UNIVERSIDAD CATÓLICA DE OCCIDENTE

FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

TEMA:

“METODOLOGÍA DE MICROPROPAGACIÓN DE SEGMENTOS NODALES DE

CEDRO (Cedrela odorata L.) Y CAOBA (Swietenia humilis), OBTENIDOS A PARTIR
DE SEMILLA SELECCIONADA, ESTABLECIDOS BAJO CONDICIONES DE
LABORATORIO DE LA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE OCCIDENTE”

AVANCES

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

SANTA ANA, AGOSTO DE 2006

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INTRODUCCIÓN

En nuestro país pocas especies forestales han sido objeto de programas de

domesticación, siendo en su mayoría especies silvestres con un alto porcentaje de
variabilidad genética, situación que tampoco ha sido comprobada debido a la ausencia de
estudios detallados. Estos estudios son demorosos debido a los largos períodos de vida y
gran tamaño de estas especies, y por tanto, el mejoramiento genético resulta complicado,
en comparación con los cultivos agrícolas, con los que además se obtienen rendimientos
económicos en corto tiempo.

Como alterantiva a estas situaciones, la microporpagación ofrece numerosas ventajas con

respecto a la propagación masiva de árboles catalogados como élite, acortando de sobre
manera los ciclos de reproducción que en condiciones de campo tomarían años.

Por esta situación, en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales se han introducido

recientemente dos especies de meliáceas de gran interés comercial como son el cedro
(Cedrela odorata) y la caoba (Swetenia humilis), siendo esta última nativa de la costa
tropical del pacífico, y especialmente de nuestro país.

La investigación consiste en establecer, mediante la técnica de cultivo de tejidos

vegetales, material de ambas especies, recolectado y certificado por CEDEFOR (Centro
de Desarrollo Forestal), para luego ser multiplicado, enraizado y aclimatado según las
condiciones más adecuadas. En base a los mejores procedimientos encontrados se
procederá a establecer los protocolos más idóneos para nuestras condiciones.
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1. PROBLEMÁTICA

En El Salvador, la cobertura de los bosques naturales, se vio reducida por la introducción

de los cultivos de café, algodón, caña de azúcar y cría de ganado, utilizando para ello
zonas de diversidad biológica altamente pobladas y fértiles. Actualmente, el área de
cobertura de bosques naturales ha bajado al 2% del área del país, considerando que una
buena parte está constituida por los manglares (bosques salados) ubicados en los
márgenes de los esteros. Si a esto se añaden plantaciones de café bajo sombra, la
cobertura de bosques se incrementaría a un 12% del territorio nacional, y aún así, sería
uno de los más bajos del mundo (SALVANATURA, 2003).

Esta problemática está provocando tanto en nuestro país como a nivel mundial, daños
irreparables en los bosques (113 millones de Ha de bosques tropicales deforestados por
año), y la desaparición de muchas especies, entre ellas las meliáceas Cedro (Cedrela
odorata L.) y Caoba (Swietenia humilis) (Muñoz, 2003), las cuales son unas especies muy
cotizadas por sus usos en construcción, carpintería y ebanistería fina (MAG, 2004). Sin
embargo, también existen problemas de propagación de estas meliáceas, por ejemplo su
corta área de dispersión de semillas (FAO, 1974) y el ataque del lepidóptero Hypsipyla
grandella (Zeller).

2. ANTECEDENTES

Anteriormente se ha trabajado con métodos convencionales para la propagación de

especies forestales con potencial comercial, tal es el caso de cedro y caoba; sin embargo,
todos se basan en manejo de campo desde la germinación continuando con las sucesivas
etapas de la vida de los árboles, encontrándose problemas de bajo potencial germinativo
de semilla (de 1764 semillas/kg de cedro 530 se consideran útiles; en caoba, de 33000
semillas/Kg 9900 se consideran útiles) (CEDEFOR, 2005). Además, frecuentemente se
presentan inconvenientes en cuanto a uniformidad genética y disponibilidad de cantidades
de semilla adecuadas para establecer una plantación comercial. (Guevara, 1996/cit. por
Orellana, 1997). Otro problema muy importante en el mejoramiento genético de forestales
se debe principalmente al largo ciclo de las especies leñosas desde la siembra de la
semilla hasta la floración (Roca y Mroginski, 1991). Para el caso, el tiempo de
germinación con el método tradicional sucede en un mínimo de 20 días; en cambio,
mediante la técnica de cultivos in vitro es en un máximo de dos semanas.

La propagación vegetativa ha tenido un papel importante en la multiplicación de árboles

“élite” (Ivanova, 1981/Cit. por Roca y Mroginski, 1991), con lo cual la micropropagación ha
demostrado ser una importante alternativa para la solución de algunos de los problemas
anteriormente expuestos. El método de diferenciación de brotes adventicios es más
común que la embriogénesis somática, y tiene mayor potencialidad para una propagación
masiva que el estímulo de las yemas axilares.
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El explante es extremadamente importante para la regeneración de especies leñosas; su
influencia en el desarrollo in vitro se ha demostrado (Villalobos et al., 1984/Cit. por Roca y
Mroginski). La edad del explante es un factor crítico en las especies maderables; en
general, la micropropagación es relativamente fácil empleando tejidos juveniles. Sin
embargo, aunque se haya delimitado la edad del material, el mejor explante se tiene que
determinar experimentalmente según la especie; los explantes más comunes en
coníferas, por ejemplo, han sido los embriones, partes de plántulas, cotiledones, y los
hipocótilos provenientes de semillas germinadas asépticamente.

3. JUSTIFICACIÓN

La biotecnología es una alternativa muy importante para regenerar y multiplicar las

especies forestales que de otra manera sería difícil y lento el proceso de regeneración.
Además, se permitiría extraer controladamente la madera para sus múltiples usos, así
como para reforestación de las áreas críticas, con plantas uniformemente genéticas.

La ruta mayormente utilizada para la regeneración in vitro de especies arbóreas (mediante

alargamiento de brotes axilares), es un proceso consistente en cuatro pasos:
 Establecimiento del cultivo y/o inducción de brotes
 Desarrollo y multiplicación de los brotes
 Enraizamiento de los brotes desarrollados
 Aclimatación en vivero (Torpe et al, 1991).

Los primeros trabajos de cultivo de tejidos en Cedro se iniciaron en 1989 por Ishii y
Maruyama, mediante el uso de ápices lograron obtener gran cantidad de plántulas. En
1997 se obtuvo semilla artificial de Cedro, encapsulando los ápices obtenidos por
micropropagación (Maruyama et al 1997/Cit. por Muñoz, 2003). En el informe se
menciona que la embriogénesis somática es la técnica apropiada para la rápida
micropropagación a gran escala y para la tecnología de semilla artificial, no obstante, esta
técnica no puede ser usada en muchas especies, en que la embriogénesis somática no
ha sido producida, incluyendo al Cedro.

En Caoba (S. Macrophylla) se ha desarrollado el primer sistema de multiplicación a partir

de microestacas de plántulas germinadas in vitro (Orellana, 1997).

En general los explantes juveniles como los embriones cigóticos, cotiledones, hipocótilos
o yemas de plántulas y hojas juveniles tienen mejor respuesta al cultivo in vitro que otros
tejidos de árboles adultos (Ahuja, 1993/Cit. por Orellana, 1997). Por esta razón, los
explantes juveniles han sido exitosamente empleados para la clonación forestal.
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4. OBJETIVOS

Objetivo general
Desarrollar una metodología de regeneración de material vegetal de las meliáceas: Cedro
(Cedrela odorata L.) y Caoba (Swietenia humilis) mediante cultivo de microestacas
regeneradas a partir de semilla seleccionada.

Objetivos específicos
 Establecer los cultivos mediante las yemas cotiledonales (cedro y caoba) y yemas
de escamas foliares (caoba).
 Establecer el nivel de citoquininas más apropiado para la fase de multiplicación.
 Inducción del enraizamiento de las plantas regeneradas por cultivo de tejidos y su
posterior transferencia a la fase de aclimatación.
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5. MARCO TEÓRICO

5.1 Ventajas de la propagación In Vitro de forestales

Dentro de las especies leñosas, las más extensivamente estudiadas en los últimos años
han sido las forestales, especialmente los maderables por su gran valor comercial (Roca y
Mroginski, 1991; Muñoz, 2003; Pérez et al., 2004).

Los programas de mejoramiento genético tradicionales en especies forestales no han

tenido repercusiones trascendentales en la urgente necesidad de reforestación o de
acortar el tiempo de obtener rentabilidad en las producciones comerciales, debido
principalmente al largo ciclo de estas especies desde la siembra de la semilla hasta la
floración. Las técnicas de micropropagación han demostrado ser una importante
alternativa para la solución de algunos de los problemas anteriormente referidos.

El método de diferenciación de brotes adventicios es más común que la embriogénesis

somática, y tiene mayor potencialidad para una propagación masiva que el estímulo de
las yemas axilares. Actualmente son pocos los antecedentes que muestren un éxito de la
embriogénesis somática en especies forestales (Roca y Mroginski, 1991).

Para fines de propagación, se prefiere producir brotes directamente del explante, ya que a
partir de callos su formación ha sido muy difícil y frecuentemente genera anormalidades.
En la diferenciación de brotes adventicios existe una interrelación entre el explante, el
medio y las condiciones ambientales de cultivo.

Según varios autores (Villalobos et al, 1984; Bonga, 1982), la edad del explante en el
desarrollo In Vitro es importante y crítico para las especies maderables; se dice que en
general, la micropropagación es relativamente fácil empleando tejidos juveniles, y es
progresivamente más difícil con tejidos adolescentes y maduros; sin embargo, es
necesario determinar esta situación a nivel experimental según cada especie; por ejemplo
los explantes más comunes en coníferas, han sido los embriones, partes de plántulas, los
cotiledones, y los hipocótilos provenientes de semillas germinadas asépticamente. La
misma situación se ha empleado en otras especies leñosas como Quercus acutissima
(Shoyama et al, 1992), Pinus contorta (Flygh et al, 1993), etc.

5.2 Medios de Cultivo In Vitro para la micropropagación de forestales

Los componentes de los medios de cultivo también han sido objeto de diversos estudios.
Generalmente se agrupan en cinco clases de compuestos: a) macro y microelementos; b)
fuentes de carbono, generalmente sacarosa; c) vitaminas; d) nitrógeno reducido, y e)
reguladores de crecimiento. El regulador de crecimiento clave en la formación de brotes
es la Kinetina; sin embargo, las auxinas en bajas concentraciones han tenido respuesta
en algunas especies (Roca y Mroginski, 1991).

Según Thorpe (1991), los medios de cultivo más frecuentemente usados para la
producción de brotes en angiospermas son WP y MS suplementados con BAP. Al cambiar
los nutrientes del medio de cultivo se puede alterar el porcentaje de explantes que formen
brotes adventicios o vástagos (Perece J., 1995/Cit. por Muñoz, 2003).
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En el caso de Cedrela odorata, Ishii & Maruyama (1992), confirmaron la producción de
múltiples brotes usando el medio WP suplementado exclusivamente con BAP (2mg/L).

6. METODOLOGÍA

La semilla ingresó el 6 de enero de 2006, procedentes de CEDEFOR y la vía de

regeneración ha sido la organogénesis directa. (Figura 1a y 1b).

La semilla se escarificó manualmente, la desinfección del explante se hizo con lejía

comercial (5.1%) al 50% v/v por 15 min, 3 enjuagues en cámara con agua estéril. (Figura
1c). Una vez desinfectada la semilla, se procedió a la siembra en tubos de ensayo los
cuales contenían un medio de agua destilada, 3% sacarosa, 0.65% de agar, y se ajustó a
un pH de 5.7, sin reguladores de crecimiento.

En cuanto a las condiciones de incubación, fueron oscuridad y alta temperatura (30°C

ideal) mientras comienza la germinación (Figura 1d); posteriormente, condiciones
normales para el laboratorio de la UNICO, el cual es un fotoperíodo de 16 horas luz y 8 de
oscuridad con 1350 lux de intensidad, con temperaturas entre 25° – 30°C . La alta
temperatura es necesaria para lograr la germinación (ideal 30°C). En este caso se
pusieron a germinar en condiciones de oscuridad, lo cual no es tan necesario para cedro,
puesto que se destaparon al mismo tiempo que las plantas de caoba (a los diez días
después de la siembra), y en ese momento estaban demasiado elongadas y delgadas,
por tanto, la altura no se ha considerado como aspecto evaluado.

Luego de 25 días de uniformizada la germinación en caoba, las plantas estuvieron listas

para el corte (Figura 1e), para luego ser sembrados en el medio de cultivo de
establecimiento, el cual contenía, sales minerales, y vitaminas MS (Murashige y Skoog,
1962), con 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar y 2.2 mM de 2-ip (6 –y, y – dimethylamino
purina); el pH fue ajustado a 5.7, aplicando 30 mL a cada frasco de 200 mL de volumen.

En cedro, la germinación se completó en aproximadamente un mes y medio, por esperar

el desarrollo de hojas verdaderas. En este caso, el medio inicial consistió del medio MS
con macro y microsales a la mitad, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar y 2.46 mM de 2-ip (6
–y, y – dimethylamino purina); pH 5.7, a razón de 30 mL por frasco.

Explantes utilizados para el establecimiento:

En caoba se utilizaron yemas de escamas foliares (Anexo 1a), las cuales son hojas
rudimentarias que protegen la yema existente en la axila y que se forma con el eje
embrionario de las plántulas de caoba (Alvarenga y Flores, 1998/Cit. por Orellana, 1997) y
la otra parte utilizada fue la yema del nudo cotiledonar (Anexo 1b). Los explantes
cotiledonares se cortaron a un centímetro del nudo cotiledonar, a nivel de las raíces
también fueron cortados con todo y cotiledones.
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Para el caso de cedro se tomaron explantes del nudo cotiledonar de aproximadamente 2
cm. y se colocaron verticalmente en el medio de cultivo.

a) b)

c) d)

e) f)
Figura 1. Descripción del proceso de introducción y germinación de semilla de cedro (Cedrela odorata L.) y
caoba (Swietenia humilis), proveniente de CEDEFOR, al laboratorio de la Universidad Católica de
Occidente, 1a) Semilla de caoba con y sin escarificación, 1b) semilla de cedro con y sin escarificación, 1c)
proceso de desinfección de la semilla en cámara de flujo laminar, 1d) frascos tapados con papel aluminio
inoculados con las semillas, 1e) semilla de caoba germinada, 1f) semilla de cedro germinada.
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7. RESULTADOS

Fase de germinación

Caoba:

Al final de 25 días de fase de germinación se tiene un porcentaje de plantas aptas para

corte (con hojas verdaderas y mayores de 4 cm), de 41.7 %; habiendo germinado las
primeras plántulas a los 5 días después de la siembra. El porcentaje de contaminación
total fue del 25%; del cual un 60 % fue por hongos y 40% por bacterias. Esto se puede
atribuir a la asociación de las semillas de especies forestales tropicales con numerosos
microorganismos, que de manera natural ayudan a los procesos de germinación, pero que
representan un factor limitante para los trabajos in vitro (Castro, 2001, Cit. por Pérez et.
al., 2004).

La altura promedio de las plantas para corte fue de 13.9 cm., con un número promedio de
3.44 explantes/planta útiles para corte (área de cotiledones con 2, 3, ó 4 yemas de
escamas foliares).

Cedro:

Luego de un mes y dos semanas se completó la germinación; la aparición del primer par
de hojas verdaderas fue más lento que para caoba; sin embargo, el inicio de la
germinación fue simultáneo. El porcentaje de plántulas útiles para corte fue del 84.6 %. El
porcentaje de contaminación total fue del 5.8 %, siendo por hongos.

Fase de iniciación (establecimiento)

Caoba:

Existen diferencias altamente significativas (p<0.01) entre el empleo de yemas

cotiledonales y yemas axilares para la producción de explantes; siendo mucho mayor la
cantidad de brotes producidos por vía yema cotiledonar con cotiledones (Figura 2a). Esto
se asemeja a lo que Orellana (1997) expuso para Swietenia macrophylla. Esto lo explicó
mediante un estudio histológico de las diferentes fuentes explante del eje embrionario, en
el que los explantes de la escama foliar y eofoliar solo presentan una yema, y su estado
de desarrollo depende de su proximidad al ápice del eje embrionario; contrariamente, en
el nudo cotiledonar es posible observar al menos dos yemas. En Anexo 2 se puede
observar una tabla de medias de cada una de las variables evaluadas.

La altura de los brotes regenerados también presenta diferencias altamente significativas

(p<0.01), con respecto a la fuente del explante, siendo de un elevado valor al emplear
explantes provenientes de yemas cotiledonales (Figura 2b)

El análisis de regresión indica que existe relación directa (p<0.01), entre el número
promedio de brotes y la altura alcanzada por los mismos, siendo como se mencionó
anteriormente, mayor el número promedio de brotes y su altura en los originados por
yemas cotiledonales.
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Por otra parte, el tiempo de brotación entre ambos tratamientos (fuentes de explantes), no
presentó diferencias estadísticamente significativas (p<0.01); encontrando que la mayor
parte de explantes presentó indicios de brotación al día 5 después de siembra en el medio
de cultivo inicial; sin embargo, mostraron mejor condición de regeneración los brotes de
yemas cotiledonales (Figura 2c).

No. de brotes

8 a a
a
7 a a a a
6
5 Yemas cot.
4 b b b b
3 Yemas foliares
a b b b
2 b b
1 b
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
a)

Altura de brotes (cm)

10.0 a
a
8.0 a
a
a
6.0 a a
a Yemas cot.
4.0 Yemas foliares

2.0 b
b b b b b b b
b ab
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
b)
Días a brotación
b b

9
b
0

7 b b
% de brotación

7
b b

5
b b b b b

b
b

3
b b b

0 5 10 15 20 25
Yemas cot. Yemas foliares Días
c)
Figura 2. a) Número de brotes, b) altura de brotes (cm) y c) días a brotación, provenientes de
yemas cotiledonales y axilares, obtenidos al final de la fase de establecimiento in vitro de
Caoba (Swetenia humilis). La significancia estadística se evaluó al 1%.
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Cedro:

En este caso no se han realizado comparaciones entre distintos tipos de explantes, ya

que según estudios en esta especie (Pérez et al, 2004), el explante ideal resulta ser
solamente el nudo cotiledonar debido a la estructura de la planta. Por tanto, los análisis
estadísticos al respecto serán al final de la fase de multiplicación.

8. LITERATURA CITADA

✔ MUÑOZ, T., S. 2003. Embriogénesis Somática en Cedro (Cederla Odorata

Linnaeus) a partir de Cotiledones. Tesis Biol. Universidad Nacional Agraria de la
Molina. Lima, Perú.

✔ MURASHIGE, T. y SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497.

✔ ORELLANA, M. 1997. Desarrollo de un sistema de cultivo In vitro para los

explantes nodales de Caoba (Swietenia marcrophylla. King). Tesis Mag. Sc.
Turrialba, Costa Rica. CATIE. 85 p.

✔ PÉREZ, J., MESÉN, F., HILJE, L., AGUILAR, M.E. 2004. Desarrollo de un método
de micropropagación aplicable a genotipos selectos de Cederla odorata L. Revista
Forestal Centroamericana, San José, C.R.

✔ ROCA, W.M. y MROGINSKI, L.A. 1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Centro

Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. 969 p.

✔ VALENTÍN, J. 2005. Comunicación personal. CEDEFOR, El Salvador.

✔ VILLALOBOS, A., LEUNG, D.W. Y THORPE, T.A. 1984. Light-cytokinin interaction

in shoot formation in cultured cotyledon explants of radiata pine. Physiol. Plant.

Direcciones Electrónicas:

www.salvanatura.org. Año 2003.

www.fao.org

www.freshwateraction.net/library.

www.mag.com.sv
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ANEXO 1.

a)

b)

Anexo 1. Tipos de cortes realizados a plantas de caoba (Swetenia

humillis), de dos semanas de edad: a) corte de yema de escamas foliares y
b) cortes de yemas cotiledonares con cotiledon.
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ANEXO 2. Análisis estadístico utilizado en la fase inicial (establecimiento) del

cultivo in vitro de caoba (Swetenia humilis).

En la fase de establecimiento para determinar la mejor fuente de explante se utilizó un

Diseño Completamente al Azar con dos tratamientos (yemas cotiledonales y yemas
foliares) y 10 repeticiones. Las unidades experimentales fueron frascos de vidrio
comerciales de 200 ml, cada uno con 3 explantes.

El modelo de análisis de varianza fue:

Yij = µ + τi + εij

Donde:

Yij = Variable aleatoria de respuesta

 = Media general
τi = Efecto del i-ésimo tratamiento
εij = Error experimental

Los resultados de los análisis de varianza son:

Anexo 2. Tabla de medias entre las variables medidas al final del proceso de
establecimiento in vitro de caoba (Swetenia humilis), siendo el número
de brotes, altura de brotes y días a brotación.

Fuente de Variación Variable Media Sign. (a)

Número promedio de brotes Yemas cotiledonales 5.22 **

Yemas de escama foliar 2.00 **

Altura de brotes (cm) Yemas cotiledonales 5.66 **

Yemas de escama foliar 0.70 **

Días a brotación Yemas cotiledonales 5.6 n.s.

Yemas de escama foliar 6.3 n.s.

a
: n.s. = no significativo; ** = p<0.01
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