Tinciones

Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Revisó: Luis Enrique Ruiz Meneses
Universidad del Atlántico
Objetivos
 Diferenciar entre colorantes ácidos y básicos.
 Explicar la importancia de un frotis en la realización de
una tinción.
 Conocer el mecanismo básico de una tinción.
 Comprender el propósito de la tinción simple.
 Explicar y comprender los pasos de una tinción de gram.
 Describir el aspecto de las células grampositivas y
gramnegativas después de cada paso en la tinción de
gram.
 Explicar y comprender las diferentes tinciones para las
estructuras de los microorganismos.
2 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Introducción
 Microorganismos en las preparaciones se observan
incoloros bajo el microscopio óptico de campo claro.

 Lo anterior conlleva a utilizar procesos de tinción

con la finalidad de observarlos mejor.

 Para la observación de los microorganismos se usa la

preparación de extendidos o frotis.

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Frotis o extendido
 Preparación seca de una bacteria sobre un portaobjetos.
 La muestra se extiende en la superficie del portaobjetos.
 Extendidos gruesos causan aconglomerado de las células.
 Extendidos muy delgados no permiten observación de
estructuras.

Tomado de Microbiología Clínica. Pratts, Guillen. 2007. 1ª Ed. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires.

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Fijación de un Frotis
 Propósito
 Adherencia de los microorganismos al portaobjetos para evitar
su arrastre durante la tinción y lavado.
 Desventajas
 Se produce muerte celular por coagulación de proteínas.
 Puede causar pequeña distorsión celular.
 Técnica
 El portaobjetos se pasa varias veces por el calor (llama del
mechero de Bunsen) con el extendido hacia arriba.
 Fijaciones químicas con metanol (1 minuto).

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Preparación de un frotis

6 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinción
 Proceso de coloración de microorganismos.
 Utiliza colorantes o tintes para observar las estructuras de los
microorganismos.
 Tintes: sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo,
uno de los cuales está coloreado.

Tintes

Origen Comportamiento químico

• Naturales: extraídos de • Ácidos o aniónicos

animales y plantas: azul de • Básicos o catiónicos
índigo y carmín. • Neutros
• Artificiales: extraídos
principalmente de alquitrán de
hulla, colorantes de anilina

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Tipos de tintes
 Según su origen
 Naturales: extraídos de animales y plantas: azul de índigo y
carmín.
 Artificiales: extraídos principalmente de alquitrán de hulla,
colorantes de anilina
 Según su comportamiento químico
 Ácidos o aniónicos
 Básicos o catiónicos
 Neutros

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Composición de un tinte

Tinte

Cromógeno Auxócromo

Se ioniza con el
Benceno Cromóforo cromógeno y
Compuesto Propiedades de forma sales que
orgánico color se pegan a las
fibras y tejidos.
9 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Tipos de tintes
Tinte Carga Descripción Ejemplo
Cromógeno
- Carga positiva (ión positivo). Azul de metileno
- Afinidad por componentes celulares Cristal violeta
Básicos Catiónica negativos. Verde de malaquita
Carbolfucsina
Son los más utilizados debido a que Safranina
las bacterias poseen una superficie Fucsina
con carga negativa que reacciona
con las cargas positivas del tinte
básico.

Cromógeno
- Carga negativa (ión negativo). Eosina
Acídicos Aniónica - Afinidad por componentes celulares Fucsina ácida
positivos. Nigrosina

10 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tipos de tinciones
Simples Diferenciales Especiales
• Utiliza un solo • Tiene más de • Colorear
tinte (básico). dos reactivos estructuras
• Se usa para • Sirve para especificas de
observar distinguir las bacterias.
forma, tamaño bacterias de • Ej. Tinción
y agrupación acuerdo a sus para esporas,
de las características cápsula y
bacterias. • Ej. Tinción de flagelos.
• Ej. Azul de Gram, Tinción
metileno, acido-alcohol
cristal violeta. resistente.

11 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tipos de tinciones
 Simples
 Utiliza un solo tinte (básico).
 Se usa para observar forma, tamaño y agrupación de las bacterias.
 Ej. Azul de metileno, cristal violeta.
 Diferenciales
 Tiene mínimo tres tintes
 Sirve para distinguir bacterias de acuerdo a sus características
 Ej. Tinción de Gram, Tinción acido-alcohol resistente.
 Especiales
 Colorear estructuras especificas de las bacterias.
 Ej. Tinción para esporas, cápsula y flagelos.

12 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinciones diferenciales

Colorante • Imparte color a la

primario célula

Agente • Remueve el tinte

decolorizante primario

Colorante de • Imparte color diferente

contraste al tinte primario

13 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Función del agente mordiente en tinciones

Agente mordiente
Simples Diferenciales Especiales

• Intensifican la • Forman un • Cubren la

coloración. complejo con estructura
• Aumentan la el colorante para aumentar
afinidad de la primario para su espesor y
muestra por el resistir la facilitar su
colorante. decoloración. observación.

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Función del agente mordiente en tinciones
 Tinción simple:
 Intensifican la coloración.
 Aumentan la afinidad de la muestra por el colorante.
 Tinción diferencial
 Forman un complejo con el colorante primario para resistir la
decoloración.
 Tinción especial
 Cubren la estructura para aumentar su espesor y facilitar su
observación.

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Tinción de Gram
 Hans Christian Gram, 1884.
 Clasifica a las bacterias en dos grandes grupos
 Bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas

 Bacterias grampositivas toman el colorante primario, por

tanto se observan color violeta.
 Bacterias gramnegativas toman el colorante secundario,
por tanto se observan color rosado.

16 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinción de Gram: reactivos
 Tinte primario: Cristal Violeta, tiñe la bacteria color
violeta.

 Agente mordiente:Yodo, forma un complejo insoluble

con el cristal violeta ayudando a que éste se adhiera a la
célula para resistir la decoloración.

 Agente decolorizante: Alcohol acetona sirve como

solvente de lípidos y agente deshidratante de proteínas.

 Contratinte: Safranina, tiñe de rosado la bacteria.

17 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Tinción de Gram: Fundamento

Bacterias Grampositivas
 Capa de peptidoglicano es
gruesa.
 No son susceptibles a la
acción de solventes
orgánicos.
 El solvente deshidrata los
poros y los cierra.
 Retiene el complejo cristal
violeta-Iodo.
Tinción de Gram: Fundamento
Bacterias Gramnegativas
 Capa de peptidoglicano es
delgada.
 Unida a una segunda
membrana exterior por
lipoproteínas.
 La membrana externa es
soluble en solventes
orgánicos como alcohol.
 No retiene el complejo
Cristal violeta-Iodo.
 Tinción de Gram: Procedimiento

Entre la adición de cada uno de los reactivos se lava con agua.

Tomado de Introducción a la Microbiología, Tortora. 2007.

20 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Actividad
 De acuerdo a los pasos de una tinción de Gram, y
teniendo en cuenta su fundamento, establezca cuál sería
el aspecto de las células en cada uno de los pasos.

21 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinción de Gram: procedimiento

Tomado de Introducción a la Microbiología, Tortora. 2007.

22 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Resultados Tinción de Gram

Gram Negativo Gram Positivo

Resultados tinción de Gram

Cocos y bacilos grampositivos, vibriones gramnegativos.

Tomado de Introducción a la Microbiología, Tortora. 2007.
24 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Importancia de la tinción de Gram
 Permite distinguir bacterias para su clasificación e
identificación.
 En la microbiología médica brinda información para tratar
enfermedades con antibióticos.
 Bacterias gramnegativas son más resistentes a los antibióticos
 Capa de lipopolisacáridos
 Antibióticos de amplio y corto espectro

25 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinción Ácido-Alcohol Resistente
 Utilizada para identificar bacterias de los géneros
 Mycobacterium (Mycobacterium leprae y Mycobacterium
tuberculosis).
 Nocardia.

 Estas bacterias no se tiñen con la tinción simple.

Deben someterse al calor para que el colorante
penetre y se retenga mejor.

 Una vez el tinte penetra en ellas es difícil

decolorizarla con alcohol ácido. Por eso se llama
ácido resistente, y el método utilizado es el Método
de Ziehl-Neelsen.
Tinción Acido-Alcohol Resistente:
fundamento
 Las bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) se caracterizan
por tener una pared celular gruesa de cera que contiene
ácidos micólicos y lípidos.
 El colorante primario utilizado: Carbolfucsina, es soluble en los
lípidos de la pared celular, por tanto BAAR retienen este
colorante.
 Bacterias no ácido-alcohol resistentes no contienen lípidos en
su pared por tanto la carbolfucsina se elimina fácilmente con la
decoloración.
 Al aplicar un segundo colorante, éstas toman su color.

27 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Reactivos de la tinción Ácido-Alcohol
Resistente
 Colorante primario: Carbolfucsina.
 Tinte rojo (5% fenol). Penetra la pared celular de las
Micobacterias al someterlas al calor.

 Agente decolorizante: Alcohol ácido

 3% HCl +95% alcohol etílico.

 Colorante de contraste: Azul de metileno.

 Tiñe a las bacterias que quedaron incoloras.
Tinción Acido-Alcohol Resistente:
procedimiento

29 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Resultados Tinción Ácido-Alcohol Resistente

Tomado de Introducción a la Microbiología, Tortora. 2007.

30 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc
Tinciones Especiales
 Tinción Negativa para cápsula
 Tinción para esporas
 Tinción para flagelos

31 Norleyn Navas Guzmán, M.Sc

Tinción para Cápsula
 Cápsula: estructura gelatinosa secretada por algunas
bacterias. Las colonias de bacterias con cápsulas son
grandes y mucoides.

 Las bacterias que tienen capsulas son virulentas y

causan enfermedad.
 La cápsula protege a la célula de la acción fagocítica del
hospedero.

 La mayoría de las cápsulas están compuestas de

polisacáridos, glicoproteínas y polipéptidos
 Compuestos hidrosolubles

 Esto hace de esta tinción una de las mas difíciles

porque la cápsula se puede perder durante el lavado,
por eso no se usa agua.
Tinción Negativa: Cápsula
 La tinción se logra mediante una mezcla del tinte y el
cultivo de la bacteria.
 Utiliza un solo tinte: Eosina o Nigrosina (tintes acídicos).
 También es utilizada para observar bacterias que no se
tiñen muy bien como las espiroquetas.
 A la tinción negativa se le conoce como efecto de cielo
estrellado.
 Klebsiella pneumoniae es una bacteria encapsulada (con
cápsula).
 Tinción Negativa: Cápsula
 Los tintes utilizados, como tienen carga negativa, se
repelen con la carga negativa de la pared celular de
las bacterias, por tanto no las tiñen.
 Estos forman un depósito alrededor de la bacteria,
creando un fondo oscuro o de contraste.
 La bacteria aparece sin teñir con un área clara o halo
que la rodea.
Tinción Negativa: cápsula
Tinción Negativa: Cápsula

Efecto de Cielo estrellado

Tinción para Esporas

 Célula vegetativa: forma metabólicamente activa,

bacterias.

 Esporas: forma metabólicamente inactiva y

altamente resistente. Respuesta a condiciones de
estrés.

 Los miembros del género anaerobio Clostridium

spp. y del género aerobio Bacillus spp. pueden
existir metabólicamente activos o inactivos.
Tinción para Esporas
 Espora o Endospora es una estructura que le brinda a la
bacteria protección y resistencia cuando las condiciones
ambientales no son favorables.
 Calor extremo o excesivo
 Congelación
 Radiación
 Desecación
 Agentes químicos

 No se tiñen con colorantes comunes debido a que estos

no pueden atravesar su pared.

 Tinción de Shaeffer-Fulton es la más utilizada.

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Tinción de Shaeffer-Fulton
 Colorante primario:Verde de malaquita. Requiere
calor para que penetre a la pared de la espora.

 Agente decolorizante: agua, remueve el exceso de tinte,

decoloriza la célula vegetativa.

 Colorante de contraste: Safranina. Tiñe las células

vegetativas.

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Tinción de para Esporas
Bacillus cereus

Espora (color verde)

Célula vegetativa (color rosado)
Tinción para flagelos
 Flagelos: estructuras que permiten el movimiento.

 Se usa un mordiente para aumentar el diámetro de los

flagelos y un tinte, generalmente carbolfucsina. De esta
manera pueden ser vistos al microscopio óptico.

 La tinción de Leifson es una de las más utilizadas.

 Su colorante es fucsina y el agente mordiente es acido tánico.

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Tinción para flagelos
Spirillum volutans

Tomado de Introducción a la Microbiología, Tortora. 2007.

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 Resumen resultados de tinciones

Tinción Gram (estructura de pared celular)

Tinción de esporas Tinción de cápsula

Referencias
 Tortora, G. J., B. R. Funke y C. L. Case. 2007. Introducción a
la Microbiología. 9a ed. Medica Panamericana.
 Madigan, M. T., J. M. Martinko, and J. Parker. 2002. Brock
Biology of Microorganism. 10th ed. Prentice Hall. NJ.
 Harley, J. P. 2005. Laboratory Exercises in Microbiology.
6th ed. Mc Graw Hill. NY.

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