Cuantificación de α-β carotenos

En una muestra de zanahoria blanca fresca. Se va a presentar la preparación de esta muestra. Para decidir como se
debe preparar la muestra se debe saber. Los analitos son el α-β carotenos, estos son los analitos que se van a extraer
de la matriz y lo que se debe saber es la polaridad de ellos porque en algún rato los vamos a tener que extraer. En este
caso estas sustancias son no polares, y son liposolubles (solubilidad).

En la cromatografía líquida (High Performance Liquid Chromatography) uno puede aprovechar la polaridad de las
sustancias para separarlas y cualificarlas y cuantificarlas. Para ello necesito que los analitos estén en solución de
preferencia preparada en la fase móvil (mezcla de solventes) sin sólidos en suspensión.

Necesito saber las propiedades más importantes de esta sustancia para saber como procesar a la muestra sin correr
el riesgo de descomponerlas, dañarlas o perderlas. Los α-β carotenos son termosensibles (sobre los 40°C se
descomponen), son fotosensibles, para lo cual se debe trabajar con luz roja. Son fácilmente oxidables.

Como me dice cuantificación, durante todo el proceso de preparación de muestra se debe ir registrando pesos,
volúmenes, factores de dilución, etc. por lo que al final con los cálculos debo cuantificar concentración. Siempre que
se hace una cuantificación se hace una curva de calibración, significa que debo saber si tengo estándares de α-β
carotenos o uno de ellos para estándar para todo. Si toca extraer se debe aforar a volúmenes conocidos.

La matriz es la zanahoria amarilla fresca. Asumimos que ya tenemos la muestra (5Kg de zanahoria). La zanahoria tiene
cáscara. Por medio de investigación bibliográfica la mayor concentración de α-β carotenos están en la cáscara; de aquí
depende en dónde yo quiera hacer el análisis si en la parte comestible o en la cáscara. Se la pela y se pesa la cantidad
de cáscara porque hay que escribir el rendimiento en parte comestible. Si se pela se pesa. El primer paso sería entra
zanahoria entera, se pela y sale cáscara y parte comestible.

Las muestras de alimentos siempre se lavan y se desinfectan. Primero con agua corriente y luego con agua clorada (o
vinagre) para evitar que proliferen microorganismos e intervengan con la muestra. Luego se las debe secar. Se los
puede secar al ambiente o en túneles de aire frío para vitar problema con la temperatura.

Luego se las puede triturar tomando en cuenta que si existe mucha agitación se airea la muestra y se oxida. En la
zanahoria no sucede esto porque no tiene mucho polifenol oxidasa. Cuando hay productos que se pardean fácilmente
se nota mucho en el vaso de la licuadora mientras se licúa (por ejemplo, pera y manzana). Si se la prensa se pierde
jugo y por ende se pierden α-β carotenos. Entonces es mejor cortarles; el tipo de corte depende y afecta a la
preparación de la muestra. Se pueden cortar en rodajas, cubitos. Entonces la preparación previa de trituración me
reduce el tamaño de partícula, el tamaño de muestra sigue igual (5kg de zanahoria). Como se redujo el tamaño de la
partícula, aumentó la superficie de contacto.

Se toma una submuestra, una porción homogénea de la muestra anterior. Entre 50-100g de submuestra.

Cuando uno trabaja con material fresco o seco debe tener en cuenta que uno de los dos se pesa más cantidad que el
otro. Se pesa más del fresco porque el seco ya está concentrado. El % de humedad de los vegetales es mas o menos
80% entonces se debe pesar más de muestra seca. Se cogen los 100g, este peso se lo debe anotar porque luego todos
los cálculos se hacen en base a los 100g.

Se trituró para usar menos solvente y poder hacer una extracción. Los carotenos se pueden extraer en acetona, etanol
o en una combinación de los dos solventes. Para extraer toda la gama de α-β carotenos se usa una mezcla de solventes.
Entonces se le va a añadir acetona – etanol (50:50).

En el tubo criogénico se pone una cantidad de solvente que por lo menos sobrepase el material que vamos a extraer.
Por ejemplo, se añaden 30 ml de solvente y se debe ayudar a que el proceso de extracción ocurra. No con centrifugado
porque es un proceso de separación. Se debe agitar para que se mezclen el sólido y el solvente, y se favorezca la
transferencia de masa. La agitación se puede hacer con agitador magnético. El tiempo de agitación se puede
determinar experimentalmente o se usa otra opción de agitación, como el agitador de vortex.

Si se quiere eliminar el problema de la oxidación se puede eliminar el aire con un gas inerte. Se introduce una manguera
que sople nitrógeno y se saca el aire. Un analito mientras más separado esté de su matriz es más sensible; por ende
se deben tomar medidas para protegerlo. Luego se pasa a la separación, se puede centrifugar si las partículas son muy
pequeñas. La velocidad se la debe determinar en el laboratorio. Tampoco es tan estricto, con tal de lograr separar. Por
ejemplo 3500 rpm; en los protocolos se encuentra en rpm o en gravedades. En gravedades es mejor reportar en los
protocolos porque midiendo el diámetro del rotor de la centrífuga se puede calcular las velocidades para recrear el
análisis. Con papel filtro (o algodón) se debe cuidar que no quede analito retenido en el papel, se debe lavar con
solvente el residuo sólido que quedó en el papel para que así todo el analito que haya sido extraído vaya a la solución.
En este caso como los α-β carotenos son coloreados es fácil ver si se quedan en el medio filtrante, por lo que se debe
lavar. Si no se hace así se puede hacer mecánico. El filtro con jeringuilla es de 0.45 o 0.22 micras de tamaño de poro
y son con estos con los que se hace la última filtrada.

Una vez ya separado se recoge el extracto, el cual será inicialmente los 30ml y un residuo sólido

Entonces se repite el procedimiento porque no todo el analito va a poder haber sido extraído en la primera extracción.
Se repite hasta poder extraer la mayor cantidad de analito y depende mucho del tamaño de partícula que se tenía en
un inicio. Este número de veces se determina en el laboratorio.

El primer extracto se llama extracto crudo, aquí está todo lo que fue soluble en la acetona-etanol. Con 3 repeticiones
fue suficiente y aproximadamente tendré 90 ml de extracto. En el α-β carotenos se extrae hasta que se decolore la
muestra. Como no hay certeza del volumen que se tiene, se lleva a un volumen conocido. Se afora con el solvente de
extracción. En consecuencia, se tienen 100 ml de un extracto crudo. En ese extracto sigo teniendo todo lo que se
solubilizó con la mezcla de solventes. Para separarlos se los puede precipitar, adsorber, luego de adsorber se debe
tener un proceso de desorción.

Entonces se procede a hacer una extracción líquida – líquido con un embudo de separación.

La percolación es la extracción de una matriz sólida con un solvente líquido.

Ya en el embudo me consigo un solvente que sea más afín a los carotenos. Este es el éter de petróleo. Es un solvente
no polar, igual que los carotenos. Es bastante específico para sustancias liposolubles y de cadena larga. Se le coloca
aproximadamente 50 ml (la mitad) y ahora se tiene el éter y el extracto y se agita para que mejore el contacto, para
que se de la transferencia de masa desde el extracto crudo al éter y se solubilicen los analitos que estén más afines a
solvente y se deja reposar para que se separen las fases. El solvente debe ser inmiscible para que no quede en una
sola fase. Se retira la tapa y se recoge el extracto empobrecido de carotenoides, el extracto refinado de α-β carotenos
se pasan a un recipiente cubierto con papel aluminio y se coloca un antioxidante para proteger los analitos.
Generalmente se pone un antioxidante llamado BHT, no interfiere ni molesta en la técnica y protege los analitos. Se
repite el procedimiento hasta asegurarse de haber extraído los α-β carotenos.

Aproximadamente tendría 150ml de extracto etéreo. Yo necesito 20 microlitros y además necesito otra fase móvil.
Probablemente este diluida, entonces debo concentrar el analito y cambiar de solvente. Concentrar se puede lograr
evaporando o evaporando al vacío (rotavapor) y ellos pueden hacer una evaporación en una atmósfera inerte.

Se debe evaporar a sequedad y evaporar todo el solvente, al final queda el analito como una delgada película pegada
al balón. Ahí también va a estar el antioxidante. Se recuperan con la fase móvil del cromatógrafo, la menor cantidad
posible. Porque luego se lleva a volumen conocido. Se usa entre 5 y 10ml. Se le coloca, se lava con pipetas Pasteur.

** el pimiento tiene el problema adicional de que tiene proteínas, lo que tapona las tuberías del cromatógrafo líquido
y se debe lavar el equipo con HCl. Los pimientos además tienen otros pigmentos que generan interferencias.

Ahora si se pasa la muestra por un filtro de 0.45 micras porque no puede entrar ningún sólido al equipo.