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TITULO DE LA PRÁCTICA

Cruz Sanchez Juan Pablo; Pardo Cepeda Laura Valentina

Universidad Distrital Francisco José de Caldas

INFO RESUMEN
ARTÍCULO
El presente documento muestra la cuantificación y análisis de la
Entregado: presencia de virus en el cultivo de la bacteria escherichia coli, dado
23 de octubre de 2017
que los virus, como la mayoría de los parásitos, son muy específicos
en relación con los hospedadores que parasitan. Algunos virus son
Palabras claves: específicos de bacterias y se denominan virus bacterianos,
Bacteria, bacteriófagos o fagos. Por lo tanto, identificaremos los bacteriófagos
Bacteriófago, Virus, E.
Coli, Lisogenia (colifagos) propios de dicha bacteria, encontrando así la magnitud del
daño causado por la infección viral.

ABSTRACT

The present document shows the quantification and analysis of the


presence of the virus in the culture of Escherichia coli bacteria, which
viruses, like most parasites, are very specific in relation to
parasitizing hosts. Some viruses are specific to bacteria and viruses
called bacterial, bacteriophage or phage. Therefore, we will identify
the bacteriophages (coliphages) characteristic of this bacterium, thus
finding the magnitude of the damage caused by the viral infection.

1. Introducción se inicia el estado intracelular y ocurre la replicación


del virus mediante la producción de nuevas copias del
- VIRUS: genoma y la síntesis de los componentes de la cubierta
(Carrillo & Audisio, 2007).
Los virus son elementos genéticos que pueden
replicarse independientemente de los cromosomas de
una célula, pero sólo dentro de la misma. Poseen una
forma infecciosa extracelular, que les permite ser
transmitidos con facilidad de un hospedante a otro y
replicarse por sí mismo mediante una vía destructiva
para la célula que lo aloja (Carrillo & Audisio, 2007).

En el estado extracelular, un virus es una partícula


diminuta metabólicamente inerte que contiene ácido
Ilustración 1. Estructura de un bacteriófago, Obtenido de:
nucleico rodeado de proteína y ocasionalmente, según https://es.dreamstime.com/imagenes-de-archivo-estructura-del-
el virus, otros compuestos macromoleculares. Una vez bacteri%C3%B3fago-del-virus-image27111334
que el ácido nucleico viral es introducido en una célula,
- BACTERIA: función principal es la de proteger al material genético
fágico, éstas proteínas pueden además proveer al fago
Las bacterias son microorganismos unicelulares que se de: cuello, cola, fibras caudales, laminas básales y/o
reproducen por fisión binaria. La mayoría son de vida espículas (Segundo, Hernández, Lopéz, & Torres,
libre, a excepción de algunas que son de vida 2010).
intracelular obligada, como Chlamydias y Rickettsias.
Tienen los mecanismos productores de energía y el Sin embargo una de las propiedades más asombrosas
material genético necesarios para su desarrollo y de estos agentes virales, es que han sido llamados, “la
crecimiento. Las bacterias integran el reino procariota forma de vida más abundante y ubicua en la tierra” ya
(pro de primitivo y cariota de núcleo) (Universidad de que se calcula que hay alrededor de 1 X 1030 UFP/mL,
la República, 2006) o más sólo en el agua de mar5; sin embargo, éstos han
sido aislados desde aguas residuales, hasta muestras de
- LISOGENIA: tierra o cieno (Segundo, Hernández, Lopéz, & Torres,
2010).
Estado en el que un fago con genoma DNA mantiene
una relación latente o persistente, no lítica, con la - COLIFAGOS:
bacteria hospedadora. Durante el estado lisogénico el
fago no se replica, sino que el genoma viral está Los bacteriófagos (fagos) son virus que sólo utilizan
integrado en el cromosoma de la bacteria (ver profago) bacterias como hospedadores para la replicación. Los
y se transmite en forma de profago a las células colifagos utilizan E. coli y otras especies emparentadas
descendientes durante la división de la bacteria. La próximamente con ella como hospedadores y, por lo
inserción del profago puede ocurrir en regiones tanto, pueden ser liberados por estos hospedadores
concretas del DNA del hospedador o en cualquier lugar bacterianos a las heces humanas y de otros animales de
(© CLÍNICA UNIVERSIDAD DE NAVARRA, sangre caliente. Los colifagos que se utilizan en la
2015). evaluación de la calidad del agua se dividen en dos
grupos principales: colifagos somáticos y colifagos de
El profago también puede perpetuarse como un ARN F-específicos (específicos para E. Coli F+)
elemento extracromosómico si se inserta en un (Organización Mundial de la Salud, 2006).
plásmido. La bacteria que contiene un fago en estado
lisogénico se denomina lisógeno, y es inmune a la
superinfección por el mismo fago (© CLÍNICA
UNIVERSIDAD DE NAVARRA, 2015).

Los cultivos bacterianos lisogénicos pueden lisarse de


forma espontánea con una frecuencia muy baja (1 X
10-6). Sin embargo, esta frecuencia de lisis (debido a
la desinserción del profago y subsiguiente replicación
viral) puede aumentarse por agentes inductores como
la luz ultravioleta (© CLÍNICA UNIVERSIDAD DE
NAVARRA, 2015).

- BACTERIOFAGO:

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan y lisan


Ilustración 2. Ciclo de multiplicación de Colifagos Obtenido de:
bacterias de manera especie específica, consisten http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/contenido/capitulo
fundamentalmente de material genético y proteínas. Su 13.html
genoma puede componerse de DNA o de RNA el cual
puede ser de cadena doble o de una sola cadena. El Una de las diferencias entre ambos grupos es la vía de
mencionado material genético es protegido por una infección. Los colifagos somáticos inician la infección
cubierta de proteínas denominada cápside. La uniéndose a receptores ubicados permanentemente en
estructura de los fagos, es determinada por sus la pared celular de los hospedadores; suelen replicarse
proteínas de envoltura (o proteínas estructurales) cuya en el aparato digestivo de los animales de sangre
caliente, pero también pueden hacerlo en medios construido mediante procesos avanzados de
acuáticos. Los colifagos somáticos incluyen una gran fabricación, es uno de los principales instrumentos
variedad de fagos (que pertenecen a las familias diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser
Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae y humano. Utiliza las propiedades de la luz y su
Microviridae) con diferentes tipos morfológicos. Los interacción con otras sustancias, para determinar la
colifagos de ARN F-específicos inician la infección naturaleza de las mismas. En general, la luz de una
uniéndose a las fimbrias de fertilidad (fimbrias F- o lámpara de características especiales es guiada a través
sexuales) de las E. coli hospedadoras, que producen de un dispositivo que selecciona y separa luz de una
exclusivamente las bacterias portadoras del plásmido determinada longitud de onda y la hace pasar por una
de fertilidad (F) (Organización Mundial de la Salud, muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra
2006). es captada y comparada con la intensidad de la luz que
incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la
Dado que las fimbrias F se producen únicamente en la transmitancia de la muestra, que depende de factores
fase de crecimiento logarítmico a temperaturas como la concentración de la sustancia (Organización
superiores a 30 ºC, no es probable que los colifagos de Panamericana de la Salud, 2005).
ARN F-específicos sean capaces de replicarse en
ambientes diferentes del aparato digestivo de los - ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN:
animales de sangre caliente. Los colifagos de ARN F-
específicos son un grupo reducido de fagos con un Desde hace muchos años se ha usado el color como
parentesco próximo que pertenecen a la familia ayuda para reconocer las sustancias químicas; al
Leviviridae y que comprenden un genoma de ARN reemplazar el ojo humano por otros detectores de
monocatenario y una cápside icosaédrica, con una radiación se puede estudiar la absorción de sustancias,
morfología similar a la de los picornavirus. Se han no solamente en la zona del espectro visible, sino
clasificado en los tipos serológicos I-IV, cuyos también en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina
genotipos pueden identificarse mediante técnicas espectrofotometría a la medición de la cantidad de
moleculares como la hibridación con sondas genéticas. energía radiante que absorbe un sistema químico en
Hasta la fecha, los virus de los grupos I y IV se han función de la longitud de onda de la radiación, y a las
encontrado exclusivamente en heces animales y los del mediciones a una determinada longitud de onda.
grupo III en heces humanas. Los fagos del grupo II se La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que
han detectado en heces humanas pero no en heces de un haz de luz es un flujo de cuantos de energía
animales, excepto en aproximadamente el 28% de las llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda
heces porcinas. Esta especificidad, que aún no se está asociada con los fotones, cada uno de los cuales
entiende por completo, proporciona un posible posee una cantidad definida de energía (Brunatti &
instrumento para distinguir entre la contaminación Martín , s.f.).
fecal de origen humano y la de origen animal, bajo
ciertas condiciones y con limitaciones (Organización La absorbancia A de una solución se define mediante
Mundial de la Salud, 2006). la ecuación:

𝐼0
- ESPECTROFOTÓMETRO: 𝐴 = − log 𝑇 = log
𝐼
(Brunatti & Martín , s.f.)
La palabra
espectrofotómetro La mayor parte de los trabajos analíticos se realizan
se deriva de la con soluciones de manera que vamos a desarrollarla
palabra latina relación que existe entre la concentración de la
spectrum, que solución y su capacidad de absorber radiación (Brunatti
significa imagen, & Martín , s.f.).
y de la palabra
Ilustración 3. Espectrofotómetro para griega phos o
análisis de aguas, Obtenido de: photos, que
http://www.aguascolombia.com/equipos significa luz. El
-analisis-de-agua/espectrofotometros/ espectrofotómetro,
2. Métodos Transfiera 0,5mL de la suspensión de
fagos al tubo marcado con 10−1 y
Suspensión bacteriana homogenice sin formar espuma.

Tome una muestra del cultivo de E. coli


Use una pipeta estéril nueva para
y Re suspéndala en una solución de NaCl
transferir 0,5mL del tubo 10−1 al tubo
al 0,85% estéril, hasta alcanzar una DO
marcado 10−2, homogenice
0,5 a 520 nm
nuevamente.

Si la cepa debe ser preservada en frio


Repita el procedimiento
antes de su uso Re suspenda la cepa en
secuencialmente hasta llegar al tubo
TSA con 20% de glicerol
10−5

Alicuotela en volúmenes de 2.5mL y


almacénela en refrigeración por 1 hora y Tome rápidamente 0,1mL de la
posteriormente consérvela a una suspensión de E. coli y 1mL de la
temperatura de -20 °C por un tiempo no suspensión de fagos diluida y
mayor de 6 semanas. adiciónelo al tubo correspondiente de
agar TSA licuado y a 48°C
Preparación de diluciones seriadas de
la suspensión de fagos
Mézclelos vigorosamente, sin
dudarlo y rápidamente
Marque 6 tubos de ensayo de 10−1 a
10−6 y marque un tubo como control
Ponga el contenido del tubo sobre la
placa de agar TSA correspondiente y
A cada tubo adiciónele 4,5mL de NaCl homogenice la caja con
0,85% estéril. movimientos suaves hasta que el
agar quede completamente
distribuido hasta los bordes de la
caja.
Marque sus cajas de agar TSA, según
las diluciones asignadas por el docente
(10−5, 10−6 , 10−7, 10−8 , 10−9 y
control). Repita este procedimiento con las
demás diluciones asignadas
Permita la incubación a 37° C por 24 Agar de concentración 10-6
horas. Resultado: Negativo

Pasado el tiempo de incubación, Conteo: 0


identifique las placas de lisis
bacteriana causadas por la infección
viral como áreas claras, uniformes y Absorbancia E Coli: 516
translucidas.
Ilustración 5. Agar
nutritivo, Concentración
de fagos 10-6
Pasado el tiempo de incubación, Tabla 2. Colonias de colifagos concentración 10-6
identifique las placas de lisis
4. Discusión
bacteriana causadas por la infección (En la discusión se comparan y analizan los resultados
viral como áreas claras, uniformes y frente a los que se esperaba o lo que es posible
translucidas. comparar con otros estudios.También pretende dar
explicación argumentada de los resultados al
comparar con la literatura).
5. Conclusión
Seleccione las cajas que tienen entre Debe corresponder a las conclusiones de sus
30 a 300 placas y cuéntelas experimentos. Frases concretas positivas o negativas

6. Cuestionario

Para realizar un cálculo estimado de


las partículas fagicas/mL realice lo
siguiente:

Fagos/mL = (número placas/caja) x


(1/mL sembrado) x factor dilución

3. Resultados

Agar de concentración 10-5


Resultado: Negativo

7. Bibliografia
Conteo: 0 Según normas APA. Ejemplo:

Anderson, Charles & Johnson (2003). The impressive


psychology paper. Chicago: Lucerne Publishing.

Absorbancia E Coli: 516 Smith, M. (2001).Writing a successful paper.The Trey


Research Monthly, 53, 149-150.
Ilustración 4. Agar
nutritivo, Concentración La secuencia de referencias esta alfabéticamente
de fagos 10-5 organizada por apellidos del primer autor, y configuradas
Tabla 1. Colonias de colifagos concentración 10-5 con una sangría francesa. La mayoría de referencias tienen
3 componentes:
1. Autores: Los autores estan enlistados en el
mismo orden en que se a especificado en la
fuente usando apellidos e iniciales. Las comas
separan todos los autores. Cuando hay 7 o más
autores, se nombran los primeros 6 y luego usa
“et al.” Para los autores restantes. Si no se
identifica el autor, el título del documento
comienza la referencia.

2. Año de publicación: En parenthesis, sigue a los


autores, un punto seguido después del
paréntesis. Si no se identifica la fecha de
publicación, use “n.d.” en paréntesis, seguido de
los autores

3. Referencia de las fuentes: Incluye título, revista,


volúmen, páginas (para artículos de revistas)
otítulo, ciudadde publicación, editor (para libros).

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