Las diferencias metabólicas en la utilización de glutamina conducen a vulnerabilidades

metabólicas en el cáncer de próstata

El nuevo paradigma oncológico de la medicina de precisión se centra en la identificación de

variabilidades metabólicas, proteómicas, transcriptómicas y genómicas en tumores que pueden
explotarse para adaptar tratamientos y mejorar los resultados de los pacientes. Los cambios
metabólicos son una característica del cáncer, y la inhibición de las vías metabólicas es ahora una
estrategia importante en la química de los medicamentos para atacar los cánceres. Sin embargo,
los biomarcadores no invasivos para clasificar los subtipos metabólicos son escasos. El propósito
de este estudio fue caracterizar los perfiles metabólicos intracelulares y extracelulares de cuatro
líneas celulares de cáncer de próstata con diversos grados de agresividad. Observamos diferencias
metabólicas entre la línea celular de cáncer de próstata agresiva PC3 y la sub-línea PC3M
metastásica, aún más agresiva, evaluada por estudios de piruvato in vivo hiperpolarizados,
espectroscopia de resonancia magnética nuclear y estudios de alimentación de carbono-13. En un
examen más detallado de las diferencias entre estas dos líneas celulares, encontramos un
aumento en la utilización de glutamina en la sublínea PC3M metastásica que condujo
directamente a la sensibilidad al inhibidor de glutaminasa CB-839. Nuestro estudio apoya la teoría
de que la progresión metastásica aumenta la utilización de glutamina y la inhibición de la
glutaminolisis podría tener implicaciones clínicas.

Cancer de próstata segunda causa de muerte en los EE-UU, El metabolismo de las células de la
próstata normal frente a las células cancerosas se ha revelado en varios ensayos bioquímicos que
son significativamente diferentes, Por ejemplo:

La concentración de citrato es más alta en la próstata normal que en la PCa (próstata con cáncer),
alcanzando concentraciones tan altas como 180 mM en el fluido prostático, La reducción
significativa en el nivel de citrato en PCa resulta de la utilización de citrato en otras vías
metabólicas.

Varias publicaciones recientes han encontrado diferencias entre la PCa y la próstata normal en la
expresión de enzimas metabólicas como la glutaminasa (GLS), acetil-CoA sintetasa y los
transportadores de ácido monocarboxílico MCT1 / MCT4 (Ver Fig. 1a). Nuestro objetivo a largo
plazo es identificar las funciones de estos metabolitos en el crecimiento y la progresión del
cáncer de próstata. Los principales cambios que se producen en la PCa son similares a los que se
observan en otros cánceres, incluido el aumento de glicolysis. Los aumentos en la glucólisis en la
progresión de la PCa se han observado tanto en cultivos celulares in vivo utilizando una nueva
técnica de imagen metabólica llamada resonancia magnética hiperpolarizada.

El nutriente clave para la mayoría de los cánceres es la glutamina, y uno de los pasos críticos en su
utilización es su conversión a glutamato a través de la enzima glutaminasa.
(a) En este esquema, se muestran las vías parciales de glucólisis, glutaminolisis y el ciclo del
ácido cítrico: el tipo rojo es enzimas específicas, las flechas rojas representan la conversión
de cofactores como NAD +, el tipo azul es transportador y el tipo negro es metabolitos
específicos . El cuadro de puntos resalta la producción de lactato a través de la lactato
deshidrogenasa (LDH). Hay varios pasos entre la fructosa-6-fosfato y la generación de dos
equivalencias de piruvato no mostrada. Nos centramos específicamente en determinar las
diferencias en los metabolitos glicolíticos aerobios y anaeróbicos en las líneas celulares de
PCa. Abreviaturas: HK (hexocinasa), PGI (fosfoglucosa isomerasa), GLDH (glutamato
deshidrogenasa), GLS (glutaminasa), MCT4 y MCT1 (transportadores de ácido
monocarboxílico), GLUT1 (transportador de glucosa), MPC (portador de piruvato
mitocondrial) MAE (enzima málica).
 (b) Para comparar los cambios de metabolitos extracelulares entre las líneas celulares, se
determinaron las concentraciones de metabolitos dentro de un período de 24 horas y se
graficaron los cambios durante ese período como se muestra. Las barras positivas son
metabolitos excretados en el medio y las barras negativas son metabolitos consumidos
por las células durante el período de 24 horas (n = 5 muestras por tipo de célula). La
captación de glutamina por las células PC3M fue más de tres veces mayor que la de las
células PC3 (P <0,0001). La producción de lactato por PC3 fue 1.3 veces superior a la de
PC3M (P <0.0001). La significación estadística entre los niveles de metabolitos se
determinó utilizando ANOVA de dos vías con comparaciones múltiples de Tukey.

c) Para comparar los niveles de metabolitos intracelulares en células cultivadas, se determinaron

las concentraciones de metabolitos y se representó el cambio de veces en comparación con la
línea celular indolente (RWPE1). Los niveles de metabolitos succinato y fosfocolina (PCho) fueron
significativamente más bajos en los lisados de células PC3M que en los lisados de PC3 (P <0,0004).
La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos vías con comparaciones
múltiples de Tukey. (d) Para comparar los niveles de metabolitos en tejidos tumorales ex vivo, se
extirparon tumores PC3 y PC3M de ratones y se prepararon muestras para análisis (100 mg por
muestra, PC3 n = 4, PC3M n = 5). Los niveles de lactato y taurina fueron significativamente más
altos en los tumores PC3 que en los tumores PC3M, mientras que los niveles de aspartato,
glutamato, glutamina y succinato fueron significativamente más altos en los tumores PC3M que en
los tumores PC3M. Se usó una prueba t no pareada utilizando el método de Holm-Sidak para
determinar la significación estadística (** P <0.02, * P <0.04).

Nuestro propósito fue ampliar nuestra comprensión de las diferencias metabólicas en los perfiles
metabólicos extracelulares e intracelulares de cuatro líneas celulares de PCa con diversos grados
de agresividad que se centran específicamente en la utilización de glutamina y glucosa. Nuestros
resultados metabólicos in vitro nos llevaron a determinar el flujo metabólico hiperpolarizado de
piruvato 1-13C en modelos animales de xenoinjerto PC3 y PC3M y las pruebas de CB-839. CB-839
(Calithera Biosciences) es un ligante nanomolar para ambas isoformas principales de glutaminasa
1 (GLS1), tiene una buena biodisponibilidad oral y se encuentra actualmente en un estudio de Fase
I para tumores sólidos y leucemia.

DE LAS FIGURAS ANTERIORES

La producción de lactato y la captación de glucosa y glutamina difieren en las células de cáncer

de próstata.

El perfil metabólico de las muestras de tejido tumoral (Fig. 1d), que incluye las células
(intracelular) y los espacios intersticiales (extracelular), reveló las mismas diferencias encontradas
en los ensayos in vitro de PC3 y PC3M: el lactato fue mayor en los tumores de PC3 que en PC3M
Los tumores y el succinato, el aspartato, el glutamato y la glutamina fueron mayores en los
tumores PC3M.

Los experimentos de rastreo de carbono 13 revelan diferencias en la utilización de glutamina.

Para explorar más a fondo las diferencias en la utilización de glutamina y glucosa en líneas de
células PC3 y PC3M, se realizaron experimentos de alimentación / rastreo de carbono-13. Se
observaron valores similares de lactato en ambos tipos de células y en ambos experimentos de
rastreo; sin embargo, con los experimentos de alimentación de glutamina con carbono 13,
encontramos la etiqueta en succinato intracelular y prolina en la línea celular PC3M (Fig. 2). Este
resultado, junto con nuestros resultados de espectroscopia de protones, enfatiza las diferencias en
la utilización de glutamina entre PC3 y PC3M
FIGURA 2

Los resultados muestran un aumento del marcador de carbono 13 de la glutamina en succinato y

prolina en células PC3M.

Los estudios de piruvato hiperpolarizado revelaron un aumento del flujo glucolítico en los
tumores PC3.

La conversión de piruvato a lactato fue mayor en los tumores PC3 que en los tumores PC3M Este
hallazgo se corresponde con la mayor producción de lactato extracelular en 24 horas por las
células PC3 que por las células PC3M en cultivo.

Los ensayos de inhibición de fármacos revelan la variabilidad de la utilización de glutamina.

Estos resultados confirman que la dependencia de glutamina es mayor en la sublínea metastásica

PC3M que en las células PC3 y que la glutamina se está utilizando para alimentar el ciclo del ácido
cítrico. Estos resultados también sugieren que la activación de mTOR es más frecuente en las
células PC3M que en las células PC3.

Los niveles de proteína indican diferencias en las vías de señalización y el metabolismo de la

glutamina.

La tecnología de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA) 46 se utilizó para analizar la actividad
de la proteína celular en los lisados de células PC3 y PC3M (n = 3). La Figura 5 resalta algunas de las
proteínas cuyos niveles variaron en> 0.1 entre las líneas celulares y específicamente en la vía de
señalización de AKT y AMPK. Niveles de S473-AKT fosforilado
(Akt-pS473, P <0.01, prueba t no pareada utilizando el método de Holm-Sidak para comparaciones
múltiples) fue mayor en los lisados de células PC3M que en los lisados de células PC3, mientras
que los niveles totales de AKT fueron iguales. Los niveles de p-AMPK fueron mayores en los lisados
de PC3 que en los lisados de PC3M. Tanto AMPK como AKT son reguladores maestros del
crecimiento celular y el metabolismo celular. La desviación entre los niveles de estas dos proteínas
podría ser la causa subyacente de la variabilidad metabólica entre las dos líneas. Los niveles de
GLS1 (GAC y KCA) y GLS2 se determinaron mediante transferencia Western en lisados celulares
PC3 y PC3M tratados o no tratados con 1 μM CB-839 (Fig. 6). La expresión de GLS2 fue mayor en
los lisados de PC3 que en los lisados de PC3M en muestras tanto tratadas como sin tratar. Los
niveles de GLS1 fueron aproximadamente equivalentes en ambas líneas celulares. La
sobreexpresión de GLS2 se observa en las células PC3 y PC3M con la incubación del fármaco, lo
que indica que GLS2 podría compensar la inhibición de GLS1. La sobreexpresión de GLS2 después
del tratamiento farmacológico es la más alta en las células PC3. La reducción de los niveles de
GLS2 con y sin fármaco presente puede conducir a una mayor susceptibilidad de PC3M al
tratamiento con CB-839

Aumento de la glucólisis observada en tumores PC3 con piruvato hiperpolarizado. (a) el esquema
ilustra las diferentes vías a través de las cuales el piruvato 1-13C hiperpolarizado se puede
metabolizar en la célula. Debido a la rápida pérdida de polarización, los metabolitos principales
detectados son las resonancias para lactato y alanina en vivo.

(b) Espectros de ratones representativos de tumores PC3M y PC3 tomados 21 segundos después
de la inyección en la vena de la cola de piruvato hiperpolarizado. La tasa de conversión más rápida
en PC3 se ve fácilmente.

(c) Imagen 1H de un ratón con tumor PC3M representativo. Se utilizó espectroscopía 13C selectiva
en segmentos para capturar la señal 13C en el tejido tumoral después de la inyección de piruvato
hiperpolarizado.

(d) Los datos de piruvato hiperpolarizado se procesaron para generar curvas dinámicas que
caracterizan la llegada de piruvato hiperpolarizado y su conversión química en lactato. El lactato
normalizado (nLac), definido como la relación de la señal acumulada total de lactato con la señal
de carbono-13 total, se calculó para cada exploración de 13C. La conversión normalizada de
lactato fue mayor en animales portadores de tumores PC3 (0.44 ± 0.09) que en los animales
portadores de tumores PC3M (0.29 ± 0.02). La significación estadística de la diferencia entre los
grupos de tumores se determinó mediante una prueba t de dos colas no apareada (P <0.03).

Discusión

Nuestros resultados ilustran la reprogramación metabólica que puede ocurrir entre líneas
celulares similares. Nuestros resultados metabólicos son intrigantes porque la línea PC3M se
derivó aislando y haciendo crecer una metástasis pulmonar de PC3 en un ratón desnudo. La línea
PC3M es más metastásica y agresiva que la línea de la célula madre inicial. Ambas líneas son
receptoras de andrógenos, nulas y, por lo tanto, resistentes a la castración. La glucólisis fue
mayor en las células PC3 que en las células PC3M tanto in vivo como in vitro según se evaluó
mediante imágenes metabólicas y análisis metabólico. Además, las variaciones en la captación
de glutamina marcada con 13C y los productos metabólicos en las células PC3M cultivadas en
comparación con las células PC3 cultivadas indican que se está utilizando la glutamina en mayor
medida para alimentar el ciclo del ácido cítrico (marcaje con succinato) en las células PC3M.
Además, se observaron niveles más altos de succinato y aspartato (ambos metabolitos formados
a partir del ciclo del ácido cítrico) en el tejido tumoral PC3M. El nivel de expresión de GLS2 fue
menor en las células PC3M que en PC3. Juntas, estas diferencias conducen a una mayor
vulnerabilidad de las células PC3M al inhibidor de GLS1 CB-839. Para nuestro conocimiento, este
es el primer estudio que muestra que CB-839 reduce la proliferación celular y la viabilidad en
una línea de PCa isogénica. Este aumento en la utilización de glutamina en líneas celulares
metastásicas más agresivas también se observó en el cáncer de ovario, lo que sugiere que la
utilización de glutamina podría estar directamente relacionada con la progresión metastásica.
(Jiang et al). informaron que las células en cultivo requieren glutamina descarboxilación reductiva
para formar estructuras esferoides a partir de Crecimiento dependiente del anclaje. CB-839 podría
tener un efecto mayor en la progresión metastásica que en la proliferación celular. Nuestros
resultados revelan que tanto PC3 como PC3M proliferan incluso en ausencia total de glutamina,
lo que ilustra la naturaleza dinámica del metabolismo y la capacidad de múltiples compuestos
para ser utilizados como fuentes de carbono y nitrógeno para proporcionar los componentes
básicos para la replicación. Nuestros datos de RPPA revelaron diferencias en los niveles de AKT
fosforilado (pS473P) y mTOR en lisados de PC3M versus PC3. La incubación con rapamicina 3 nM
(un inhibidor de mTOR) o CB-839 1 µM redujo la producción de ATP Sólo en células PC3M. Se
sabe que el AKT fosforilado activa mTOR, que puede estimular la utilización de glutamina, y el
aumento de la concentración de glutamina puede modular directamente la vía mTOR. En estudios
futuros, determinaremos si la regulación de esta vía puede explicar las diferencias en la utilización
de glutamina entre estas dos lineas celulares.

En conclusión, observamos mayor fux glucolítico en los tumores PC3 que en los tumores PC3M
en ratones y observamos un aumento en la utilización de glutamina en la línea celular PC3M.
Una vez que comprendemos los mecanismos subyacentes a esta variación metabólica entre los
subtipos de PCa, podremos usar imágenes metabólicas hiperpolarizadas para proporcionar una
justificación para las combinaciones individualizadas de inhibidores de la vía metabólica y la
quimioterapia y mejorar potencialmente el resultado de los pacientes con cáncer de próstata.

Figura 4. Vulnerabilidades terapéuticas de la línea celular PC3M observada en los ensayos de

fármacos. Las células PC3 y PC3M se trataron con diversos metabolitos o inhibidores y se
evaluaron los efectos sobre la viabilidad y proliferación celular. A menos que se indique lo
contrario, el significado estadístico de las diferencias entre los grupos se determinó por la ausencia
de apareamiento prueba t de dos colas. (a) Comparación de recuentos de células PC3 y PC3M
después de 72 horas de crecimiento en presencia o ausencia de glutamina 2 mM (Gln). (b)
Comparación de recuentos de células PC3 y PC3M después de 72 horas de tratamiento con
inhibidor de GLS1 CB-839 o vehículo. Se usaron de cinco a seis repeticiones para cada condición.
En ambos experimentos (ayb), la proliferación de PC3M se inhibió en mayor medida que la
proliferación de PC3 (P <0.03 [+/− Gln], P <0.00001 [+/− CB-839]). La proliferación de PC3 no fue
inhibida por CB-839, pero fue inhibida por la exclusión completa de glutamina en los medios.
Ambas líneas celulares proliferaron en ausencia de glutamina y en presencia de CB-839. (c) Niveles
de ATP en células tratadas durante 72 horas con vehículo o con 1 μM de CB-839 sobre control sin
tratar. Se usaron de cinco a seis repeticiones para cada condición. Los niveles de ATP se redujeron
solo en las muestras de PC3M tratadas (P <0,0001). (re). Los niveles de ATP fueron equivalentes a
los de las células tratadas con vehículo cuando las células tratadas con CB-839 1 μM también se
incubaron con dimetil 2-oxoglutarato 4 mM, lo que demuestra que DMKG rescató el ciclo del ácido
cítrico. (e) El tratamiento con inhibidor de mTOR rapamicina (3 nM o 25 nM) redujo
significativamente los niveles de ATP en las células PC3M en comparación con el control del
vehículo, pero no redujo los niveles de ATP en las células PC3. La significación estadística de las
diferencias se determinó mediante ANOVA de dos vías (P <0,00001, siete muestras repetidas por
condición).

Figura 5. Variación de la vía de señalización entre las células PC3 y PC3M. El análisis de la matriz de
proteínas de fase inversa (RPPA) se utilizó para identificar las diferencias en la expresión de varias
proteínas en células PC3 y PC3M (n = 3 muestras por tipo de célula). Las etiquetas del eje x
representan proteínas seleccionadas dirigidas por los anticuerpos utilizados en el análisis; V es
validado y C es curso. Se ha demostrado que los anticuerpos validados en múltiples ensayos se
dirigen solo a la proteína nombrada y no tienen una unión de destino; Por supuesto, los
anticuerpos tienen enlace de destino. Lisados celulares PC3M expresaron niveles más altos de AKT
fosforilado (Akt-pS473, P <0.01, prueba t no pareada utilizando el método de Holm-Sidak para
comparaciones múltiples), 4E-BP1 y mTOR que los lisados de células PC3. La expresión de AMPK y
p-AMPK fue mayor en los lisados de células PC3.
Figura 6. Expresión de la proteína glutaminasa en líneas celulares PC3 y PC3M antes y después del
tratamiento con CB-839. Las células PC3 y PC3M se trataron (+) o no se trataron (-) con el inhibidor
de GLS1 CB-839 (1 µM) y su expresión de las proteínas GLS1 y GLS2 se determinó mediante
transferencia Western. Los anticuerpos específicos para GAC y KCA se utilizaron en dos muestras
replicadas, mientras que la expresión de GLS2 se determinó en tres repeticiones. Los lisados de
células PC3 tenían niveles más altos de expresión de GLS2 que los lisados de células PC3M
independientemente del tratamiento con CB-839. La densidad media de las bandas en las
transferencias de GLS2 se determinó utilizando el software ImageJ. La significación estadística se
determinó mediante una prueba t de dos colas no pareada. La diferencia en la expresión de GLS2
fue significativa en las células no tratadas (P <0,03), pero debido a la alta variabilidad, la diferencia
no fue significativa en las células tratadas con fármaco. Niveles de GLS1 (GAC y KGA) fueron
similares en todos los lisados celulares. Los geles completos se pueden ver en los datos
complementarios.