UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRACTICA N° 5
ESPECTRO DE ABSORCIÓN - DETERMINACIÓN DE λ ÓPTIMO

INTEGRANTES:
Crespo Caballero, Marelly Grey Gabriela 20161343
Del Carpio Ramírez ,Amada Zoila 20170436
Espinoza Villanueva, Lucia Patricia 20161344
Perez Del Rosario, Eduardo Javier 20161366
Mayta Solis, Benjamin Francisco 20161358

GRUPO: Lunes de 2:00p.m-4:00p.m

FECHA DE LA PRÁCTICA: 23/04/18
FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 30/04/18

INTRODUCCIÓN:
La interacción entre las ondas electromagnéticas y la materia de la región UV-visible
es el campo de estudio de la espectroscopia UV-visibles o espectrofotometría. Está
basada en la relación que presenta un haz de luz incidente en la muestra y el haz de
luz que pasa por la solución. Su estudio se basa en que la cantidad de luz absorbida
por la materia presente en la solución es característica del compuesto. La respuesta
de dicho componente es función de las características del haz de luz incidente en la
muestra, lo que permite determinar la respuesta en función de la calidad del haz
proporcionado. Dicho conjunto de respuesta en el rango de longitud de onda de la
gama UV-visible se denomina espectro de absorción; dicha respuesta es
característica de cada compuesto, la cual estudiaremos y nos iremos familiarizando
con la utilización y manejo de un espectrofotómetro 20 Génesis.

RESULTADOS:
Cuadro de espectro de absorción de Azul de bromofenol.
Ʌ 520 nm 560 nm 580 nm 600 nm

%T 36.058 8.933 3.141 3.945

A 0.443 1.049 1.503 1.404

Cuadro de la curva de calibración de azul de bromofenol.

Tubo Blanco 1 2 3 4 5

Sol. Trabajo (mL) 0 2 4 6 8 10

 H2O destilada 10 8 6 4 2 0
(mL)

Absorbancia 0 0.491 0.789 1.116 1.355 1.474

Concentración 0 0.0008 0.0016 0.0024 0.0032 0.004

(mg/mL)

mg% 0 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4

ug/mL 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4

Mg/L o ppm 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4

Constante de absortividad= 371.54

Cuadro de la curva de calibración de Naranja de metilo.

Tubo Blanco 1 2 3 4 5

Sol. Trabajo (mL) 0 2 4 6 8 10

H2O destilada 10 8 6 4 2 0
(mL)

Absorbancia 0 0.059 0.123 0.197 0.260 0.317

 Concentración 0 0.0008 0.0016 0.0024 0.0032 0.004
(mg/mL)

mg% 0 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4

ug/mL 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4

Mg/L o ppm 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4

Constante de absortividad = 80.786

DISCUSIONES:
● El espectro de absorción del naranja de metilo muestra una creciente al comenzar
porque la concentración es muy parecida a la del blanco, entonces comienza a
separarse poco a poco del rango inicial y alcanza su punto máximo de absorbancia,
para así, permitir asegurar que la concentración es la pieza clave dentro de la
solución, puesto que si tiene muy poca, va a ser una absorbancia baja, porque “se
absorben aquellas frecuencias que son capaces de producir excitación electrónica”,
pero luego desciende debido a que ya no existe un equilibrio en la solución que le
permita al colorante absorber la intensidad incidente optimizando la transmitancia
mucho más que la absorbancia.

● El azul de bromofenol tiene la propiedad de que la longitud de onda a las formas

ácida y básica, en concentraciones equivalentes, tienen igual absorbancia.

● La absorbancia es directamente proporcional a la concentración, por tanto, siempre

que la concentración de colorante se aumente, la absorbancia aumenta también. De
la misma forma cuando la concentración del colorante disminuye, la absorbancia
disminuye.
● La absorcion de radiacion electromagnetica a determinada longitud de onda puede
alterar el estado energético de una molécula, esto se puede medir para realizar un
estudio cuanti o cualitativo, este fenómeno es el fundamento de la
espectrofotometría. Cuando un haz de luz incide sobre un medio homogéneo parte
de la radiación es absorbida y parte de la radiación es transmitida, la fracción de luz
que se absorbe y se transmite depende de la cantidad de moleculas presentes en el
medio (de la concentración) lo que nos permite cuantificar una sustancia (Fecuchi y
Romero, 2010).
CONCLUSIONES:
- Aprendimos el manejo del espectrofotómetro y su utilidad para medir la absorbancia
de una solución.
- Se determino experimentalmente el lambda óptima de absorción (λ) del azul de
bromofenol y el naranja de metilo mediante la medición de estas a diferentes longitudes de
onda (λ) dentro del rango de luz visible hasta encontrar la absorbancia máxima, obteniendo
para el azul de bromofenol un landa de 580 nm.
- Aplicamos la ley de Lambert y Beer concluyendo que la diferencia entre intensidades
del rayo incidente con el emergente (absorbancia) es proporcional a la longitud de
trayectoria y a la concentración de la solución.
- Evidenciamos la relación lineal entre la absorbancia y la concentración propuesta
por la ley de Beer al preparar la curva de calibración cuyo eje de ordenadas es la
absorbancia y el eje de abscisas contiene la cantidad de concentración de forma
ascendente, para hallar la pendiente “a” que seria el coeficiente de la absorbancia.
- Aprendimos a hallar la concentración en mg/ml de una solución y expresarlo en otras
unidades.

PROBLEMAS ENCARGADOS:

1. Hallar la concentración de un metabolito en una muestra de suero si su absorbancia es

de 0, 280 y las absorbancias del estándar son:

TUBO ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN

(mg/dL)

1 0, 100 10

2 0, 200 20

3 0, 300 30

2. El coeficiente de extinción molar del NADH es 6220 . ¿Cuál será la concentración de una
muestra que tiene una absorbancia de 0, 720 diluida a la mitad y puesta en una cubeta de
1cm de espesor?
3. Una solución que contiene 2 g/L de una sustancia que absorbe en una cubeta de
1 cm trasmite el 75% de luz incidente. Calcular la transmitancia de una solución que
contiene: a) 4 g/L, b) 1 g/L, c) 5.4 g/L, e) si el peso molecular de compuesto es 250.
Calcule el coeficiente de extinción molar.
Resolución:
Hallando la absortividad.
A=2-logT%........(2)
A=2-log75
A=0.1249
Reemplazando A en la ecuación 1.
A=a.b.c
0.1249=a.1cm.2
a=0.0625

a) A=0.0625.1cm. 4
A=0.25
En 2:
A=2-logT%
0.25=2-logT%
T%=56.23
b) A=0.0625.1cm. 1
A=0.0625
En 2:
A=2-logT%
0.0625=2-logT%
T%=87.09
c) A=0.0625.1cm. 5.4
A=0.3375
En 2:
A=2-logT%
0.3375=2-logT%
T%=45.7
d) a=0.0625.250
a=15.63
4. Una solución M de ATP tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a 260mm en
una cubeta de 1 cm. Calcular:
Hallando la absortividad.
A=2-logT%........(2)
A=2-log70.2
A=0.15
Reemplazando A en la ecuación 1.
A=a.b.c
0.15=a.1cm.
a=15000
-La transmitancia de la solución en una cubeta de 3 cm.
A=a.b.c
A=15000
A=0.45
En 2:
A=2-logT%
0.45=2-logT%
T%=35.8
-La absorbancia de una solución en cubeta de 1 cm o 3 cm.
A=a.b.c
A=15000 . M.3cm
A=0.45
-La absorbancia de una solución 5xM.
A=a.b.c
A=15000
A=0.75

5. con los siguientes datos graficar en un solo papel milimetrado las tres curvas de
absorción de la Hb en su estado desoxihemoglobina, oxihemoglobina y
cianometahemoglobina indicando cada curva con diferente color o marca. Grafique en
sistema XY longitud de onda D.O respectivamente, identificar para cada curva el o los
puntos de máxima absorción.

Λ (nm) Hb HbO2 HbCN

470 0.07 0.34 0.46
475 0.05 0.31 0.4
480 0.06 0.27 0.35
485 0.11 0.24 0.32
490 0.15 0.21 0.28
495 0.18 0.18 0.27
500 0.23 0.17 0.28
505 0.25 0.2 0.29
510 0.34 0.24 0.3
515 0.35 0.3 0.33
520 0.4 0.38 0.35
525 0.45 0.5 0.38
530 0.47 0.58 0.42
535 0.52 0.67 0.47
540 0.54 0.7 0.53
545 0.57 0.66 0.54
550 0.62 0.62 0.52
555 0.66 0.57 0.51
560 0.7 0.56 0.49
565 0.78 0.5 0.47
570 0.72 0.58 0.42
575 0.68 0.68 0.32
580 0.65 0.8 0.24
585 0.6 0.7 0.22
590 0.51 0.57 0.15
595 0.47 0.4 0.12
600 0.13 0.18 0.05

a) ¿Qué importancia tiene la longitud de onda?

Las longitudes de onda son importantes por que proporcionan distinto nivel o cantidad de
energía y se usan para exitar determinado numero de moléculas, una parte de estas serán
absorbidas y otras serán transmitidas dándose su lectura, el rango visible esta entre 400 y
800 nm.
b) ¿Por qué en las graficas no coinciden los puntos de máxima absorción a pesar de
pertenecer las tres graficas a la Hb?
A pesar de ser el mismo compuesto los puntos de máxima absorción no es el mismo porque
se encuentran en diferentes estados y esto las hace diferentes.
6. A partir de una solución stock de sulfato de cobre de 10 g% (g/100mL) se preparó la
siguiente batería. Exprese las concentraciones de cada uno de los tubos en ppm y en mg%.

Tubo N°1 N°2 N°3 N°4

Sol. Stock CuSO4 0,25 0,5 2,0 4,0

(mL)

H2O destilada (mL) 9,75 9,5 8,0 6,0

Mg% (mg/100mL) 4000 2000 500 250

ppm 40000 20000 5000 2500

BIBLIOGRAFÍA:

● Rubinson, J. y Rubinson, K. 2000. Química Analítica Contemporánea

.Primera Edición. Editorial Prentice Hall. México.
● Ríos C., Angel; et.al. 2012. Técnicas espectroscópicas en química analítica.
Volumen I y II. Editorial Síntesis. Madrid.
● J. M. Fernández Alvarado(2009), Química anlitica,editados por Ldo Salinas
Úriz
● Christian, Gary D. 2009. Química Analítica. Sexta Edición. Editorial Mc Graw
Hill.
● Feduchi y Romero, 2010. Bioquimica. Segunda edición. Editorial
Panamericana.
Angerosa, M y Perazzi, B. 2011. Creatinina en sangre: calidad analítica e influencia
en la estimación del Índice de Filtrado Glomerular. Scielo. disponible en:
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-
29572011000200003