Arkadiusz Kozubek

Aleksander F. Sikorski
Jan Szopa

Molekularna
organizacja komórki
II. Lipidy, liposomy
i błony biologiczne
pod redakcją A. Kozubka

Wydanie II, poprawione

Wrocław 1996
Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego
Recenzent Maria Warwas

Opracowanie typograficzne Maciej Szłapka

© Copyright 1993 by Uniwersytet Wrocławski - Wydawnictwo

ISBN 83-229-1513-6

Łamanie wykonano w Pracowni Składu Komputerowgo ΤΥΡΟ-GRAF

Wydrukowano we Wrocławskiej Drukarni Naukowej
Spis treści
Wstęp 9

1. Lipidy 11
1.1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych 17
1.1.1. Ekstrakcja lipidów z materiału zwierzęcego 18
l .1.2. Ekstrakcja lipidów rozpuszczalnikami o małej toksyczności 18
1.1.3. Ekstrakcja lipidów z erytrocytów 20
1.1.4. Ekstrakcja lipidów z materiału roślinnego 20
1.2. Izolacja i analiza lipidów 21
1.2.1. Frakcjonowanie lipidów metodą chromatografii na
CM-celulozie 23
1.2.2. Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej chromatografii
cieczowej (HPLC) 24
l .2.3. Analiza fosfolipidów w chromatografii cienkowarstwowej 25
l .2.4. Oznaczanie fosforu w rozdzielonych w TLC frakcjach
fosfolipidowych 26
1.2.5. Analiza lipidów roślinnych w chromatografii
cienkowarstwowej 27
1.2.6. Izolacja i oczyszczanie lecytyny jajecznej 28
l .2.7. Izolacja monogalakto- i dwugalaktodwuglicerydów
z całkowitych lipidów roślinnych 30
l .2.8. Izolacja lipidów fenolowych (5-n-alk(en)ylorezorcynoli)
z ziaren żyta 31
l .2.9. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów rezorcynolowych 32
1.2.10. Oznaczanie składu nasyconych i nienasyconych homologów
lipidów rezorcynolowych w cienkowarstwowej
chromatografii argentacyjnej 33
l .2.11. Oznaczanie składu homologów lipidów rezorcynolowych
pod względem długości łańcucha alifatycznego
w chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu ... 34
1.2.12. Oczyszczanie lipidów rezorcynolowych oraz izolacja
poszczególnych ich homologów 35
1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach
i fosfolipidach 36
1.3.1. Transestryfikacja lipidów 36
1.3.2. Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych
w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej . . . . 37
l .3.3. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych
w chromatografii gazowej 38
1.4. Metody ilościowe analizy lipidów 39
1.4.1. Oznaczanie lipidów całkowitych metodą wanilinową . . . 39
 Spis treści 6

1.4.2. Oznaczanie cholesterolu całkowitego 40

1.4.3. Oznaczanie glikolipidów metodą fenolową 40
1.4.4. Oznaczanie fosforu w fosfolipidach 41
1.4.5. Oznaczanie fosfolipidów w zawiesinach wodnych (np.
w liposomach) 43
l .4.6. Oznaczanie lipidów rezorcynolowych 43
1.5. Detekcja lipidów w chromatografii cienkowarstwowej .... 44
1.5.1. Detekcja nieswoista 44
1.5.2. Detekcja swoista 45
1.6. Amfifilowe właściwości lipidów 48
1.6.1. Wyznaczanie krytycznego stężenia micelizacji na
przykładzie związku powierzchniowo czynnego 53
l .6.2. Właściwości termotropowe fosfolipidów - wyznaczanie
temperatury przejścia fazowego metodą optyczną 54
l .6.3. Samoorganizacja cząsteczek fosfolipidów - powstawanie
liposomów 58
1.7. Utlenianie lipidów 59
l .7.1. Oznaczanie produktów peroksydacji reagujących z kwasem
tiobarbiturowym 60
1.8. Wybrane enzymy metabolizmu lipidów 61
l .8. l. Lipaza trójglicerydowa - test dyfuzyjny na wykazywanie
aktywności 62
1.8.2. Fosfolipaza A2 62
1.8.3. Oznaczanie aktywności fosfolipazy A 63
1.8.4. Fosfolipaza D 63
1.8.5. Izolacja częściowo oczyszczonej fosfolipazy D 64
l .8.6. Hydroliza fosfatydylocholiny przez fosfolipazę D 64
1.8.7. Wykorzystanie fosfolipazy D do konwersji lecytyny do
innych fosfolipidów 65
1.9. Lipoksygenazy - enzymatyczne utlenianie lipidów 65
1.9.1. Utlenianie kwasu linolowego przez lipoksygenazę soi . . 65

2. Błony biologiczne 69
2.1. Białka i lipidy błon erytrocytów 70
2.1.1. Porównanie składu lipidowego błon erytrocytów
przeżuwaczy i nieprzeżuwaczy 73
2.1.2. Izolacja i analiza ilościowa i jakościowa białek cieni
erytrocytów 74
2.1.3. Oznaczanie białka metodą Lowry'ego 75
2.1.4. Oznaczanie cukrów całkowitych 76
2.2. Właściwości barierowe błon biologicznych 76
2.2.1. Transport bierny małych nieelektrolitów 76
 Spis treści 7

2.2.2. Wybiórczość transportu ułatwionego jonów poprzez błonę

biologiczną 80
2.2.3. Indukowana przepuszczalność dwuwarstwy fosfolipidowej
dla jonów. Jonofory 81
2.3. Płynność błony biologicznej 83
2.3.1. Ocena płynności błon pęcherzyków lipidowych sporządzonych
z mieszaniny fosfatydylocholiny i cholesterolu (9:1) metodą
depolaryzacji fluorescencji z użyciem difenyloheksatrienu 85
2.4. Liposomy jako modele w badaniach procesu fuzji błon
biologicznych 85
2.4. l. Badanie fuzji liposomów poprzez śledzenie mieszania
zawartości ich przestrzeni wodnych 88

3. Elementy technologii liposomowej 90

3.1. Techniki preparacji liposomów 91
3.1.1. Efekt stosowanej techniki preparacyjnej na pojemność
liposomów 94
3.1.2. Duże jednowarstwowe liposomy „obciążone" sacharozą,
metodą solubilizacji detergentem niejonowym i dializy . . 98
3.2. Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach 98
3.2.1. Wpływ składu lipidowego na objętość zamkniętą 99
3.3. Określanie trwałości i stabilności liposomów 100
3.3.1. Uwalnianie karboksyfluoresceiny jako miernik stabilności
liposomów 100
3.3.2. Badanie wpływu surowicy na trwałość liposomów .... 101

Dodatek 103
1. Temperatury i entalpie głównego przejścia fazowego fosfolipidów
(Tabela 4) 103
2. Temperatury przejścia dwuwarstwa-HII fosfatydyloetanolamin
(Tabela 5) 105
3. Orientacyjne masy cząsteczkowe niektórych lipidów
(Tabela 6) 106
4. Struktura i niektóre właściwości wybranych związków
powierzchniowo czynnych (Tabela 7) 107
 Wstęp
Lipidy (od greckiego słowa lipos - tłuszcz) są drobnocząsteczkowymi związkami
organicznymi występującymi w komórkach zwierząt, roślin i mikroorganizmów
lub na ich powierzchni. Lipidy pełnią kluczową rolę jako aktywne składniki błon
biologicznych, a także w wielu procesach metabolicznych. Są również formą
zapasową paliwa metabolicznego.
Pierwszą analizę elementarną lipidów przeprowadził Lavoisier wykazując, że
tłuszcze i oleje składają się głównie z węgla i wodoru. Scheele badając lipidy
odkrył glicerol i wykazał jego obecność w tłuszczach zwierzęcych i olejach ro-
ślinnych. Chevreul w 1811 r. wydzielił z mydeł kwasy tłuszczowe, a w 1812 r.
odkrył w kamieniach żółciowych cholesterol. Podzielił on tłuszcze na dwie grupy
- tłuszcze zmydlające się i niezmydlające się i wykazał, że tłuszcze zmydlające
się są estrami glicerolu i kwasów tłuszczowych. W tym samym czasie niemiecki
lekarz Vogel stwierdził występowanie cholesterolu w ścianach naczyń krwionoś-
nych człowieka. W 1877 r. Hoppe-Seiler wydzielił z żółtka jaja oraz z mózgu
lipid nazwany lecytyną (z greckiego lekitos - żółtko jaja). W 1884 r. angielski
lekarz G. Tudicum w swojej książce dotyczącej budowy mózgu wskazywał bio-
logiczną uniwersalność fosfolipidów. W szczególności napisał, że fosfatydy są
chemiczną duszą każdej bioplazmy, zwierzęcej i roślinnej. Mogą pełnić różnorod-
ne funkcje dzięki posiadaniu kontrastowych właściwości. Szczególnie istotna jest
ich zdolność do tworzenia roztworów koloidalnych. Bez tych właściwości mózg,
jak i każda bioplazma nie mogłyby funkcjonować. Badacz ten wydzielił również
z mózgu związki zawierające azot i fosfor, które nazwał kefaliną, sfingomielina
i cerebrozydem. Dalsze postępy badań lipidów następowały powoli i dopiero od
lat pięćdziesiątych XX w. po opracowaniu nowych metod rozdzielania i analizy
tych związków stały się możliwe znaczące postępy. Nowo uzyskiwane dane
pozwoliły na zweryfikowanie dotychczas przyjętej opinii o funkcji biologicznej
lipidów. Funkcje zapasowe i energetyczne zostały zepchnięte na plan dalszy -
głównymi okazały się te, które dotychczas były mało dostrzegane - udział w bu-
dowie i funkcji błon biologicznych, procesach biosyntezy i modyfikacji białek
w komórce, przemianach energii (fotosynteza), a także w międzykomórkowym
przekazywaniu informacji, jak również w wielu istotnych przemianach metabo-
licznych (np. lipidowe hormony, witaminy, barwniki czy kwasy żółciowe).
Jedną z najbardziej intrygujących cech lipidów jest ich nadzwyczajna różno-
rodność. Powody istnienia takiej różnorodności są niezbyt znane, tym niemniej
coraz więcej uwagi poświęca się badaniom jej roli np. w budowie i funkcji błon
biologicznych, w których lipidy stanowią średnio 50% składu (od 80% w osłonce
mielinowej do 20% w mitochondriach). Nawet pojedyncza błona może zawierać
ponad 100 unikalnych typów lipidów. Dlaczego tak wiele i czy każda błona ma
unikalny skład lipidowy? Powody tej heterogenności są jeszcze mało znane, cho-
ciaż coraz częściej stwierdza się aktywną rolę lipidów w procesach przebiegają-
 Wstęp 10

cych z udziałem błon biologicznych. W tych badaniach istotne są następujące

zagadnienia:
- mieszanina lipidów powinna co najmniej tworzyć stabilną strukturę dwu-
warstwową, w której białka mogłyby wykazywać swą aktywność,
- jedne typy lipidów mogą być wymagane do stabilizacji np. rejonów o sil-
nym zakrzywieniu, połączeń między błonami czy też optymalnej interakcji
z określonymi białkami,
- inne lipidy są ważnymi czynnikami regulatorowymi. Szczególnie istotne są
pochodne fosfatydyloinozytolu występujące w błonach komórek eukariotycz-
nych,
- pewne lipidy biorą także udział w szlakach biosyntezy. Na przykład fosfa-
tydyloglicerol u E. coli dostarcza reszt glicerofosforanowych dla biosyntezy peri-
plazmatycznych oligosacharydów,
- dla optymalnej aktywności pewnych enzymów mogą być również wymaga-
ne pewne swoiste lipidy,
- lipidy, a w szczególności gangliozydy, pełnić mogą istotną rolę w regulacji
wzrostu komórki, wiązaniu do swoistych receptorów w błonie plazmatycznej,
a także w procesie adhezji,
- inne składniki lipidowe również mogą pełnić specjalne funkcje. Dotyczy to
m.in. dolicholu, ubichinonów, menachinonów, karotenoidów, a także czynnika
aktywującego krwinki płytkowe.

Opisane w dalszej części tego skryptu ćwiczenia mają na celu zilustrowanie

tematyki lipidowej oraz wstępu do problematyki błon biologicznych. Nie preten-
dują jednak do roli wyczerpującej ilustracji wszystkich zagadnień możliwych do
napotkania w czasie studiowania biochemii i biofizyki lipidów i błon biologicz-
nych.