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Ingeniería racional de una α-amilasa adaptada al frío del ciliado

antártico Euplotes focardii para la mejora simultánea de la


termoestabilidad y la actividad catalítica.
Importancia
Las enzimas adaptadas al frío tienen alta actividad específica a temperaturas
bajas y moderadas, una propiedad que puede ser extremadamente útil en
diversas aplicaciones ya que implica una reducción en el consumo de energía
durante la reacción catalizada. Sin embargo, la elevada termolabilidad
concurrente de las enzimas adaptadas al frío limita a menudo sus aplicaciones en
los procesos industriales. La α-amilasa del ciliado antártico etilóptico Euplotes
focardii (denominado EfAmy) es una enzima adaptada al frío con una actividad
catalítica óptima en medio alcalino. Estas características únicas lo distinguen de
la mayoría de las α-amilasas caracterizadas hasta ahora. En este trabajo,
diseñamos la novela EfAmy con termoestabilidad mejorada, afinidad de unión de
sustrato y eficiencia catalítica a varias extensiones, sin impacto en su preferencia
de pH. Estas características pueden considerarse una propiedad importante para
ser utilizadas en alimentos, detergentes, textiles y otras aplicaciones industriales.
La estrategia de ingeniería enzimática desarrollada en este estudio también
puede proporcionar un conocimiento útil para la futura optimización de moléculas
que se utilizarán en aplicaciones industriales particulares.
INTRODUCCIÓN
Las α-amilasas (EC 3.2.1.1) son endo-agitando enzimas que hidrolizan almidón
clivando aleatoriamente los enlaces 1,4-α-D-glucosídicos entre las unidades de
glucosa adyacentes en cadena de amilosa lineal (1, 2). Basándose en la similitud
de secuencias, las α-amilasas se han clasificado en las familias de glucósido
hidrolasa (GH) (3), que se incorporan principalmente a la familia GH13 en la base
de datos Carbohidrato-Active enZYmes (CAZy) (4). Sin embargo, con el rápido
aumento del número de α-amilasas recientemente descubiertas, también se han
identificado como representantes de otras familias de GH (3). Las relaciones
evolutivas entre los miembros de GH13 se han revisado recientemente
extensamente y la familia se subdivide actualmente en 42 subfamilias sobre la
base de similitudes en sus secuencias (5). La estructura terciaria de todas estas
enzimas se caracteriza por un barril (β / α) 8 que contiene una tríada catalítica
conservada (Asp, Glu, Asp) que forma el sitio activo (6). Las α-amilasas se han
utilizado en una amplia gama de procesos industriales tales como en alimentos,
detergentes, textiles y industria del papel (7, 8). Representan aproximadamente
el 30% del mercado mundial de enzimas (2). Las α-amilasas pueden obtenerse
de varias fuentes, incluyendo plantas, animales y microorganismos. Las α-
amilasas microbianas son generalmente atractivas para aplicaciones
biotecnológicas e industriales (1, 9), en particular las producidas por extremófilos,
ya que pueden soportar condiciones adversas (10-15). En general, las enzimas
adaptadas al frío producidas por los psicrófilos poseen altos valores
biotecnológicos y proporcionan un beneficio económico más productivo a baja
temperatura que los homólogos mesófilos o termófilos. Esto implica ahorro de
energía en procesos industriales (16, 17). Sin embargo, aunque se ha estudiado
un número reducido de α-amilasas adaptadas al frío para la comprensión de la
adaptación molecular de enzimas adaptadas al frío (18-22), rara vez se
desarrollan para un uso inmediato en aplicaciones industriales (23). Como
cuestión de hechos, ha habido una alta demanda para el descubrimiento de la
nueva α-amilasa adaptada al frío para usarlos en diversos procesos industriales
(24).
Las enzimas adaptadas al frío poseen una gama de características estructurales
que confieren mayor flexibilidad estructural en comparación con homólogos
termoestables, que se traduce usualmente en alta actividad específica a bajas
temperaturas (37). Sin embargo, una mayor flexibilidad también puede
representar una espada de dos filos para los organismos psicrófilos, ya que
también aumenta la probabilidad de que las proteínas puedan sufrir
desnaturalización en respuesta a pequeños cambios en las temperaturas (25).
Por lo tanto, la alta termolabilidad de las enzimas adaptadas al frío ha sido un
inconveniente importante para su uso en aplicaciones industriales (17, 26). Una
manera de resolver este problema es modificar las enzimas adaptadas al frío
existentes mediante mutagénesis dirigida al sitio combinada con un enfoque de
diseño racional (27), que generalmente se basa en alineaciones de secuencia de
consenso guiadas por estructura con secuencias que tienen una identidad de
aminoácidos moderada o alta, Con el fin de reducir el número de posibles
residuos diana a mutar. Anteriormente, los principios de diseño racionales se han
utilizado con éxito para mejorar la estabilidad y / o la eficacia catalítica de enzimas
tales como amilasa maltogénica y fosfolipasa tipo patatina (28-30). Estos cambios
redujeron la flexibilidad molecular del polipéptido mediante: 1- introducción de
residuos hidrófobos en el núcleo proteico; 2- introducción de puentes disulfuro y
sal para aumentar las interacciones electrostáticas en el polipéptido; 3-
estabilización de los dipolos de la hélice α; 4- introducción de residuos Pro; Y el
acortamiento de 5 bucles para disminuir la entropía del bucle (27, 31).
Recientemente, la α-amilasa adaptada al frío del ciliado antártico Euplotes
focardii, llamada EfAmy, se expresó heterólogamente en Escherichia coli y se
caracterizó bioquímicamente (32). El protozoario ciliado E. focardii muestra un
fenotipo estrictamente psicrófilo (33, 34). La actividad amilolítica de EfAmy se
comparó con la de la enzima homóloga (EcAmy) de la especie congénere mesófila
E. crassus (32). Los resultados mostraron que EfAmy representa una enzima
psicrofílica clásica con alta actividad hidrolítica a bajas temperaturas (5-25 ° C) y
alta termolabilidad. Además, EcAmy mostró una termoestabilidad aumentada de
2 veces a 50 ° C en comparación con EfAmy. En el presente estudio, se aplicó
mutagénesis dirigida al sitio para generar un EfAmy activo en frío con
termoestabilidad mejorada y eficiencia catalítica a bajas temperaturas. Aplicamos
un enfoque de diseño racional para identificar los residuos que contribuyen a la
estabilidad estructural y la eficiencia catalítica de la EfAmy-α-amilasa activa en
frío. Ensayos bioquímicos de las versiones de ingeniería de EfAmy reveló que la
combinación de mutaciones en los bucles de superficie y el núcleo catalítico
resultados en un aumento significativo de la termoestabilidad y la eficiencia
catalítica de la enzima. Las nuevas α-amilasas generadas en nuestro estudio
podrían tener importantes aplicaciones en las industrias de detergentes y
alimentos y bebidas, donde las enzimas adaptadas al frío ya han sido
ampliamente aplicadas e incluso han llevado a una evolución de los procesos
convencionales. Además, el éxito de nuestra estrategia de diseño racional sugiere
que puede aplicarse universalmente a otras enzimas.
Resultados y discusion
EfAmy análisis de secuencias
En un estudio anterior (32), bioquímicamente caracterizado dos homólogos
Α-amilasas de dos especies relativamente cercanas Euplotes, el pshychrophilic E.
focardii (llamado EfAmy) y el mesófilo E. crassus (llamado EcAmy). Demostramos
que EfAmy y EcAmy compartieron similitud de secuencia relativamente alta (68%
de identidad, 82% de similitud). Con el fin de identificar su relación evolutiva con
otros miembros de la glucosida hidrolasa (GH) 13 subfamilias, EfAmy y EcAmy se
alinearon con α-amilasas de taxa representativo de bacterias, Archaea y Eukarya.
La alineación se convirtió en un árbol filogenético (Fig. 1). El árbol muestra
claramente que EfAmy (denominada en el árbol como Euplotes focardii) y EcAmy
(Euplotes crassus) junto con secuencias homólogas de otros ciliados como
Euplotes harpa, Oxytricha trifallax, Tetrahymena thermophila (y Paramecium
tetraurelia cluster dentro del clado de la subfamilia GH13_1 que es Representada
por varios hongos bien estudiados y α-amilasas de levadura, incluyendo α-
amilasa de ácido Aspergillus niger (46), α-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae
(47) y α-amilasa de Saccharomycopsis fibuligera (48).
Dependencia del pH de EfAmy y variantes dirigidas al sitio
La dependencia del pH de las actividades de α-amilasas mutantes y de tipo
salvaje se examinaron en diversos tampones a valores de pH que oscilaron entre
5,0 y 11,0, en condiciones de ensayo estándar. Los resultados mostraron que el
pH óptimo de todas las variantes dirigidas al sitio era 9, que era similar al de la
enzima de tipo salvaje (Figura S2). Mientras que las α-amilasas de la mayoría de
bacterias y hongos tienen pH óptimo en el intervalo ácido a neutro (1), EfAmy
representa una enzima alcalina como las α-amilasas alcalinas previamente
caracterizadas de Bacillus spp. (54). Esto puede considerarse una propiedad
importante para la utilización de la enzima en las industrias detergentes y textiles
y en otras aplicaciones industriales.
Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de las
variantes dirigidas al sitio.
Se determinó el efecto de la temperatura en las actividades de α-amilasas de tipo
salvaje y mutante a diversas temperaturas que oscilaban entre 5 y 60ºC (Figura
4). Bajo las condiciones estándar utilizadas, el EfAmy de tipo salvaje mostró la
actividad más alta a aproximadamente 25ºC. Se observó una actividad máxima
del cincuenta por ciento a 5ºC y aproximadamente un 10% de actividad residual
permaneció a 45ºC. Todas estas características indican que el tipo silvestre se
comporta como una enzima psicrofílica clásica. Con el fin de optimizar la actividad
enzimática y la estabilidad a altas temperaturas, y sin un compromiso dramático
de su actividad a baja temperatura para una aplicación más amplia en usos
industriales, introdujimos mutaciones en los bucles de superficie y el dominio
catalítico del EfAmy basado en nuestro análisis estructural.
Parámetros cinéticos
Se realizaron estudios cinéticos sobre las enzimas silvestres y mutadas a 5, 25 y
35 ° C usando almidón como sustrato. Como se indica en los resultados
presentados en la Tabla 2, en comparación con el EfAmy de tipo salvaje, los
mutantes E166P, S185P y T350P mostraron una ligera disminución de la tasa de
rotación (kcat) y un aumento de la afinidad de unión del substrato (disminución
de KM) a todas las temperaturas. Sin embargo, la eficacia catalítica global
aumentó para estos mutantes de sitio único. Este efecto fue más significativo
cuando se combinaron las tres mutaciones (E166P / S185P / T350P) con un valor
de kcat / KM aumentado del 56% a 35ºC. Por otra parte, aunque se observó una
ligera disminución de los valores de kcat a 5 y 25ºC cuando se ensayaron las
variantes de sitio único con sustituciones de aminoácidos en el núcleo catalítico
de la enzima (V212T o V232T), un aumento significativo de las eficiencias
catalíticas Fueron detectados a todas las temperaturas medidas. Esto puede
explicarse por la disminución dramática de los valores de KM de ambos mutantes
de sitio único. Curiosamente, cuando se analizó la enzima diseñada que llevaba
la combinación de todas las mutaciones (E166P / S185P / T350P / V212T /
V232T), se observó un aumento significativo de la tasa de rotación a alta
temperatura (35ºC). De hecho, esta enzima representa el catalizador más
eficiente entre todas las enzimas ensayadas en el presente estudio cuando las
reacciones se llevaron a cabo a 35ºC. Vale la pena señalar que la enzima de
ingeniería que llevaba combinado cinco mutaciones mostró una eficiencia
catalítica aún mejor que la de la EcAmy mesófilo (32). Existe un acuerdo común
de que se ha producido un equilibrio entre la termoestabilidad y la actividad
catalítica durante la evolución natural de las enzimas para adaptarse a diferentes
nichos de temperatura en el medio ambiente (68). Esto puede ser apoyado por
el hecho de que las enzimas adaptadas al frío con alta eficiencia catalítica a baja
temperatura a menudo muestran una alta termolabilidad a altas temperaturas
debido a la pérdida de estructuras nativas (69, 70). Sin embargo, la
termoestabilidad y la actividad catalítica no son mutuamente excluyentes en una
enzima adaptada al frío. Se ha informado que los métodos de evolución dirigida
pueden conferir enzimas con alta termoestabilidad y alta actividad catalítica (71,
72). Dorothee Kern y sus colaboradores han aplicado recientemente enfoques de
reconstrucción de secuencias ancestrales (ASR) para crear una "superenzima"
que exhibe alta termoestabilidad y actividad catalítica a bajas temperaturas (73).
En el presente estudio, hemos demostrado que el diseño racional basado en la
ingeniería de proteínas también puede lograr el mismo efecto

CONCLUSIÓN
Las estrategias de la ingeniería de la proteína se utilizan a menudo para optimizar
rasgos de la enzima. Tanto el diseño racional como la evolución dirigida se han
utilizado para adaptar las propiedades enzimáticas (74, 75). El diseño racional
requiere un conocimiento profundo de las estructuras parentales, secuencias de
consenso e interacciones entre residuos de aminoácidos para identificar
mutaciones que conducirían a propiedades enzimáticas deseadas, especialmente
el alto nivel de termoestabilidad y eficiencia catalítica requerida para aplicaciones
industriales. En el presente trabajo, aplicamos un método de diseño racional para
diseñar una nueva α-amilasa adaptada al frío con termoestabilidad mejorada,
afinidad de unión al sustrato y eficacia catalítica en varias extensiones. En una
variante (E166P / S185P / T350P), introdujimos residuos Pro en los dominios A y
B en bucles superficiales. En la segunda variante (V212T / V232T), facilitaron
interacciones extra moleculares en el núcleo catalítico de la proteína. El objetivo
de estas sustituciones era rigidizar la estructura molecular de la enzima. De
hecho, la variante dirigida al sitio E166P / S185P / T350P mostró un fuerte
incremento en la termoestabilidad con respecto al tipo salvaje, mientras que la
variante dirigida al sitio V212T / V232T mostró un mayor impacto a la eficacia
catalítica en comparación con las enzimas con superficie Mutaciones. Todos
nuestros sitios de mutación se seleccionaron sobre la base de los análisis
estructurales y de consenso entre la enzima adaptada al frío y su contraparte
mesófilo. A diferencia de la mutagénesis dirigida únicamente basada en el análisis
estructural de proteínas que a menudo muestra un impacto adverso a los
parámetros cinéticos, el enfoque de consenso guiado por la estructura supone
que la naturaleza ha optimizado eficientemente el espacio de secuencia de la
proteína. Por consiguiente, un único punto de interés mutacional para posiciones
que coinciden con el deseado límite de consenso ha demostrado ser un enfoque
exitoso para ser usado en enzimas de ingeniería con parámetros cinéticos
mejorados (29, 77, 78). La combinación de análisis de secuencia y comparación
de modelos basados en homología parece ser un buen enfoque para el diseño
racional de las mutaciones para mejorar la estabilidad térmica y la eficiencia
catalítica de esta enzima (79, 80). Nuestro estudio apoya este enfoque
multidisciplinario para engendrar diversidades estructurales en catálisis y para la
optimización de aplicaciones industriales particulares. La α-amilasa de E. focardii
que hemos diseñado es prometedora para aplicaciones industriales no sólo por
su eficiencia en el frío, sino también porque representa una enzima alcalina,
similar a la α-amilasa de los Bacillus spp. (11, 54) y diferente de la mayor parte
de la Α-amilasas caracterizadas hasta ahora. Esta característica puede
considerarse una propiedad importante para ser utilizada en las industrias
detergentes y textiles y en otras aplicaciones industriales.

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