ACFrOgD2exUXYbJPOTKfXmIFmt4DsYSTauxx0hoYKxzsxXicwKMZfwqPa1m7lSOJOWxAmbawVq3ylwGeWZj-ysWKCm9RvHld3Rv 2DgEZR0FytAGbmGmpycPTEStLEE

Facultad de Química y Biología
Laboratorio de Química Orgánica II

Ing. en Biotecnología.
Primer Semestre 2019
Ing. en Biotecnología
Laboratorio de Química Orgánica II.
Primer Semestre de 2019

Jueves
8:00 – 11:10 horas
Contenido:
- Normas generales para la seguridad de laboratorio.
- Normas generales para las Evaluaciones.
- Horarios de atención.
- Calendario de actividades.
- Guías para prácticos de laboratorio.
Resumen de Reglas Esenciales para la Seguridad en el Laboratorio [1]
Siempre ☺ Nunca 
- Use protección para los ojos - Fume en el Laboratorio
- Use ropa adecuada - Coma en el Laboratorio
- Lave sus manos antes de dejar el - Inhale, deguste o huela
Laboratorio imprudentemente reactivos
- Conozca las normas y procedimientos - Corra dentro del Laboratorio
de seguridad para cada acción a realizar - Distraiga a sus compañeros o
en el Laboratorio deambule por el Laboratorio
- Manipule los reactivos cuidadosamente - Lleve a cabo experiencias no
y conozca sus propiedades autorizadas
- Mantenga limpia y despejada su área de
trabajo
- Esté atento a eventualidades
- Cuando deba armar equipos, revise
cuidadosamente su ensamblado antes
de usarlo
Manual de Laboratorio. Edición 2019. 2

Evaluaciones
• Control de entrada: En cada sesión de laboratorio usted realizará un control de entrada

individual. El promedio de estos tendrá una ponderación igual al 30% de la nota final
de laboratorio.
• Reporte: Al finalizar cada sesión, cada grupo de trabajo deberá enviar un reporte en
formato pdf utilizando la plataforma “classroom”. El reporte no debe exceder cuatro páginas
(portada no incluida) y debe contener:
− Objetivos
− Descripción del procedimiento experimental
− Resultados
− Discusión/es
− Bibliografía
El promedio de los reportes equivale al 20% de la nota final de laboratorio.
- Pruebas de ciclo: Al finalizar cada ciclo, se realizará una evaluación escrita. La distribución
de los contenidos y fechas designadas, se pueden ver en el calendario de actividades.
Ponderaciones:
1ª prueba de ciclo 25%
2ª prueba de ciclo 25%
Promedio controles de entrada 30%
Promedio reportes 20%

Aprobación del laboratorio y asistencia:

- La nota mínima de aprobación del laboratorio es de 3,95 con asistencia del 100%.
- Aquellos alumnos que presenten una asistencia menor al 100% sin el correspondiente
justificativo, reprueban automáticamente el curso.
- En caso de inasistencia, deberán presentar justificación a secretaria de la carrera:
• Certificado médico (Licencia médica o certificado profesional).
• Constancia de asistente social de facultad (en caso de problemas personales).
• Constancia laboral (en caso de tener un trabajo remunerado).
Atención a estudiantes
Vía mail de lunes a viernes de 9:00 a 18:00 a la dirección judith.faundes@usach.cl.
Bibliografía de esta sección
1. Galagovsky, L. (1999). Química Orgánica, Fundamentos teórico-prácticos para el Laboratorio,

6º Ed., Buenos Aires: EUDEBA.

2.
Calendario de Actividades Laboratorio de Química Orgánica II.
Primer semestre 2019
Jueves: 8:00-11:10 horas
Semana Actividad
25 de marzo Inicio de semestre
04 de abril Introducción. Asistencia Obligatoria.
11 de abril Práctico 1: Digestión enzimática de proteínas.
18 de abril
25 de abril Práctico 2: Variación de la actividad enzimática según factores fisicoquímicos.
02 de mayo
09 de mayo Práctico 3: Extracción y purificación de ácidos nucleicos.
16 de mayo
23 de mayo Prueba de Ciclo 1
30 de mayo Práctico 4: Obtención de Biocidas de origen vegetal
06 de junio
13 de junio Práctico 5: Encapsulación de agentes biocidas en geles de alginato de calcio.
20 de junio
27 de junio Prueba de Ciclo 2
09 de julio
13 de julio Cierre de semestre

PRÁCTICO 1.
“Digestión enzimática de proteínas”
Introducción:
Las caseínas son los principales componentes proteicos de la leche, constituyendo el 80% del total
de las proteínas. Se definen como fosfoproteínas que precipitan a pH 4,6 a 20°C e incluyen cuatro tipos de
cadenas polipeptídicas αs1-caseína, αs2-caseína, βs1-caseína y k-caseína. Son proteínas complejas que gracias
a su diferente distribución de cargas e hidrofobicidad se asocian a sales inorgánicas, principalmente calcio y
fosfato, para formar agregados coloidales (micelas), que proporcionan a la leche su opalescencia
característica.
Las enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos se denominan de manera general como peptidasas y
juegan un rol importante en muchos procesos biológicos tales como el recambio de proteínas, digestión y
defensa de patógenos. Estás pueden dividirse entre exo- y endopeptidasas. Las primeras pueden ser amino-
o carboxipeptidasas y liberan aminoácidos por la ruptura de los enlaces peptídicos a partir del final de la
cadena polipeptídica. Las endopeptidasas, rompen enlaces peptídicos en el interior de la cadena polipeptídica
y son clasificadas por en base al mecanismo catalítico en serinícas, cisteínicas, aspárticas y
metaloendopeptidasas.
La tripsina es una enzima endopeptidasa encontrada en el jugo pancreático que cataliza la hidrólisis
de enlaces peptídicos formados a partir de los grupos carboxilo de los aminoácidos L-arginina y L-lisina.
Figura 1.1: Ecuación general de la reacción de hidrólisis enzimática por tripsina.
Los aminoácidos formados pueden determinarse mediante el número de grupos amino libres usando
titulación estándar luego de la reacción del formaldehído con el grupo amino de los aminoácidos
hidrolizados, que liberan iones H+ de acuerdo con la siguiente ecuación química:
~NH2 + HCHO → ~NHCH2O + H+
A medida que se produce la reacción, la solución se hace más ácida y la cantidad de álcali requerido
para neutralizar este aumento de la acidez es una medida de los grupos amino libre formados en la hidrólisis.
El mecanismo de la reacción se basa principalmente en las propiedades anfotéricas de los

aminoácidos y se explica en la siguiente figura:
Figura 1.2: Mecanismo de reacción entre aminoácidos y formaldehído.
Procedimientos:
1. Obtención de caseína sin grasa.
Se calientan 100 mL de leche líquida en un vaso de precipitados a 40 ºC, a los que se agregan, gota a
gota, 2 mL de una solución acuosa al 50 % de ácido acético. Se deja enfriar la mezcla y se filtra. El sólido
(caseína) se presiona para sacar el líquido, y se transfiere a otro vaso de precipitados. La solución, conocida
como suero, se desecha en esta oportunidad.
La caseína obtenida se lava dos veces con 15 mL de acetona cada vez; se filtra, se seca, y se pesa. Con
esta caseína se hará las reacciones frente a tripsina.
2. Digestión de la caseína obtenida.
Reactivos:
- Caseína (1%, 0,8%, 0,6%, 0.05%).
- Tripsina 0,1%
- NaOH 0,1N
- Ácido acético
- Buffer de acetato de sodio (pH =8.5).
- Hielo.
- Formaldehído neutralizado al 40%.
- Fenolftaleina.
- Agua destilada.
- Solución de TCA

Procedimiento:
• Preparación del Sustrato: Preparar caseína al 1% disolviendo 1g in 100 mL de buffer de acetato de

sodio de (pH = 8.5). Las otras diluciones (0,8%, 0.6%, y de 0,05%) pueden prepararse a partir de esta
solución.
En caso de utilizar caseína comercial, utilizar → caseína para uso in vitro
• Sacar con una pipeta soluciones de 1 mL de caseína; cada concentración en tubos de ensayo
separados.
• Agregar 0,2 mL de tripsina a cada tubo.
• Incubar la mezcla a 37 ºC por 30 minutos
• Agregar 1 mL de solución de ATC (TCA) al 12%
• Enfriar rápidamente la mezcla en hielo
• Centrifugar por 5 minutos a 3.000 rpm; sacar el sobrenadante, medir su volumen, que corresponde
al volumen de aminoácidos libres.
• En un Erlenmeyer agregar 5 mL de formaldehído neutralizado al 40%
• Titular con NaOH 0,1N hasta que se forme un color rosado débil. La cantidad de NaOH agregado (el
valor del título) es una medida de los grupos aminoácidos libres producidos.
• Calcular la concentración de los aminoácidos libres:
N x V (a.a) = N x V (NaOH)
• Graficar una curva estándar del título versus la concentración.
Bibliografía:
1) Applied Biochemistry Lab:

http://walghazzawi.kau.edu.sa/Files/0007119/Files/119837_applied_biochemistry.pdf
2) Isolation of casein from milk:

http://www.chemistry.mcmaster.ca/~chem2o6/labmanual/expt11/2o6exp11.html

PRÁCTICO 2.
“Variación de la actividad enzimática según factores fisicoquímicos.”
Introducción:
La pepsina es una endoproteasa presente en el estómago, que cataliza la hidrólisis de los enlaces
peptídicos de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano.
La actividad enzimática está modulada por diversos factores tales como: pH, temperatura, cofactores,
concentraciones de sustrato y los productos finales, presencia de inhibidores, modulación alostérica,
activación por proteólisis, entre otros.
El pH afecta la carga de los grupos químicos ionizables (-COOH, -NH2, -SH, etc) de las cadenas
laterales de los aminoácidos. Dicha carga altera la conformación de la proteína de manera que existe un pH
en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Pequeñas desviaciones del pH
pueden afectar drásticamente su actividad.
Figura 2.1: curvas de % actividad enzimática versus pH del medio.
Por otro lado, la temperatura puede generar una desnaturalización térmica de la enzima,
disminuyendo la actividad catalítica de ésta. Por lo tanto, existe una temperatura óptima a la cual se favorece
la reacción, por sobre la cual se produce la degradación de la enzima.
Figura 2.2: Influencia de la temperatura en la velocidad de reacción enzimática.

Procedimiento:
1. Obtención de Suspensión de albúmina desnaturalizada.
La suspensión de albúmina se obtiene de la siguiente manera:
• Se pone en agua caliente un huevo hasta que esté cocido. Seguidamente, se separa la clara de la
yema y la cáscara. La proteína adquirida se denomina albúmina.
• En una licuadora, se procesa la albúmina con 100 mL de agua hasta obtener una suspensión de
partículas blancas muy finas.
• La suspensión se filtra con gaza dos veces a fin de eliminar las partículas muy finas.
• El filtrado se diluye con agua destilada hasta generar 800 mL de agua.
Esta solución de albúmina estará preparada con anterioridad.
En un vaso de precipitado, tome 100 mL de la solución de albúmina preparada. Determine la

absorbancia de la suspensión y de ser necesario dilúyala hasta obtener una solución cuya absorbancia esté
entre 0,900 y 0,950 a 430 nm. Para determinar tentativamente la dilución, realice una regla de tres simple
entre la absorbancia y la concentración (suponga que la solución madre tiene una concentración de 100%
v/v).
Si la solución diluida tiene una absorbancia mayor a 0,950, diluya aún más con agua destilada. Si la
absorbancia es menor a 0,900, agregar más clara de huevo en suspensión.
2. Preparación de Solución Madre de Pepsina.
Se preparará una solución “madre” al 1% m/v de pepsina. A partir de esta, se deben prepara las siguientes
diluciones:
• Solución 2:1 pepsina:agua, es decir 0,66% m/v de pepsina
• Solución 1:2 pepsina:agua, es decir 0,33% m/v de pepsina
Por lo tanto, para este experimento trabajará con soluciones:

a) 1% (sin diluir)
b) 0,66% (dilución 2:1 pepsina:agua)
c) 0,33% (dilución 1:2 pepsina:agua)
d) 0% (100% agua, sin pepsina)
Debido a que la enzima se “desactiva” a temperatura ambiente, esta se prepara el mismo día del
práctico y se guarda refrigerada y protegida de la luz mientras no se utilice.

3. Variación de la reacción de hidrólisis de albúmina según condiciones experimentales.
• Prepare un set de cuatro tubos rotulados del 1-4

• Agregue a cada tubo 10 mL de la solución de albúmina (cuya absorbancia está ajustada).
• Al tubo 1 agregue 1,5 mL de pepsina al 1%.
• Al tubo 2 agregue HCl al 10% hasta obtener un pH entre 3-2, para esto agregue aproximadamente
3 gotas de la solución de ácido diluido y mida el pH de la solución agregue más ácido de ser
necesario.
• En el tubo 3, ajuste el pH igual que en el tubo 2 y agregue además 1,5 mL de solución de pepsina.
• En el tubo 4, ajuste el pH al igual que en el tubo 2. Agregue 1,5 mL de pepsina que previamente fue
calentada hasta ebullición (utilice un mechero para esto).
• Lleve los 4 tubos a calentar a baño María a 40°C durante 5 min. Pasado este tiempo, enfríe la reacción
en baño de hielo.
• Mida la absorbancia del producto de reacción a 430 nm en espectrofotómetro.
• Anote los datos, compare y concluya al respecto.
Figura 2.3: Esquema de procedimiento.
4. Variación de la hidrólisis enzimática de albúmina de acuerdo con la concentración de enzima.
• Agregue a cada tubo 10 mL de la solución de albúmina (cuya absorbancia está ajustada).

• A cada tubo, agregue 3 gotas de HCl al 10%. Homogenice la mezcla y mida el pH. El pH
óptimo es 2., si es mayor, agregue una gota más de ácido hasta obtener el pH deseado.

• Con una pipeta graduada, agregue 1,5 mL de cada una de las soluciones de pepsina a los
correspondientes tubos: tubo 1 → 1,5 mL de pepsina 1%; tubo 2 → 1,5 mL de pepsina 0,66%;
tubo 3 →1,5 mL de pepsina 0,33%; tubo 4 → 1,5 mL de pepsina 0%.
• Homogenice los tubos con ayuda de una varilla de agitación (ojo, no mezcle las soluciones.
Para cada homogenización asegúrese de que la varilla esté limpia)
• Lleve los tubos a calentamiento en un baño maría a 40°C durante 5 min.
• Finalizado el tiempo de calentamiento, enfríe los tubos en un baño de hielo, manténgalos
allí durante 5 min.
• Mida la absorbancia de las muestras a 430 nm.
• Anote los datos obtenidos. Realice un gráfico de Abs v/s concentración de pepsina. Si la
concentración de un compuesto es proporcional a la absorbancia de este de acuerdo con la
ecuación 1 ¿Qué puede inferir de este experimento?
𝑨𝒃𝒔𝝀𝒏𝒎 = 𝒄 ∙ 𝜺 ∙ 𝒅 Ec.1
Bibliografía:
1. The Digestion of Protein by Pepsin:

http://science.jburroughs.org/resources/MBLabs/16_Protein_Digest_Teach2.pdf
2. Applied Biochemistry Lab:

http://walghazzawi.kau.edu.sa/Files/0007119/Files/119837_applied_biochemistry.pdf

PRÁCTICO 3.
“Extracción y purificación de ácidos nucleicos”
Introducción:
La extracción y purificación de ADN y de ARN de una muestra celular se basa en el hecho de que los
iones salinos externos son atraídos hacia las cargas negativas de los ácidos nucleicos permitiendo la
disolución de éstos y su posterior extracción. Se empieza por triturar la fruta fría y extraer luego el ADN-ARN
para su separación y purificación. La extracción del ADN-ARN es por medio de la acción de un solvente como
el alcohol etílico.
Procedimiento:
1. Extracción de ADN-ARN de frutas.
Para la extracción del ADN y ARN necesitará dos soluciones:
• Solución de trituración: 30 mL de solución acuosa de sacarosa al 10,5% en peso.
• Solución lisante (buffer-1) con los siguientes compuestos:
- 30 mL de agua destilada.
- 0,4 g de cloruro de sodio.
- 1,25 g de bicarbonato sódico.
- 1,3 mL de dodecil benceno sulfonato de sodio, SDS) al 5%.
Ambas soluciones estarán listas el día del práctico.
Proceda de la siguiente manera:
• Pesar la fruta antes de la extracción.

• Colocar la fruta pesada en un mortero que tiene una tela de gasa dentro de él, agregando 15 mL
solución de trituración, y triturando la fruta suavemente con un pistilo de mortero.
• Colocar la fruta molida y el líquido de la trituración anterior en un embudo que tiene gasa, y filtrar
con presión manual.
• Transferir 10 mL del filtrado a un tubo de ensayo ancho, y tratarlo con 10 mL de la solución lisante
preparada antes; tapar el tubo y mezclarlo suavemente invirtiendo el tubo unas 20 veces a intervalos
de dos segundos, sin agitación. El detergente rompe las membranas lipídicas de las células,
liberando los ácidos nucleicos.
2. Extracción de los ácidos nucleicos liberados.
• Agregar lentamente 20 mL de etanol de 95% frío.

• Observar la interfase entre los dos líquidos por el aparecimiento de los ácidos nucleicos que se
extraen y precipitan en etanol.
• Con la ayuda de una brocheta de madera, levantar el ADN-ARN, y depositarlo en un tubo de
centrifugación, donde se lavará por 3 minutos para su purificación.
• Sacar por succión la solución de alcohol centrifugada, y dejar el sólido dentro del tubo de
centrifugación.
• Agregar 3-4 mL de alcohol frío para lavar el sólido de ADN-ARN, y volver a centrifugar por 2 minutos.
3. Procedimiento de purificación del ADN y del ARN:
• Separación de ADN y de ARN puros: Los ácidos nucleicos ADN-ARN anteriormente purificados y
separados se tratan con un buffer de acetato de sodio-ácido acético, de pH 4,5 (buffer-2, de
purificación). Para esta separación se toma 10 mg de fenol, se saturan con 2 mL del buffer ácido,
y se agregan a la muestra de ADN-ARN. Se agita, y se espera 10 minutos. El ARN se disuelve en el
buffer ácido.
• Se separa la solución de ARN por succión, y se precipita el ARN de ella llevándola a pH 8 (con
bicarbonato de sodio), y agregando etanol frío, igual que en la extracción inicial de este experimento;
se seca, y se pesa.
• El ADN, remanente, que se encuentra en la fase fenólica se extrae con cloroformo, se concentra en
el evaporador rotatorio, y se pesa para conocer la cantidad de ADN puro, que se compara con la de
ARN obtenido antes.
Bibliografía:
1. Nucleic Acids: Organic Chemistry, Reusch (2012), o McMurry, 2007.

2. The Basics of How Phenol Extraction Works: http://bitesizebio.com/384/the-basics-how-phenol-
extraction-works/
3. Phenol/chloroform extraction: http://www.openwetware.org/wiki/Phenol/chloroform_extraction
4. Phenol/chloroform Extraction:
http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason/lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf

EXPERIENCIA 4:
“Obtención de biocidas de origen vegetal”
Introducción:
Se conoce que los compuestos de nitrilo o cianuros orgánicos están ampliamente distribuidos en el
reino vegetal. El mayor grupo de compuestos nitrilos es el de los glicósidos cianogénicos, los cuales poseen
la siguiente estructura general, donde R y R’ son generalmente H o alquilo.
Son compuestos incoloros, solubles en agua y en alcohol, pero insolubles en solventes apolares.
Comúnmente se encuentran en semillas de especies de la familia de las Rosáceas, en particular en especies
del género Prunus, pero también en algunos tipos de legumbres y en distintos tipos de raíces. La abundancia
de estos compuestos en los tejidos vegetales disminuye conforme la planta alcanza la madurez.
La hidrólisis enzimática de este tipo de compuestos produce, en primera instancia otro grupo de compuestos
nitrilos conocido como cianhidrinas. Las cianhidrinas son compuestos orgánicos de fórmula general
R2C(OH)CN, donde R y R’ pueden ser H, alquilo o arilo y presentan actividad biocida.
La síntesis química de cianhidrinas conlleva una reacción que involucra el tratamiento de una cetona
o un aldehído con cianuro de hidrógeno (HCN), en presencia de cianuro de sodio o potasio, mientras que en
la célula todo esto sucede mediante una enzima.
Paso 1: Adición de CN- Paso 2: Protonación del intermediario
Intermediario tetraédrico

El tipo de cianhidrinas más común en algunos tipos de frutos con carozo (almendras, nísperos,
damascos o duraznos) es el mandelonitrílo (proveniente de la amigdalina), cuya función es usarse como
método de defensa ante agentes externos (por ejemplo: microorganismos), ya que puede degradarse en
benzaldehído y cianuro (altamente tóxico) al hidrolizarse. La degradación de los compuestos se realiza
mediante acción enzimática de dos tipos de enzimas: Glucosidasas (catalizan la hidrólisis de los enlaces
glucosídicos) y la hidroxinitrilo liasa que cataliza la descomposición de la cianhidrina.
Procedimiento:
En este práctico ud trabajará con material vegetal que ha sido tratado previamente con hielo seco
durante al menos 5 horas. Para la extracción de los glicósidos cianogénicos proceda de la siguiente manera:
• En un mortero, romper 1 semilla fría, previamente masadas, e introducirlas en un vaso con un

volumen de hexano de modo que éste sobrepase hasta 1 cm por sobre el sólido, dejándolas en
contacto durante 20 minutos, y con agitación ocasional. De esta forma se extraen compuestos
altamente hidrofóbicos.
• Sacar la solución de hexano por filtrado, guardándola aparte.
• Poner las semillas trituradas y desengrasadas, en un balón de fondo redondo con etanol de 95% y
extraer a reflujo durante 20 minutos, para sacar los compuestos orgánicos solubles en etanol.
• Filtrar la mezcla, separando la fracción de etanol.
• Concentrar el extracto etanólico por medio de un evaporador rotatorio. (pesar el balón antes)
• Mientras se realiza este proceso, repetir los pasos 1 al 5 con otras semillas, de mango o palta.
• El extracto obtenido al concentrar se extrae dos veces con 15 mL de acetato de etilo.
• Concentrar el extracto de acetato de etilo por medio de un evaporador rotatorio. (pesar el balón
antes)
• Trasvasar los productos a un recipiente limpio, seco y rotulado para cada uno y secarlos bajo
campana. Almacenar en frío hasta la Experiencia Nº4.

• Hacer un análisis de cromatografía en capa fina del extracto de hexano, del extracto etanólico y
del extracto de acetato de etilo obtenidos anteriormente, eluyendo con diclorometano y usando
mandelonitrilo como referencia. Luego observar la placa a la luz UV. Finalmente revelar con vapores
de yodo.
• Calcular el rendimiento a partir de la masa inicial de las semillas.
Test de vapores de Yodo sublimado (Este procedimiento se debe hacer con lentes y con guantes):
• En un frasco de vidrio colocar yodo sólido y calentarlo en un baño de agua (con la tapa cerrada)
hasta que se produzca una nube de vapores de yodo en el frasco, luego abrir el frasco y colocar el
cromatofolio (posteriormente cerrarlo). Dejar unos 40 segundos hasta que la placa comience a
adquirir un color café; esto ocurre porque el yodo es muy reactivo con el triple enlace del CN, lo
cual indica la presencia de cianhidrinas y/o compuestos que posean un grupo ciano (nitrilo).
Consejos sobre la parte experimental:
• No botar las muestras, hay que conservarlas y rotularlas hasta el final de la experiencia.
• Masar los vasos o balones con los que se va a trabajar.
Sistema de Reflujo:
Columna de
Reflujo
Calefactor con magneto

Refrigerante
rotatorio
Balón redondo con

la muestra

Evaporador Rotatorio:
Rotador
Condensador
Válvula de
vacío Balón con la
muestra
Balón recolector del

Baño calefactor con
solvente
agua
Controlador de
temperatura
Precauciones:
• No usar temperaturas muy altas (provocaría la descomposición del producto).

• Por ningún motivo permitir que alguna solución esté en contacto con el agua.
• Trabajar con los solventes bajo campana y en caso de algún accidente consultar con el/la profesor/a
o el/la ayudante.
• No inhalar los vapores de yodo (trabajar bajo campana) y trabajar con guantes.
• Nunca cerrar la llave de agua que genera el vacío en el sistema del evaporador rotatorio antes de
sacar la muestra, el agua podría ingresar al interior del evaporador rotatorio.
Bibliografía:
1. Seigler, D (1974): Isolation and characterization of naturally ocurryn cyanogenic compounds,

Phytochemistry, 14, 9-29, 1974.
2. Seigler, D (1991): Cyanide and Cyanogenic Glycosides. In Rosenthal,G; Berenbaum, M: Herbivores:
Their interactions with secondary plant metabolites. Volumen I: The Chemical Participants. 35-70.
Academic Press, INC.
3. Arrázola, G; Grané, N; Martin, M; Dicenta, F (2013): Determinación de los compuestos cianogénicos
amigdalina y prunasina en semillas de almendras (Prunus dulcis L.) mediante cromatografía líquida
de alta resolución.
4. http://www.jbiopest.com/users/LW8/efiles/Vol_5_0_103_105F.pdf
5. http://www.scielo.br/pdf/rsbmt/v42n2/v42n2a03.pdf

6. http://www.magrama.gob.es/ministerio/pags/biblioteca/revistas/pdf_plagas%2FBSVP-16-02-499-
503.pdf
7. http://inta.gob.ar/documentos/reaccion-de-grignard-para-detectar-compuestos-del-acido-
cianidrico-en-
sorgo/at_multi_download/file/INTA_reaccion_de_grignard_para_detectar_acido_cianidrico_en_sorgo
pdf.pdf
8. http://www.arpapress.com/Volumes/Vol11Issue2/IJRRAS_11_2_20.pdf
9. http://www.academicjournals.org/article/article1380729035_Fowomola.pdf
10. https://www.uam.es/departamentos/medicina/farmacologia/especifica/ToxAlim/ToxAlim_L9.pdf

PRACTICO 5.
“Encapsulación de agentes biocidas en geles de alginato de calcio.”
Introducción
Un gel corresponde a un sistema coloidal donde la fase continua se encuentra en estado sólido, mientras
que la fase dispersa en estado líquido. Este tipo de estructura presenta una densidad similar a la de un líquido,
conservando una estructura similar a un sólido. Se pueden distinguir dos tipos de geles organogeles e
hidrogeles. Los hidrogeles son matrices poliméricas constituidas por polímeros solubles en agua que al
entrecruzarse se hacen insolubles. La utilización de productos naturales ha tomado un rol relevante en la
síntesis de hidrogeles, debido a que generalmente estos confieren propiedades de biodegradabilidad y
biocompatibilidad, dos propiedades fundamentales requeridas en las aplicaciones biofarmacéuticas.
El ácido algínico es un polisacárido sintetizado en la pared celular de las células de las algas pardas en
forma de sales de calcio y magnesio. Este polisacárido es un copolímero formado por dos ácidos urónicos, el
ácido β-D-manurónico (M) y el ácido α-L-gulurónico (G). En la figura 1 se representan ambos ácidos urónicos.
Figura 5.1.- Estructura química de los ácidos urónicos que componen el ácido algínico. (A) ácido β-D-manurónico, (B) ácido α-L-
gulurónico.
Una de las propiedades más interesantes del ácido algínico es su gelificación en presencia de cationes
divalentes, como el ion calcio. La formación de geles se encuentra relacionada con las diadas de ácido
gulurónico, las cuales son capaces de coordinar cationes divalentes mediante los electrones de los grupos
carboxilato, con la participación de los átomos de oxígeno de los grupos hidroxilo y del enlace glicosídico
(en la figura 2 se esquematiza la coordinación). La formación de estos puntos de unión conduce a la
separación de fase mediante la gelificación del polisacárido.

Ca2+
Figura 5.2.- Representación esquemática de la formación de puntos de unión entre distintas cadenas de ácido algínico a través de la
coordinación de ion calcio.
El ácido algínico es biocompatible, biodegradable, capaz de formar geles con elevadas capacidades de
hinchado, presenta sensibilidad frente a estímulos de pH y es un recurso natural encontrado en grandes
cantidades en las algas pardas, lo cual lo convierte en un componente de interés para la preparación de
hidrogeles con fines biomédicos.
Procedimiento:
Materiales
Para el práctico se utilizará alginato de sodio extraído del alga parda Desmarestia ligulata recolectada en
caleta Cocholgüe. Su peso molecular es 49.000 g/mol y se encuentra constituido por un 70% de ácido
gulurónico.
Procedimiento experimental
• Disolver 250 mg de alginato de sodio en 10 mL de agua destilada utilizando un agitador magnético.

• Distribuir el alginato de sodio en 5 frascos agregando 2 mL de solución. Rotule los frascos del 1 al 5.
• El frasco 1 corresponde al blanco. En el frasco dos se incorporará mandelonitrilo. Del frasco 3 al 5
se agregarán los 3 compuestos orgánicos previamente extraídos en el laboratorio anterior.
• Las soluciones se dispersarán con agitación constante.

• Con ayuda de un gotario tome la solución y deposítela gota a gota en una solución de cloruro de
calcio 0,1 M. No agite la solución durante este procedimiento.
• Mantenga inmerso los geles esféricos obtenidos por 10 minutos en la solución de cloruro de calcio.
• Retire los geles con una espátula de manera cuidadosa y deposítelos en papel filtro para eliminar el
agua adsorbida.
• En el extremo de un tubo de vidrio (ver figura 3) deposite los geles utilizados como blanco (1).
Introduzca el insecto de estudio mediante el uso de pinzas, de modo que quede en el centro del
mismo. Ponga un algodón en los extremos para tapar las salidas.
Figura 5.3.- Ejemplo de un bioensayo de doble elección.
• Observe que camino elige el insecto. Determine cuanto tiempo el insecto reside en cada uno de los
extremos mediante el uso de cronometro.
• Estime si el estímulo utilizado es repelente para el insecto en función de cuánto tiempo el insecto
permanece en la zona del estímulo.
• Repita la experiencia con el resto de los geles preparados.
• Estime cuál de las formulaciones fue la más eficiente como repelente o atrayente para los insectos.
Discuta en su informe cual es la conveniencia que se trate de un repelente o un atrayente a sabiendas
de que el compuesto encapsulado es un biocida.
Bibliografía:
1. Alginic acid: Chemical structure, uses and health benefits. Nova Publishers, New York, 2015.
Capítulo 3 y 7.
2. http://www.wiley-vch.de/books/biopoly/pdf_v06/bpol6008_215_224.pdf
3. http://web.udlap.mx/tsia/files/2013/12/TSIA-71-Avendano-Romero-et-al-2013.pdf

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Facultad de Química y Biología

Laboratorio de Química Orgánica II

Laboratorio de Química Orgánica II.

Primer Semestre de 2019

Resumen de Reglas Esenciales para la Seguridad en el Laboratorio [1]

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 2

• Control de entrada: En cada sesión de laboratorio usted realizará un control de entrada

El promedio de los reportes equivale al 20% de la nota final de laboratorio.

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 3

Aprobación del laboratorio y asistencia:

Vía mail de lunes a viernes de 9:00 a 18:00 a la dirección judith.faundes@usach.cl.

Bibliografía de esta sección

1. Galagovsky, L. (1999). Química Orgánica, Fundamentos teórico-prácticos para el Laboratorio,

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 4

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 5

Figura 1.1: Ecuación general de la reacción de hidrólisis enzimática por tripsina.

~NH2 + HCHO → ~NHCH2O + H+

El mecanismo de la reacción se basa principalmente en las propiedades anfotéricas de los

Figura 1.2: Mecanismo de reacción entre aminoácidos y formaldehído.

1. Obtención de caseína sin grasa.

2. Digestión de la caseína obtenida.

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 7

• Preparación del Sustrato: Preparar caseína al 1% disolviendo 1g in 100 mL de buffer de acetato de

1) Applied Biochemistry Lab:

2) Isolation of casein from milk:

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 8

Figura 2.1: curvas de % actividad enzimática versus pH del medio.

Figura 2.2: Influencia de la temperatura en la velocidad de reacción enzimática.

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 9

1. Obtención de Suspensión de albúmina desnaturalizada.

La suspensión de albúmina se obtiene de la siguiente manera:

Esta solución de albúmina estará preparada con anterioridad.

En un vaso de precipitado, tome 100 mL de la solución de albúmina preparada. Determine la

2. Preparación de Solución Madre de Pepsina.

Por lo tanto, para este experimento trabajará con soluciones:

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 10

3. Variación de la reacción de hidrólisis de albúmina según condiciones experimentales.

• Prepare un set de cuatro tubos rotulados del 1-4

Figura 2.3: Esquema de procedimiento.

4. Variación de la hidrólisis enzimática de albúmina de acuerdo con la concentración de enzima.

• Agregue a cada tubo 10 mL de la solución de albúmina (cuya absorbancia está ajustada).

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 11

1. The Digestion of Protein by Pepsin:

2. Applied Biochemistry Lab:

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 12

1. Extracción de ADN-ARN de frutas.

Para la extracción del ADN y ARN necesitará dos soluciones:

• Solución de trituración: 30 mL de solución acuosa de sacarosa al 10,5% en peso.

• Solución lisante (buffer-1) con los siguientes compuestos:

Ambas soluciones estarán listas el día del práctico.

Proceda de la siguiente manera:

• Pesar la fruta antes de la extracción.

2. Extracción de los ácidos nucleicos liberados.

• Agregar lentamente 20 mL de etanol de 95% frío.

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 13

3. Procedimiento de purificación del ADN y del ARN:

1. Nucleic Acids: Organic Chemistry, Reusch (2012), o McMurry, 2007.

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 14

Paso 1: Adición de CN- Paso 2: Protonación del intermediario

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 15

• En un mortero, romper 1 semilla fría, previamente masadas, e introducirlas en un vaso con un

Manual de Laboratorio. Edición 2019. 16

Consejos sobre la parte experimental: