CINÉTICA DE CRECIMIENTO

Ruby Aracely Narváez, Luisa María Rojas, María Fernanda Rivera.

rubynarvaez@unicauca.edu.co, mariart@unicauca.edu.co, rmluisa@unicauca.edu

Universidad del Cauca, Facultad de Ciencias Agrarias, Ingeniería Agroindustrial

Popayán-Cauca.

Resumen- En el presente informe se busca exponer el trabajo realizado con respecto a la práctica
de cinética de crecimiento de levaduras (R1y R2), en la cual se utilizó la cámara de neubauer
para hacer el conteo de las células y la prueba de espectrofotometría para medir densidad óptica.
Al realizar el conteo utilizando el método con la cámara de neubauer se notó que a la hora 12m
hubo el mayor crecimiento para las dos levaduras.
Según la gráfica fue posible mostrar con claridad la fase exponencial desde el tiempo 0 tanto para
R1 como para R2, hasta tiempo 1 en R1 y tiempo 2 en R2. Con la espectrofotometría se permitió
determinar los valores de densidad óptica de la levadura, los cuáles en R1 iniciaron en 1,746 y
finalizaron en 1,944 y para la levadura R2 iniciaron en 1,186 y finalizaron en 1,616.

Abstract- In the present report we seek to present the work done with respect to the practice of
yeast growth kinetics (R1 and R2), in which the neubauer chamber was used to count the cells
and the spectrophotometry test to measure density optics.
When counting using the method with the neubauer camera, it was noted that at 12m, there was
the highest growth for the two yeasts. According to the graph it was possible to clearly show the
exponential phase from time 0 for both R1 and R2, to time 1 in R1 and time 2 in R2. With the
spectrophotometry it was allowed to determine the optical density values of the yeast, which in
R1 started in 1.746 and ended in 1.944 and for yeast R2 they started in 1.186 and finished in
1.616.

I. INTRODUCCIÓN
El crecimiento se puede considerar como el
aumento ordenado de todos los constituyentes
químicos de un organismo, lo cual, para los
organismos unicelulares, conduce a un
aumento en el número de individuos en la
población. En un medio de apoyo para el
crecimiento adecuado, los microorganismos
unicelulares aumentan de tamaño, y por
último se dividen en dos celulas hijas, por un
proceso llamado fusión binaria o gemación.
Por ello se puede decir que el crecimiento, es el
nivel de individuos dentro de una población
(ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones
celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento
de las poblaciones celulares se puede subdividir
en sistemas cerrados, como el cultivo
intermitente y en sistemas abiertos, como el
cultivo alimentando por lotes y el cultivo
continúo. [1]
La curva del crecimiento microbiano
representa la evolución del número de número
de células viables presente en un cultivo
microbiano líquido a lo largo del tiempo de
estudio. Se estudia el número de células
viables por mililitro de un cultivo de volumen
limitado y con una cantidad de nutrientes
limitada.
En la curva de crecimiento se diferencias
cuatro fases, la fase de retraso a veces llamada
fase de latencia, que representa un periodo de
transición para los microorganismos cuando
son transferidos a una nueva condición. En
esta fase se producen las enzimas necesarias
para que ellos puedan crecer en un nuevo
medio ambiente; en esta fase no hay
incremento de celulas pero hay gran actividad
metabólica, aumento en el tamaño individual
de las células, en el contenido proteico, ADN
y peso seco de las células.
La fase de crecimiento exponencial o
logarítmico, es el periodo de la curva de
crecimiento en el cual el microorganismo
crece exponencialmente.
La fase estacionaria se da por las limitaciones
de crecimiento que ocurren ya sea por
agotamiento de algún nutriente esencial o por
la acumulación de productos tóxicos; y la fase
de muerte celular que sucede cuando empieza
una disminución progresiva en el número de
células viables. [2]
IMAGEN 1. Curva de crecimiento.
1. CÁMARA DE NEUBAUER
Es un instrumento de precisión hecho en
vidrio especial, usado para contar células o
partículas.
La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados
grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadrados
grandes de las esquinas están divididos en 16
cuadrados con aristas de 0,25 mm. El cuadrado
grande central está dividido en 16 cuadrados
medianos con aristas de 0,2 mm estando cada
cuadrado mediano subdividido en 16 cuadrados
pequeños con aristas de 0,05 mm y una superficie
de 0,0025 mm2. [3]
IMAGEN 2. Metodología de conteo de células en
cámara de Neubauer.
2. ESPECTROFÓTÓMETRO
Es un instrumento con el que se apoya
la espectrofotometría para medir la cantidad de
intensidad de luz absorbida después de pasar a
través de una solución muestra
PARTES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Espectrómetro: Produce un rango deseado de
longitud de onda de luz. Primero un colimador
(lente) transmite un haz recto de luz (fotones) que
pasa a través de un monocromador (prisma) para
dividirlo en varias componentes de longitudes de
onda (espectro). Entonces un selector de longitud
de onda (ranura) transmite sólo las longitudes de
onda deseadas.
Fotómetro: Después de que el rango deseado
de longitud de onda de luz pasa a través de la
solución muestra en la cubeta, el fotómetro
detecta la cantidad de fotones que se absorbe III. RESULTADOS Y DISCUSIONES
y luego envía una señal a un galvanómetro o
Se describen los resultados obtenidos por nueve
una pantalla digital. [4]
grupos de laboratorio, los cuales siguieron
diferentes metodologías de trabajo, con el
mismo tipo de levaduras (cinética de
crecimiento) R1 y R2 cuyas soluciones ya se
encontraban preparadas con anterioridad y listas
para ser aplicadas con la metodología de trabajo
correspondiente.
IMAGEN 3. Proceso general para el análisis con un
espectrofotómetro.

1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO
DE LEVADURAS
II. METODOLOGÍA
CAMARA DE NEUBAUER En la cinética de crecimiento todos los grupos
1.) Inocular el microorganismo con caldo utilizaron el método de la cámara de neubauer,
nutritivo que contiene glucosa. donde se calculó (aprox) el número de células
2.) Tomar 10 ml de inocuo. encontradas en cuatro cuadros de los dieciséis
3.) Homogenizar el inocuo utilizando el que habían por fracción, el primer grupo
agitador vórtex. encontró un crecimiento bajo, el cual tomo el
4.) Tomar 30 microlitos de la muestra. conteo al tiempo 0 (8am), tanto en R1 y en R2, el
5.) se introduce la muestra liquida por mayor conteo de crecimiento lo tuvo el grupo
capilaridad entre la cámara y el cubre. cinco al tiempo 4 (12am) para ambas levaduras ,
6.) Se lleva la cámara de neubauer al y a partir del grupo 6 el conteo empezó a
microscopio con el aumento adecuado disminuir un poco en R1 pero en R2 disminuyó
y se cuentan las células. notablemente y en los grupos siete, ocho y nueve
cuyos tiempos son 6, 7 y 8 el conteo disminuyo
considerablemente para ambas levaduras, como
ESPECTROFOTOMETRÍA se muestra en las tablas número 1 y 2 de R1 y R2
1.) Tomar 5 ml de la muestra del inocuo. respectivamente.
2.) Es indispensable hacer un blanco y Tabla 1. Datos obtenidos para la levadura R1.
llevarlo a la medición antes que la X(y)celulas /ml t/h(x) ln(x) Densida optica
muestra. 12400000 0 16,33320703 1,746
3.) Llevar la muestra al 372000000 1 19,73440441 1,754
espectrofotómetro.
575200000 2 20,17022836 1,84
1. Homogenizar la muestra
aplicando el agitador vórtex. 674800000 3 20,32992691 1,887
2. Purgar la cubeta (celda). 918400000 4 20,63814358 1,862
3. Agregar la muestra a la celda. 713200000 5 20,38527244 1,879
4. Llevar la celda con la muestra al 200400000 6 19,11582593 1,918
espectrofotómetro. 183200000 7 19,02608901 1,95
5. Medir absorbancia.
191600000 8 19,07092042 1,944
Tabla 2. Datos obtenidos para la levadura R2.
X(y)celulas /ml t/h(x) ln(x) D.Optica
42000000 0 17,55318018 1,186
255600000 1 19,35912428 1,273
452800000 2 19,93096108 1,38
500000000 3 20,03011866 1,367
571200000 4 20,16324997 1,388
233200000 5 19,26740701 1,453
263600000 6 19,38994336 1,479
188800000 7 19,05619881 1,525 Gráfica 3. Densidad Óptica R1.
296000000 8 19,50587001 1,616

A cada una de las tablas, de las levaduras (R1

Y R2), se les realizaron gráficas de UFC vs
TIEMPO tanto corregidas como no corregidas
y la gráfica de DENSIDAD ÓPTICA vs
TIEMPO arrojando los siguientes resultados:

Gráfica 4. Cinética de Crecimiento R2.

Gráfica 1. Cinética de Crecimiento R1.

Gráfica 5. Fase Exponencial Corregida R2.

Gráfica 2. Fase Exponencial Corregida R1.
 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
𝒎 = 𝝁 = 1,18
𝒍𝒏(𝟐)
𝒕𝒅 =
𝝁
𝑙𝑛(2)
𝒕𝒅 = = 0,59ℎ
1,18

Gráfica 6. Densidad Óptica R2.

DISCUSION DE RESULTADOS
En las gráficas 1 y 4 se pueden observar la
cinética de crecimiento no corregida, donde se
CÁLCULOS CORRESPONDIENTES. encuentran puntos tales como el punto 6 de R1
 Determinación del tiempo de o el punto 5 en R2 que obstruyen para que la
duplicación para R1. gráfica se muestre exponencial, impidiendo
así observar un mejor crecimiento de las
Pendiente 3,401197382 levaduras. Por ello fue necesario hacer una
Intercepción 16,33320703 corrección que se nota en la graficas 2 y 5.
Según la gráfica las células no entraron a una
𝒀 = 𝒎𝒙 + 𝒃
fase de adaptación (fase de latencia) ya que
𝒀 = 𝟑, 𝟒𝒙 + 𝟏𝟔, 𝟑𝟑 éstas entraron en su fase logarítmica desde el
tiempo 0 tanto para R1 como para R2, hasta
𝝁 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 tiempo 1 en R1 y tiempo 2 en R2 que fue
𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 donde se mostró con claridad la fase
exponencial.
𝒎 = 𝝁 = 3,4
En las gráficas 2 y 5 las cuales se encuentran
𝒍𝒏(𝟐) en fase exponencial ya corregida, se observa
𝒕𝒅 = que la población de levaduras tanto en R1 y
𝝁
R2 crece con cierta rapidez hasta cierto punto,
𝑙𝑛(2) en esta fase la población de levaduras ingresa
𝒕𝒅 = = 0,2ℎ
3,4 a un ambiente nuevo y favorable para su
desarrollo, el azúcar permite que las levaduras
 Determinación del tiempo de
durante el transcurso de la fermentación
duplicación para R2.
cubran sus necesidades energéticas sin aporte
Pendiente 1,188890454 de aire. El metabolismo anaerobio de los
Intercepción 17,75886473
hidratos de carbono, el cual se produce en
ausencia de aire, tiene gran importancia en el
crecimiento de la población de las levaduras
𝒀 = 𝒎𝒙 + 𝒃 [5].

𝒀 = 𝟏, 𝟏𝟖𝒙 + 𝟏𝟕, 𝟕𝟓 Después de alcanzar el máximo crecimiento

tanto en R1 como en R2 estas ingresaron a
𝝁 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 una fase de autolisis gradual, esto quiere decir
que no se observó una fase estacionaria pues
en ambos casos se empezó a disminuir las
UFC.
Luego estas levaduras entraron a una fase de
muerte, donde las UFC empezaron a disminuir
exponencialmente, esto se debe a que las
levaduras tienen una disminución progresiva
en el número de células viables, es decir, se
detiene el proceso de fusión binaria, lo cual
pudo ser causado por el envejecimiento del
medio, el consumo exhaustivo de los
nutrientes que se tornan limitantes y la
acumulación de productos de desecho [1]. Sin
embargo en la gráfica 2 exponencial corregida
luego de entrar en la fase de muerte, se puede
observar una fase casi estacionaria, lo cual
estaría mostrando que no hay en sí, un
aumento de microorganismos (no hay división
de algunos), sino que la aparición de nuevos
individuos se compensa por la muerte de
otros.
En la práctica de cinética de crecimiento se
deben tener en cuenta los efectos de la
temperatura en el crecimiento de las levaduras
R1 y R2, pues cada levadura tiene una
temperatura adecuada en donde la velocidad
de duplicación será mayor, ya que no todas las
levaduras crecen al mismo rango de
temperaturas y con mismos factores o
condiciones.
DENSIDAD ÓPTICA
Debido a que se trabajó con un medio de
cultivo en estado líquido, uno de los métodos
que se estableció para estudiar el crecimiento
de las levaduras (R1 y R2) fue la turbidimetría,
que se basa en mediciones de densidad óptica,
lo cual nos permitió observar el crecimiento de
las levaduras (R1 y R2) en tiempo real.
La medición de la densidad óptica se realiza
por medio de un espectrofotómetro, el cual se
basa en la turbidez del medio de cultivo, que
sucede cuando la cantidad de células se
encuentra en aumento. Los valores de
densidad óptica (tabla 1) de la levadura R1
iniciaron en 1,746 y finalizaron en 1,944 y
para la levadura R2 (tabla 2) iniciaron en
1,186 y finalizaron en 1,616. En ambos casos
la densidad óptica estuvo en aumento, y esto
se ve reflejado en las gráficas 3 (R1) y 6 (R2)
donde se nota un aumento exponencial,
aunque en la levadura R1 se observa que en el
dato 4 (tiempo 3) con densidad óptica de 1,
887 influye en que la gráfica tenga un cambio
en su aumento, puesto que el dato que le
continua es más pequeño, causando una
desviación notable en la gráfica 3; igualmente
esto sucede en R2 en el dato 3 (tiempo2) con
densidad óptica de 1,38 donde en la gráfica 6
se observa una pequeña desviación. Por ello se
dice que R2 tuvo mejor comportamiento. En
ambos casos, las desviaciones (grande y
pequeña) se pudo haber dado por errores en la
toma de mediciones, ya que la teoría dice que
a mayor densidad óptima hay menor
transmitancia, (fracción de luz incidente que
pasa a través de una muestra), lo que significa
que la producción de biomasa en el cultivo era
cada vez mayor [6].
También se le realizaron ajustes a las gráficas
de densidad óptica para observar mejor el
aumento de crecimiento, para esto se
eliminaron algunos datos tanto para R1 y R2
en las gráficas 3 y 6, ya que estos datos fueron
los posibles causantes de las desviaciones. La
corrección se muestra en las siguientes
gráficas 7 y 8 respectivamente:
Gráfica 7. Densidad óptica corregida R1.

Gráfica 8. Densidad óptica corregida R2.
En las gráficas 7 y 8 se puede observar el
cambio obtenido referente a las gráficas 3 y 6
al eliminar los datos causantes de las
desviaciones, este cambio nos permite
observar con mayor claridad el aumento de las
células a través del tiempo, sin embargo, no se
puede evidenciar las fases de crecimiento de
la cinética microbiana de forma detallada, ni
diferenciar células muertas de células vivas
[6].
El tiempo de duplicación de las células de las
levaduras R1 y R2 fueron de 0,2h y 0,59h
respectivamente lo que significa que este es el
tiempo requerido para que una célula de R1 o
R2 se divida o una población se duplique [7],
con lo cual podemos deducir, que el tiempo de
generación o duplicación de las células de las
levaduras (R1 y R2) es bastante rápido.
IV. CONCLUSIONES
En la cinética de crecimiento de las levaduras
no se observó como tal una fase estacionaria
pues, las células siempre se mantuvieron en
fase exponencial según las gráficas 2 y 5,
aunque se observa en estas respectivas
graficas que el crecimiento en los primeros
tiempos se dio de manera eficaz, pues la fase
exponencial fue más notoria.
Se puede observar como la densidad óptica de
la levadura R2 tuvo un mejor aumento
exponencial, respecto a la levadura R1, donde
el aumento se vio con varias desviaciones.
Al terminar el seguimiento de cinética de
crecimiento de las levaduras fue posible
concluir que estas levaduras R1 y R2 tienen
un proceso de fusión binaria o gemación que
requiere poco tiempo.
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