Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką chromatografii cienkowarstwowej na podsta-

wie rozdziału barwników zawartych w liściach.

Wstęp (na podstawie: Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 1995)

chromatografia

gazowa cieczowa

kolumnowa planarna

bibułowa cienkowarstwowa

Rysunek 1: Ogólny podział technik chromatograficznych

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC, z ang. Thin Layer Chromatgraphy) jest jedną z

odmian chromatografii planarnej. Chromatografia planarna jest z kolei odmianą chromato-
grafii cieczowej – metody rozdziału mieszaniny substancji rozpuszczonych w cieczy będącej
fazą ruchomą (eluentem) na odpowiednio dobranej fazie stacjonarnej (adsorbencie). W
chromatografii planarnej faza stacjonarna jest uformowana w postaci płytki lub płasko roz-
prowadzona na nośniku, najczęściej szklanej lub plastikowej płytce.

Zasada analizy
Analizowaną próbkę w postaci roztworu różnych związków składowych umieszcza się blisko
krawędzi płytki chromatograficznej, którą zanurza się w eluencie tak jak pokazano na Rysun-
ku 2. Działanie sił kapilarnych powoduje unoszenie eluenta. Jest to tak zwany sposób wstępu-
jący analizy. Eluent przenosi próbkę wzdłuż adsorbenta (fazy stacjonarnej). W trakcie prze-
chodzenia przez fazę stacjonarną próbka rozdziela się na składniki różniące się powinowac-
twem do adsorbenta. Składniki, które silniej oddziałują z fazą stacjonarną są rozmieszczone w
pobliżu linii startu, a słabiej oddziałujące z adsorbentem – rozmieszczają się w pobliżu czoła

1
fazy ruchomej. Dodatkowo rozdział stymulowany jest przez obecność par eluenta w komorze
analitycznej, w której osadzona jest płytka. W ten sposób otrzymuje się obraz rozdzielanych
składników względem czasu dotarcia do przeciwległej krawędzi płytki (czasu retencji) w po-
staci chromatogramu.

Rysunek 2: Zasada rozdziału substancji w chromatografii planarnej

Analizę jakościową składników prowadzi się na podstawie położenia na chromato-

gramie odpowiednich plamek, a ilościową – na podstawie wielkości plamek i intensywności
ich zabarwienia. Wielkością charakteryzującą przesuwanie się badanej substancji jest współ-
czynnik retencji (Rf), który określa stosunek drogi migracji danego składnika (A) do całkowi-
tej drogi przebytej przez fazę ruchomą (B):
A
Rf 
B

Techniki analizy
Rozróżnia się szereg technik chromatografii planarnej w zależności od typu fazy stałej i spo-
sobu uformowania nośnika. Na przykład w chromatografii bibułowej rozdział chromatogra-
ficzny wykonuje się na odpowiednio dobranej bibule, a w chromatografii cienkowarstwo-
wej (TLC) – na cienkiej warstwie sorbentu osadzonej na podłożu w postaci płytki lub folii.
Przy użyciu TLC można badać substancje, których analiza jest również możliwa przy użyciu
chromatografii kolumnowej – techniki w której adsorbent stanowi wypełnienie kolumny
chromatograficznej. W odróżnieniu od chromatografii kolumnowej TLC posiada następujące
zalety:
 próbki nie muszą być idealnie oczyszczone, płytkę chromatograficzną używa się tylko raz,
a zanieczyszczenia nie przeszkadzają w analizie jakościowej i ilościowej,

2
 próbki można nanosić na płytkę w dużej objętości, zatem mogą one być rozcieńczone, a
rozpuszczalnik może być usuwany podczas nanoszenia próbek poprzez odparowanie,
 na jednej płytce można rozdzielić do kilkudziesięciu próbek jednocześnie, a zatem TLC
jest techniką bardzo szybką w przeliczeniu na jedną próbkę,
 identyfikacja składników próbki i ich analiza nie zależy od rodzaju fazy ruchomej, a zatem
nie jest konieczne zwracanie uwagi na odpowiedniość fazy ruchomej do zastosowanego
detektora,
 możliwe jest obserwowanie przebiegu rozdzielania chromatograficznego,
 cena analiz nie jest tak wysoka, jak w przypadku wysokosprawnej chromatografii kolum-
nowej HPLC.

Chromatogram plamkowy TLC można przekształcić w chromatogram pikowy. Przekształce-

nia tego dokonuje się metodą densytometryczną, poprzez pomiar stopnia zaczernienia płytki
w wyniku działania światła, a uzyskany wykres określa się mianem densytogramu. Niekiedy
TLC stosuje się razem z chromatografią kolumnową. Chromatografia cienkowarstwowa wy-
korzystywana jest wówczas do wstępnego, szybkiego przeglądu próbek, a kolumnowa – do
właściwej analizy. Koszt badania jest wtedy znacznie niższy, a czas – krótszy. Ponadto obec-
ność wykrywanych składników jest wówczas potwierdzona dwukrotnie.
Inną odmianą planarnej chromatografii cieczowej jest chromatografia HPTLC (z ang.
High Performance Thin Layer Chromatography, Wysokosprawna Chromatografia Cienko-
warstwowa). W HPTLC stosuje się płytki o drobniejszym uziarnieniu i węższych porach,
opory przepływu są znacznie większe, a czas analizy dłuższy niż w zwykłej TLC. Droga roz-
wijania chromatogramu jest krótsza, rozdział substancji analizowanych – lepszy, a rozmycie
plamek – małe. Dzięki temu możliwe jest wykrywanie nanogramowych ilości substancji.

Adsorbenty
Jako adsorbent stosuje się najczęściej żel krzemionkowy – tlenek krzemu modyfikowany gru-
pami wodorotlenowymi. Rozdział odbywa się dzięki obecności w żelu grup hydroksylowych,
z którymi analizowane substancje tworzą wiązania wodorowe. Drugim czynnikiem zapewnia-
jącym rozdział jest stopień rozwinięcia powierzchni adsorbentu. Im większa jest powierzchnia
właściwa fazy stacjonarnej, tym silniejsze jest oddziaływanie między fazą stacjonarną, a sub-
stancją rozdzielaną i tym lepiej rozdzielony jest chromatogram. W celu zwiększenia efektyw-

3
ności rozdzielania powierzchnię żelu krzemionkowego można pokryć związkami srebra, ole-
jem parafinowym lub glikolem etylenowym.
Innymi polarnymi fazami stacjonarnymi (stosowanymi w tzw. normalnym układzie
faz TLC) mogą być: niemodyfikowany tlenek krzemu, krzemian magnezu, poliamidy czy
celuloza. Przykładem fazy stacjonarnej o charakterze lipofilowym (w tzw. odwróconym ukła-
dzie faz) jest acetylowana celuloza.
Jeżeli składniki analizowanego roztworu są bezbarwne, to można je wywołać sprysku-
jąc płytkę z adsorbentem odpowiednio dobranym odczynnikiem chemicznym powodującym
powstanie związku barwnego. Adsorbent może również zawierać czynnik fluoryzujący (np.
siarczek kadmu lub krzemian cynku). Wówczas przy zastosowaniu do obserwacji chromato-
gramu lampy o długości fali powodującej fluorescencję tego czynnika, widoczne będą plamki
substancji gaszących fluorescencję czynnika fluoryzującego, albo mających inną długość fali
światła emitowanego pod wpływem wzbudzenia.
Adsorbent może być osadzany na podłożu przy pomocy środka wiążącego (np. gipsu
lub skrobi), który może przeszkadzać podczas rozwijania chromatogramu lub jego wizualiza-
cji
Eluenty
W TLC stosuje się takie same eluenty jak w chromatografii kolumnowej. Bez względu na
charakter analizowanych związków (polarne lub niepolarne) faza stacjonarna może być po-
larna lub niepolarna, jednak faza ruchoma powinna spełniać następujące warunki:
 do rozdziału wykorzystuje się prostą zależność, że polarne przyciąga polarne – zatem
do analizy związków polarnych stosowane będą bardziej polarne eluenty niż do anali-
zy związków niepolarnych,
 eluent do TLC powinien być tak dobrany, aby plamki składników mieszaniny rozło-
żone były równomiernie. Skład eluentu może być stały lub zmieniany podczas rozwi-
jania chromatogramu.

4
Problemy do rozwiązania przed wykonaniem ćwiczenia
kurkumina, smocza krew
 Zadanie będzie polegało na rozdziale mieszaniny dwóch historycznych barwników –
kurkuminy i smoczej krwi. Głównymi barwnymi składnikami smoczej krwi są drakorodyna i
drakorubina. W poniższej tabeli zestawiono współczynniki retencji dla różnych barwników:
Barwnik Współczynnik retencji
kurkumina 0.91
1 frakcja 0.92
smocza krew 2 frakcja 0.81
3 frakcja 0.72


W jakiej kolejności na chromatogramie TLC powinny pojawiać się powyższe barwniki?

2) Co można powiedzieć o wzajemnej polarności wymienionych powyżej barwników,
jeżeli wiadomo, że faza stacjonarna TLC ma charakter polarny, a faza ruchoma – charakter
słabo polarny?
3) Z czego mogą wynikać niewielkie różnice pomiędzy wartościami współczynnika Rf
dla danego związku uzyskanymi w dwóch eksperymentach z zastosowaniem takich samych
faz stacjonarnych i eluentów?
4) Dlaczego ściany komory chromatograficznej wykłada się bibułą zanurzoną w eluen-
cie?

Materiały, sprzęt i odczynniki

mieszanina barwników butelka na eluent pęseta

płytka do TLC pokryta SiO2 aceton
komora chromatograficzna metanol
kapilara ołówek
cylinder linijka
zlewka bibuła

Pracę należy wykonywać pod dygestorium, w fartuchu, okularach i rękawiczkach

ochronnych.

5
Wykonanie ćwiczenia

Rozdział chromatograficzny
Proszę przygotować eluent będący mieszaniną acetonu i metanolu w stosunku objętościowym
1:1 (skład eluentu został wcześniej tak dobrany, aby rozdział był efektywny). Ściany komory
chromatograficznej wyłożyć bibułą, do komory wlać niewielką ilość eluentu – tak, aby po-
wierzchnia cieczy nie sięgała wyżej niż 0,5 cm od dna komory.
Na płytce chromatograficznej zaznaczyć linię startu w odległości ok. 1 cm od krawędzi płytki.
Roztwory dwóch barwników i ich mieszaniny nanieść przy użyciu kapilary na płytkę w miej-
scu linii startu – tak, aby powstały 3 plamki (k, l, m) o średnicy do 2 mm oddalone od siebie o
ok. 0.5 cm. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej i poczekać około 25, aż rozwinie
się chromatogram. W momencie gdy czoło eluenta znajdzie się w odległości ok. 0.5 cm od
górnej krawędzi, płytkę należy wyjąć pęsetą i ołówkiem zaznaczyć czoło fazy ruchomej i
delikatnie obrysować plamki.

Rozwiązanie problemów:

6
7
Analiza uzyskanych wyników
Na poniższym rysunku przedstawiającym płytkę chromatograficzną proszę zaznaczyć uzy-
skane po rozdziale plamki poszczególnych barwników, gdyż chromatogram nie jest trwały.
Następnie zmierzyć na płytce chromatograficznej odległości A1, A2, A3 oraz A4 (odpowiadają-
ce poszczególnym barwnikom) oraz B dla każdej z naniesionych plamek k, l, m i wpisać je do
poniższej tabeli. Obliczyć wartości współczynników retencji, porównać z wartościami poda-
nymi powyżej i wyciągnąć wnioski.

plamka „k” plamka „l” plamka „m” barwnik

B B B ----------------

A1 A1 A1

A2 A2

A3 A3

A4