Metody badania czystości mikrobiologicznej

przemyśle life science

Ryszard Dziwisioski

W wielu gałęziach przemysłu określanych często wspólnym mianem „life science”

zasadniczym elementem zapewniającym jakośd produktu jest kontrola czystości
mikrobiologicznej. W niniejszej pracy omówiono przekładowe szybkie metody pozwalające
na wykrycie skażenia mikrobiologicznego. Z uwagi na różnorodnośd stosowanych technik
analitycznych, dla scharakteryzowania podstawowych fenomenów, na których są oparte
stosowane metody, opisano jedynie wybrane testy.

Pobieranie próbek
Integralnym elementem metody analitycznej jest pobieranie próbek. Z uwagi na
pochodzenie próbki można podzielid na stałe (np. próbki surowca będącego w stanie stałym),
płynne (np. próbka wody pobrana z systemu uzdatniania lub surowców płynnych), pobierane
z powierzchni, pobierane z powietrza lub innego gazu.
Powszechnie stosowane procedury laboratoryjne przewidują aseptyczne pobieranie próbek i
dostarczanie ich do miejsca przeprowadzenia analizy w ciągu 24 godzin. Próbki w tym czasie
powinny byd przechowywane w obniżonej temperaturze dla zahamowania zmian związanych
ze wzrostem mikroorganizmów.

Próbki stałe i płynne

Procedura pobierania próbek powinna byd określona, w zależności od właściwości badanego
materiału. Kluczowe znaczenie przy poborze próbek ma ich reprezentatywnośd. Jeśli próbka
analityczna składa się z wielu próbek podstawowych (np. pobieranych z wielu opakowao
jednostkowych tej samej serii produktu gotowego), należy badad każdą próbkę osobno, a
jeżeli to niemożliwe, należy zapewnid ich dokładne zmieszanie. W przypadku materiałów
niejednorodnych, takich jak sedymentujące zawiesiny lub sypkie proszki, przed pobraniem
próbki należy zmieszad materiał w całej objętości pojemnika. W przypadku kremów,
proszków sprasowanych, sztyftów itp. przed pobraniem próbki należy usunąd wierzchnią
warstwę materiału.

Próbki pobierane z powierzchni

Pobieranie próbek z powierzchni wymaga określenia nie tylko sposobu pobrania próbki, ale
także określenia wielkości i kształtu badanej powierzchni. Nie bez znaczenia jest też wybór
miejsc, z których będą pobieranie próbki, oraz właściwości takie jak np. chropowatośd,
hydrofobowośd lub hydrofilowośd powierzchni. Zgodnie z regułą najgorszego przepadku
próbki należy pobierad z takich miejsc, których zanieczyszczenia mikrobiologiczne jest
najbardziej prawdopodobne, a czyszczenie najtrudniejsze. Pobierając próbkę należy
pamiętad, że nie ma pewności, czy z badanej powierzchni pobrano wszystkie
mikroorganizmy. Wiele drobnoustrojów może byd trudnych do pobrania np. w przypadku
porowatej struktury powierzchni lub utworzenia się biofilmu.
Często stosowaną metoda jest wykonywanie wymazu za pomocą wilgotnego bawełnianego
wacika, który następnie jest umieszczane w roztworze o znanej objętości. Roztwór ten
następnie jest poddawany kolejnym operacjom, zgodnie z procedurą wybranej metody. Inną
metodą jest przyklejanie taśmy samoprzylepnej najpierw do badanej powierzchni a
następnie do pożywki agarowej wylanej na płytce.

Próbki pobierane z powietrza lub innego gazu

Źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego może byd powietrze w pomieszczeniu oraz
sprężone powietrze lub inne gazy doprowadzane do urządzeo poprzez systemy dystrybucji.
Najprostszą metodą badania powietrza w pomieszczeniu jest metoda sedymentacyjna. Płytki
z pożywką agarową są wykładane w wybranych miejscach na określony czas. Do głównej
zalety tej metody należy niski koszt, a do wad zalicza się to, że najłatwiej wyłapywane są ze
środowiska cząsteczki o najsilniejszych skłonnościach do samoistnej sedymentacji. Czas
pobierania próbek jest relatywnie długi.
Do pobierania próbek są także stosowane różnego rodzaju urządzenia, które pobierają
określoną ilośd powierza, a obecne w nim mikroorganizmy są wyłapywane zwykle na
membranie filtracyjnej, stałym podłożu agarowym wylanym na płytkę lub podłożu płynnym,
przez które powietrze jest przepuszczane. W zależności od tego czy próbka pobierana jest z
otoczenia, czy systemu dystrybucji sprężonego gazu, urządzenia są odpowiednio
wyposażone przez producentów.

Tradycyjne metody posiewów

Metody badania zanieczyszczeo mikrobiologicznych gotowych produktów są określone w
rozporządzeniu ministra zdrowia z dnia 23 grudnia 2002 r. w sprawie określenia procedur
pobierania próbek kosmetyków oraz procedur przeprowadzania badao laboratoryjnych (Dz.
U. z 2003 r. Nr 9, poz. 107). Tradycyjnie, aby wykonad zliczanie lub badanie
mikroorganizmów w danym produkcie, mikrobiolog powinien wykonad następujące
operacje:
- przygotowad, wysterylizowad, skontrolowad, przechowad podłoża,
- wykonad posiew próbki na różnych podłożach po przygotowaniu rozcieoczenia,
- inkubowad w okresie od 1-5 dni,
- zliczyd kolonie,
- przeszczepid, izolowad i zidentyfikowad kolonie.
Czas oczekiwania na wynik jest zasadniczą niedogodnością metod trakcyjnych. Ponieważ
rozporządzenie nie wskazuje obligatoryjnie metod, jakie mają byd zastosowane do kontroli
CCP, istnieje możliwośd zastosowania szybkich testów mikrobiologicznych.

Szybkie testy mikrobiologiczne

Szybkie testy mikrobiologiczne można podzielid na następujące grupy:
1. metody mikroskopowe i pochodne,
2. związane z przemianą materii,
3. oparte o reakcje immunologiczne.

Metody mikroskopowe i pochodne

Metoda Prescott’a-Breed'a
Klasyczna metoda Prescott’a-Breed’a polega na zliczaniu bakterii obserwowanych pod
mikroskopem w próbce o znanej objętości. Próbkę umieszcza się na szkiełku
przedmiotowym. Mikroorganizmy są zabarwione zwykle błękitem metylenowy. Technika ta
jest żmudna i charakteryzuje się niską czułością. Wynik liczenia jest sumą mikroorganizmów
żywych i martwych. Wynik uzyskiwany tą metoda jest znacznie wyższy od otrzymywanego
metoda posiewu.

Metoda Frost’a
Metoda Frost’a polega na wykonaniu posiewu na szkiełku przedmiotowym. Najpierw
nanoszona jest określona objętośd próbki, która następnie jest zalewana ciepłym agarem i
inkubowana od czterech do ośmiu godzin w temperaturze 37st.C, lub dwadzieścia cztery
godziny w temperaturze 24st.C. Zabarwione kolonie są zliczane pod mikroskopem.

Zautomatyzowana cytometria stacjonarna

W metodzie Direct Epifluorescent Filter Technique (DEFT) jako marker zastosowany oranż
akrydynowy, który wiąże się z DNA i RNA. Po filtracji testowanego produktu przez membranę
i zabarwieniu możemy za pomoca mikroskopu fluorescencyjnego zliczyd mikroorganizmy z
możliwością odróżnienia żywych komórek od martwych. Komórki żywe pod dzianiem UV
świecą w kolorze pomaraoczowym, a martwe – zielonym. Analiza obrazu zwiększa
możliwości tej techniki, jakkolwiek jej zastosowanie jest ograniczone do produktów, które
można poddad filtracji. Jako markera można także używad pochodnych fluoresceiny lub
przeciwciał sprzężonych z fluoresceiną.
Inna odmiana tej metody jest zastosowana w systemie MicroStar (produkt firmy Millipore)
Pojedyncze komórki są wyłapywane na membranie filtracyjnej. Po krótkiej inkubacji,
powstałe mikrokolonie są poddawane działaniu środka, który powoduje bioluminescencję w
wyniku zużywania energii zgromadzonej w ATP. System wyposażony w kamerę zlicza
mikrokolonie. Powyższa technika jest doskonała w zastosowaniu dla produktów słabo
zanieczyszczonych, możliwych do filtrowania.

Cytometria przepływowa
Mikroorganizmy zawieszone w medium przepływającym przez komorę pomiarową
przechodzą przez wiązkę świetlną i emitują sygnał fluorescencyjny, tak jak w przypadku
opisanej powyżej cytometrii stacjonarnej. Światło emitowane przez każdy mikroorganizm
jest analizowane przez detektor umożliwiający szybkie i precyzyjne zliczanie. Technika ta
została w pełni zautomatyzowana i posiada wysoką czułośd (około 100
mikroorganizmów/ml).

Metody związane z przemianą materii

Metody elektrochemiczne
Pomiar ma charakter pośredni. Rozwój mikroorganizmów stwierdza się poprzez rejestrację
zmian własności elektrochemiczne podłoża. Zmiany te wynikają z zaniku substratu lub
pojawiania się substancji wytworzonych przez mikroorganizmy.

Impedymetria
Mikroorganizmy rozkładają złożone związki, takie jak białka i wielocukry na aminokwasy,
kwasy organiczne i inne proste związki dysocjujące w roztworze. Zmiany przewodności
stwierdzone przy pomocy odpowiedniego systemu detekcji pozwalają stwierdzid obecnośd
mikroorganizmów. Jedną z mierzalnych właściwości jest impedancja, czyli opór pozorny
przewodnika określany dla prądu zmiennego. Na wielkośd impedancji składają się dwie
wartości: opór czynny (rezystancja) i opór bierny (reaktancja). Do badania podłoża
mikrobiologicznego wykorzystuje się prąd zmienny, gdyż prąd stały powodowałby hydrolizę
próbki.
W przypadku niektórych mikroorganizmów większą czułośd i szybkośd można osiągnąd
stosując impedymetrię pośrednią. Np. drożdże w warunkach tlenowych przerabiają cukier na
biomasę dwutlenek węgla i wodę z praktycznie stuprocentową wydajnością. W tym
przypadku można wykorzystad reakcję dwutlenku węgla w roztworze zasadowym. Zamiana
jonów hydroksylowych na węglanowe daje mierzalny sygnał pozwalający stwierdzid
obecnośd drobnoustrojów. Impedymetrię pośrednią stosuje się także w przypadku pożywek
o dużej przewodności.
Możliwe jest też badanie selektywne drobnoustrojów, np. badanie miana coli. Impedymetrię
stasuje się wtedy po przeprowadzeniu wzorcowania w stosunku do metody referencyjnej.
Czas potrzebny na przeprowadzenie analizy impedymetrycznej w przypadku urządzenia
Bactometer (bioMerieux, Hazelwood, Mo., U.S.A.) wynosi ok. czterech godzin. Metoda da się
w pełni zautomatyzowad.

Zmiana potencjału oksydoredukcyjnego lub pH

Rozwój mikroorganizmów powoduje zmianę potencjału oksydoredukcyjnego podłoża. Czas
jaki upływa do wykrycia tej zmiany jest odwrotnie proporcjonalny do liczby bakterii
obecnych w podłożu oraz czasu ich wzrostu. Obecnie są dostępne testy, w których wzrost
mikroorganizmów powoduje zanik fluorescencji lub zmianę barwy substancji wskaźnikowej
wrażliwej na zmianę potencjału oksydoredukcyjnego. W zależności od rodzaju sygnału
stosowane są odpowiednie detektory.
Przykładowo, Omnispec Bioactivity Monitor System (Wescor, Inc., Logan, Utah, U.S.A.)
mierzy kolorymetrycznie zmianę jakim ulega dodany barwnik pod spływem zmiany pH,
potencjału oksydoredukcyjnego lub stężenia wolnych grup aminowych. Czas
przeprowadzenia analizy dla tego urządzania waha się od dwóch do dwudziestu czterech
godzin.

Detekcja zmiany stężenia substratu lub produktu

Przekładem systemu mierzącego wielkośd emisji konkretnego produktu przemiany materii
jest urządzenie BacT/Alert Microbial Detection System (Organon Teknika, Durham, N.C.,
U.S.A.), które bada stężenie dwutlenku węgla produkowanego przez mikroorganizmy.
Urządzenie do tego celu jest wyposażone w zaawansowany technologicznie czujnik i
oprogramowanie. Czas pomiaru dla kultury E. coli może wynosid od 6 do 8 godzin.

Bioluminescencja
Adenozynotrifosforan (ATP) jest obecny w każdej żywej komórce. Detekcję ATP można
przeprowadzid wykorzystując zjawisko bioluminescencji. Efekt bioluminescencji jest
wynikiem następującej reakcji:
2
( LH2 )  ATP  O2 Mg
 P  AMP  PPi  CO2  hv
Lucyferaza katalizuje dekarboslylację oksydatywną lucyferyny ( ( LH 2 ) ), która jest
przekształcana w oksylucyferynę ( P ). Do zajścia reakcji niezbędna jest obecnośd ATP, który
ulega rozpadowi do adenozynomonofosforanu ( AMP ) i pirofosforanu ( PPi ). Reakcji
towarzyszy wydzielenie energii świetlnej. Emisja światła jest podstawą pomiaru. Wynik
pomiaru otrzymuje się po kilku minutach.
Zależnośd pomiędzy stężeniem ATP w analicie a wielkością emisji jest liniowa, ale z uwagi na
specyfikę testów higienicznych, stosowanie ATP-metrii napotyka następujące trudności:
 Różne gatunki organizmów maja różną zawartośd ATP. Np. drożdże zawierają sto razy
więcej ATP niż komórki bakteryjne.

 Komórki tego samego gatunku mają róże stężenia ATP, w zależności od fazy wzrostu.

 Na wynik pomiaru może wpływad ATP pochodzące z innych źródeł, np.

niskoprzetworzonych surowców naturalnych lub krwi i innych wydzielin
pochodzących od człowieka.

Dlatego w praktyce wielkośd emisji mierzy się w Relative Light Unit (RLU). Wartośd RLU jest
proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia np. badanej powierzchni urządzenia. Dla
większości systemów pomiarowych różnych firm są opracowane wartości akceptowalne,
nieakceptowane i marginalne RLU dla określonych aplikacji przemysłowych. Póki nie ma
ustalonych norm całkowitego stężenia ATP dopuszczalnego w konkretnych przypadkach
praktyki produkcyjnej, wartości RLU są ustalane zupełnie dowolnie.
Dużą zaletą ATP-metrii jest prostota przeprowadzenia testu i możliwośd uzyskania wyników
w ciągu pięciu minut.

Wykorzystanie reakcji immunologicznych

Reakcja pomiędzy przeciwciałem i antygenem może byd wykorzystywana do detekcji
wszystkich substancji o charakterze antygenu, a wiec nie tylko elementów żywych komórek,
ale także do wykrywania toksyn, alergenów antybiotyków i innych substancji, których
obecnośd w produkcie jest niepożądana. Reakcje immunolgiczne są wykorzystywane między
innymi w testach ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), testach RIA (radio immuno
assay), separacji immunomagnetycznej, czy jako elementy markerów fluorescencyjnych
stosowanych w cytometrii. Metody oparte o powinowactwo przeciwciała do antygenu
charakteryzują się dużą specyficznością.
ELISA jest metoda opartą na zjawisku wiązania określonych związków przez przeciwciała oraz
reakcji enzymatycznych z udziałem zawiązków połączonych z tymi przeciwciałami. Enzymy
związane z przeciwciałami lub antygenami pełnią rolę markerów. Jest wiele odmian testów
ELISA. Większośd z nich bazuje na reakcji przeciwciał zaadsorbowanych na stałym podłożu.
Stosuje się wtedy płytki z miniaturowymi probówkami. Przykładowy schemat realizacji testu
ELISA jest następujący:
1. Nanieśd próbkę, będącą w postaci roztworu, na powierzchnię pokrytą przeciwciałami,
które wiążą antygen z próbki.

2. Spłukad powierzchnię, w celu usunięcia pozostałości próbki z niewiązanym

antygenem.

3. Dozowad przeciwciała z przyłączonymi cząstkami enzymu. Przeciwciała przyłączą się

do cząstek antygenu zaadosbowanych na powierzchni.
 4. Spłukad z powierzchni pozostałości niezwiązanych przeciwciał.

5. Zadozowad substancję, która jest przekształcana przez enzym w reakcji barwnej.

Firmy diagnostyczne oferują zestawy do wykrywania typowych patogenów. Są dostępne

także systemy do całkowicie automatycznej realizacji testów. W zależności od
zastosowanych markerów, zwykle stosuje się pomiar kolorymetryczny lub fluorescencyjny.
System VIDAS (bioMerieux, Hazelwood, Mo., U.S.A.) wykonuje automatycznie analizę,
zależnie od zestawu, w czasie od czterdziestu pięciu minut do dwóch godzin.

Separacja imminomagnetyczna
Separacja imminomagnetyczna ma na celu wydzielenie cząstek o charakterze antygenu z
mieszaniny. Wydzielony materiał można poddad dalszej obróbce.
W metodzie tej przeciwciała są nanoszone na małe cząstki metalu o właściwościach
magnetycznych. Cząstki z naniesionymi przeciwciałami są dodawane do roztworu
zawierającego antygen. Po zajściu reakcji przeciwciał z antygenem, naczynie z mieszaniną
jest umieszczane w silnym polu magnetycznym, które zatrzymuje na ściance naczynia cząstki
metalu wraz z zaadsorbowanymi molekułami. Wtedy pozostałe cząstki są wypłukiwane z
naczynia. Po wyłączeniu pola magnetycznego cząstki antygenu powracają do roztworu.

PCR
PCR (polymerase chain reaction) umożliwia wybiórczą amplifikację określonego fragmentu
DNA. Żeby zrealizowad procedurę, trzeba dysponowad starterami, czyli fragmenty
jednoniciowego DNA o długości od 20 do 30 nukleotydów, które są zdolne do wiązania się z
koocami fragmentu DNA, który ma byd amplifikowany. Żeby metoda była specyficzna, kod
startera musi byd specyficzny dla poszukiwanego organizmu. Etapy cyklu reakcji PCR są
następujace:
1. Rozłożenie podwójnej nici DNA w 95st.C.

2. Dodanie starterów do roztworu i obniżenie temperatury do 40-60st.C, aby startery

mogły się przyłączyd do badanych nici DNA.

3. Podwyższenie temperatury do temperatury 72st.C, w której polimeraza syntetyzuje

fragment DNA, poczynając od dwuniciowego fragmentu utworzonego przez starter i
badany odcinek.

4. Podniesienie temperatur do 95st.C w celu powtórzenia cyklu.

Po zakooczeniu pierwszego cyklu zamiast jednej kopii DNA mamy dwie, ale po powtórzeniu
procedury dwadzieścia jeden razy mamy już milion kopii badanego odcinaka DNA. Proces
powielania wybranego fragmentu DNA jest realizowany wielokrotnie, aż do momentu, gdy
stężenie powielanych odcinków kwasu dezoksyrybonukleinowego pozwala na ich detekcję
np. metodą elektroforezy. Przy wykorzystaniu automatycznych urządzeo, czas potrzebny na
amplifikację jest rzędu jednej godziny.
Biosensory
Biosensor jest to kompleks cząstek pochodzenia biologicznego osadzonych na materiale
pozwalającym na uzyskanie sygnału, gdy biosensor wejdzie w kontakt z analitem. Obecnie
opracowano wiele biosensorów, w których wykorzystuje się enzymy, przeciwciała, kwasy
nukleinowe, cale komórki itd. Biosensory, wykorzystujące znane i częściowo wymienione
powyżej techniki analityczne, mogą dawad odpowiedź w ciągu kilku minut, jednak z uwagi na
czułośd może byd potrzebne zastosowanie PCR, separacji immunomagnetycznej lub innej
techniki w celu zwiększenia stężenia badanych cząstek w analicie. Wykorzystanie na szeroką
skalę biosesorów do kontroli jakości w warunkach przemysłowych pozostaje ciągle kwestią
przyszłości.

Podsumowanie
Szybkie testy mikrobiologiczne pozwalają na stworzenie efektywnego systemu monitoringu
dzięki:
 możliwości wykonywania dużej liczby analiz w krótkim czasie,

 stosowaniu systemów mniejszych i taoszych w eksploatacji niż całe laboratorium

mikrobiologiczne,

 prostocie wykonania testów.

Szybkie testy, takie jak ATP-metria lub testy z wykorzystaniem reakcji immunologicznych,
pozwalają na uzyskanie wyników podczas realizacji procesu. Niektóre szybkie metody, takie
jak cytometria, umożliwiają wykrywanie mikroorganizmów nie tworzących kolonii, a wiec
niewykrywalnych metodami posiewu. Szybkie testy, takie jak ELISA, pozwalają wykrywad nie
tylko mikroorganizmy, ale także substancje niepożądane. Takie testy, jak ELISA wykraczają
poza granice kontroli mikrobiologicznej i stają się elementem wszechstronnej kontroli jakości
produktu. Z drugiej strony testy ELISA pozwalają na wykrycie jedynie związków, dla których
zostały zaprojektowane, z uwagi na dużą selektywnośd.
Trudności w stosowaniu szybkich metod są związane z koniecznością właściwej interpretacji
wyników. Przykładem może ATP-metria, która jest uznaną metoda badania ogólnej czystości
np. powierzchni urządzenia lub wody procesowej. Chociaż zależnośd między wynikiem
otrzymanym w RLU (Relative Light Unit), a ilością CFU (Colony Forming Unit) w jednostce
objętości jest liniowa, to brak specyficzności uniemożliwia jednoznaczną interpretację
wyników w przypadku mieszaniny zanieczyszczeo zawierając ATP.
Wybór metody analitycznej powinien byd przeprowadzany w powiązaniu z analizą zagrożeo i
wyborem krytycznych punktów kontrolnych (CCP). Wybór metody zależy od rodzaju
badanego medium lub powierzchni, wymaganego progu detekcji oraz czynników
chemicznych lub biologicznych obecnych w próbce. Metoda analityczna powinna byd
dostosowana do CCP, tak by analiza była wiarygodna. W przeciwnym razie należy
wprowadzid taką zmianę w technologii lub urządzeniu, żeby kontrola w CCP była wykonalna
lub CCP stał się niepotrzebny.
Szybkie testy mikrobiologiczne nie wyprą tradycyjnych metod badao, póki świat nauki nie
uzna ich za bardziej wiarygodne, a organy paostwowe sprawujące nadzór nad produkcją nie
wprowadzą ich jako obligatoryjnych metod badania jakości, w zastępstwie metod
tradycyjnych.
Bibliografia
1. Aantrekker Esther D. den, Recontamination in food processing – quantitative modeling
for risk assessment, Uniwersytet Wageningen, Holandia, 2002;
2. Burianka Maria, Pliszka Anna, Janczura Ewa, Teisseyre Teresa, Załęska Helena,
Mikrobiologia żywności. Mikrobiologiczne metody badania produktów żywnościowych.
PZWL, 1971;
3. Dostálek Pavel, Brányik Tomáš, Prospects for Rapid Bioluminescent Detection Methods in
the Food Industry – a Review, 2005,
http://www.cazv.cz/attachments/1-Dostalek.pdf;
4. Fung Daniel Y.C. Rapid methods and automation in microbiology. Comprehensive Reviews
in Food Science and Food Safety, 2002,
http://members.ift.org/NR/rdonlyres/F13F34EA-B9FF-43A7-ADBC-
94E9B48F1D6E/0/crfsfsv01n1p003022ms20001206.pdf;
5. International Society for Pharmaceutical Engineering (ISPE), Tampa, FL, USA, ISPE
Baseline Guide: Volume 5 - Commissioning and Qualification;
6. Komisja SFSTP pod przewodnictwem E. Petat, Alternatywne metody kontroli
mikrobiologicznej. Prezentacja szybkich technik. Raport Komisji SFSTP. Pharmaceutica nr
10, 2004;
7. U. S. Food and Drug Administration, U. S. Department of Agriculture, National Advisory
Committee on Microbiological Criteria for Foods, Hazard Analysis and Critical Control
Point Principles and Application Guidelines, 1997,
http://vm.cfsan.fda.gov/~comm/nacmcfp.html.