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Tema 1. Generalidades.
Medios de cultivo:
Clases de medios:
Métodos de esterilización.
• Calor húmedo
• Filtración
• Calor seco
• Agentes químicos
• Radiaciones
Tema 2.
• Tipos de cultivo:
• Los medios mas usados son:
• Tipos de siembra:
• Los hongos se cultivan en cámaras húmedas.
Métodos de cuantificación.
Tipos de colorantes:
• Ácidos:
• Básicos:
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Preparación de un frotis:
Tipos de tinciones:
• Tinciones simples:
♦ tinción negativa
♦ tinción básica
• Tinciones diferenciales:
♦ tinción Gram
♦ tinción ácido−resistente
♦ tinción de estructuras:
♦ tinción para hongos inferiores.
• Microscópicamente
• Microscópicamente:
• Pruebas fisiológicas para levaduras:
♦ Capacidad de asimilar diferentes fuentes de carbono
♦ Fermentación de fuentes carbonadas
♦ Asimilación de glucosa al 50% o 60
♦ Resistencia a 37ºC.
♦ Capacidad de crecimiento en presencia de cicloheximida
♦ Hidrólisis de urea
♦ Asimilación de fuentes nitrogenadas
♦ Tolerancia al ácido acético
♦ Asimilación de vitaminas
• Pruebas de estructura:
♦ Composición de la pared celular
♦ Diferencia en rutas metabólicas, en el complejo de la ubiquinona o en la coenzima Q.
• Pruebas bioquímicas:
♦ Carácter killer
♦ Fosfatasa alcalina termorresistente
♦ Prueba de la esculina
♦ Fermentación de HdC
♦ Prueba del citrato
♦ Concentración mínima inhibitoria
• Métodos genéticos
• Detección de enzimas mediante sustratos cromógenos
• Cromatografía gaseosa y técnicas derivadas
• Métodos serológicos:
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• Métodos moleculares
• Técnica de la guanina−citosina
♦ HPLC
♦ Tempertura de fusión
• Electroforesis en campo pulsante
• Análisis de polisacáridos de membrana
• Perfiles de restricción de ácidos nucleicos
• Hibridación de ADN
Técnica de conjugación.
Transformación.
Micromanipulación.
Tema 7. Problemas.
Técnicas en microbiología.
Tema 1. Generalidades.
Medios de cultivo:
Peptonas: hidrolizado proteico fuente de nitrógeno. Se obtiene de diferentes formas, por hidrólisis enzimatica
o por hidrólisis ácida, las dos formas dan resultados distintos. Las peptonas no son útiles para pruebas de
identificación o caracterización por que poseen restos de azucares que podrían dar falsos positivos.
• Extractos de carne, malta, levadura..: el de levadura es el mas usado porque tiene vitaminas factores
de crecimiento vitaminas y es fuente de N.
• Factores de crecimiento: sangre, suero, vitaminas, NADH, metales traza, aminoácidos,.... Hay que
tener cuidado por si fuesen termolábiles, ya q no se podrían esterilizar en autoclave. También se usan
como agentes protectores contra ciertos microorganismos.
• Sales minerales y metales: sulfatos, fosfatos, Ca, Fe, Mn, Mg, metales traza. Suelen ser contaminantes
de otros compuestos. Se añaden especialmente cuando queremos detectar determinada actividad.
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inhibidores... para hacer medios selectivos o para identificar algún microorganismo, etc...
• Agentes solidificantes: agar, gelatina, alginatos, solidifican el medio. El mas usado es el agar: 2%
para levaduras, 1'5% para bacterias y hongos, y 1−0'75% para pruebas de movilidad de bacterias.
Clases de medios:
• Medios de enriquecimiento: son los que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo frente
al resto en una población mixta.
• Medios selectivos: permiten el crecimiento de ciertos microorganismos impidiendo que crezcan otros
(TCBS para Vibrio).
Los medios los venden casi preparados, normalmente hay que disolverlos y esterilizarlos, si el medio lleva
agar hay que hervirlo para que se disuelva y posteriormente autoclavarlo, esto cuando se distribuye en tubos.
Métodos de esterilización.
• Calor húmedo:
♦ Autoclave: 12ºC durante 15 minutos. El medio queda libre de microorganismos y esporas. No
se puede usar con medios con elevadas concentraciones de azucares ya que estos caramelizan.
♦ Tindalización: tres ciclos de 100ºC que permiten el desarrollo de esporas entre dos ciclos
sucesivos de modo que pueda acabar con ellas.
• Filtración: se usa con compuestos termolábiles. Las membranas de 0'22 micras son amicróbiocas, las
de 0'45 permiten el paso de bacterias pero no de hongos ni levaduras.
• Calor seco: en cabinas y hornos a altas temperaturas. Son ciclos de 170ºC durante 90 minutos. Se usa
para el vidrio.
• Agentes químicos: el material plástico de polietireno viene esterilizado por agentes químicos. Como
el oxido de etileno liquido que no deja residuos.
• Radiaciones UVA y radiaciones gamma: las primeras esterilizan superficies las segundas se usan para
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medicamentos o productos que se vayan a envasar.
Tema 2.
• Tipos de cultivo:
♦ Puro o axenico: procede de una sola célula.
♦ Mixto: por mas de una población.
♦ Bimembre: por un microorganismo que necesita, para vivir, el que nosotros estudiamos. Por
ejemplo el cultivo de fagos necesita un césped bacteriano para desarrollarse.
• Tipos de siembra:
♦ En placa por extensión:
♦ En placa por estrías:
♦ Por vertido en placa: se siembran 100microlitros de la muestra y sobre esta el medio de
cultivo, después se autoclava. El crecimiento es dentro del medio.
♦ Replicador multipunto: permite siembra diferentes cepas en una misma placa. Se usa para
pruebas de identificación.
♦ Por aislamiento en estría:
♦ En medio liquido.
Métodos de cuantificación.
• Cuantificación por cámara: puede ser una cámara Thoma o Neubauer. Una cámara Thoma esta
dividida en 16 partes cada una dividida a su vez en 16 subunidades, en ella se meten 10−4 ml para el
recuento. En una cámara de Neubauer también hay una primera división en 16 partes pero cada una de
ellas esta dividida en 25 subunidades, también aquí se cargan 10−4 ml. Para hacer los cálculos de nº
de cs por ml ver practicas.
• Test de opacidad: se usan unos tubos de referencia, tubos de McFarland, enumerados del 1 al 5 o del 1
al 8 de turbidez internacional que tienen diferente opacidad, el calculo se hace por comparación entre
nuestra muestra y el tubo correspondiente.
• UFC: método que se realiza mediante siembra por extensión en placa. Se hacen diluciones seriadas,
de estas se hacen recuentos en cámara Thoma para escoger la dilución que ver practicas.
• Membranas de filtración: se filtra el cultivo y se siembra el filtro sobre el medio. Se usan cultivos
poco concentrados.
• Epifluorescencia directa: se filtra el cultivo a través de una membrana y las cs que quedan atrapadas
se tiñen con naranja de acridina para poder observarlas al microscopio de epifluorescencia.
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• Técnica del numero mas probable (NMP): se usa para medir coliformes en muestras. Se siembra la
muestra en una batería de tubos que se hace por triplicado. Estos se incuban a 35ºC 24 horas y
después se lee cada disolución, hay que ver cuantos tubos fueron positivos en cada batería de tubos y
teniendo en cuenta los positivos de cada dilución, hecha por triplicado, se va a una tabla.
Tipos de colorantes:
• Ácidos:
♦ En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y
no las células, que tienen carga negativa.
♦ Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...
• Básicos:
♦ En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las
células.
♦ Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o
carbol−fucsina...
• Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un cultivo
liquido.
Preparación de un frotis:
• Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.
• Secado al aire.
• Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama
rápidamente.
Tipos de tinciones:
• Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con un
mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas estructuras
para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los
microorganismos entre ellos y con otras células.
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• Diferenciales. Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas especies.
• Tinciones simples:
♦ tinción negativa: se usa un colorante ácido, nigrosina o tinta china, que no entra en la célula
de modo que estas no se observan teñidas, lo que se ve de color es el fondo.
◊ Frotis.
◊ Secado al aire
◊ Colorante.
◊ Visionado a 100X
• Tinciones diferenciales:
♦ tinción Gram: se basa en las diferencias entre las paredes de las Gram + y las Gram − , el
primer colorante tiñe todas las células, en las G+ entra y con la acción del lugol formara una
molécula muy grande que no sale de la célula, pero el disolvente, etanol, disolverá la capa d
lipopolisacaridos de las Gram negativas donde esta el 1º colorante, ya que no pudo atravesar
esta barrera, de modo que al añadir el 2º será este el único que les de color.
◊ Extensión.
◊ Fijación.
◊ Colorante básico, cristal violeta, entra en las células.
◊ Lavado con agua destilada.
◊ Mordiente, lugol: el colorante básico ya no puede salir de G+.
◊ Lavado con etanol que disuelve la capa de lipopolisacaridos de G− donde esta el 1º
colorante.
◊ Colorante de contraste básico, safranina o rojo metilo . que tiñe a las G−.
♦ tinción de estructuras:
◊ tinción de cápsulas:
⋅ Protocolo MENEVAL:
• Extensión.
• Colorante ácido rojo congo que no teñirá la célula.
• Colorante básico, fucsina básica preparada en medio ácido, penetrara
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en la célula virando a azul al reaccionar con el 1º colorante.
• Lavado.
• Visionado: célula roja con centro azul y fondo transparente.
◊ tinción de esporas:
⋅ Extensión.
⋅ Fijación a la llama.
⋅ Colorante, verde malaquita, que penetra en la espora.
⋅ Lavado con agua.
⋅ Colorante de contraste, safranina, que entra en la célula pero no en la espora.
⋅ Secado.
⋅ Visionado: la endospora verde y la célula rosa.
◊ tinción de flagelos:
⋅ Extensión.
⋅ Secado al aire.
⋅ Adición de mordiente para aumentar el tamaño de los flagelos.
⋅ Visionado.
◊ tinción de vacuolas grasas:
⋅ Extensión.
⋅ Fijación a la llama.
⋅ tinción con negro sudan.
⋅ Lavado con agua.
⋅ Secado
⋅ Visionado.
Los caracteres que se suelen usar son morfológicos externos y estructurales y características fisiológicas e
inmunológicas. Se hacen también pruebas bioquímicas que hacen referencia a las rutas metabólicas que usan
los microorganismos.
• Microscópicamente:
♦ Gemación: monopolar. Bipolar, multipolar.
♦ Sistemas de reproducción,...
♦ Asimilación de glucosa al 50% o 60%: el medio es con YNB y glucosa al 50% o 60%.
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♦ Resistencia a 37ºC.
♦ Hidrólisis de urea: para identificar los géneros Cryptococcus y a veces Rhodotorula. Esta
prueba se hace en medio con urea como fuente de N, si hay crecimiento se observara un halo
transparente alrededor de la colonia, la urea es termolábil de modo que se esteriliza por
filtración.
♦ Asimilación de fuentes nitrogenadas: el medio contiene YCB como fuente de carbón y la
fuente de N que queremos testar.
♦ Tolerancia al ácido acético: se hace con YNB, glucosa, agar si queremos un medio sólido y
ácido acético al 1%. Identifica Zygosaccharomyces rouxi en concreto.
♦ Asimilación de vitaminas: se añade una fuente de N muy pura solo con sales, sin
contaminantes, una fuente de carbono y todas las vitaminas a excepción de la que queramos
testar.
• Pruebas de estructura:
♦ Composición de la pared celular: % de mananos.
• Pruebas bioquímicas:
♦ Carácter killer: producido por una toxina que las levaduras excretan al medio.
♦ Prueba del citrato: Klebsiella y Enterobacter son positivas y E.coli negativa. El ácido cítrico
es una molécula que pertenece al ciclo de Krebs y con esta prueba sabremos si un organismo
usa el citrato como fuente de carbono ya que si es así el pH del medio se volverá básico, el
indicador que se usa es el azul de bromotimol que a pH ácido es verde y a pH básico es azul.
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Se usan tiras API con varias celdillas cada una con un sustrato diferente donde se inoculan e incuban las cepas
a probar.
Los productos extracelulares son isoenzimas que los microorganismos excretan al medio con potencial toxico.
• En medio sólido: para facilitar la recogida de los productos extracelulares se realiza la siembra sobro
un papel de celofán previamente colocado sobre el medio.
♦ Recogida de la membrana de celofán.
♦ Lavado con tampón.
♦ Homogeneización y centrifugación.
♦ El sobrenadante se recoge ya que es donde estarán los productos extracelulares.
♦ Esterilización por filtración con una membrana amicróbica de 0'22 m.
♦ Conservación en congelación.
• En medio liquido:
♦ Se cultiva el microorganismo en medio liquido.
♦ Se somete a centrifugación refrigerada.
♦ Se recoge el sobrenadante y se cuantifican la cantidad de proteínas mediante el método de
Lowry o el de Bradford, métodos espectrofotométricos en los que se hace una recta patrón
con concentraciones proteicas conocidas y sus absorbancias para posteriormente extrapolar
las absorbancias de nuestra muestra de concentración desconocida.
• Dosis letal 50: se utiliza para cuantificar la toxicidad in vivo de productos extracelulares. Se define
como la cantidad de producto necesaria para matar el 50% de la población muestra en un periodo
determinado.
Para el estudio de los virus se estudia su efecto citopatogénico, que es el daño celular producido in vitro,
reflejo de la lesión que se supone producen in vivo.
• Métodos genéticos: son métodos más reproductibles aunque es necesario complementarlas con
pruebas bioquímicas.
• Detección de enzimas mediante sustratos cromógenos: son enzimas que detectan metabolitos del
microorganismo a estudiar y permiten identificar específicamente una especie. Esta técnica se emplea
como complemento para otras de tipo presuntivas como la actividad catalasa y la actividad oxidasa.
• Cromatografía gaseosa y técnicas derivadas: detecta metabolitos secundarios producidos por los
microorganismos y es capaz de identificar a determinados grupos hasta el nivel de especie.
• Métodos serológicos:
♦ Tipado fágico: determina la sensibilidad de la bacteria a determinados fagos, estableciendo
relaciones entre las bacterias en función de dicha sensibilidad, ya que los fagos son muy
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estrictos, cada fago infecta determinadas cepas de una misma especie.
♦ Métodos enzimáticos : ELISA por ejemplo.
♦ Técnicas inmunológicas de aglutinación antígeno−anticuerpo.
Una diferencia en un 2% de este par de bases indica una especie distinta e incluso géneros diferentes.
El protocolo que se emplea es a partir de la misma concentración de ADN de distintos organismos. Se parte de
65ºC y se aumentan de 5 en 5ºC, después de cada aumento se mide la densidad óptica y enfrentándola con la
temperatura se calcula la Tm para compararla con la de otros organismos.
• Electroforesis en campo pulsante: se usa para distinguir entre cepas de la misma especie. Este método
es capaz de resolver fragmentos de ADN con un numero de pares de bases muy elevado, de hasta
9000 kb, cromosomas enteros por ejemplo de levaduras. A diferencia de otras electroforesis esta
consta de mas de un campo eléctrico que alternan. El bromuro de etidio es un colorante que además
de permitir visualizar las distintas bandas de ADN le da rigidez para que no se reorienten.
♦ Sistema FIGE: consta de dos campos eléctricos paralelos al gel.
♦ Sistema CTAFE: el gel se dispone verticalmente en una cubeta y los dos campos se disponen
en el formando un ángulo de 45º. En este gel las moléculas migran en zigzag a través del
grosor del gel y en cada pulso el ADN invierte un tiempo en reorientarse y otro en migrar, de
este modo las moléculas mayores tardan mas en moverse que las pequeñas.
♦ Sistema CHEF: el campo eléctrico esta generado en este caso por 24 electrodos dispuestos en
grupos de 4 en los lados de un hexágono. El gel se dispone horizontalmente. Con este tipo de
electroforesis se puede cariotipar una especie, es decir, definir el numero de cromosomas
siempre y cuando estos no pasen de 9000 kb.
Preparación del ADN para migrar cuando es de elevado peso molecular: se prepara la muestra en bloques de
agarosa que protegen los fragmentos de ADN para que no se rompan y a la hora de obtener un perfil no
obtengamos un numero mas alto de bandas que de cromosomas. La agarosa que se usa tiene un punto de
fusión mas bajo que el de una agarosa convencional.
Los marcadores que vayamos a usar también han de ser incluidos en los bloques, los cuales se tratan con
proteinasa K que digiere las proteínas de modo que el ADN migrara mejor por los poros del gel.
El estudio de los perfiles obtenidos se hace como una electroforesis normal: se hace una recta patrón con
perfiles de bandas de pares de bases conocidas y sus respectivas distancias de migración y se compara con
nuestra muestra.
• Análisis de polisacáridos de membrana: se usa para establecer tipados de cepas de bacterias Gram
negativas que tienen lipopolisacáridos por encima de la membrana, que aportan virulencia y
toxicidad, en concreto se basa en la estructura de los lipopolisacáridos que tienen una parte
hidrofóbica, el lípido A, que aporta esa toxicidad y que esta muy conservado al igual que otros
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azucares responsables del antigeno0.
Protocolo:
• Perfiles de restricción de ácidos nucleicos: los muestras de ADN se obtienen a partir de ADN
plasmídico, mitocondrial o genómico. Para obtener el ADN hay que degradar la pares celular, en
bacterias con lisozima, en levaduras con glucanasa (por que su pared esta compuesta por mananos y
glucanos) y n hongos depende de la especie aunque normalmente se usan quitinasas y celulasas.
Las muestras de ADN se tratan con enzimas de restricción eligiendo aquellas con las que se obtienen largos
fragmentos de ADN, para migrarlos en un gel de agarosa previamente teñido.
• Hibridación de ADN: se emplean sondas de ADN de ácidos nucleicos de cadena simple que hibridan
con la cadena complementaria por apareamiento de bases. también existen sondas de ARNr con las
que se hace ribotipado. En microbiología existen sondas comerciales llamadas BACTEC, para
Mycobacterium y Neisseria gonorrheae.
Técnica de conjugación.
Hay dos tipos de levaduras, el tipo a y el tipo b, esto esta determinado por el locus MAT. Ambos tipos de
levaduras son haploides.
Utilidades de la conjugación:
Descripción génica:
• Tipo sexual:
• Otros:
♦ MAT a Leu 3, 8−1: cepa silvestre o dominante, con algún problema en la ruta metabólica de
la Leu en el paso 3 y a la que le faltan los aminoácidos 8 y 1.
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Técnica de fusión de protoplastos.
Se emplea para:
• Obtener cepas que reúnan en una sola célula características que nos interesen de las dos células que
hemos usado para hacer la fusión.
• Obtención de células con dotación cualquier cromosómica: 3n, 4n, 5n, etc...
• Para transferir el material genético citoplasmático sin que exista cariogamia, fusionando una célula
normal con una célula mutante Kar que no produce cariogamia. Al fusionarlas la célula silvestre
adquiere los caracteres citoplasmáticos del mutante Kar.
Transformación.
Permite introducir ADN exógeno, generalmente plasmídico, con un gen de interés en otra célula que nos
interesa adquiera las propiedades que ese gen confiere. Se usan marcadores de resistencia a antibióticos, o
auxotrofias, para seleccionar las cepas que incorporan el gen.
Micromanipulación.
Se usa en análisis genéticos de productos meióticos y para hibridar y construir cepas especificas.
Tema 7. Problemas.
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