MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Resumen de las prcticas de Microbiologa de Alimentos

1 Ingeniero Tcnico Agrcola Industrias Agrarias y Alimentarias CURSO 2004-2005

Profesora: Cristina Solano Goi e-mail: cristina.solano@unavarra.es Tfno. Contacto: Instituto de Agrobiotecnologa 948-168024

RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS (ISO 4833, 2003)

10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1

Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

10-4

1 ml

1 ml

1 ml
Suspensin madre: 45 min a T amb como mximo, antes de aadir el medio

X2 Aadir PCA 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando

30 1 C 72 3 h

Recuento placas Colonias 15-300

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN PLACA (ISO 7402, 1993) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1 Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

10-4

1 ml

1 ml

1 ml
Suspensin madre: 45 min a T amb como mximo, antes de aadir el medio

X2 Aadir VRBG 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando Aadir doble capa

37 1 C 24 h

Recuento placas Colonias tpicas 15-300

(colonias color violeta con halo de precipitacin)

Confirmacin 5 colonias pase a Agar nutritivo Colonias confirmadas como Enterobacterias 37 1 C 24 h

oxidasa KIA + (fermentacin

glucosa)

de

37 1 C 24 h Si es oxidasa Se siembra un KIA

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS (NF ISO 7954, 1988)

10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1

Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

10-4

1 ml

1 ml

1 ml
Suspensin madre: 15 min a T amb como mximo, antes de aadir el medio

X2 Aadir OGA 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando

25 1 C 5 das

Recuento placas Colonias 15-300

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA (NF ISO 4832, 1991)

10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1 Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

10-4

1 ml

1 ml

1 ml

X2 Aadir VRBL 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando Aadir doble capa
Suspensin madre: 45 min a T amb como mximo, antes de aadir el medio

37 1 C 24 h

Recuento placas Colonias tpicas 15-300

(colonias color violeta rodeadas o no de halo de precipitacin)

INVESTIGACIN DE Escherichia coli: PRESENCIA/AUSENCIA 10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1 Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar a un tubo estril 10 ml de muestra 10 ml caldo EC (DC) con campana Durham precalentado a 44 C 44 C 24-48 h POSITIVO: Presencia de gas en 1/10 parte de la campana Confirmacin Prueba del indol 0,1 ml Caldo de triptona 44 C 24 h Aadir 3 o 4 gotas del reactivo de Kovacs NEGATIVO: no anillo rojo AUSENCIA NEGATIVO: Ausencia de gas en 1/10 parte de la campana AUSENCIA

POSITIVO: anillo rojo

PRESENCIA

RECUENTO DE Staphylococcus coagulasa positivo EN PLACA (ISO 6888, 1999) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1 Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

10-4

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml Baird Parker

X2 Extender el inculo con perlas de vidrio estriles 37 1 C 24 + 24 h Placas 15-150 colonias tpicas y no tpicas. Confirmacin: inocular tubos de BHI con 3 colonias tpicas y 3 colonias no tpicas 37 1 C 20-24 h Coagulasa

CATALASA Opcional

+
37 1 C 20-24 h Coagulasa positivo

0,1 ml de cultivo (BHI) + 0,3 ml plasma de conejo

25 g muestra 225 ml agua peptona tamponada Dilucin 10-1 Homogeneizar (2 min Stomacher)

0,1 ml RVS (10 ml) 41,5 1 C 24 3 h BGA

M.K. R.V.

37 1 C 18 2 h

1 ml MKTTn (10 ml) 37 1 C 24 3 h XLD

37 1 C 18 2 h

M.K. R.V.

Colonias no tpicas AUSENCIA

BGA: rosas y medio rosa XLD: rojas con centro negro

Colonias tpicas

Confirmacin Pase de 5 colonias tpicas a Agar Nutritivo 37 1 C 18 - 24 h Galera de confirmacin API

Serologa -

Reacciones bioqumicas -

Confirmacin serolgica

Glu+, SH2+, ure-, indol-, lys+, -gal-, Antgeno O,H+ PRESENCIA

AISLAMIENTO

ENRIQUECIMIENTO

PREPRE -ENRIQUECIMIENTO

INVESTIGACIN DE Salmonella (NF EN ISO 6579, 2002)

25 g muestra 225 ml caldo Fraser-demi Dilucin 10-1 Homogeneizar (30 seg Stomacher)

30 1 C 24 2 h Agar Palcam Agar Oxford 37 1 C 24 + 24 h 37 1 C 18 2 h 0,1 ml

Caldo Fraser (10 ml)

Agar Palcam Colonias tpicas

37 1 C 24 - 48 h

Agar Oxford Colonias tpicas

Verde grisceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro, deprimidas en el centro (48h)

Pequeas, grisceas, rodeadas de halo negro. A las 48 h tienen reflejos verdosos y son deprimidas en el centro.

Confirmacin 5 colonias tpicas Siembra en TSAY 37 1 C 18 - 24 h

Iluminacin de Henry+ Catalasa + Bacilos Gram positivos

Listeria spp

37 1 C 18 - 24 h

Hemlisis+ Test de CAMP + Ramnosa+ Xilosa-

Listeria monocytogenes

AISLAMIENTO

ENRIQUECIMIENTO

PREPRE -ENRIQUECIMIENTO

INVESTIGACIN DE Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1, 1997)

RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS 10 g muestra 90 ml caldo peptona Dilucin 10-1

Homogeneizar (2 min Stomacher)

Filtrar y preparar una dilucin seriada desde la dilucin 10-1 10 MIN, 80 c (destruccin de formas vegetativas)

10-2

1 ml

1 ml

Preparar una dilucin seriada dilucin 10-1 : slo han resistido las esporas dilucin 10-2

Aadir PCA 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando

1 ml
PCA 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando

1 ml
Schaedler 15-20 ml, 45-50 C Agitar homogeneizando Aadir doble capa

37 C 24 h 37 C 24 h Recuento placas Colonias 30-300 Tincin Gram/esporas Recuento placas Colonias 30-300 Tincin Gram/esporas RECUENTO ESPOROS AEROBIOS

37 C, JARRA ANAEROBIOSIS 24 h Recuento placas Colonias 30-300 Tincin Gram/esporas RECUENTO ESPOROS ANAEROBIOS

RECUENTO FORMAS VEGETATIVAS

PREPARACIN DE YOGUR

5 ml leche pasteurizada

Inocular con el cultivo iniciador (a partir de yogur comercial) 37 C 24 h Yogur FERMENTACIN LCTICA 37 C 24 h Leche lquida

PREPARACIN DE CERVEZA

Suspensin de harina de malta al 5% en agua

Llenar hasta el borde. Cerrar con tapn de rosca

75 C 1h Activacin amilasas. Hidrlisis del almidn a glucosa y maltosa 121 C 10 min Enfriar tubos T ambiente

Saccharomyces cerevisiae
T ambiente 3-7 das Cerveza FERMENTACIN ALCOHLICA

Inocular con

ANLISIS DEL AIRE

37 C 24 h

Determinacin aerobios mesfilos ambientales

Destapar placa PCA durante 30 min.

ANLISIS DE MANIPULADORES placa VRBG

Tomar muestra de la nariz con hisopo estril Pasar dedos sin lavarse las manos Pasar dedos despus de lavarse las manos con un desinfectante

placa AMS

37 C 24 h

37 C 24 h

Colonias de Enterobacteriaceae: violetas con halo

Colonias de S. aureus: amarillas

ANLISIS DE SUPERFICIES HISOPO Restregar Plantilla papel de aluminio con abertura de 9 cm2

Humedecer hisopo estril en la solucin salina Solucin salina

Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina

15-30 min

Placa PCA

Placa VRBG

37 C 24 h

ufc/9 cm2 PLACAS RODAC

37 C 24 h

ufc/25 cm2

Presionar placa Rodac sobre superficie elegida