ALIMENTO

VOLATIL POR SECADO

(HUMEDAD) MATERIA SECA

ORGANICA INORGANICA
(CENIZAS)
SOLUBLE EN DISOLVENTES
ORGANICOS
(GRASA O LIPIDOS)
CON NITROGENO
(PROTEINAS)

NO GRASO SIN NITROGENO

(CARBOHIDRATOS)

NO DIGERIBLES
DIGERIBLES (FIBRA)
 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

- Composición química compleja

- Nitrógeno elemento común.
- Interacción con otros componentes.
- Diversas características físicas y químicas.
- Ampliamente distribuidas.
CONSIDERACIONES PARA LA CUANTIFICACION

Necesidades específicas
• Proteína cruda
• Proteína verdadera
• Proteína soluble
• Fracciones específicas
• a.a. libres

Niveles de detección requeridos

Naturaleza de la muestra
• Complejidad de la matriz
• Homogeneidad de la muestra
• Presencia de otros componentes nitrogenados
 CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS.

CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS

1. Contenido de nitrógeno.
2. Contenido enlaces peptídicos.
3. Cuantificación grupos amino primarios.
4. Cuantificación amino ácidos específicos.
5. Contenido de proteína cruda seca.
DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL

Fundamento:
Considerando que el nitrógeno sólo proviene de las
proteínas se puede tener un estimado de su
concentración, ya que se encuentra en una proporción
constante para cada una de ellas.

La mayoría de las proteínas tienen una cantidad

aproximada de 16% de nitrógeno.

100 g proteína
-------------------------- = factor = 6.25
16g de nitrógeno

% proteína cruda = % N2 x factor

FACTORES DE CONVERSIÓN

TRIGO
HARINA ENTERA 5.83
HARINA REFINADA 5.70
PASTAS 5.70
SALVADO 6.31
ARROZ 5.95
CEBADA, AVENA, CENTENO 5.83
MAÍZ 6.25
SOYA 5.71
NUECES
CACAHUATES,
NUECES DE BRASIL 5.41
ALMENDRAS 5.18
OTRAS NUECES 5.30
LECHE Y PROD. LÁCTEOS 6.38
GELATINA 5.55
TODOS LOS OTROS 6.25
CUANTIFICACION DE NITRÓGENO

Método de Kjeldhal
Digestión húmeda de la materia orgánica y
cuantificación del amoniaco producido a partir
del nitrógeno.

Método de Dumas
Combustión (seca) de la materia orgánica y
cuantificación de nitrógeno o compuestos
nitrogenados gaseosos.
 A. MÉTODO DE KJELDAHL (Desarrollado en 1883.)

Digestión.
-Oxidación de proteínas y
compuestos orgánicos por
H2SO4
-Fijación del nitrógeno como
sulfato de amonio

n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

proteína calor
 Destilación.

Desprendimiento de amoniaco por

una base fuerte
(NH4)2SO4 + NaOH NH3 + Na2SO4 + H2O

Recuperación del amoniaco en:

•Agua H2O (neutro) + NH3 (NH4)2OH (alcalino)
•Un ácido fuerte (HCl, H2SO4) en exceso
HAexceso (ácido) + NH3 NH4A + HAremanente (ácido)
•Un anfótero (Ác. Bórico)
H3BO3 (ácido) + NH3 (NH4)H2BO3 (alcalino)
Titulación.

Ácido – base

(NH4)22+ -OH + H+ -A (NH4)A + H2O

H+ -Aremanente + B+ -OH BA + H2O

(NH4)+ H2BO3- + H+ -A H3BO3 + (NH4)A

OTRAS ALTERNATIVAS PARA MEDIR EL AMONIACO

A) Nesslerización
4NH4OH + 2HgI2 + 4KI + 3KOH NH2Hg2IO + 7KI + 2 H2O
Rojo-naranja, 440nm

B. Azul de indofenol (Berthelot)

NH3 + fenol + hipoclorito Indofenol (Azul, 630nm)
-OH

C. Cambio de pH del destilado

D. Cromatografía iónica
E. Detección potenciométrica con electrodos específicos
Causas de pérdida de nitrógeno.

- Tiempo prolongado de digestión.

- Muestras con baja concentración de nitrógeno y
mayores proporciones de carbohidratos y grasas
aumenta la dificultad en la digestión.
- Cantidad de ácido
- Cantidad de muestra
- Velocidad de calentamiento
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA DETERMINACIÓN
Efecto de la temperatura en la digestión.
Temperatura óptima de digestión 360°C
Adición de sales para elevar el punto de ebullición.
Influencia de catalizador.
Aumenta la eficiencia en la descomposición.
- Mayor eficiencia con óxido de mercurio.
- Causa menor pérdida que selenio o cobre.
El oxido de titanio puede sustituir al oxido de mercurio
(no tóxico y menos costo).
VENTAJAS DESVENTAJAS

• Muy común. Oficial • Puede establecerse

(comparación). pérdida de nitrógeno.
• El nitrógeno no proteico • El contenido de nitrógeno
puede eliminarse puede variar entre las
después de precipitar la proteínas.
proteína con TCA. • Baja especificidad.
• Puede ser automatizado
• Det. colorimétrica del NH3
B. MÉTODO DUMAS. (Desarrollado en 1831)

-Combustión 700 - 1000°C.

-Uso de catalizador metálico.
-Cuantificación Volumétrica N2 gas.

Acoplamiento a equipos de CG incrementan

exactitud
-Conductividad térmica
-Quimiluminiscencia
 QUIMILUMINESCENCIA

1000ºC
Compuestos con N NO + Productos de combustión

NO + O3 NO2* + O2 NO2 + hλ

La emisión de luz es específica para el oxido nítrico y se

mide a 650-900nm

La determinación completa se realiza en 30 seg.

FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA
DETERMINACIÓN

- Formación de compuestos refractarios (ej.

nitruros).
- Influencia del catalizador
VENTAJAS
-Automatización del método
DESVENTAJAS
-Costos
-Sensibilidad
DETECCIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN
1. Reacción de Millon
Grupos fenólicos (tirosina)
Color rojo ladrillo con nitratos de mercurio
2. Reacción Xantoprotéica.
a.a. aromáticos.
Precipitado blanco con Ac. nítrico ------ amarillo
3. Reacción de Biuret.
Enlaces peptidicos.
Color violeta con sales de cobre
4. Reacción con ninhidrina
Grupos amino libres (a.a. y peptidos)
Color azul con ninhidrina
5. Ident. de cisteina y cistina
Color rojo con nitroprusiato de sodio
 CUANTIFICACION DE PROTEÍNA SOLUBLE

A. Métodos Físicos
1. Espectrofotométricos U.V
2. Fluorescencia
3. Infrarrojo cercano (NIRA)
B. Métodos Químicos
1.- Biuret
2.- Lowry
3.- Unión a colorantes
4.- Turbidimétricos
5.- Titulación
1. ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA
-Fuerte absorción a.a. aromáticos tirosina, triptofano,
histidina y fenilalanina (entre 260 y 280 nm).
-Presenta interferencias por compuestos aromáticos
(ac. nucleicos).
Coeficientes de absorción (K) de algunas proteínas
utilizadas comúnmente como patrón.

• Albúmina Bovina Sérica (BSA): 63

• Inmunoglobulina bovina, humana, o de conejo (IgG): 138
• Ovoalbúmina de pollo: 70

Abs = K C
Abs
K = --------------
C
•Sensibilidad del método 0.1 a 3 mg/ml.
•No requiere uso de reactivos
•No destructivo.

Curva de
calibración de
Albúmina Bovina
Sérica (BSA)
Coeficiente de
correlación
0.99911.
 2. FLUORESCENCIA

•Los compuestos aromáticos potencialmente presentan

fluorescencia.
•Absorción a una longitud de onda y reemisión de la
radiación.
•Alta sensibilidad (ng/ml)
•No destructivo.
•Diferencias en contenido de aa aromáticos
•Costo del equipo
 Existe la alternativa de unir químicamente
compuestos fluorescentes (ejm. derivados del
naftaleno u otros compuestos aromáticos).

•Sensibilidad 10-500 ng/mL

3. INFRARROJO CERCANO (NIRA)

•Absorción de energía por enlaces produciendo cambios

vibracionales u oscilatorios de las moléculas.
•Enlaces involucrados C-N, N-H y O-H, C-H, C=O
•Permite analizar proteínas y otros componentes (agua y
lípidos).
•Alta sensibilidad y precisión.
•No destructivo
•Requiere Calibración para cada producto
•Puede ser usado con muestras íntegras (reflactancia)
COZZOLINO, Daniel, FASSIO, Alberto y FERNANDEZ, Enrique.
USO DE LA ESPECTROSCOPÍA DE REFLECTANCIA EN EL
INFRARROJO CERCANO PARA EL ANÁLISIS DE CALIDAD
DE ENSILAJE DE MAÍZ. Agric. Téc. [online]. oct. 2003, vol.63,
no.4 [citado 01 Octubre 2007], p.387-393.

Figura 3. Espectro infrarrojo de muestras de ensilaje de maíz (línea

punteada) y desviación estándar de los espectros (línea entera).
 Non-Destructive Analysis of Whole Grain Soy
Beans by Near Infrared Spectroscopic Method

Reference
M.Takahashi, M.Hajika, K.Igita, and T.Sato, "Rapid
Estimation of Protein, Oil and Moisture Contents in
Whole Grain Soybean Seeds by Near Infrared
Reflectance Spectroscopy." Proceedings of NIR 95
 MÉTODOS QUÍMICOS

1.MÉTODO DE BIURET. (1940).

Principio: Formación de un complejo colorido entre
enlaces peptídicos y ión cúprico en medio alcalino

H-N: :N-H
/ \
O=C C=O
\ /
R-CH Cu2+ CH-R
/ \
H-N: :N-H
\ /
O=C C=O
/ \
R-CH CH-R
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

- Sensibilidad 1 - 10 mg/ml.
- Rápido (20-30 mins)
- Poco específico
- Interferencias con iones amonio
- Cambios de color por el tamaño de la proteína
2. MÉTODO DE LOWRY (1951).

Principio: Formación de complejo (cobre-proteína) en medio

alcalino y Reducción del reactivo de Folín (Folin-Ciocalteu
reagent: Na2MoO4 + Na2WoO4 + H3PO4) por el complejo.

Especies reducidas de Coloración azul (745-750 nm)

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
- Participación de enlace peptídico y grupos aromáticos
(tirosina, triptofano). Mayor especificidad que Biuret.
- Sensibilidad 10-2000 µg/ml.
DESVENTAJAS

- Diferente respuesta de las proteínas

- Bajas velocidades de reacción.

- Inestabilidad del reactivo.

Lowry. Variación entre proteínas

Albumin, bovine serum 1.00

Aldolase, rabbit muscle 0.94
α-Chymotrypsinogen, bovine 1.17
Cytochrome C, horse heart 0.94
Gamma globulin, bovine 1.14
IgG, bovine 1.29
IgG, human 1.13
IgG, mouse 1.20
IgG, rabbit 1.19
IgG, sheep 1.28
Insulin, bovine pancreas 1.12
Myoglobin, horse heart 0.90
Ovalbumin 1.02
Transferrin, human 0.92
3. UNIÓN A COLORANTES.

a) Bradford (Azul de Coomasie)

b) Colorantes aniónicos (Amidoschwarz, Orange G)

Principio:
Formación de complejos estables proteína-colorante.
a) BRADFORD (1976).

Principio:
Unión no covalente de la proteína al colorante azul de
Coomassie que cambia de rojo a azul.
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

El colorante presenta diferencias en color en función de la

carga.
Proteina
Rojo Verde Azul Azul-Proteina
(470 nm) (650 nm) (590 nm) (590 nm)
H+ H+

- Forma aniónica interacción con las proteínas (grupos

básicos y aromáticos).

- Sensibilidad 0.001 a 0.1 mg/ml.

- Presenta inestabilidad del color en función del pH.

Unión a colorantes. Reacción de Bradford

Concentraciones crecientes de proteína

b) Colorantes aniónicos (Amidoschwarz o amido black,
Naranja 12, Naranja G)

Principio:
Unión no covalente de la proteína precipitable a los
colorantes (Negro Amido 10B, Naranja 5, Naranja ácida
12, etc.)

Amido black 10B Orange G

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

- Unión a grupos catiónicos de los aa básicos

- Precipitación de la proteína con TCA (Antes o después
de teñir)
- Medición espectrofotométrica (Colorante no unido o
después de solubilización del complejo)
- Presenta mayor especificidad.
- Problemas con proteínas de bajo peso molecular
(insulina).
- Sensibilidad 0.5 mg/ml.
- Rápido (menos de 15 mins)
4. MÉTODOS TURBIDIMETRICOS.

a) Ac. tricloroacético (1952)

b) Ferrocianuro de potasio en medio ácido (1951)
c) Ac. sulfosalicílico (1951)

Principio:
Medición de la turbidez por precipitación de proteínas
en condiciones controladas.

a) TCA 3-10%
b) Ferrocianuro 0.75%
c) Ac. Sulfosalicílico 2.5%
CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS

- Rápidos (15 mins)

- Sensibilidad 0.5 - 1.5 mg/ml.
- Poco específico
- Presencia de compuestos insolubles en ácido
- Diferencias en precipitación de las proteínas
5. MÉTODOS POR TITULACIÓN (60’s).

a) Medio acuoso
b) Medio no acuoso
c) En presencia de Formol

Principio:

Estimación de la proteína por la presencia de

grupos ionizables en las cadenas laterales.
a) TITULACIÓN EN MEDIO ACUOSO

- Grupos involucrados, amino y carboxilo.

- Generalmente potenciométricas.
- Reacciones ácido-base.
- Poca especificidad.
b) TITULACIONES NO ACUOSAS

- Disminución de la constante dieléctrica del medio

con solventes.
- Aumento del pK de los grupos carbóxilo y
disminución pK de los grupos amino.
- Facilita la titulación ácido-base.
- Generalmente se utilizan alcohol y acetona.
- Baja especificidad
c) TITULACIÓN EN PRESENCIA DE FORMOL

- El formaldehído reemplaza al grupo -NH2 por un

grupo imino -N=CH2
- Posterior titulación del grupo carboxilo libre
- La reacción se realiza con formaldehído neutro
COOH COOH
| |
R-CH-NH2 + H2C=0 ⇒ H2O + R-CH-N=CH2