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Línea Tecnológica o Red de Conocimiento Red de conocimiento Ambiental

Programas Asociados a la Práctica de
Laboratorio
Competencias Asociadas
Resultados de Aprendizaje
Duración estimada de la Práctica
Número de aprendices estimado
Tecnología en Control Ambiental
Caracterizar física, química y microbiológicamente
el agua en los procesos de tratamiento.
Procesar las muestras de aguas de acuerdo con las
técnicas y métodos establecidos.
28020102102 Manejar muestras para análisis
28020102103 Manejar equipo de laboratorio
28020102104 Analizar las muestras de agua
28020103001 Registrar y codificar las
muestras de acuerdo con lo establecido en las
normas del laboratorio.
28020103002 Desarrollar los protocolos de
análisis de acuerdo a las técnicas empleadas
28020103003 Presentar los formatos de
informe de resultados
28020103004 Pesar y/o medir el volumen de
una muestra de reactivo requerida en los análisis
fisicoquímicos y/o microbiológicos
28020103005 Preparar soluciones de reactivo
a una concentración determinada
28020103006 Estandarizar una muestra de
reactivo utilizando una técnica de análisis
adecuado.
6 horas
10 por sesión

1. Introducción

DBO es una sigla que traduce literalmente “demanda biológica de oxígeno”. Pero desde el punto de vista
ambiental, las pruebas de DBO constituyen una estimación “semi cuantitativa” de la cantidad de “materia
orgánica fácilmente biodegradable” que contiene una muestra de agua. Ya que no existen formas directas
para medir una diversidad tan grande de sustancias, como la que puede ser cobijada bajo el rótulo de
“materia orgánica fácilmente biodegradable”, los métodos de medición se fundamentan en una
ponderación indirecta basada en “la cantidad de oxígeno que se requiere para oxidar biológicamente la
materia orgánica presente”.

En otras palabras, los métodos de medición se fundamentan en la hipótesis de que la cantidad de materia
orgánica contenida en la muestra, es directamente proporcional a la cantidad de oxígeno que requiere
una población bacteriana para digerirla. Así, si hay mucha “materia orgánica fácilmente biodegradable en
una muestra, una población de microorganismos aeróbicos adicionada a ésta, deberá crecer sin dificultad
y si hay un crecimiento apreciable en la población de éstos microorganismos, entonces ocurrirá un
descenso en la concentración del oxígeno disuelto del sistema”. Por tanto, el descenso en la concentración

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de oxígeno disuelto en la muestra, es directamente proporcional a su concentración en materia orgánica.

La magnitud de éste descenso es lo que se conoce como DBO.

2. Objetivo general

Determinar la DBO5 presente en una muestra de agua dada.

3. Objetivos específicos

• Conocer la técnica para determinar la concentración de DBO en una muestra de agua dada
• Interpretar el resultado obtenido con relación al tipo de muestra analizada

4. Aplicación

La determinación de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) es una prueba cuyos procedimientos

estandarizados son usados para determinar el requerimiento relativo de oxígeno de aguas residuales,
vertimientos y aguas contaminadas. Este ensayo tiene una amplia aplicación en la medición de cargas de
contaminación para plantas de tratamiento y en su evaluación de la eficiencia de remoción de DBO en
dichos sistemas de tratamiento. La prueba mide el oxígeno molecular utilizado durante un periodo de
incubación específico para la degradación bioquímica de la materia orgánica (demanda carbonácea) y el
oxígeno utilizado para oxidar el material inorgánico como los sulfuros y el ion ferroso. También puede
medir la cantidad de oxígeno utilizada para oxidar formas de nitrógeno reducidas (demanda nitrogenácea)
a menos que su oxidación sea prevenida por un inhibidor. Los procedimientos de dilución de siembra y
proporcionan una estimación de la DBO a pH 6.5 a 7.5 .

5. Definiciones

• Agua residual: Las aguas residuales son cualquier tipo de agua cuya calidad se vio afectada
negativamente por influencia antropogénica.
• “DBO”: demanda biológica o bioquímica de oxígeno.
• Demanda de oxígeno: es la cantidad de oxígeno estimada que se requiere para que un proceso
oxidativo ocurra.
• Dilución: es la reducción de la concentración de una sustancia química en una disolución.
• Disolución acuosa: mezcla homogénea de dos o más sustancias en donde el solvente principal o
mayoritario es agua.
• “OD”: oxígeno disuelto presente en una muestra expresado en unidades de mg/L.

6. Fundamento del método

6.1 Método de la DBO5 por dilución1

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APHA, AWA. SMWW, Ed. 20. Método 5210-B
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El método consiste en llenar con muestra, a rebosar, una botella hermética de un tamaño especificado e
incubando a la temperatura especificada para 5 días. El oxígeno disuelto es medido inicialmente y después
de la incubación, y la DBO se calcula a partir de la diferencia entre DO inicial y final. Debido a que el OD
inicial se determina poco después de que se haga la dilución, todo la absorción de oxígeno que ocurre
después de esta medición se incluye en la medición de DBO.

7. Interferencias y limitaciones

7.1 Existen numerosos factores que afectan la prueba de la DBO, entre ellos la relación de la materia
orgánica soluble a la materia orgánica suspendida, los sólidos sedimentables, los flotables, la
presencia de hierro en su forma oxidada o reducida, la presencia de compuestos azufrados, peróxido,
cloro y las aguas no bien mezcladas. Al momento no existe una forma de corregir o ajustar los efectos
de estos factores.

7.2 Los resultados se reportan como DBO5 debido a que no se adiciona inhibidor de nitrificación.

7.3 Requerimientos de dilución. Si el agua de dilución es de baja calidad, su DBO aparecerá como DBO
de la muestra, efecto que será amplificado por el factor de dilución, y el resultado tendrá una
desviación positiva. El método de análisis debe incluir agua de dilución de verificación y agua de
dilución como blanco para establecer su calidad, mediante la medición del consumo de oxígeno con
una mezcla orgánica conocida, generalmente glucosa y ácido glutámico. La fuente del agua de
dilución es destilada a partir del agua de grifo.

8. Toma de muestras

Las muestras para análisis de DBO se pueden degradar significativamente durante almacenamiento entre
la recolección y el análisis, lo que resulta en bajos valores de DBO.

Se debe minimizar la reducción de DBO mediante el análisis de la muestra a la brevedad o por

enfriamiento a temperatura cercana a la de congelación durante el almacenamiento.

Sin embargo, incluso a baja temperatura, considere un tiempo de almacenamiento al mínimo.

1) Si el análisis de las muestras tomadas se comienza dentro de 2 h de la recogida, el

almacenamiento en frío es innecesario. Si el análisis no se inicia dentro de 2 h de recogida de las
muestras, esta se debe mantener en o por debajo de 4 ° C después del momento de la
recolección. Posteriormente, se debe comenzar el análisis dentro de las 6 h de la toma; cuando
esto no es posible porque el sitio de muestreo está lejos de laboratorio, almacenar en o por
debajo de 4 ° C y la longitud informe y temperatura de almacenamiento con los resultados. En
ningún caso el análisis inicial debe ser de más de 24 horas después haber sido tomada la muestra.
Cuando los ensayos se van a utilizar con fines reglamentarios hacer todo lo posible para entregar
muestras para su análisis dentro de las 6 h de recolección.

2) Para muestras compuestas, conserve las muestras a una temperatura igual o inferior a a 4 ° C
durante la composición. El Límite de composición será máximo un período de 24 h. Usar los

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mismos criterios que para el almacenamiento de muestras aleatorias. El tiempo y condiciones de

almacenamiento hacen parte de los datos que acompañan los resultados.

9. Materiales y equipos

a) Botellas de incubación: botellas tipo Winkler de vidrio de 300 mL (tienen un tapón de vidrio
esmerilado y una boca acampanada). Estas botellas deben estar lavadas con un detergente
neutro, deben enjuagarse bien, antes de su uso.
b) Incubadora de aire o baño de agua, la regulación a 20 ± 1 ° C. Excluir toda la luz con el fin de
evitar la posibilidad de la producción fotosintética de DO.
c) Medidor de OD: utilizar un medidor de OD calibrado, que genere datos de oxígeno disuelto
en mg/L.

Figura 1.Medidor YSI de OD Figura 2. Incubadora refrigerada para DBO

10. Reactivos y soluciones

• Buffer de fosfatos, pH 7,2. Pese 8,50 g. KH2PO4, 21,75 g K2HPO4, 33,40 g Na2HPO4.7H2O
• y 1,7 g. NH4Cl. Lleve a un litro con agua destilada.
• Solución de sulfato de magnesio. Pese 22,5 g. MgSO4 y lleve a un litro con agua
destilada.
• Soluciones de cloruro de calcio. Pese 27,5 g. CaCl2 y lleve a un litro con agua destilada.
• Solución de cloruro férrico. Pese 0,25 g. FeCl3.6H2O y lleve a un litro con agua destilada.
• Solución Control de Glucosa y Ácido Glutámico. Pese 150 mg glucosa y 150 mg de ácido
glutámico o 187,2 mg. de clorhidrato de ácido glutámico.

Estos reactivos deben ser secados previamente a 110 ºC durante dos horas. Disuelva y lleve a un
litro con agua destilada. Prepare y utilice solución fresca, antes de usarse.

11. Procedimiento

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a. Preparación del agua de dilución.

Colocar un volumen deseado de agua en un recipiente limpio y adicione 1 mL de cada solución
de nutrientes: buffer fosfato, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y cloruro férrico por cada 1
L de agua a preparar. Inocule si es el caso. Utilizar esta agua de dilución hasta dentro de 4 horas
de preparada para asegurarse de tener controlada la calidad de la misma.
Antes de usar el agua de dilución, mantener la temperatura en 20 °C ± 3°C. Saturar con oxígeno
disuelto utilizando un aireador convencional.

b. Almacenamiento de agua de dilución.

Preferiblemente no almacenar agua de dilución preparada por más de 24 h después de haber
adicionado los nutrientes, minerales y solución buffer a menos que el blanco del agua de dilución
cumpla consistentemente la calidad de los límites de control. Descarte agua almacenada si el
blanco de dilución muestra un descenso de más de 0.2 mg/L de OD en 5 días.

c. Patrón de chequeo de glucosa-ácido glutámico

Como la DBO es un bioensayo, sus resultados pueden estar en gran parte influenciados por la
presencia de interferencias o por el uso deficiente de un inóculo. Se puede chequear la calidad
del agua, la efectividad del inóculo, y la técnica analítica por medio de mediciones de una mezcla
de 150 mg /L de glucosa y 150 mg/L de ácido glutámico como una solución estándar de chequeo.
La glucosa tiene una oxidación excepcionalmente alta y variable, pero cuando esta es usada con
ácido glutámico, la tasa oxidativa es estabilizada y muy similar a la que se obtiene con la muchos
desechos de agua residual.
Se debe determinar la DBO5 de una dilución al 2% de la solución estándar de glucosa-ácido
glutámico utilizando la técnica descrita más adelante.

d. Inoculación
1) Fuente de inóculo: siempre es necesario tener presente una población de
microorganismos capaz de oxidar la materia orgánica biodegradable en muestra. Algunos
ejemplos de fuentes de inóculo pueden ser agua residual doméstica, efluentes sin cloración
o desinfección provenientes de plantas de tratamiento o aguas superficiales que reciben
descargas de aguas residuales. Algunas muestras no contienen una población microbiana
suficiente, por ejemplo, algunas aguas industriales, desechos que han tenido procesos de
desinfección, vertimientos a altas temperaturas y vertimientos de valores de pH extremos.

Para algunas muestras se debe inocular el agua de dilución, o la misma muestra, adicionando
una pequeña población de microorganismos. El inóculo preferido es el efluente de una
planta de tratamiento de aguas residuales; aunque también se puede utilizar agua residual
alistada a temperatura ambiente al menos por 1 h pero no más de 36 h.

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2) Control del inóculo: Se debe determinar la DBO del material inóculo de igual forma como
para una muestra. Del valor encontrado en el control del inóculo y un conocimiento de la
cantidad del inóculo presente en el agua de dilución, se puede determinar el requerimiento
de OD del inóculo. Idealmente, se deben hacer diluciones con el inóculo de tal forma que
resulte un decrecimiento de al menos un 50% del OD. Una gráfica del decrecimiento de OD,
en miligramos por litro, versus mililitros de inóculo para todas las botellas teniendo un
decrecimiento de 2 mg/L y un residual mínimo de 1 mg/L de OD deberían representar una
línea recta donde la pendiente indica el decrecimiento de OD por mililitros de inóculo. El
intercepto con el eje del OD es el decrecimiento del oxígeno causado por el agua de dilución
y este debe ser menor que 0.1 mg/L. Para determinar el requerimiento de OD para una
botella de ensayo, reste el requerimiento de OD atribuido al inóculo del valor de OD total.

e. Pretratamiento de la muestra
Debe chequearse el pH de todas las muestras antes del ensayo, incluso si en anteriores ocasiones
el pH está en un rango aceptable.

1) Muestras que contengan valores de pH alcalinos (pH > 8.5) o acidez (pH < 6.0): neutralizar
las muestras hasta un rango de pH entre 6.5 – 7.5 con solución de ácido sulfúrico (H2SO4) o
hidróxido de sodio (N aOH) de concentración suficiente de tal forma que la adición de estos
reactivos no diluyan la muestra más del 0.5%. Siempre inocular las muestras que ya tengan
el pH ajustado.
2) Muestras que contienen compuestos de cloro: Si es posible, evitar muestras que contienen
cloro residual, muestreando antes de los procesos de cloración. Si la muestra ya ha sido
clorada, pero no hay presente niveles detectables de cloro residual, se tendrá que inocular
el agua de dilución. Si el cloro residual está presente, se puede “declorar” la muestra y luego
inocular el agua de dilución. No se debe analizar muestras cloradas/decloradas sin inocular
el agua de dilución. En algunos casos, el cloro de las muestras se puede disipar dejándolas
por 1 a 2 h directamente a la luz. Para las muestras en donde el cloro residual no se disipa
en un periodo razonable de tiempo, este se puede eliminar por adición de solución de
tiosulfato de sodio, Na2SO3.
Para determinar el volumen requerido de solución de tiosulfato de sodio en una alícuota de
muestra de 100 a 1000 mL, adicionar 10 mL de solución ácido acético 1:1 o 1+50 de ácido
sulfúrico, 10 mL de solución yoduro de potasio (KI) de 10 g/100 mL por alícuota de 1000 mL,
y titule con solución de tiosulfato de sodio hasta el punto final del almidón-yodo. Adicionar
a la muestra neutralizada, un volumen relativo de solución de tiosulfato de sodio,
determinado por el ensayo descrito anteriormente, mezclar, y después de 10 a 20 min,
chequear el cloro residual en la muestra. (NOTA: el exceso de tiosulfato de sodio, ejerce una
demanda de oxígeno y reacciona lentamente con ciertos compuestos orgánicos de
cloraminas que pueden estar presentes en las muestras cloradas.)

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3) Muestras que contienen otras sustancias tóxicas: muchos vertimientos industriales, por
ejemplo, desechos de curtiembres, contienen metales tóxicos. Algunas muestras a menudo
requieren especial estudio, cuidado y tratamiento.
4) Muestras super saturadas con OD: las muestras que contienen más de 9 mg OD/L a 20 °C
pueden ser encontradas en aguas heladas o en aguas donde ocurre fotosíntesis. Para
prevenir pérdida de oxígeno durante la incubación de dichas muestras, se debe reducir la
saturación de oxígeno tomando la muestra en una botella winkler, agitándola vigorosamente
o aireándola con aire comprimido limpio.
5) Ajuste de temperatura de las muestras: se debe asegurar que las muestras estén a 20 ± 1°C
antes de realizar cualquier dilución.
6) Inhibición de nitrificación: si se desea inhibir la nitrificación adicionar 3 mg de 2-cloro-6-
(tricloro metil) piridina (TCMP) a cada botella de 300 mL antes de tapar o adicionar suficiente
cantidad del agua de dilución para hacer una concentración final de 10 mg/L. (NOTA: La
TCMP pura se disuelve lentamente y puede flotar en la parte superior de la muestra. Algunas
formulaciones comerciales se disuelven más rápido, pero no son 100% TCMP).

f. Técnica de dilución
Se debe realizar varias diluciones de muestra que resultarán en un OD de al menos 1 mg/L y un
requerimiento de OD de al menos 2 mg/L después de 5 días de incubación. Cinco diluciones son
recomendadas a menos que la experiencia con una muestra en particular demuestre que el uso
de un número menor de diluciones produce al menos dos botellas que proporcionan un
decrecimiento mínimo aceptable de OD. Un análisis más rápido, como la DQO, puede ser
aproximadamente correlacionada con la DBO y servir como una guía a la hora de seleccionar las
diluciones. En caso de tener ausente este dato previo, se pueden usar las siguientes diluciones:
0.0 a 1.0% para vertimientos industriales muy contaminados, 1 a 5% para agua residual cruda, 5
a 25% para un efluente biológicamente tratado y 25% a 100% para aguas de río contaminadas.

Se pueden preparar las diluciones en probetas o material volumétrico, y luego transferir a las
botellas Winkler de DBO; aunque también se puede preparar la dilución directamente en la
botella. El número de botellas a ser preparadas para cada dilución depende de la técnica de
medición del OD y del número de repeticiones deseadas. Determine el oxígeno inicial de cada
una de las botellas. Tape todas las botellas con un tapón esmerilado y sello de agua, e incube por
5 días a 20 °C.

g. Determinación del OD inicial

Si la muestra contiene materiales que reaccionan rápidamente con el OD, se debe determinar el
oxígeno inicial OD inmediatamente después del llenado de la botella winkler de DBO con la
muestra diluída. En el caso que el consumo estimado de OD sea insignificante con respecto al
tiempo, este no debe ser superior a los 30 minutos entre realizada la dilución y la medición en el
equipo del OD.

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h. Blanco de dilución
Se debe usar un blanco de agua destilada como chequeo de la calidad del agua de dilución y la
limpieza de las botellas utilizadas. Siempre que se monte una DBO debe de realizarse un blanco.
Determine el OD del blanco inicialmente, y este no deberá disminuir más de 0.2 mg/L a los cinco
días.

i. Incubación
Incubar a 20 °C ± 1 °C las botellas Winkler con las respectivas diluciones de muestras, blancos de
dilución y patrón de chequeo de glucosa y ácido glutámico. Deben protegerse de la luz, por tanto
evite abrir la incubadora durante los 5 días del proceso.

j. Determinación del OD final

Luego de los cinco días de incubación, determinar el OD en las botellas Winkler, tal cual como se
indica anteriormente.

12. Cálculos

El resultado de la DBO5 debe calcularse mediante la siguiente expresión:

𝐷𝐵𝑂5 (𝑚𝑔/𝐿) = (𝑂𝐷1 − 𝑂𝐷5 ) × 𝑓

Donde:
OD1 corresponde al oxígeno disuelto inicial en mg/L
OD5 es el oxígeno disuelto al quinto día en mg/L
f es el Factor de Dilución.

13. Referencias

• APHA, AWWA, WEF, (1995). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
19th Edition, Washington, USA.
• WORLD HEALTH ORGANIZATION, (1987). GEMS/Water Operational Guide.
UNEP/WHO/UNESCO/WHO/Proyect on Global Water Quality Monitoring. Geneva, Italy.

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