DETERMINACIÓN DE ACIDO

7.1 DOMOICO (Biotoxina Amnésica ASP)

PE LO LAB 08-11 MSW ESP
(5.4) POR HPLC CON DETECTOR UV-VIS
ISP - 018
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I. ALCANCE
La siguiente metodología establece la determinación del Ácido Domoico (Biotoxina ASP)
mediante la Cromatografía Liquida- HPLC en moluscos bivlavos.

II. PRINCIPIO
El principio del método corresponde a un proceso de extracción metanólica del ácido
Domoico contenido en la muestra homogenizada, la solución sobrenadante es analizada a
condiciones isocráticas a 242 nm.

III. EQUIPOS Y MATERIALES

3.1 Cromatógrafo liquido de alta eficiencia (HPLC) con detector UV.
3.2 Columna C-18-e (5μm) 150 x 4.6 mm o equivalente
3.3 Guarda columna C-18-e (5μm)
3.4 Balanza analítica con resolución de 0.0001g
3.5 Procesadora de alimentos.
3.6 Centrífuga
3.7 Bomba de vacío
3.8 Equipo de filtración
3.9 Campana de extracción de solventes
3.10 Agitador orbital y/o vortex
3.11 Tamiz de acero inoxidable con malla  1mm
3.12 Vasos de precipitado de 250 ml
3.13 Micropipeta calibrada de 10 - 100 μl
3.14 Micropipeta calibrada de 100-1000μl
3.15 Tips de 200 μl , 1000μl
3.16 Probeta de 25,50,100,500 ml
3.17 Filtros tipo jeringa diámetro  25 mm porosidad 0.45μm
3.18 Jeringas plásticas capacidad 1 y 3 ml
3.19 Membrana de Nylon porosidad  0.2 μm
3.20 Mascarilla protectora contra solventes
3.21 Guantes de látex o equivalente
3.22 Viales cromatográficos con inserto de 2 ml .
3.23 Septas.

IV. REACTIVOS
4.1 Agua grado cromatográfico o equivalente
4.2 Acetonitilo HPLC
4.3 Metanol HPLC
4.4 Ácido trifluoroacetico grado espectrofotométrico
4.5 Solución certificada de ácido Domoico
4.6 Material de referencia

V. SOLUCIONES

5.1 Metanol al 50 %
Medir 250 ml de agua grado cromatográfico o equivalente y se mezclan con 250 ml
de metanol HPLC.
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5.2 Solución diluyente Acetonitrilo:Agua (10:90)

Se mide 9 ml de agua grado cromatográfico o equivalente y se añade 1 ml de
acetonitrilo HPLC.

VI. PROCEDIMIENTO

6.1 Generalidades
Se debe evitar el contacto de las muestras y los estándares con la piel, los ojos y
mucosas. Se recomienda utilizar mascarillas y guantes para manipular las muestras

6.2 Preparación de las muestras

6.2.1 Moluscos bivalvos frescos, congelados:

6.2.1.1 Proceder a descongelar la muestra de producto hidrobiológico.

6.2.1.2 Una vez descongelada la muestra separar la parte comestible (Tejido
muscular).
6.2.1.3 Para el caso de moluscos :
6.2.1.3.1 Moluscos que ingresan con su concha, limpiar minuciosamente el
exterior con agua potable.
6.2.1.3.2 Proceder a desvalvar y enjuagar el interior con agua potable para
eliminar cualquier presencia de arena u otra materia extraña.
6.2.1.3.3 Separar la carne de las conchas seccionando los músculos
aductores y el tejido adherido a ellas.
6.2.1.4 Recoger entre 100 – 150 gramos de carne en un recipiente de vidrio.
6.2.1.5 Colocar la muestra sobre los tamices de acero y dejar escurrir por espacio
de 5 minutos. Desechar el drenado.
6.2.1.6 Homogenizar el tejido y triturarlo en una licuadora hasta obtener una pasta
(papilla).

6.2.2 Moluscos bivalvos Procesados:

6.2.2.1 Proceder a descongelar la muestra de moluscos bivalvos.

6.2.2.2 Colocar la muestra sobre los tamices de acero y dejar escurrir por espacio
de 5 minutos. Desechar el drenado.
6.2.2.3 Homogenizar el tejido y triturarlo en una licuadora hasta obtener una pasta
(papilla).

6.2.3 Moluscos Bivalvos en Conserva:

6.2.3.1 Abrir el envase, triturar el tejido, y homogenizar con el líquido de gobierno.

6.2.3.2 En el caso de conservas de gran capacidad separar la carne y drenar por
unos minutos, recolectando todo el líquido de gobierno en un envase de
vidrio. Determinar la masa de la carne y el volumen del líquido con el
objetivo de recombinar porciones similares.
6.2.3.3 Triturar una porción de carne y recombinar con el líquido de gobierno en
proporciones iguales al contenido original.
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6.3 Extracción Metanólica

6.3.1 Pesar 2 g de muestra homogenizada directamente en un matraz aforado de
10 ml.
6.3.2 2 Aforar con una solución de metanol HPLC al 50%.
6.3.3 Homogenizar la muestra durante 10 minutos en el vortex.
6.3.4 Dejar reposar la muestra por 60 minutos en refrigeración.
6.3.5 Homogenizar la muestra durante 5 minutos en el vortex.
6.3.6 Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos.
6.3.7 Filtrar el sobrenadante a través de filtros tipo jeringa de 0.45 μm, recibiendo el
filtrado directamente en el vial.
6.3.8 De encontrarse concentraciones de ácido domoico con áreas superiores al
área del punto máximo de la curva de calibración, realizar diluciones con la
solución metanólica al 50 %.

6.4 Determinación

6.4.1 Las muestras se analizan tan pronto como sea posible. Los extractos y los
homogenizados pueden ser almacenados a temperaturas  -10ºC.
6.4.2 Inyectar soluciones patrón de ácido domoico.
6.4.3 3 La identificación del ácido domoico se realiza por comparación con el tiempo
de retención del patrón y la confirmación se efectúa mediante la adición de
patrón a los extractos de las muestras analizadas que presenten
concentraciones de ácido domoico mayores a 10 ugAD/ g, el tiempo de
contacto mínimo debe ser de 4 horas a 4°C, observándose un aumento del
área del pico y la no aparición de desdoblamientos del mismo.

6.5 Curva de calibración

Preparar la curva de calibración con las concentraciones expresadas en la tabla Nº 1.

Emplear solución diluyente Acetonitrilo:Agua (10:90) para completar el volumen
Emplear viales con inserto para obtener un mejor rendimiento. La concentración nominal
del estándar es de 99.4 μg/ml.
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6.6 Condiciones cromatografías

6.7 Construcción de la Curva de Calibración

Inyectar 10 μl de los estándares, programando el equipo para que realice la curva de
Calibración empleando la concentración versus el área.

6.8 Análisis Cromatográfico de la muestra

Fijar un volumen a inyectar de la muestra, este volumen debe ser idéntico al empleado en
la construcción de la curva de calibración.

VII. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

El resultado se obtiene de la siguiente forma:

((gAD  AE ) / ml )obtenido.curva  Vol .Total .extracto(ml )  d

Acido.Domoico( g / g ) 
Peso.muestra( g )

Donde :
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AE : Ácido epidomoico

El resultado final será expresado en la hoja de ensayo considerando la incertidumbre

expandida:

Resultado final =Ácido Domoico (μg/g) ±U

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 M.A Quilliam “Chemical methods for domoic acid, the amnesia shellfish poisoning(ASP)
toxin” 2003.
 Validación de la metodología para la determinación de ácido domoico (Biotoxina ASP en
moluscos bivalvos por cromatografía líquida de alto rendimiento – Revista Peruana de
Medicina Experimental y Salud Pública, 2002.
 Manual de información general que acompaña a la solución certificada de ácido domoico
(DACS-1) y Material de Referencia MUS 1B, enviada por el National Research Council de
Canadá (NRC-CNRC, Canadá).
 Quilliam, M.A. and Wright, J.L.C., “The amnesic shellfish poisoning mystery”, Analyt. Chem.
61: 1053A-60A (1989).
 CENTRO RICERCHE MARINE Laboratorio Nazionale di Riferimento per le Biotossine
Marine “METODO PER L’IDETIFICAZIONE E LA DETERMINAZIONE DELL’ ACIDO
DOMOICO NEI MOLLUSCHI EDULLI LAMELLIBRANCHI”.