c Ê




Alkalaza + Flavourzyme (hydroliza pod ich wpływem)

×Ê alkalaza (proteaza z Bacilluslicheniformis),
×Ê flavourzyme (proteaza z Aspergillus oryzae),

P
   (przeciwutlenianie)- hormon peptydowy wchodzący w skład układu hormonalnego

RAA, którego zadaniem jest kontrola stężenia jonówsodowych i potasowych w organizmie

*angiotensyna I ikonwertazy angiotensyny (ACE) uzyskane z płuc królików,

pÊ Bioaktywne peptydy: przeciwutleniające, przeciwnowotworowe, obniżające ciśnienie,

obniżające poziom cholesterolu.
pÊ „dmiany roślin, których hydrolizaty wykazują silne działanie przeciwutleniające:
z kiełków pszenicy za pomocą Alkalazy,
z nasion rzepaku przez Flavourzyme, z sezamu za pomocą trypsyny.

Przygotowanie izolatu białek (PI) i hydrolizy enzymatycznej

pÊ Przygotowanie izolatu białka;

pÊ è rozpuszczono w 0,1 mol HCl przy pH 8,00 i M    w temperaturze 50°C;
pÊ Przy hydrolizie indywidualnej, dodanie wskaźnika do kompleksu enzym/substrat;
pÊ ·onitorowanie przez 60 min.
pÊ Połączenie hydrolizy enzymów;
pÊ åodanie Flavourzymu do hydrolizatu Alkalazy po 60 min, przedłużenie hydrolizy do 120 min.
pÊ „cena stopnia hydrolizy (%) - stosunek 0,22 mol / L białka rozpuszczalnego w TCA do
całkowitego białka w supernatancie mieszaniny reakcyjnej.
Elektroforeza SåS:

pÊ metodą *
 (1970) na żelu poliakrylamidowym dodecylo siarczanu.
pÊ System przerywany - nakładano kolejno 4% i 10% żel poliakryloamidowy.
pÊ ´atężenie prądu 40mA.
pÊ Próbki (1 mg / ml białka), rozpuszcza się w Tris / Gly buforu (pH 6,8) zawierającego
20g / l SåS i 50 g / l 2-merkaptoetanolu.
pÊ Po elektroforezie żele barwiono 0,2%
CoomassieBrilliant Blue R-250 (10% (v / v) kwasu octowego

„dbarwienie próby kationu rodnika ABTS

pÊ â0µl próby zawierającej stężeniem 0,5; 0,75; 1,5 i 1 mg / ml białka;

pÊ åodanie â ml rozcieńczonego ABTS+*;
pÊ ·ierzenie absorbancji przy długości fali 7â4nm;
Siła redukująca

×Ê mililitr hydrolizatu białka (1,5 mg / ml) miesza się z 2,5 ml 0,2 mol / l buforu fosforanowego
(pH 6,6) i 2,5 ml 1% żelazocyjanianem oraz mieszaniny inkubuje się w temperaturze 50°C;

×Ê Po 20 min inkubacji dodaje się 2,5 ml 10% A P, a następnie odwirowuje;

 ×Ê ]zyskany supernatant (2,5 ml) rozcieńcza się wodą (2,5 ml) dodaje chlorku żelaza 0,1% (0,5
ml);

×Ê Pomiar absorbancji 700 nm. Wzrost wartości absorbancji mieszaniny reakcyjnej oznacza
wzrost właściwości redukcyjnych ë 
.

Analiza działania hamującego angiotensynę.

×Ê 60 mikrolitrów hydrolizatu próbki inkubowano w temperaturze â7ºC przez 80min z 80µl

mieszaniny hipurowo-His-Leu w 0,2 mol / L buforze fosforanu potasu zawierającego â00
mmol / l ´aCl przy pH 8,â i 10µl roztworu ACE;

×Ê Wydzielany kwas hipurowy z hipuro-His-Leu przez ACE ekstrahowano z 1,5 ml octanu etylu;

×Ê Warstwę octanu etylu (1 ml) zebrano, odparowano

i kwas hipurowy rozpuszczono w âml wody destylowanej;

×Ê Absorbancja została określona na 228nm.

ST„PIEŃ HYåR„LIZY (åH):

Alkalaza: åH = 5â,2â ± 0,7%;

Flavourzyme : åH =â7,17 ± 1,05%;

×Ê Wzrost stopnia hydrolizy oznacza wyższą aktywność proteolityczną Alkalazy w porównaniu

do Flavourzyme.

×Ê Zastosowanie Alkalazy, a następnie Flavourzyme spowodowało końcowy wzrost åH do 69,29

± 0,9%.

Właściwości przeciwutleniające hydrolizatów Pu„C PI (PI- izolat białkowy)

×Ê „cena poprzez pomiar aktywności zmiatania rodników;

×Ê Badanie hydrolizatów alkalazyi flavourzyme w różnych åH.

1.Ê Zdolność zmiatania rodników

×Ê Zdolność substancji do zachowywania się jak donory elektronów lub atomów wodoru w
zetknięciu z rodnikiem ABTS+;

×Ê RSA dla hydrolizatem zależne od Troloxu;

×Ê Analizowane hydrolizaty wykazują zdolność zmiatania rodników;

×Ê RSA hydrolizatów wzrasta wraz ze wzrostem åH;

×Ê Hydrolizaty alkalazy wykazują ok. 2-ârazy większe RSA niż hydrolizaty flavurzyme;

×Ê Podczas hydrolizy enzymów największe RSA dla hydrolizatów o najwyższym åH;

 ×Ê Hydrolizaty z mieszaniny alkalazyi flavourzyme ʹ niższe RSA niż tylko dla hydrolizatów
alkalazy;

2. Siła redukująca

×Ê est miarą zdolności przeciwutleniaczy do działania jako czynniki redukujące w reakcjach

redox;

×Ê ]żywana do pomiaru zdolności hydrolizatów białkowych do redukcji Fe2+ do Feâ+.

Ad 2.

pÊ Zależność siły redukującej od åH

pÊ åla hydrolizatów alkalazy wzrost siły redukującej wraz ze wzrostem åH do 40%;
pÊ Przy dalszym wzroście åH spadek siły redukującej.
pÊ åla hydrolizatów flavourzyme spadek siły redukującej.
pÊ Połaczenie obu hydrolizatów nie ma wpływu na zmianę siły redukującej.
pÊ ´iskie wartości siły redukującej wszystkich próbek hydrolizatów;
pÊ Powód ʹ niskie stężenie białek w próbach hydrolizatów.
Ad. 2 ʹ analiza wyników

×Ê Flavourzyme nie jest odpowiedni do poprawy siły redukującej Pu„C PI.

×Ê Alkalaza ma dodatni wpływ na wzrost siły redukującej badanych związków.

×Ê Siła redukująca nie zawsze jest powiązana ze wzrostem właściwości zmiatania rodników.

â. åziałanie hamujące angiotensynę

pÊ „kreślane dla poszczególnych enzymów oraz ich kombinacji.

pÊ ´iezhydrolizowane Pu„C PI oraz hydrolizaty flavourzyme nie wykazują zdolności hamujących
ACE.
pÊ Zdolność inhibicyjna ACE dla hydrolizatów alkalazy wzrasta wraz ze wzrostem åH.
Ad. â ʹ analiza wyników
pÊ Produkcja peptydów inhibitujących ACE podczas hydrolizy Pu„C PI przez alkalazę.
pÊ Peptydy te nie są produkowane przy hydrolizie flavourzyme.
pÊ åziałanie hamujące ACE badanych hydrolizatów zależy od typu enzymu.


è  P


pÊ Alkalaza jest enzymem bardziej efektywnym i bardziej odpowiednim do produkcji

bioaktywnych hydrolizatów białek.
pÊ ·a dobre właściwości zmiatania wolnych rodników oraz inhibitorów ACE.
pÊ est enzymem, który może mieć duży udział w dalszym rozwoju bioprocesów.
pÊ onieczne są dalsze badania w celu wyselekcjonowania peptydów
w hydrolizatach Pu„C PI.
 ü Ê 
 


A: Charakterystyka ' ´ 

  uzyskanej z handlowego lateksu papai

pÊ lasahydrolaz (EC â.2.1.52)Ê

pÊ Egzoenzym
pÊ Hydrolizuje '

z uwolnieniem ´-acetyloglukozoaminy (Glc´Ac) i ´-
acetylogalaktozoaminy (Gal´Ac)
pÊ '  
 ' P P
 M 

M

 

M  ë   

M   

pÊ ·ikroorganizmy, rośliny, łzy zwierząt

pÊ ]czestniczą w przemianach glikoprotein w kiełkujących nasionach, metabolizmie ´-glikanów
w czasie dojrzewania owoców jabłoni
pÊ ´iektóre roślinne ɴ-´AHAs są zdolne do degradowania chityny
pÊ Składnik systemu obronnościowego roślin przed patogenami
·ATERIAŁY I ·ET„åY:

ƒÊ * ʹ cytoplazma wysoko wyspecjalizowanych komórek, powstałych na drodze

jednokrotnej hydrolizy przyległych ścian i rozprowadzana po roślinie przez system
przewodzący. Związany z białkami odpornościowymi takimi jak: chitozyna, ɴ-1,â-glukanaza,
hevamina, heveina

ƒÊ Lateks uzyskany z papai (Caricapapaya) jest formą mulipleksową składającą się z

chemopapainy A, peroksydazy, peptydazy A i chitynazy

Co uzyskano?

pÊ 60-100% aktywności w M 
; w pH=6 gwałtowna inaktywacja; optymalne pH 5

pÊ 80-100% max aktywności w temp. 

pÊ M
M 
pÊ   ëMMë P

üü
  ü ü
ÊÊ
Ê


 

ƒÊ Enzym jest specyficzny dla łańcuchów glukozowych w konfiguracji '

ƒÊ ë   
  ë
   ëM   

ƒÊ P    


  Më  

ƒÊ PM
ë  

     
 M M
 
 M M 
     
 ë

 

ëM
  

   M   M 

 
 ë
 
 ! 

M  

MM
 â Ê    

APrzeciwgrzybicze działanie flawonoidów naturalnych i modyfikowanych enzymatycznie

wyizolowanych z owoców cytrusowych.

ßÊ Flawonoidy - metabolity wtórne powszechnie występujące w roślinach.

ßÊ Polifenole, element strukturalny: jednostka diarylopropanowa (C6 -Câ-C6)

öÊ lasy: różnice w budowie Câ,

öÊ Podklasy: różnice w rodzaju i umiejscowieniu pierścienia aromatycznego

Znaczenie:

pÊ immunomodulacyjne
pÊ przeciwnowotworowe
pÊ przeciwutleniające
pÊ hipoglikemiczne
pÊ przeciwgrzybicze

·ateriały i metody:

FLAW„´„IåY

pÊ ´aringina - owoce grejpfruta ʹ ekstrakcja wodą destylowaną, temp. 80C

pÊ Hesperydyna - pomarańcze ʹ ekstrakcja wodnym roztworem (w roli rozpuszczalnika), pH
10,0-10,5, temp. 70C
pÊ ´oehesperydyna - gorzkie pomarańcze ʹ ekstrakcja wodnym roztworem etanolu, temp. 25C
ßÊ ]zyskany ekstrakt jest schłodzony (krystalizacja flawonoidów). „sad
przesączany i płukany. Suszony w temp. 50C.

GRZYBY

G

 

pÊ Aspergillus parasiticus
pÊ Aspergillus flavus
pÊ Fusariumsemitectum
G

  

ßÊ è  

PRZEBIEG BAåA´IA:

pÊ Rozpuszczenie flawonoidów w å·F do jednakowego stężenia

pÊ åodatek flawonoidów do pożywki
pÊ Wprowadzenie 10ml pożywki do płytki Petriego
pÊ Zaszczepienie pleśni
pÊ „bserwacja i pomiary w ciągu 86h
pÊ Wykonanie analiz statystycznych