“Año de la Inversión para el Desarrollo Rural y la Seguridad Alimentaria”

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela de Ingeniería en Industrias Alimentarias

ELECTROFORESIS
(PRACTICA 08)

Alumna : Tito Osco, Eva Martha Cód. 2013-38995

Curso : Laboratorio de Análisis Instrumental de los alimentos

Año : Tercero

Sección : A

Docente : Prof. Dr. Miguel A. Larrea céspedes

Tacna – Perú

2017
 INTRODUCCION

Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia

fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo eléctrico. Se dio una
visión general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para proteínas en
condiciones nativas o desnaturalizadas, se incorporaron nuevos conocimientos
tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionales de este método, como
son la adición de compuestos de restricción de la difusión y que aumentan la
estabilidad de los geles. Se ejemplificó el comportamiento anómalo de algunas
proteínas en la determinación del peso molecular por electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizadas.

La electroforesis es un método analítico – semipreparativo, en el que se separan

biomolecular, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de
un campo eléctrico, fue empleado por primera vez por Tiselius en el año
1937. Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la
electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), posteriormente el método fue
perfeccionado por varios investigadores como Davis y Ornstein. La popularidad de
este creció rápidamente y se logró un aumento de la resolución.

El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta técnica en 1970, y ya en

1972 se emplean agentes reductores y SDS en la determinación del peso molecular
de proteínas en lo que se denominó electroforesis en geles de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE).
FUNDAMENTO TEORICO

La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las

técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas
biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto
poseen esta propiedad de movilidad en un campo eléctrico. La movilidad dependerá
de la carga que presentan al pH que trabajemos.

La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones

de macromoléculas (ADN y Proteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un
entramado tridimensional que impide o reduce la difusión. Este gel ha de ser
compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del líquido en los
poros (reticulados hidratables). Los soportes pueden ser más o menos restrictivos
según que el tamaño de poros limite o impida el paso de las moléculas.

Los más restrictivos, como los geles de acrilamidabisacrilamida, oponen

impedimento al paso de las moléculas, participando así en el proceso de
separación. Entre los menos restrictivos está la agarosa. El tamaño de poro que da
unas dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido
previamente.

El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las moléculas

mayores respecto a las de menor tamaño. Las separaciones moleculares están
pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electroforética de las
moléculas que van a ser separadas.

Método de separación molecular en el que el DNA, el RNA o las proteínas se

separan en una matriz de gel según su peso molecular, gracias a la aplicación de
un campo eléctrico para atraer las moléculas a través del gen en una dirección
determinada. Por su estructura, los ácidos nucleicos tienen entre ellos velocidades
de migración parecidas a través del gel. En cambio las proteínas pueden tener
estructuras muy diferentes, algunas de las cuales pueden incluso hacer que estas
no migren. Para que el movimiento se dé solamente en función del peso molecular
de dichas proteínas, estas deben ser desnaturalizadas previamente mediante un
detergente como puede ser el dodecilsulfato sódico (SDS).

Este detergente caracteriza un tipo de electroforesis muy utilizada llamada

SDSPAGE, del inglés: sodium dodecyl sulfate – polyacryla mide gel electrophoresis.
Una vez finalizada la electroforesis, se adquiere una imagen como la que vemos a
continuación, en la cual cada columna representa una muestra y cada banda una
proteína o un grupo de ellas. Las bandas situadas en la parte más inferior coinciden
con aquellas proteínas con peso molecular más pequeño.

La electroforesis en gel es un proceso utilizado para medir el número o el tamaño

de ADN, ARN, genes y proteínas. El gel es la matriz en la que las muestras se
desplazan a través y serán separados en función de su tamaño. Tamaños pequeños
viajarán más, mientras que las moléculas más densas, más grandes sólo se
recorrerán una distancia corta. Esta técnica se utiliza con frecuencia como un primer
paso en muchos experimentos genéticos para asegurarse de que el producto
deseado está presente.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita:

A) una fuente de Tensión que proporciona el campo eléctrico, mediante dos

electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece la
diferencia de potencial.

B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos.

C) un soporte electroforético.

D) el tampón de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del

agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la
proximidad del cátodo; el tampón evitará que el entorno anódico se acidifique y el
catódico se haga más básico a lo largo de la electroforesis.
El polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida,
los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato amónico,
TEMED). En nuestro caso, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo
por su tamaño y no por su carga ya que previamente las proteínas serán
desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el cual despliega a las proteínas
y se queda pegado a su superficie confiriéndole una gran carga negativa. Esa gran
carga negativa enmascara la carga intrínseca de la proteína, y las proteínas una vez
tratadas con SDS presentan toda la misma carga, y la separación será debida
solamente a la masa molecular de la proteína.
TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS

 Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE)

Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido

por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato),
básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico).

El flujo electroosmótico crece con el pH del medio electroforético.

 Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC)

En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto

catiónico o anicónico para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas
inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos neutros de un modo más o
menos eficaz, por afinidad hidrófilahidrófoba. Se puede utilizar este tipo de
electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación, como
es el caso de algunos enantiomeros

 Electroforesis capilar en gel (CGE): Esta es la transposición de la

electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno
con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que
ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de
convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden
separar de este modo.
 Isoelectroenfoque capilar (CIEF): Esta técnica, también conocida como
electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un
capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y
se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga
neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y
manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las especies separadas hacia
el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten
separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH.

ELECTROCROMATOGRAFÍA CAPILAR:

Este tipo de separación asocia la electromigración de los iones, propio de la

electroforesis, y los efectos de separación entre fases presentes en la
cromatografía. La técnica consiste en la utilización de un capilar relleno con
una fase estacionaria, cuyo papel es doble: actúa como material selectivo
que debe, por otro lado, participar en la migración del electrolito.

El factor de separación es muy elevado, pero existen un cierto número de

problemas que limitan su aplicación, como el efecto de los modificadores
orgánicos sobre el flujo electroosmótico y la dificultad de un control preciso
del volumen de muestra introducido en el capilar
PROCEDIMIENTO:

 Crear el gel usando agar. Mezclar el agar junto con el agua y se disuelve el
agar por calentamiento. La cantidad de agar y agua que necesita variará así
que asegúrese de seguir lo que se recomienda en la botella de agar. Inserte
el peine electroforesis en gel en el molde. El peine crea los pocillos en los
que se coloca la muestra. Verter el agar caliente en el molde y permitir que
el agar se enfríe. Se solidificará cuando hace frío. Retire el peine de gel del
molde.

 Dibuje un pequeño diagrama del gel y etiqueta que muestra irá en cada
pocillo. Esto es muy importante como geles pueden contener una gran
cantidad de pozos y no recordarán lo que la muestra se cargó en cada pocillo.
Debe llevar un registro.
 Colocar el gel frío sobre una superficie oscura ya que esto hace que sea más
fácil de cargar las muestras en el pozo. Se recomienda que sólo las muestras
de carga en todos los demás así como esto evita que cualquier superposición
o sangrado en el gel.

 Con una pipeta, se mezcla cada muestra con una pequeña cantidad de tinte.
La mayoría de las veces este colorante contendrá bromuro de etidio, una
sustancia tóxica. Use guantes cuando se mezclan las muestras. Tenga
cuidado al cargar las muestras en los pocillos. Si presiona la punta de pipeta
demasiado, voy a entrar en el gel que arruina el gel. Tendrá que hacer un
nuevo gel si esto ocurre.

 Colocar el gel con las muestras cargadas en la cámara de electroforesis. El

lado con las muestras debe estar orientada de modo que están más cerca
del negro, o negativo, terminal.
 Mezclar una solución de sal utilizando cloruro de sodio y agua destilada.
Verter esta disolución de sal en cada lado de la cámara hasta el nivel de agua
apenas cubre la parte superior del gel. Lo mejor es verter la solución de sal
en primero en los pozos en los dos lados que contienen el gel. A
continuación, se vierte la solución en en el lado opuesto de la muestra para
cubrir el gel. Esto reduce cualquier posible difusión de la muestra durante el
llenado.
 Ponga la tapa electroforesis sobre la cámara y conecte el cable rojo al
terminal positivo de la cámara y el cable negro al terminal negativo. A su vez
en la fuente de alimentación, asegurando que el voltaje está entre 50 y 100
voltios. Dejar correr el gel durante unos 10 minutos. Podrás ver las muestras
que separa a medida que corren a través del gel.

 A su vez de la fuente de alimentación y retire la tapa de la electroforesis.

Retire el gel y colocarlo dentro de un transiluminador. El transiluminador es
una caja de luz ultravioleta. Tome una fotografía del gel. El bromuro de etidio
será fluorescente y se puede ver las diferentes bandas de ADN. Imprimir una
imagen de su gel de si se puede.
BIBLIOGRAFIA:

1. Chávez Planes MA,Díaz Brito J, Pérez U, Delfín J. Temas de enzimología.

Tomo 2. Facultad de Biología Universidad de La Habana, 1990

2. Nochumson S, inventors; FMC Corporation, assignee. Polyacrylamide cross-

linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium.US patent
4,542,200. 1985 Sep 17.

3. Campell MK. Biochemistry. Second edition. Saunders College

Publishing.1995.

4. Garfin DE. One dimensional gel electrophoresis. Methods in enzymology. vol

182. Academic press.1990.