer pozo; 6) se
ensambló el equipo y se conectó, dentro de una cava refrigeradora a 2°C, a la fuente
de poder; 7) se aplicaron las siguientes condiciones de corrida: 30 V constantes
hasta que la línea de corrida alcanzó el borde inicial del gel de separación, a partir de
47
La porción II se concentró por ultrafiltración empleando equipo DDS Lab. Módulo 20-
0,36-LAB marca RANNIE, ubicado en el Instituto de Química de FAGRO UCV,
Maracay. Este equipo consta de dos secciones principales: la columna donde se
ensamblan las membranas (Figura 7b) y el motor compresor (Figura 7a). El módulo
de membranas ensamblado en la columna consiste de 20 marcos separadores
(Figura 7c), 10 soportes de membrana con salida para permeado (Figura 7d), 20
láminas de papel filtro (Figura 7e) y 20 membranas semipermeables de acetato de
celulosa tipo 600 cm con área efectiva de 0,36 m2 (Figura 7f). Las condiciones de
trabajo aplicadas fueron las señaladas por Giardina (1995): a) caudal de 8
litros/minuto; b) rango de presión de entrada de 10 a 15 atm; c) rango de presión de
salida de 15 a 20 atm; d) presión hidráulica como contrapresión de 20 Ton. Se
48
a b
c d e f
proteínas, en ese punto se añadió ácido acético hasta reducir pH hasta 4,6; se
mantuvo la agitación y el calentamiento por 20 minutos. Se colocó en baño de maría
invertido hasta alcanzar una temperatura entre 40 y 45°C, y luego de lo cual se filtró
a través de papel de filtro (Whatman N°1). La proteína retenida en el papel de filtro se
pesó, se empacó en envase hermético y se almacenó a -20° C. El escalado de este
procedimiento, a nivel de planta semi-industrial, se describe mas adelante en una
sección posterior.
Para “liberar” los péptidos bioactivos que pudiesen estar contenidos en algunas de
las secuencias de aminoácidos contenidos en las proteínas del lactosuero es
necesario aplicar una hidrólisis enzimática. Ésta hidrólisis debe ser parcial, puesto
que se desean obtener péptidos entre 3 y 20 residuos de aminoácidos, por lo cual se
hace necesario, en primer lugar, determinar las condiciones de temperatura, pH,
relación enzima/sustrato y tiempo de incubación, para obtener un grado de hidrólisis
entre 10 y 20%, para luego hidrolizar los concentrados de lactosuero obtenidos en la
sección anterior.
Factor -a -1 0 1 A
(A) pH 5 6 7 8 9
(B) T °C 26 34 42 50 58
(C) E/S % p/p 1 2 3 4 5
(D) t minutos 30 60 90 120 150
A cada uno de los extractos solubles menores de 3 kDa se les determinó la actividad
inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina (IECA) y la capacidad
antioxidante determinada por el método ORAC. Posteriormente se seleccionó al
hidrolizado con mayor actividad biológica.
Se adiciona
Estos se añaden primero y se
luego de la
incuba a 37°C por 10 minutos
incubación
Tris Sol.
agua Muestra Sol. Sustrato
ZnCl2 ECA
Control 40 0 40 0 160
Blanco 40 40 0 0 160
Blanco
0 40 0 40 160
muestra
Muestra 0 0 40 40 160
Los resultados obtenidos de este experimento sirvieron para decidir con cual tipo de
lactosuero se realizarían las siguientes etapas de este trabajo.
Sobre la base de los resultados del análisis factorial 23, se procedió a seleccionar el
hidrolizado funcional para ser elaborado a mayor escala a nivel de planta piloto, de
forma de contar con suficiente producto para las otras etapas de este trabajo.
Para obtener cantidades suficientes del hidrolizado a nivel de Planta Piloto fue
necesaria la contratación de los servicios de una empresa privada para realizar las
siguientes modificaciones a una marmita doble camisa, de 70 litros de capacidad,
existente en la planta: instalación de agitador con motor y de línea de agua a la
cámara interna de la marmita para permitir el enfriamiento del producto procesado.
Agitar suavemente
Agitar suavemente
Se realizó una Prueba Triangular presentando a los panelistas el yogurt natural sin el
hidrolizado (A) y el yogurt con el hidrolizado (B) según planilla correspondiente
(Anexo 10). Se trató de determinar si la incorporación del hidrolizado era detectada
por el consumidor. El panel estuvo constituido por 12 evaluadores semi-entrenados,
62
los cuales realizaron dos ensayos cada uno en orden diferente de presentación (AB,
BA). Para un total de 24 ensayos. El análisis estadístico se realizó aplicando la tabla
“Número mínimo de juicios correctos para establecer la significancia a varios niveles
de probabilidad para la prueba de triángulo de una cola” publicada por Roessler et al.
(1978), a un nivel de significancia de 0,05.
Se realizó prueba afectiva del yogurt natural con hidrolizado para determinar la
aceptabilidad del producto, con 100 consumidores con edades comprendidas entre
19 y 45 años (miembros del núcleo de la UCV, Maracay) a los que se les presentó el
producto en vasos plásticos desechables, y se les pidió registrasen su respuesta en
una planilla en la que se les debían marcar su apreciación del producto en una
escala hedónica no-estructura de 15 cm de largo, cuyos extremos estaban marcados
como “me disgusta mucho” y “me gusta mucho”; se les indicó que el punto central (a
7,5 cm) corresponde a una respuesta “indiferente”. Las respuestas fueron tabuladas
y expresadas en centímetros (Stone y Sidel, 1993).
Una vez comprobada la aceptabilidad del yogurt natural funcional de leche de cabra,
se inició el desarrollo de un yogurt de cabra saborizado como opción para mejorar
esa aceptabilidad. Se siguieron todos las etapas de un Desarrollo Exploratorio en la
elaboración de un yogurt a partir leche de cabra (Capra hiricus), saborizado con una
mermelada de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), con lo cual se
esperaba incrementar la capacidad antioxidante del yogurt gracias a su contenido de
polifenoles, y otros componentes bioactivo. A continuación se describen dichas
etapas:
63
Leche de cabra
Refrigerar a 4°C
para una bebida láctea viscosa incluiría azúcares y/o edulcorantes artificiales,
carbohidratos y/o espesantes; todos estos componentes podrían tener un efecto
sobre la hipertensión creando un placebo “activo” lo cual confundiría los resultados
del estudio. Para asegurar grupos con una conformación semejante entre sí, se
aplicó un proceso de aleatorización estratificado, ejecutado por la Cátedra de
Bioestadística de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UCV, núcleo Maracay.
Además de la aleatorización, y para evitar que la interpretación de los resultados
fuese influenciada por expectativas previas, ni el paciente ni el médico, encargado de
la toma de la presión arterial, conocieron a qué grupo fue asignado (condición “doble
ciego” del estudio clínico).
La variable respuesta del estudio fue la presión arterial registrada (por triplicado) a
cada participante en tres momentos: el día anterior al inicio del consumo del yogurt,
luego al final de la tercera y sexta semanas. La toma de la presión arterial se realizó,
para todos los participantes, con el mismo equipo (Kit de Presión profesional
Lumiscope, de tamaño de brazalete de 11" - 15", libre de látex) y por la misma
Médico Internista asignada para el estudio. Esta variable es continua, y se
compararon las medias de los dos grupos para determinar si se rechazaba o no la
hipótesis nula (Ho: ambas medias eran iguales) con respecto a la hipótesis alternativa
(Ha: ambas medias eran diferentes, prueba de dos colas). Considerando que el
estudio de Del Campo (2010) realizado en el Hospital Universitario Ramón y Cajal de
la ciudad de Madrid, España, logró determinar una diferencia () de por lo menos
15,2 mmHg en la presión sistólica de los dos grupos experimentales, con una
desviación estándar () de la reducción promedio de 14,6 mmHg, se procedió a
calcular el tamaño de la muestra aplicando la fórmula:
70
Donde:
Y: grado de hidrólisis (GH)
: coeficientes estimados por el modelo
: niveles de la variable independiente
: término del error aleatorio
71
2.6.4. Análisis de varianza con un diseño factoria 23 (Tabla 5) para la selección del
hidrolizado con mayor actividad biológica: IECA y ORACFL;
Donde:
Yij: puntaje del producto en escala no estructurada
µ: media global
i: efecto fijo del i-ésimo nivel factor “método de concentración”.
j: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “origen del lactosuero”
k: efecto fijo del j-ésimo nivel factor “tipo de hidrólisis”
ijkl: término del error aleatorio
Yij = µ + i + j + ij
Donde:
Yij: puntaje del producto en escala no estructurada
µ: media global
i: efecto fijo del i-ésimo nivel tratamiento formulación-tipo fermento.
j: efecto fijo del j-ésimo bloque (panelista)
ij: término del error aleatorio
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El bajo contenido de proteínas en los tres lotes de leche de vaca, aunque cercano al
valor mínimo de 3,02% reportado por Wendorff y Paulus (2011), estuvo en el límite
inferior del rango de 2,85-3,84 reportado para ese mismo rebaño por Alvarado (2001)
y no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los lotes para este
renglón.
El contenido de grasa estuvo dentro del rango reportado por Salvador et al. (2006) y
no se observó efecto de la época del año, puesto que este rebaño está estabulado y
no recibe pasto fresco en ninguna época del año. Las diferencias entre los dos lotes
del mes de abril, pudieron deberse a cambios puntuales en la alimentación.
éste mínimo y se corresponde con un nivel de sólidos totales menor al 12% (Tabla
9). Con respecto a la leche de cabra, se obtuvo un rendimiento entre 15,5 y 16,1 Kg
de queso/100 Kg leche, el cual se corresponde con el rango reportado por Guo et al.
(2004) para leche de cabra entre 15,3 y 19,1 Kg de queso/100 Kg de leche. Este
mayor rendimiento de la leche de cabra con respecto al de vaca, se refleja también
en una menor cantidad de lactosuero recolectado: el de la leche de vaca representó
el 91% del peso de la leche inicial (Tabla 9), mientras que el de la leche de cabra fue
el 83% (Tabla 10).
Según Hernández et al. (1992) hasta un 20% del contenido de proteína total de la
leche corresponde a las proteínas solubles del suero, por tanto, los lactosueros de
vaca y cabra de este trabajo debieron tener un contenido de proteínas máximo de
0,60% y 0,70%, respectivamente, equivalentes al 20% de la proteína total de la leche
empleada como materia prima. Pero los contenidos promedio aquí obtenidos para
ambos lactosueros fueron 1,33 y 1,36 %, respectivamente. El exceso de proteína en
el lactosuero se consideran así pérdidas en caseínas, ya que esa porción debería
estar formando parte del queso. En el presente trabajo, estas pérdidas fueron de
27% y 14%, para vaca y cabra, respectivamente. En el caso de las grasas, también
se observaron pérdidas, en el orden de 9% y 24%, respectivamente; ya que esa
cantidad debería estar formando parte del queso. Estas pérdidas se pueden atribuir a
77
BOVINO CAPRINO
Proteínas (%) 1,33 ± 0,19 a 1,36 ± 0,11 a
Grasa (%) 0,31 ± 0,14 b 0,67 ± 0,29 a
Cenizas (%) 0,60 ± 0,02 a 0,60 ± 0,02 a
Lactosa (%) 4,46 ± 0,02 4,16 ± 0,21
Humedad (%) 93,41 ± 0,01 93,6 ± 0,28
a
Sól.totales (%) 6,98 ± 0,27 6,58 ± 0,28 a
Sól. No Grasos (%) 6,67 ± 0,03 a 5,92 ± 0,30 a
Acidez (% ác. Láctico) 0,144 ± 0,013 a 0,146 ± 0,009a
a,b: superíndices diferentes indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1c y d.
Sin embargo, por lo menos para el caso del lactosuero bovino, estas pérdidas
parecen ser frecuentes ya que la literatura reporta los siguientes valores para el
contenido de proteína en lactosuero: 0,83 % (Monsalve y González, 2005; Vázquez-
Puente et al., 2010); 0,94% (Jakymec et al., 2001); 1,20% (Quintero et al., 2001); y
1,34% (Uribarrí et al., 2004). Siendo estos dos últimos similares a los aquí obtenidos.
Bovino Caprino
Proteínas (%) 19,56 20,67
Grasa (%) 3,92 10,18
Cenizas (%) 8,77 9,16
Lactosa (%) 67,70 60
Humedad (%) - -
Sól.totales (%) 100 100
Sól. No Grasos (%) 96,08 89,87
Acidez (% ác. Láctico) 2,10 2,62
Bovino Caprino
Proteínas (%) 1,06 ± 0,15 a 1,03 ± 0,02 a
Grasa (%) < 0,05 < 0,05
Cenizas (%) 0,61 ± 0,04 a 0,63 ± 0,07 a
Lactosa (%) 5,35 ± 0,06 a 5,73 ± 0,06 a
Humedad (%) 92,96 ± 0,02 92,5 ± 0,01
Sól.totales (%) 7,03 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a
Sól. No Grasos (%) 7,02 ± 0,41 a 6,9 ± 0,10 a
a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05), ver Anexo 1e y f.
Bovino Caprino
Proteínas (%) 14,98 14,96
Grasa (%) < 0,05 < 0,05
Cenizas (%) 8,72 8,91
Lactosa (%) 74,16 76,04
Humedad (%) - -
Sól.totales (%) 100 100
Sól. No Grasos (%) 100 100
Así que al final de este proceso se obtuvieron lactosueros de ambas especies con
una composición en proteínas, cenizas, lactosa y sólidos totales, similar a la
conseguida por Muñi et al. (2005) en el lactosuero dulce prefiltrado y centrifugado
antes de la aplicación de un proceso de concentración por ultrafiltración: proteína
0,83%, lactosa 4,95%, cenizas 0,52% y sólidos totales 6,31%.
80
La similitud de ambos sueros también ha sido reportado por Casper et al. (1998)
quienes señalaron que los resultados de la composición del lactosuero de cabra,
obtenido de la manufactura de un queso tipo cheddar, fueron comparables con los
del lactosuero bovino proveniente del proceso del mismo tipo de queso.
LF
SA
Ig(CP)
Ig(CL)
- LG
- LA
1 2 3 4 5 6 7
La similitud de los patrones confirma que ambos lactosueros constituyen una fuente
similar de proteínas para la hidrólisis.
Giardina (1995) logró una mayor concentración con el mismo equipo aplicando
tres ciclos de ultrafiltración y diafiltración, alcanzando un valor cercano al 23% de
proteínas, que representó una relación de proteína/sólidos totales entre 35 y 38%.
85
Para el objetivo del presente trabajo fue suficiente con la concentración lograda, ya
que los factores de concentración concuerdan con el 1,4 recomendado por Sola
(2007) en la elaboración de productos lácteos. La proteína concentrada de esta
forma se caracteriza por no estar desnaturalizada, manteniendo muchas de sus
propiedades funcionales intactas. Sin embargo, es necesario comprobar su
susceptibilidad a la hidrólisis tanto por concentrados enzimáticos como por las
enzimas con las que cuentan las bacterias ácido-lácticas.
al., 2003). Por esta razón, en el presente trabajo se evaluó otra opción para
concentrar las proteínas, tomando una segunda porción de ambos lactosueros para
procesarla por termocoagulación. En una primera instancia se siguió el
procedimiento recomendado por Ramírez y Rivas (2003) de bajar el pH hasta 4,5
antes de inciar el calentamiento, pero se observó poca floculación de la proteína,
lográndose una recuperación de apenas 11,4%. Se decidió entonces modificar esta
etapa ajustando el pH a 6,4 mínimo con una solución de hidróxido de sodio 2,5M y
luego iniciar el calentamiento con agitación moderada hasta 90° C, en ese momento
se añadió ácido acético hasta un pH final de 4,6 y se mantuvo calentamiento por 30
minutos. De esta forma si se obtuvo una mayor floculación de las proteínas,
recuperándose 38,8% de la proteína bovina y 54,4% de la caprina (Tabla 18).
Esto confirma lo señalado por Vázquez-Puente et al. (2010) quienes concluyeron que
para obtener un máximo rendimiento en “quesos de suero” (requesón y ricotta) se
debe calentar el lactosuero a una temperatura de 93°C, bajar el pH y mantener el
calentamiento de 30 a 40 minutos. La recuperación de proteínas fue
significativamente mayor con el lactosuero caprino (p<0,05).
la ricotta baja en grasa con 72% de humedad y 12% de proteínas, se tiene que
ambos valores son mayores a 1,6 veces el contenido de proteínas normal de los
“quesos de suero”.
Sin embargo, la recuperación de proteínas en ambos casos está por debajo del
logrado por la ultrafiltración, y esto se debe a que la desnaturalización de todas las
proteínas del lactosuero no es completa, sino que unas son mas sensibles que otras
al efecto del calor, y por tanto, el contenido final de proteínas final variará de acuerdo
a las variables del proceso aplicado para la coagulación: concentración, pH,
temperatura, tiempo y acidez (Nicolai et al., 2011). Según Webb y Whittier (1948)
mediante este procedimiento de termocoagulación se debe recuperar, como proteína
desnaturalizada, solo entre 50 y 60 % de la proteína originalmente presente en el
lactosuero empleado como materia prima, ya que este porcentaje corresponde a la
proteína coagulable del lactosuero derivado de la elaboración de quesos o de
caseínas.
Como se puede observar, en el caso del lactosuero caprino se logró llegar a ese
nivel de recuperación. En el caso del lactosuero bovino es posible que el bajo
rendimiento se deba a la raza de donde se originó la leche con la cual se elaboró el
queso, como se mencionó anteriormente de bajo rendimiento quesero, aunado a los
problemas de manejo del rebaño. La proteína obtenida de esta forma, está
desnaturalizada y en los pasos posteriores se evaluó el efecto de esta condición
sobre la hidrólisis enzimática.
dinámico descrito en la Figura 14. Los valores óptimos en el eje de las x son los que
están en rojo y el valor óptimo de la respuesta es 12,372 % de grado de hidrólisis
(GH) en un rango de 0,85 a 24,32. Este resultado concuerda con los de van der Ven
et al. (2002) quienes obtuvieron un GH promedio de 12% en un rango de 0 a 35% en
un diseño central compuesto para determinar el GH de la hidrólisis de un
concentrado de lactosuero con la enzima Corolasa PP. La función de deseabilidad
obtenida fue de 0,982, cuyo valor es considerado como muy bueno cuando se acerca
a 1 (Montgomery y Runger, 2004). Se observa que la respuesta óptima esta en el
rango que indica la función de deseabilidad.
El perfil de tiempo indica que se requirió un mínimo de 150 minutos de hidrólisis para
estar en el rango deseado de hidrólisis. En el perfil E/S, se observa que el
incrementar la relación enzima/sustrato de 1% hasta 5%, solo produce un ligero
aumento en GH.
24,320
0,
12,585
1,
DH
12,372
,85000
0,
-5,000
,98186
Desirability
1, 3, 5, 7, 9, 26, 58, 1, 3, 5, 30, 150,
34,
11,00
Grado de hidrólisis (%)
9,00
7,00
5,00
3,00
1,00
30 60 90 120 150
Tiempo de incubación (minutos)
Figura 15- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del
lactosuero de cabra termocoagulado (tratamiento 6), hidrolizado por
proteasa de A. oryzae.
Según lo reportado por Tsai et al. (2008) la acción combinada de una proteasa con
una cepa ácido-láctica con actividad proteolítica, permite alcanzar un mayor
contenido en péptidos bioactivos, en el mismo tiempo de incubación que un proceso
con la acción única de la proteasa. Por esta razón, se decidió incluir en este ensayo
la hidrólisis combinada de ambos mecanismos. En la Tabla 20 se resumen los
cálculos de Mp y cantidad de enzima, así como el grado de hidrólisis GH promedio
obtenido al aplicar una hidrólisis por la acción combinada de la proteasa y una cepa
ácido-láctica. Se observa un mayor GH en comparación con el proceso solo
enzimático.
21,00
Grado de hidrólisis
16,00
11,00
(%)
6,00
1,00
30 60 90 120 150
Tiempo de incubación (minutos)
Figura 16- Efecto del tiempo de incubación sobre el grado de hidrólisis del
lactosuero de cabra termocoagulado, hidrolizado con la mezcla de
proteasa de A. oryzae y cepa ácido-láctica
Por el contrario, en las siguientes tres líneas, no se observan las dos primeras
bandas (lactoferrina y seroalbúmina), pero aparecen dos bandas debajo de la IgG
pesada, con PM estimados de 56,1 y 53,2 kDa, y otras dos debajo de la -LA, con
PM estimados de 14 y 13 kDa. Tanto estas nuevas bandas como las originales
94
1 2 3 4
Seroalbúmina (66,5
kDa)
lactalbúmina (15,5
kDa)
25000
25000
Intensidad
20000 20000
Intensidad
15000
15000 10000
5000
10000 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.)
Tiempo de incubación (min.)
Intensidad
15000 10000
10000
5000
5000
0 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.) Tiempo de incubación (min.)
30000
Intensidad
20000
20000
10000
10000
0
0
0 60 120 150
0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.) Tiempo de incubación (min.)
poliéptido 14 kDa. G H
20000 poliéptido 13 kDa.
20000
15000
Intensidad
15000
Intensidad
10000 10000
5000 5000
0 0
0 60 120 150 0 60 120 150
Tiempo de incubación (min.) Tiempo de incubación (min.)
pH 7 T 42 E/S 3% 30 min.
Tabla 22 – Listado de péptidos (por peso
molecular, Da) presentes en los
extractos solubles menores de 3
kDa, determinadas por espectro-
metría MALDI-TOF, en orden de
mayor a menor “abundancia”, de
los hidrolizados de lactosuero
caprino tomados a tres tiempos
diferentes de incubación de la
hidrólisis enzimática con proteasa
de A. oryzae.
pH 7 T 42 E/S 3% 90 min.
T = 30 min t = 90 min t = 150 min
1717.9517 893.0328 893.1105
2104.8232 877.0569 877.1475
1505.8056 908.9984 861.1718
1618.8898 832.3036 909.0888
1880.9981 930.9570 915.1118
1755.8836 915.0104 1506.0226
1488.7705 899.0357 2105.1369
1782.9319 1104.0258 1430.9347
1656.8267 1718.9623 1414.9088
1589.7336 703.9876 1445.9569
1392.7170 1543.8126 1392.9321
1543.7510 862.3191 1527.9956
1668.8438 1142.0028 1718.1748
2413.2746 1082.1856 pH 7 T 42 E/S 3% 150 min.
3600.6427 931.0956
1838.8817 1120.1442
2186.1276 1098.1724
1700.9055 899.2117
10 20 30 40 50
MKCLLLALGL ALACGIQAII VTQTMKGLDI QKVAGTWYSL AMAASDISLL
60 70 80 90 100
DAQSAPLRVY VEELKPTPEG NLEILLQKWE NGECAQKKII AEKTKIPAVF
110 120 130 140 150
KIDALNENKV LVLDTDYKKY LLFCMENSAE PEQSLACQCL VRTPEVDKEA
placa multipocillo para medir la actividad IECA, por fluorescencia. Las lecturas del
fluorómetro se cargaron en una hoja de excel y se obtuvieron las curvas de
inhibición, a partir de la ecuación de la curva (y=a ln(x)+b) se obtuvo el IC50 mediante
la siguiente fórmula IC50 = EXP((50-b)/a). En el Anexo 4 se tabulan estos
coeficientes. En la Figura 21 se presenta un ejemplo de las curvas obtenidas.
80
70
60
% de inhibición
50
40 y = 18,699ln(x) + 7,4944
30 R² = 0,937
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Todos los hidrolizados mostraron actividad inhibidora de la enzima ECA (Tabla 24)
considerándose, por ejemplo, que en el estudio de van der Ven et al. (2002) con 46
hidrolizados de lactosuero con “buena” actividad IECA in vitro, obtuvieron un rango
de IC50 de 170 a 880 g/mL. El hidrolizado con mayor actividad fue el que necesitó
menor concentración de proteínas para inhibir el 50% de la actividad de la enzima
(IC50): 4,27 g/mL del hidrolizado proveniente del lactosuero bovino termocoagulado
tratado con la mezcla de proteasa+BAL, seguido por el caprino bajo las mismas
condiciones de concentración e hidrólisis con 10,54 g/mL.
En la Tabla ANOVA (Anexo 3a) se observa que la interacción de los tres factores fue
significativa, por tanto, el análisis final de estos resultados se hizo sobre la base de
esa interacción. Como se muestra en la Figura 22, cuando T3 se mantiene constante
en el nivel 2 (hidrólisis enzimática + fermento BAL) se obtiene la mayor actividad
inhibidora de la enzima ECA en cualquiera de los niveles de los otros dos factores
(método de concentración y origen del suero). Mientras que con la aplicación de
sólo hidrólisis enzimática (T3:1) se obtiene mayor inhibición con el suero de cabra
(T2:1) tanto ultrafiltrado como termo-coagulado.
103
250
200
150
IACE
100
50
0
T1
-50 1
T2: 1 2 T2: 1 2 T1
2
T3: 1 T3: 2
Con respecto al tipo de hidrólisis, a pesar de que en el caso específico del lactosuero
bovino ultrafiltrado hubo una actividad ORAC significativamente mayor cuando fue
105
0,55
0,6
0,50
0,5
0,45
ORAC
ORAC
0,4
0,40
0,3
0,35
0,2 0,30
T2 T3
0,1 1 0,25 1
1 2 T2 1 2 T3
2 2
T1 T1
Los extractos solubles < 3kDa de los ocho tratamientos fueron analizados por HPLC-
MS-MS para identificar los péptidos que pudiesen ser responsables por la actividad
observada. En el Anexo 5 se muestran los espectros de masas de cada uno de
ellos. En la Tabla 27 se señalan las masas moleculares de los cinco péptidos mas
abundantes en cada tratamiento, se observa en general que los pesos moleculares
oscilan entre 800 y 1300 Da. Para determinar si había diferencias entre los distintos
tratamientos en cuanto a la distribución de estos pesos moleculares, se aplicó un
ANOVA en un diseño factorial 23 con los tres factores manejados hasta este punto:
método de concentración, tipo de lactosuero y tipo de hidrólisis. La tabla ANOVA se
muestra en el Anexo 6, donde se observa que el único factor que parece tener efecto
sobre la distribución de las masas moleculares es el tipo de lactosuero: la media de
los pesos moleculares de los péptidos en el lactosuero bovino fue significativamente
menor (p<0,05) que la de los del caprino.
Bovino Caprino
T2 T4 T5 T8 T1 T3 T6 T7
988,3 1039,3 1001,4 1001,5 1108,3 1114,2 1103,5 1070,5
950,3 877,4 1041,4 1041,4 1264,5 1264,5 1070,4 1340,5
1131,3 1110,4 887,4 887,4 1215,3 970,2 855,4 1232,5
1167,3 986,3 806,3 1259,5 919,2 877,3 1210,5 1017,4
877,3 948,4 1103,5 1158,5 1375,5 1070,4 1005,4 1270,6
DERIVADOS DE LA β-Lactoglobulina
Ion MS/MS Masa
m/z Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia
DERIVADOS DE LA Lactoferrina
Ion MS/MS Masa
m/z Calculada Proteína Especie Fragmento proteína Secuencia
al reducir la presión arterial en 21,4 mmHg, a pesar de no haber mostrado una buena
actividad in vitro, sugiriendo que el proceso de digestión intestinal lo corta en
dipéptidos Ala-Leu y Pro-Met, que al ser absorbidos pudieron ser los responsables
de tal reducción.
La secuencia DTDYKKY de la -LG fue reportada por Ortiz-Chao et al. (2009) en una
de las fracciones con baja actividad IECA obtenidas de la hidrólisis de esta proteína
con proteasa N Amano.
Según Ribeiro y Ribeiro (2010) muchos autores han identificado a la leche de cabra
como un ingrediente funcional, gracias a sus propiedades para mantener la salud,
reducción de riesgos de enfermedades crónicas y modificación positiva de las
funciones fisiológicas. Por esta razón y por su potencial actividad IECA, se
seleccionó el lactosuero caprino para las últimas etapas del presente trabajo; para
compensar la deficiencia en la capacidad antioxidante, se evaluó la incorporación de
una fruta rica en polifenoles y otros antioxidantes en la formulación del producto
funcional.
En este mismo sentido Didelot et al. (2006) sugirieron que la ingestión oral de un
péptido bioactivo purificado es menos efectivo que el consumo del hidrolizado
completo, puesto que la digestión gastro-intestinal puede liberar péptidos bioactivos
de este último, pero haría perder su actividad del péptido purificado. Sobre la base de
esto, el desarrollo del ingrediente funcional se realizó en función del hidrolizado
completo, y no de péptidos aislados, con buena actividad IECA in vitro.
La actividad IECA promedio de los siete lotes se muestra en la Tabla 33, así como
también el contenido de proteínas total de los extractos menores a 3 kDa, de cada
lote, de acuerdo a la determinación de N total por Kjeldahl, lo cual representa el
contenido de péptidos principalmente derivados de la hidrólisis. La actividad IECA,
expresada como IC50, del ingrediente funcional es de 13,66 ± 1,25 g/mL, es decir
que con esta concentración de péptidos se inhibe el 50% de la actividad de la enzima
ECA, y cada lote de 4,3 Kg de hidrolizado contiene en promedio 66,27 ± 1,23 g de
péptidos.
En el presente trabajo se realizaron los cálculos para determinar la dosis que fue
factible alcanzar con la disponibilidad de hidrolizado fabricado. Al añadir 4,3 Kg del
hidrolizado fabricado, con un promedio de 66,27 g de péptidos, a un lote de 40 Kg de
leche de cabra, se consiguió que cada ración de 150g de yogurt natural alcanzara un
contenido medio de 224,4 ± 4,2 mg de péptidos, lo cual está dentro del rango
señalado por Seppo et al. (2003).
115
homogeneidad
8
6
4
cremosidad blanco
2
cabra
0
vaca
Este perfil descriptivo coincide con el elaborado por Vargas et al. (2008) sólo en
relación a la percepción del sabor ácido y a la consistencia en boca (o cremosidad).
En cuanto a ésta última propiedad, los autores le atribuyen la diferencia entre ambos
yogures a las variaciones en la micro-estructura de los geles. El de cabra presenta
un gel con menor grado de contracción, y por tanto, con poros más abiertos; esto se
lo atribuyeron a una menor intensidad de las fuerzas de atracción entre las micelas
de la leche de cabra, en comparación con las de la leche de vaca. Con respecto a las
otras características, sus resultados difieren de los del presente trabajo en: 1)
homogeneidad, señalaron que el de cabra presentaba menos grumosidad (mayor
homogeneidad), 2) sabor ácido, registraron una percepción similar para ambos tipos,
y 3) color blanco, señalaron que el color del de cabra se percibió mucho más blanco.
Es difícil llegar a una conclusión en cuanto al resto de los resultados de ambos
estudios, ya que las mismas se pueden deber tanto a factores intrínsecos de la
materia prima y del producto terminado, como por las condiciones en que se
realizaron los ensayos, incluyendo el panel y el entrenamiento recibido.
Martín-Diana et al. (2003) propusieron que para mejorar la textura del yogurt se debe
aumentar el contenido de sólidos no grasos de la leche y/o emplear fermentos
lácticos productores de exo-polisacáridos (EPS). Puesto que para este prototipo no
se pudieron incrementar los sólidos de leche de cabra, y adicionalmente, se deseaba
evitar el uso de estabilizantes no proteicos, se decidió buscar y seleccionar entre los
117
Para la selección del fermento láctico, se evaluaron las características de los yogures
elaborados con tres fermentos YoFlex® diferentes: YC-180, YC-280 y YC-380. En la
Tabla 35, se muestran los resultados obtenidos para la consistencia de cada yogurt,
así como su pH y acidez.
Tabla 35 – Valores de pH, acidez y consistencia de cada yogurt base elaborado con
diferentes fermentos Yo-Flex® (promedio ± desviación estándar).
Fermento YoFlex pH Acidez Consistencia (cP)
YC180 4,29 ± 0,01 a 1,15 ± 0,04 a 81975 ± 1703 a
YC280 4,50 ± 0,01 a 0,90 ± 0,05 a 58106 ± 2299 b
YC380 4,14 ± 0,01 a 0,92 ± 0,04 a 54413 ± 1095 b
(a,b) superíndices diferentes, en cada columna, indican diferencias significativas (p<0,05)
determinadas mediante prueba de rango no-paramétrica de Kruskal-Wallis.
El yogurt elaborado con YC-180 resultó con mayor consistencia, mientras que los
otros dos presentaron una consistencia menor, pero similar entre ellos. Estos
resultados no concuerdan con lo señalado por el proveedor, según el cual, el orden
de consistencia final, de mayor a menor, sería YC-280 > YC-180 > YC-380 (Chr.
Hansen A/S, Dinamarca). Sin embargo, se debe tomar en cuenta que esa
información se basa en ensayos realizados con leche de vaca, por lo cual, era de
esperar un comportamiento diferente considerando lo anteriormente mencionado
sobre las diferencias de la leche de cabra con respecto a la de vaca, especialmente
en el contenido de caseína S1. Por otra parte, mediante la evaluación sensorial de
las fórmulas prototipo, se observó que algunas de las características sensoriales si
coincidieron con las reseñadas por el proveedor (Chr. Hansen A/S, Dinamarca). El
yogurt YC-180, por tener un sabor “a yogurt” menos marcado presentó un mayor
sabor “a leche de cabra”, no detectable en las otras dos formulaciones; el YC-280
presentó buen sabor “a yogurt” pero la consistencia fue ligeramente filante; el YC-380
118
presentó un sabor “a yogurt” más intenso, pero a su vez se percibió como el más
ácido. Las formulaciones así elaboradas para cada tipo de fermento fueron
evaluadas mediante un panel semi-entrenado; en el Tabla 36 se resumen los
resultados. La formulación que recibió mejor puntuación fue la YC-380, con una
ponderación de 12,3 cm cercana al máximo de 15 cm (“me gusta mucho”). Las otras
dos formulaciones recibieron una puntuación cercana al punto medio (7,5 cm) el cual
se considera que denota indiferencia hacia ellos, ni gusto ni disgusto marcados.
Güler-Akin y Akin (2007) también obtuvieron alto puntaje en la evaluación sensorial
de un yogurt de cabra elaborado con el fermento láctico YoFlex® YC-380 de Chr.
Hansen (Peyman-Chr. Hansen, Turquía).
En primer lugar, se planteó aplicar una prueba para determinar si los consumidores
podían detectar diferencias entre los dos lotes de yogurt elaborados, mediante una
prueba de Triángulo, con las siguientes hipótesis: Ho: A = B; Ha: A ≠ B. En la Figura
25 se muestran los resultados de la prueba triangular aplicada a dos muestras: A
(yogurt natural de cabra sin hidrolizado) y B (yogurt natural de cabra con hidrolizado).
Llevando estos resultados a la Tabla de Roessler et al. (1978), bajo la columna de
nivel de significancia de 0,05 se tiene que, para un total de 24 evaluaciones, se
requiere un mínimo de 13 aciertos para rechazar la hipótesis nula de que no hay
diferencia entre las muestras. Puesto que solo hubo 9 aciertos, se concluye que no
existe suficiente evidencia muestral para rechazar Ho, y por tanto, el panel no
detectó diferencias entre ambos yogurts.
ACIERTOS
9
ERRADOS
15
disgusta mucho” a 15 cm “me gusta mucho”, fue de 11,19 ± 2,80 cm “me gusta un
poco”. Es decir que un 51% de los evaluadores le dieron al producto una evaluación
mayor a 11,3 cm; lo cual indica una buena aceptabilidad del producto. La principal
objeción entre el 49% que le dio una menor evaluación es el “sabor a cabra”,
“aguado” y el “alto” grado de acidez (Figura 26).
Aceptabilidad
6
Me disgusta un poco
23 13
Indiferente
Me gusta un poco
30
28
Me gusta
Me gusta mucho
Los lotes de cada tipo (con o sin hidrolizado) resultaron significativamente diferentes
(p<0,05) en los contenidos de humedad, sólidos totales y proteínas; pero no hubo
diferencias en grasa ni cenizas (Tabla 38). El contenido similar de grasa en ambos,
permitió enmascarar las diferencias en los otros componentes, ya que como se
demostró anteriormente la mayoría de los evaluadores no lograron diferenciar ambos
productos, a pesar de las ligeras diferencias en humedad y proteínas.
121
Tabla 38 – Composición porcentual del yogurt natural sin hidrolizado y del yogurt
natural funcional (promedio ± desviación estándar).
sin hidrolizado con hidrolizado
Humedad (%) 88,44 ± 0,52b 86,33 ± 0,60a
Sólidos Totales (%) 11,56 ± 0,52b 13,67 ± 0,60a
Proteínas (%) 4,49 ± 0,37b 5,23 ± 0,30a
Grasa (%) 3,06 ± 0,06a 3,00 ± 0,06a
Cenizas (%) 0,71 ± 0,02a 0,76 ± 0,09a
a,b: superíndices diferentes, en las filas, indican grupos
significativamente diferentes (p<0,05
En la tercera etapa de este trabajo, para mejorar la aceptabilidad del yogurt y para
aumentar la capacidad antioxidante del producto, se propuso la incorporación de un
saborizante natural no tradicional con moderada capacidad antioxidante: la fruta del
tomate de árbol (C. betacea Sendtn.).
Esta alta aceptabilidad del concepto puede deberse en parte al hecho señalado por
Huang et al. (2005) de que el término “antioxidante” se está haciendo muy popular en
la sociedad moderna gracias a la mayor cobertura que los medios de comunicación
están dando a los beneficios a la salud de aquellos que consumen mayores
cantidades de compuestos con capacidad antioxidante. Así, que sobre la base de
esta respuesta se pudo proseguir con la siguiente etapa del desarrollo.
T1 70 30 4
T2 80 20 3
T3 90 10 2
x
: Leyenda: 1 Me disgusta mucho; 2 Me disgusta ligeramente; 3 No me
gusta NI me disgusta; 4 Me gusta ligeramente y 5 Me gusta mucho
123
Tabla 43 – Actividad ORACFL del yogurt base y del yogurt batido con mermelada
de tomate de árbol (promedio ± desviación estándar)
Yogurt ORACFL
(uMoles Trolox/mg ss)
Con la finalidad de conocer el efecto del agregado de fruta al yogurt para mejorar su
sabor, se realizó una prueba de aceptabilidad. A 100 consumidores se les suministró
una muestra de la formulación de yogurt elaborada con el fermento YC-380, y
mezclada con mermelada de tomate de árbol en una proporción 75:25.
Aceptabilidad
1
4
31 22 Me disgusta un poco
Indiferente
Me gusta un poco
Me gusta
Me gusta mucho
42
En la cuarta etapa se realizó estudio para determinar la vida útil del yogurt funcional
de leche de cabra tanto natural como saborizado, durante el almacenamiento
refrigerado a 4°C durante 28 días. El pH del yogurt natural se redujo 0,18 unidades
entre el inicio y el final del ensayo, mientras que el saborizado se incrementó en 0,66
unidades (Figura 28). El comportamiento del yogurt natural fue el esperado; según
Güler-Akin y Akin (2007) el tiempo de almacenamiento afecta significativamente el
nivel de acidez del yogurt de leche de cabra: la acidez titulable aumenta mientras que
el pH disminuye. Ellos reportaron reducciones por el orden de unas 0,2 unidades de
pH en “bioyogurt” de leche de cabra. En el caso del yogurt saborizado, el incremento
del pH denota un cambio en la microbiología del producto.
128
7,00
6,00
Yogurt Natural
5,00
pH 4,00
3,00 Yogurt
Saborizado
2,00
1,00
d1 d7 d14 d21 d28
Días de almacenamiento
7
6
Yogurt Natural (coliformes)
5
Log UFC/mL
4 Yogurt Saborizado
(coliformes)
3
Yogurt Natural (hongos y
2
levaduras)
1 Yogurt Saborizado (hongos y
0 levaduras)
d1 d7 d14 d21 d28
días de almacenamiento
10
Recuento de BAL (Log UFC/mL)
9
8
7
6
5
4 Yogurt Natural
3 Yogurt Saborizado
2
1
0
d1 d7 d14 d21 d28
Días de almacenamiento
0,7
ORAC ( mg/g sólidos solubles)
0,6
0,5
0,4
0,3 ORAC Yogurt Natural
0,2 ORAC Yogurt Saborizado
0,1
0
d1 d7 d14 d21 d28
Días de almacenamiento
Solo se pudo determinar la actividad IECA en el yogurt natural los días 1 y 28,
obteniéndose los valores de IC50 de 10,24 ± 0,41 g/mL y 24,19 ± 5,74 g/mL,
respectivamente. Esto representa una ligera disminución en dicha actividad, pero
todavía muy superior al IC50 reportado por Tsai et al. (2008) de 240 a 226 g/mL
obtenido con la combinación de la fermentación ácido-láctica con la hidrólisis
enzimática. En un estudio de vida útil de una bebida con lactosuero hidrolizado,
después de seis semanas de almacenamiento a 4°C, se encontró que el producto
retuvo el 92% de la actividad IECA (Fluegel et al., 2010).
15,0
14,0
13,0
12,0
11,7
Puntuación (cm)
11,5 11,3
11,0
10,0 10,1 10,2
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28
15,0
14,0
13,0
12,0 11,4
Puntuación (cm)
11,3
11,0
10,0 9,6
9,0
8,0
7,5
7,0
6,0
5,0
DÍA 1 DÍA7 DÍA14 DÍA 21 DÍA 28
En el caso del yogurt natural, se confirma una vida útil de por lo menos 28 días, ya
que mantuvo sus propiedades organolépticas, microbiológicas y bioactivas durante
todo el periodo de evaluación. En vista de este resultado, se tomó la decisión de
realizar el estudio clínico con el yogurt natural.
Anaranjado
(yogurt sin 18 11 (31-62) 1,72±0,06 7 (39-58) 1,59±0,07
hidrolizado) 87±5 73±6
(a) El grupo Amarillo representa el grupo “Tratamiento”, mientras que el Anaranjado
el grupo “Placebo”. (b) Edad en años; talla en m; peso en Kg.
133
A mitad del ensayo se retiró una de las participantes del grupo placebo, quien por
razones personales debía estar fuera de la ciudad de Maracay mas de dos semanas,
quedando por tanto este grupo conformado por 17 participantes y se descartaron los
datos correspondientes a la persona retirada.
Mediante una encuesta completada al final del estudio por cada participante (Anexo
9) se obtuvo la siguiente información con respecto al cumplimiento de las normas
acordada al inicio del ensayo, con respecto a la toma del producto. A la pregunta de
si consumieron su ración diaria los 42 días del ensayo, un 71% en el grupo placebo y
un 81% en el grupo tratamiento respondieron que sí; el resto dejaron de hacerlo de
uno a cuatro días en total. Con respecto al momento del día para la toma del yogurt,
en el grupo placebo un 77% lo tomó en la mañana, un 6% en la tarde y un 17% en la
noche, mientras que en el grupo tratamiento fue 52%, 24% y 24%, respectivamente.
Una persona en cada grupo varió un día el momento del consumo.
arterial entre la primera toma y la última para cada participante; los resultados se
muestran en la Tabla 45. Ese grupo de 9 personas mostró un incremento promedio
de 13 mmHg en la PAS y de 3 mmHg en la PAD. Por esta razón se procedió a excluir
todos los datos de estos 9 participantes de sus correspondientes grupos para los
análisis estadísticos.
De esta forma, para el análisis final de los resultados del estudio clínico se
mantuvieron los datos de presión arterial de 17 personas en el grupo que recibió el
yogurt con el hidrolizado de lactosuero (grupo Tratamiento) y 12 personas en el
grupo que recibió el yogurt sin hidrolizado (grupo placebo). Al comparar ambos grupo
(Tabla 46), en cada día de toma de presión (DTP), se observa que no hay diferencias
significativas (p>0,05) entre las medias de la presión arterial sistólica (PAS). En el
Anexo 11 se resumen los análisis estadísticos aplicados.
Tratamiento Placebo p
(mmHg) (mmHg)
Inicio 136 ± 8,6 139 ± 9,3 0,2093
Final 130 ± 9,5 130 ± 10,7 0,8919
135
En la Tabla 47 se hace una comparación de las medias, pero dentro de cada grupo,
entre los valores PAS del día inicial vs la medición final, respectivamente. En ambos
grupo se observan diferencias significativas (p<0,05) entre el inicio y el final del
estudio. En el grupo que recibió el yogurt con hidrolizado la reducción de la PAS fue
de 6 mmHg, mientras que en el grupo que recibió el placebo fue de 9 mmHg.
Dentro de cada grupo se observa una disminución significativa de la PAD al final del
ensayo (Tabla 49), el grupo tratamiento se obtuvo una reducción de 4 mmHg en la
PAD, mientras en el grupo placebo fue de 6 mmHg. Tuomilehto et al. (2004)
obtuvieron un resultado similar y se lo atribuyeron al “acostumbramiento” de los
136
De los 15 estudios evaluados por Pripp (2008), solo en uno no hubo reducción en la
presión arterial; en el cual se utilizó un hidrolizado de lactosuero. Como señalan
137
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. Conclusiones
4.2. Recomendaciones
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156
Anexo1a
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,694915 p =,0580
1 2 3
1 0,447214 1,788854
2 0,447214 2,236068
3 1,788854 2,236068
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,514124 p =,0635
1 2 3
1 2,086997 1,937926
2 2,086997 0,149071
3 1,937926 0,149071
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping) variable:
Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,200000 p =,0273
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche vaca) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =6,879552 p =,0321
1 2 3
1 2,608746 1,416176
2 2,608746 1,192570
3 1,416176 1,192570
157
Anexo1b
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =4,865497 p =,0878
1 2 3
1 2,086997 0,596285
2 2,086997 1,490712
3 0,596285 1,490712
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,200000 p =,0273
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,200000 p =,0273
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; Densidad (resultados análisis leche cabra) Independent (grouping)
variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,600000 p =,0608
1 2 3
1 2,236068 1,788854
2 2,236068 0,447214
3 1,788854 0,447214
158
Anexo1c
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,467787 p =,0650
1 2 3
1 0,149071 2,086997
2 0,149071 1,937926
3 2,086997 1,937926
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,322034 p =,0257
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
159
Anexo1d
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; grasa (resultados análisis suero cabra completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 1,341641
2 1,341641 2,683282
3 1,341641 2,683282
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =6,000000 p =,0498
1 2 3
1 2,236068 1,788854
2 2,236068 0,447214
3 1,788854 0,447214
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra completo) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,200000 p =,0273
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
160
Anexo1e
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,535014 p =,0628
1 2 3
1 1,490712 2,310604
2 1,490712 0,819892
3 2,310604 0,819892
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,384615 p =,0249
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero vaca descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 1,341641 2,683282
2 1,341641 1,341641
3 2,683282 1,341641
161
Anexo1f
Multiple Comparisons z' values; Proteínas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,581921 p =,0614
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
Multiple Comparisons z' values; Cenizas (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =7,260504 p =,0265
1 2 3
1 2,683282 1,341641
2 2,683282 1,341641
3 1,341641 1,341641
Multiple Comparisons z' values; SNG (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,581921 p =,0614
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
Multiple Comparisons z' values; S.TOTALE (resultados análisis suero cabra descremado) Independent
(grouping) variable: Lote Kruskal-Wallis test: H ( 2, N= 9) =5,581921 p =,0614
1 2 3
1 2,161532 0,298142
2 2,161532 1,863390
3 0,298142 1,863390
162
Anexo 2 - Tabla del análisis ANOVA para la variable dependiente GH. Se obtuvo un
R2= 0,83052 con un error por falta de ajuste no significativo (P>0,01).
SS df MS F p
Blocks 0,604 2 0,3022 0,1108 0,895691
(1)pH (L) 457,985 1 457,9851 167,9965 0,000000
pH (Q) 4,117 1 4,1172 1,5102 0,234927
(2)T (L) 233,028 1 233,0281 85,4785 0,000000
T (Q) 63,865 1 63,8654 23,4269 0,000131
(3)E/S(L) 92,866 1 92,8657 34,0647 0,000016
E/S(Q) 4,196 1 4,1958 1,5391 0,230679
(4)t (L) 517,079 1 517,0792 189,6732 0,000000
t (Q) 103,899 1 103,8990 38,1119 0,000008
1L by 2L 357,248 1 357,2480 131,0444 0,000000
1L by 3L 5,929 1 5,9291 2,1749 0,157556
1L by 4L 71,859 1 71,8586 26,3589 0,000070
2L by 3L 33,117 1 33,1170 12,1479 0,002641
2L by 4L 9,092 1 9,0915 3,3349 0,084459
3L by 4L 4,973 1 4,9730 1,8242 0,193555
Falta de ajuste 355,084 58 6,1221 2,2457 0,029884
Error Puro 49,071 18 2,7262
Total SS 2384,656 92
163
Anexo 3a - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados IECA
Univariate Tests of Significance for IACE (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)
Sigma-restricted parameterization
Effective hypothesis decomposition
SS Degr. of MS F p
Effect Freedom
Intercept 125199,1 1 125199,11055,1230,000000
"T1" 4460,0 1 4460,0 37,587 0,000014
"T2" 19299,0 1 19299,0 162,643 0,000000
"T3" 99494,1 1 99494,1 838,492 0,000000
"T1"*"T2" 1582,9 1 1582,9 13,340 0,002148
"T1"*"T3" 4178,9 1 4178,9 35,218 0,000021
"T2"*"T3" 23325,8 1 23325,8 196,579 0,000000
"T1"*"T2"*"T3" 1462,5 1 1462,5 12,325 0,002897
Error 1898,5 16 118,7
Anexo 3b - Tabla del análisis ANOVA análisis factoria 23 para resultados ORAC
Univariate Tests of Signi ficance for ORAC (Spreadsheet1 in IACE suero menor 3kDa)
Sigma-restricted parame terization
Effective hypothesis decomposition
SS Degr. of MS F p
Effect Freedom
Intercept 4,431582 1 4,431582 3841,441 0,000000
"T 1" 0,069445 1 0,069445 60,197 0,000001
"T 2" 0,101010 1 0,101010 87,559 0,000000
"T 3" 0,001305 1 0,001305 1,132 0,303238
"T 1"*" T2" 0,276705 1 0,276705 239,857 0,000000
"T 1"*" T3" 0,059302 1 0,059302 51,405 0,000002
"T 2"*" T3" 0,001395 1 0,001395 1,210 0,287693
"T 1"*" T2"*"T3" 0,000273 1 0,000273 0,237 0,633004
Error 0,018458 16 0,001154
164
Anexo 4
2
Coeficientes y R de las ecuaciones de la recta (y=ax+b) obtenidas en ensayo IECA para cálculo
de los IC50
muestra a b R
2
IC50 ( g/mL)
1-1 20,858 0,0535 0,9637 10,96
1-2 21,117 -0,5135 0,9637 10,94
1-3 18,699 7,4944 0,937 9,71
2-1 22,312 9,5732 0,9407 6,12
2-2 19,539 16,79 0,94 5,47
2-3 20,536 14,151 0,9643 5,73
3-1 18,364 6,5051 0,9784 10,68
3-2 17,748 7,9902 0,9915 10,67
3-3 18,765 5,0215 0,9837 10,99
4-1 18,919 21,672 0,9791 4,47
4-2 19,235 20,415 0,984 4,66
4-3 16,146 28,963 0,9918 3,68
5-1 20,637 -54,116 0,9973 155,26
5-2 20,666 -55,593 0,9867 165,59
5-3 18,655 -42,096 0,8559 139,32
6-1 18,016 -24,807 0,9691 63,58
6-2 19,756 -34,311 0,942 71,35
6-3 17,915 -24,396 0,9853 63,61
7-1 17,577 -27,966 0,9721 84,41
7-2 17,984 -31,688 0,958 93,90
7-3 18,134 -30,697 0,9732 85,63
8-1 21,680 -70,22 0,9908 256,01
8-2 21,406 -68,436 0,9929 252,86
8-3 19,003 -51,414 0,9292 207,83
165
1.0
1108.3
0.8
1264.5
1215.3
0.6
919.2
1375.5
1090.3
0.4 779.2
843.2 1005.3
230.0
1056.3
1454.4
710.1
0.2
681.2
611.1
1572.6
515.0
360.0
1814.4 1870.1
390.9
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
1.0
988.3
0.8
950.3
1131.3
0.6
1167.3
877.3
788.2
1264.4
833.3
0.4
229.9
1421.4
720.2
0.2
585.1 643.1
263.9 1591.6
545.1
2066.3
359.9 441.0
1664.4 2147.7
1751.7
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z
Anexo 5 – continuación.
Intens. +MS, 17.4-61.8min #(360-1392)
x10 4
1114.2
3
1264.5
970.2
877.3
1070.4
1005.3
843.2
935.3
1215.4
229.9
1017.3
778.1
1167.3
1
1344.4 1429.5
653.2
706.1
1377.4
761.1
518.0 582.1
1591.6
1506.5
360.0
1687.7 1790.6 1839.2 2069.3
2012.3
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
1039.3
2.5
877.4
1110.4
986.3
948.4
2.0
229.9
1.5
1265.5
1375.5
830.2
1.0
730.2
1211.4
760.2
658.2
0.5
1486.6
263.9
1465.4
496.1 1689.7
309.0
355.0
2133.5
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Anexo 5 – continuación.
1001.4
1.25
1.00
0.75
0.50
1041.4
887.4
0.25
806.3 1103.5
927.3
1211.5 1526.7
1259.5
1158.4
756.3
1325.5
229.9
1427.5
439.1 1466.5
546.1 603.1
324.1360.0
0.00
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
1103.5
1070.4
855.4
6
1210.5
1005.4
1258.5
1292.5
932.3 1429.6
2
546.2
786.3
756.3 1333.5
701.2
860.3
654.2 916.3
229.9
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Anexo 5 – continuación.
1070.5
2.0
1.5
1340.5
1.0
0.5
1017.4 1232.5
1270.6
900.4
229.9 1446.5
773.3
461.8 715.2
1502.5 1767.7
276.0 624.2 1591.7
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
1001.5
1.5
1.0
1041.4
887.4
0.5
1259.5
1158.5
806.3 1103.5
756.3 927.3
696.3
1504.7
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z
Anexo 7
PLANILLA DE EVALUACIÓN DEL CONCEPTO
Buen día: en la Planta de Leche estamos desarrollando un nuevo producto, cuya descripción sería la
siguiente:
RESULTADO:
TOTAL PERSONAS ENCUESTADAS: 25
Statistix 8.0
Descriptive Statistics
Variable N Mean SD C.V.
compra 25 4.1200 1.2689 30.798
Anexo 8
PLANILLA DE EVALUACIÓN (ANÁLISIS DESCRIPTIVO)
Teniendo presente lo acordado en la sesión previa donde se seleccionaron los descriptores de yogurt,
favor evaluar en la siguiente muestra los atributos señalados, marcando en la línea contigua la
calificación que usted le otorga.
POCO MUCHO
1) HOMOGENEIDAD
2) BLANCO
3) OLOR ÁCIDO
4) SABOR ÁCIDO
5) CREMOSIDAD
172
Anexo 9
Anexo 10
Instrucciones:
1. Se le presentan 02 series de 03 muestras cada una. Favor PRUEBE CADA SERIE POR
SEPARADO.
2. Cada serie contiene DOS muestras IGUALES y UNA muestra DIFERENTE.
3. Pruébelas en el orden en que se le indica
4. Favor MARQUE CON UNA X LA MUESTRA DIFERENTE EN CADA SERIE.
5. Asegúrese de enjuagarse la boca entre cada muestra.
Observaciones:__________________________________________________
__________________________________________________________
Anexo 11
Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el primer día de toma de presión arterial:
T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean 2 Mean 1 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 138,91 136,47 1,2649 85 0,209 36 51 9,30 8,57 1,177 0,587 0,536 85 0,465
PAD 89,61 86,27 2,540 85 0,012 36 51 5,14 6,58 1,638 0,127 7,712 85 0,0067
Comparación entre grupo tratamiento (1) y placebo (2) el último día de toma de presión arterial:
T-tests; Grouping: grupo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean 2 Mean 1 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 130,05 130,35 -0,136 85 0,891 36 51 10,73 9,50 1,27 0,423 0,467 85 0,495
PAD 83,61 81,72 1,913 85 0,0591 36 51 4,606 4,47 1,0606 0,836 0,095 85 0,758
Comparación dentro del grupo tratamiento, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión
arterial:
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
Mean 1 Mean 3 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 136,47 130,35 3,4126 100 0,0009 51 51 8,575 9,505 1,228 0,469 0,4636 100 0,4975
PAD 86,27 81,72 4,0810 100 0,00009 51 51 6,585 4,472 2,167 0,0071 8,5032 100 0,0043
Comparación dentro del grupo placebo, entre el primer día (1) y el último (3) de toma de presión
arterial:
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
Mean 1 Mean 3 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 138,91 130,05 3,741 70 0,0003 36 36 9,305 10,73 1,33 0,401 0,343 70 0,559
PAD 89,61 83,61 5,213 70 0,000002 36 36 5,145 4,606 1,247 0,516 0,620 70 0,433
Integrando los datos de todos los participantes, comparación del primer día (1) con el último (3) de
toma de presión arterial:
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
Mean 1 Mean 3 t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 137,48 130,22 5,06 172 0,000 87 87 8,914 9,97 1,25 0,299 0,870 172 0,352
PAD 87,65 82,50 6,21 172 0,000 87 87 6,222 4,60 1,83 0,0054 3,446 172 0,0650
175
Anexo 12
EFECTO SEXO
MUJERES: INICIO vs FINAL
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
Mean Mean
t-value df p Va lid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
INICIO FIN
PAS 136,25 125,77 4,271 70 0,00006 36 36 11,11 9,630 1,332 0,399 1,163 70 0,2844
PAD 86,61 81,94 2,975 70 0,0040 36 36 8,25 4,522 3,328 0,001 10,911 70 0,0015
HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DE LA PAS (10,5 mm de Hg) reducción de COMO DE
LA PAD (4,7 mm de Hg).
HOMBRES: INICIO vs FINAL
T-tests; Grouping: DTT (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 1 Group 2: 3
Mean INICIO Mean FIN t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
PAS 138,35 133,37 3,118 100 0,002 51 51 6,947 9,046 1,695 0,064 1,546 100 0,2165
PAD 88,39 82,90 6,257 100 0,000 51 51 4,195 4,652 1,229 0,467 0,790 100 0,376
HUBO REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA TANTO DEL PAS ( 5 mm de Hg) COMO DE LA PAD ( 5,5 mm
de Hg).
COMPARACIÓN EL DÍA INICIAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES
T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean Mean
t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
MUJERES HOMBRES
PAS 136,25 138,35 -1,084 85 0,281 36 51 11,118 6,947 2,560 0,002 12,063 85 0,0008
PAD 86,61 88,39 -1,320 85 0,190 36 51 8,250 4,195 3,867 0,000 18,004 85 0,0001
NO HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN LAS PAS y PAD ENTRE HOMBRES Y MUJERES AL
INICIO DEL ENSAYO
COMPARACIÓN EL DÍA FINAL ENTRE HOMBRES vs MUJERES
T-tests; Grouping: sexo (Spreadsheet3 in datos estudio clínico ajustado) Group 1: 2 Group 2: 1
Mean Mean
t-value df p Valid N Valid N Std.Dev. Std.Dev. F-ratio p Levene df p
MUJERES HOMBRES
PAS 125,77 133,37 -3,754 85 0,0003 36 51 9,630 9,046 1,133 0,675 0,711 85 0,401
PAD 81,94 82,90 -0,956 85 0,3416 36 51 4,522 4,652 1,058 0,870 0,022 85 0,882