Revisin

INMUNOLOGA,

VOL. 20 / N M . 4 / O CTUBRE-DICIEMBRE 2001 2001; PP 216-224

Estructura y funcin de las balsas lipdicas (rafts), dominios de membrana ricos en esfingolpidos y colesterol
F. MARTN-BELMONTE, J. M ILLN Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa, Universidad Autnoma de Madrid-Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Cantoblanco. Madrid
STRUCTURE AND FUNCTION OF LIPID RAFTS, CHOLESTEROL AND SPHINGOLIPID ENRICHED MEMBRANE DOMAINS.

RESUMEN Cuando se generan liposomas con una mezcla de distintos lpidos se pueden formar dominios separados con diferente composicin lipdica. La posibilidad de que las membranas celulares utilicen esta propiedad para formar dominios heterogneos de lpidos ha fascinado a los investigadores durante muchos aos. Mediante diferentes aproximaciones se han acumulado recientemente evidencias a favor de la existencia de dominios enriquecidos en glicoesfingolpidos y colesterol dentro de las membranas celulares, denominados balsas o rafts. Considerando suficientemente demostrada la existencia de estos dominios en las clulas, nos vamos a centrar en esta revisin en su estructura, su composicin de lpidos y protenas, y en el papel de los rafts tanto en el transporte polarizado de protenas en las clulas epiteliales como en los procesos de sealizacin en clulas del sistema inmune. PALABRAS CLAVE: Rafts/ Transporte apical/ Sistema inmunitario/ Sealizacin.

ABSTRACT It is well known that separate domains with different lipid compositions are formed in liposomes containing mixtures of different lipids. The possibility that cellular membranes use this property to form lipid domains has intrigued researchers for a long time. Different approaches have recently provided evidence on the existence of sphingolipid and cholesterol-based structures called membrane rafts. Assuming that the existence of rafts in the cells is sufficiently demonstrated, we will focus in this review on the structure, protein and lipid composition of the rafts, and the role of rafts in cellular processes such as protein sorting in epithelial cells and signalling in immune system cells.

KEY WORDS: Rafts/ Apical sorting/ Immune system cells/ Signalling.

ABREVIATURAS UTILIZADAS
DIGs: Glicoesfingolpidos insolubles en detergente. GPI: Glicosilfosfatidilinositol. FRET: Fluorescencia por transferencia de energia de resonancia. MDCK: Clulas de rin canino Madin-Darby. TGN: Red del trans-Golgi. OG: Octil-glucsido. GFP: Protena verde fluorescente.

HA: Hemaglutinina. ITAM: Motivos de activacin de los inmunoreceptores basados en tirosinas. TCR: receptor de clulas T. BCR: Receptor de clulas B. SMAC: Complejo de activacin supramolecular. CSD: Dominio de andamiaje de la caveolina. NOS: Sintasa de xido ntrico. EGFr: Receptor del factor de crecimiento epidrmico. IAP: Protena asociada a integrinas.

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ESTRUCTURA DE LOS RAFTS

os glicolpidos se asocian por sus largas cadenas aciladas formando agrupaciones muy compactas estabilizadas por los puentes de hidrgeno que se producen entre sus cabezas azucaradas. De hecho, los esfingolpidos, especialmente los glicoesfingolpidos, tienen temperaturas altas de fusin debido a que sus cadenas de hidrocarbonos presentan un grado alto de saturacin. El colesterol se intercala entre las cadenas hidrocarbonadas donde provoca una disminucin de su flexibilidad y de esta forma compacta la bicapa lipdica (revisado 1). Este empaquetamiento lateral de los esfingolpidos y el colesterol conduce a la formacin de dominios dispersos que se encuen-

tran en una fase similar a la fase lquida ordenada (2), que se denominan balsas o rafts, dentro de la bicapa de las membranas (Fig. 1). La estructura peculiar de los rafts les confiere la propiedad de ser insolubles en detergentes no inicos (Tritn X-100) a bajas temperaturas. De esta forma las protenas y lpidos de los rafts pueden ser aislados bioqumicamente por centrifugacin de equilibrio como complejos de baja densidad insolubles en el detergente Tritn X-100 (DIGs) (3). Los DIGs, sin embargo, al ser aislados aparecen como agregados ms grandes que los rafts intracelulares. Los ltimos datos indican que el tamao de los rafts es considerablemente pequeo y por debajo del poder de resolucin de las tcnicas microscpicas aplicadas hasta el momento (1). El

Figura 1. Modelo de estructura de los rafts. La bicapa lipdica es asimtrica en los rafts, con la esfingomielina y los
glicoesfigolpidos enriquecidos en la cara exoplsmica de la membrana y los glicerolpidos (p.e. fosfatidilcolina) en la cara citoplsmica. El colesterol est presente en las dos caras y se intercala entre las cadenas hidrocarbonadas.

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entrecruzamiento qumico en clulas vivas ha sugerido que las protenas ancladas por GPI residen en microdominios de, al menos, 15 molculas (4). De hecho, utilizando la tcnica de fluorescencia por transferencia de energa de resonancia (FRET) se ha estimado que el dimetro de los rafts es menor de 70 nm (5). Desde que se postul por primera vez la existencia de los rafts (6), ha habido una gran controversia sobre si existan realmente o eran simples artefactos producto de la utilizacin de detergentes para su aislamiento. Se han realizado numerosos experimentos, tanto in vivo como in vitro, que confirman su existencia, pero quiz uno de los ms definitivos ha sido el aislamiento de rafts en ausencia de detergentes (7). El posterior anlisis de estos microdominios aislados sin detergentes determin que presentaban la misma composicin que los aislados por el mtodo tradicional. LOS RAFTS EN EL TRANSPORTE APICAL Simons y Wandinger-Ness propusieron en 1990 un modelo de transporte apical basado en distintas observaciones independientes. Se conoca que la membrana apical de las clulas epiteliales est enriquecida en glicolpidos y colesterol (8). Por otro lado, se haba observado que existe un cotransporte de glicolpidos y protenas a la membrana apical de las clulas MDCK (9). El modelo basado en los rafts postula que el mecanismo de transporte apical est fundamentado en las interacciones lpido-lpido y lpido-protena (Fig. 2) que tienen lugar en microdominios especficos con

un contenido elevado en glicolpidos y colesterol. De esta forma, los glicoesfingolpidos se asocian y forman agrupamientos en las membranas de la red del trans-Golgi (TGN), donde podran actuar como plataformas para la inclusin de protenas carga destinadas a ser transportadas a la membrana apical, mientras que las protenas con destino a la membrana basolateral seran excluidas. Estos lpidos y protenas podran ensamblarse junto con protenas accesorias en la cara citoplsmica de la TGN para formar un subdominio capaz de formar vesculas que engloben la maquinaria necesaria para asegurar una distribucin especfica a la membrana apical. Las protenas basolaterales, cuyo transporte est basado en interacciones protena-protena, no son capaces de acceder a estos dominios y son excluidas especficamente de las vesculas de transporte apical. Cuando la fraccin de los esfingolpidos y colesterol en una membrana aumenta, como ocurre cuando las vesculas de carga se mezclan con la membrana plasmtica al finalizar la ruta exoctica, la fase lquida ordenada se hace continua. La membrana apical podra representar, por tanto, un gran microdominio lipdico de rafts donde los dominios de lpidos en fase lquida desordenada forman agrupaciones aisladas (10). Candidatos a formar parte de la maquinaria de los rafts en el transporte apical El principal criterio para determinar si una protena se asocia especficamente a los rafts es analizar su resistencia a ser solubilizada por detergentes

Figura 2. Modelos de formacin de vesculas de transporte. El transporte basolateral est fundamentado en interacciones protena-protena. El mecanismo propuesto para el transporte apical, sin embargo, se basa en interacciones lpido-lpido y lpido-protena.

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no inicos suaves como el Tritn X-100. El posterior anlisis con detergentes no inicos intermedios, como el octil-glucsido (OG), permite diferenciarlas de protenas asociadas al citoesqueleto, que son siempre insolubles. En primer lugar, es importante diferenciar las protenas que son transportadas unidireccionalmente por los rafts, es decir, protenas carga, de aquellas que estaran formando parte de la maquinaria de transporte mediada por rafts, ciclando entre la TGN y la membrana plasmtica. Para identificar las protenas que formaban parte de la maquinaria de transporte se inmunoaislaron vesculas de clulas MDCK destinadas a la superficie apical (11). El anlisis posterior de estas vesculas defini una serie de posibles candidatos que podran formar parte de dicha maquinaria. La caveolina es la protena asociada a rafts mejor caracterizada. Esta protena se ha visto que se une al colesterol, pudiendo estar implicada en su transporte a la membrana plasmtica (12; 13). La caveolina forma homo-oligmeros que se incorporan en las vesculas apicales y que podran estabilizar los rafts en el TGN (14). Otras protenas transmembrana asociadas a rafts son las anexinas XIII a y b. Las anexinas son una familia de protenas que se unen a las membranas en presencia de calcio. Se ha descrito que la anexina XIIIb se localiza apicalmente en las clulas MDCK, mientras que la anexina XIIIa se distribuye en las dos membranas de estas clulas, estando ambas implicadas en el transporte apical de protenas mediado por rafts (15; 16). Recientemente se ha demostrado que las protenas sintaxina 3 y TIVAMP estn asociadas a rafts en clulas MDCK, lo que parece indicar que los SNARE son parte de la maquinaria de transporte de los rafts (17). De igual forma, el proteolpido MAL tambin se asocia especficamente a los rafts de clulas epiteliales polarizadas y de linfocitos T(18; 19; 20). De hecho, MAL es la nica protena asociada a rafts que se ha demostrado que tiene una funcin esencial como componente de la maquinaria para el transporte apical de protenas de membrana y secretadas en las clulas epiteliales (21; 22; 23). Protenas carga que podran utilizar los rafts para su transporte apical El nmero de protenas carga descubiertas que se asocian a rafts se ha incrementado extraordinariamente en los ltimos aos. En general tienen tendencia a asociarse a rafts las protenas que estn ancladas a la membrana, en la cara exoplsmica o citoplsmica, por cadenas aciladas saturadas. Las protenas ancladas por GPI estn unidas a la cara exterior de la membrana por el grupo glicosilfosfatidilinositol con dos o ms cadenas de cidos grasos saturados (3), mientras que la familia de tirosncinasas Src doblemente aciladas, se une a la cara cito-

plsmica de las membranas de los rafts (24). Incluso una sola cadena acilada, como el cido mirstico, se ha visto que es suficiente para relocalizar la protena soluble GFP en los rafts (25). Hasta el momento, son pocas las protenas transmembrana cuya asociacin a rafts ha sido demostrada bioqumicamente. Las protenas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) del virus influenza, ampliamente utilizadas como modelo de transporte en clulas polarizadas, son protenas transmembrana asociadas a los rafts. Se ha descrito que se asocian a los rafts por sus dominios transmembrana, aunque, la protena HA tambin est estabilizada en los rafts por palmitilacin (26). En cualquier caso, no puede descartarse que otras protenas transmembrana estn realmente asociadas a los rafts aunque de forma ms lbil, por lo que podran disociarse durante el proceso de extraccin con detergentes. Se han descrito pocas protenas secretadas que se asocien de forma especfica a los rafts de lpidos. Es posible que las protenas solubles que se secretan apicalmente en las clulas epiteliales polarizadas, sean transportadas en el interior de las vesculas de rafts que, supuestamente, median el transporte a la membrana apical. El proceso de aislamiento de rafts, con o sin detergentes, podra destruir la integridad de estas vesculas, liberando su contenido y, de esta forma, destruir la asociacin. Aun as, recientemente se ha visto que la tiroglobulina se asocia especficamente a estos dominios durante su transporte apical por la va exoctica (27). Es posible que la interaccin de sta y otras protenas secretadas con los rafts se produzca por su asociacin a un receptor de membrana que est especficamente incorporado en estos microdominios, como ocurre con la protena carboxipeptidasa E que es el receptor para prohormonas del tipo de las pro-opiomelanocortinas (28). FUNCIN DE LOS RAFTS EN LA SEALIZACIN EN CLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO Recientemente se ha observado que los rafts desempean una funcin esencial en los procesos de sealizacin a travs de receptores de membrana, en particular en los receptores de las clulas del sistema inmunitario de tipo multicadena. Estos receptores estn formados por varias subunidades, unas de reconocimiento, de tipo inmunoglobulina, que entran en contacto mediante la fosforilacin de sus dominios ITAMs (immunore ceptor tyrosine-based activation motifs) con subunidades transductoras, como las tirosncinasas submembranales de la familia Src o Syk. stas inician el reclutamiento de ms subunidades sealizadoras y de ensamblaje, formando finalmente un complejo supramolecular que regula finalmente la transduccin de seales (29).

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A esta categora de receptores multicadena pertenecen los receptores de clulas B y T (BCR y TCR) y el receptor de alta afinidad para la IgE en basfilos y mastocitos (FcRI). Adems de la organizacin similar de sus diferentes subunidades, en los tres receptores se produce el mismo fenmeno en respuesta a una oligomerizacin mediada por ligando: algunas de las subunidades del receptor son reclutadas en los rafts, donde residen constitutivamente algunos correceptores (CD8, CD4), subunidades de transduccin de tipo tirosncinasa (Lyn, Lck, Fyn) o con una funcin conectora (LAT). Por tanto, es en estos dominios donde el complejo multimrico de transduccin es ensamblado y desde donde se produce la sealizacin. Este modelo de reclutamiento de los receptores en

rafts ha sido refrendado en los ltimos aos por diferentes observaciones independientes. As, pocos minutos despus de la estimulacin, aumenta la insolubilidad en detergentes no inicos de algunas de las subunidades de estos receptores, en particular la de las formas ms activas (-CD3 hiperfosforilado, p. ej.), que pasan a colocalizar con marcadores de rafts (Fig. 3) (30). Adems, la alteracin de los rafts con frmacos que reducen los niveles de colesterol, como la metill--ciclodextrina, modifica la capacidad estimuladora de estos receptores, bien inhibindola en el caso del TCR y el FcRI (31; 32) o bien incrementando algunos parmetros, como la movilizacin de calcio, en el caso del BCR (33). As mismo, la alteracin de la localizacin de Lck o LAT, mediante la eliminacin

CD4 TRC raft CD28

CD4 TCR TCR CD28

Activacin de la sealizacin (Ptyr, PLC Ca2+, Ras/ERK)

Figura 3. Modelo para la activacin de clulas T mediante la agregacin de receptores en los microdominios de rafts.
(a) Las clulas T en reposo presentan rafts de pequeo tamao, con una serie molculas asociadas. CD45 inhibe la actividad quinasa de LCK. (b) La ligacin del TCR produce la agregacin de los receptores en los rafts con las molculas sealizadoras asociadas, lo que induce la activacin de la sealizacin al interior celular.

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de sus anclajes acilados, inhibe la transmisin de la seal estimuladora desencadenada por el TCR (34, 24). En los linfocitos T se ha descrito que algunos de los componentes mayoritarios de los rafts poseen capacidad coestimuladora. La oligomerizacin de protenas ancladas por GPI como CD59 o CD48 con anticuerpos entrecruzantes, o de uno de los glicolpidos mayoritarios de estos dominios, el ganglisido GM1, con la subunidad B de la toxina colrica, promueve un aumento de la fosforilacin en tirosina en presencia de cantidades subptimas de anticuerpos frente a CD3 en linfocitos T (35, 36). Esta capacidad coestimuladora de los componentes mayoritarios de los rafts ha aumentado notablemente el inters por conocer la organizacin de los rafts en la superficie de la clula. Aunque CD59 y GM1 son aislados en las mismas fracciones insolubles o DIGs, el anlisis de su distribucin en la superficie celular, su cintica de internalizacin en respuesta a la oligomerizacin y la ausencia de comodulacin de una molcula sobre la otra, revela un agrupamiento en dominios diferentes. Por otra parte, estos dominios coestimuladores carecen por s mismos de la capacidad para reclutar el TCR en los rafts y es necesaria la agregacin directa del receptor para que este proceso tenga lugar (37). En los linfocitos T, todo el ensamblaje supramolecular que se forma en torno al receptor cuando reconoce un antgeno presentado por una APC, ha sido denominado sinapsis inmunolgica o SMAC (supramolecular activation complexes). Adems del receptor multicadena y los rafts, el citoesqueleto de actina es el tercer elemento que participa en la formacin de este complejo. El reclutamiento del TCR en los rafts es dependiente de un citoesqueleto de actina funcional, puesto que puede ser bloqueado con el inhibidor de la polimerizacin de actina citocalasina D (38). La coestimulacin con anticuerpos frente a la protena anclada por GPI CD48 incrementa a su vez la asociacin al citoesqueleto de actina de -CD3 (36). La reorganizacin del citoesqueleto y su acoplamiento al complejo del TCR estimulado es regulado por Rho GTPasas como Rac1, CDc42 o RhoA, o por protenas intercambiadoras de GTP de la familia Rho como Vav1. La protena adaptadora Cbl-b no slo regula negativamente la fosforilacin de Vav1 y la redistribucin de la actina promovida por la estimulacin del TCR (39), sino tambin la segregacin del receptor en los rafts, lo que indica la existencia de una relacin directa entre ambos sucesos (38). Aunque los rafts fueron descritos en las clulas del sistema inmunitario a principios de los aos 90, es en estos ltimos tres aos cuando se ha comenzado a comprender su relevancia en los procesos de transduccin de seales desde la superficie celular. Una vez situados en este contexto, que-

dan an, sin embargo, varias incgnitas por elucidar: organizacin de los rafts, heterogeneidad, tamao y composicin; maquinaria proteica que regula estos dominios, tanto en su localizacin y organizacin en el lugar adecuado de la clula, como en su participacin en los procesos dinmicos de activacin; contribucin de los rafts, desde su faceta coestimuladora, al incremento y sostenimiento de la seal, etc. En este ltimo aspecto, queda por comprobar cmo contribuyen los rafts a la trasmisin de seales por aquellos componentes, como las protenas ancladas por GPI, que carecen de los segmentos transmembrana y citoplsmicos necesarios, a priori, para conectar directamente con las molculas de transduccin intracitoplsmicas. En definitiva, un conjunto de preguntas que estn provocando, tambin en el rea de la inmunologa, un creciente inters por estos dominios de membrana. LAS CAVEOLAS Las caveolas fueron identificadas originalmente como invaginaciones de la membrana plasmtica en clulas endoteliales y epiteliales con un tamao de 50-100 nm (40). En realidad, las caveolas pueden ser invaginaciones, estructuras lisas dentro del plano de la membrana plasmtica o vesculas libres. Las caveolas, adems, se pueden fusionar para formar estructuras tipo racimo y tbulos con tamaos significativamente ms grandes de 100 nm. Las caveolas son abundantes en el endotelio, en clulas musculares, en adipocitos y en clulas epiteliales del pulmn (revisado en 41), pero estn ausentes en otras como los linfocitos T. Las caveolas son especializaciones de los rafts. Tanto su composicin como sus propiedades bioqumicas son exactamente iguales que los rafts, de tal forma que pueden ser aisladas por los mismos procedimientos descritos para el aislamiento de los rafts. De hecho, las caveolas se pueden definir como rafts que contienen la protena caveolina. Las caveolinas son una familia de protenas integrales de membrana de 21-25 kDa. Se conocen tres genes de caveolina. Las caveolinas 1 y 2 se expresan ubicuamente, mientras que la expresin de caveolina 3 es especfica de clulas musculares y astrocitos (41). La caveolina-1 une colesterol directamente, lo que estabiliza la formacin de complejos de homo-oligmeros. Como los rafts estn muy enriquecidos en colesterol, es muy probable que la caveolina se asocie a estos microdominios para formar las caveolas a travs de su interaccin directa con el colesterol. Los homo-oligmeros de caveolina podran interaccionar unos con otros dentro de los rafts para formar las invaginaciones de los dominios de membrana que podemos ver como caveolas. En conclusin, los rafts existen independiente-

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mente de las caveolas, pero deben aparecer con anterioridad a la formacin de las caveolas para la insercin de la caveolina en sus membranas. En este sentido, en las clulas donde la caveolina se expresa, los rafts funcionaran, entre otras cosas, como precursores de las caveolas (42). Las caveolas han sido implicadas en numerosas funciones como la internalizacin de determinadas pequeas molculas en un proceso conocido como potocitosis que es independiente de la endocitosis (43). Se ha visto que los complejos toxina colrica-GM1 se internalizan en la clula mediante un proceso de endocitosis mediado por caveolas (44), siendo adems un proceso de endocitosis completamente diferente al mediado por cubiertas de clatrina. La caveolina-1, como describimos anteriormente, une colesterol y se piensa que est implicada en transportar colesterol desde el retculo endoplsmico a la membrana plasmtica (12; 13). Hay evidencias que sugieren que la familia de miembros de la caveolina funciona como protenas de andamiaje que organizan y concentran determinados lpidos (colesterol y glicoesfingolpidos) y molculas sealizadoras modificadas por lpidos (45). La caveolina presenta un dominio de andamiaje (caveolin scaffolfding domain) (CSD) por el que interacciona directamente con las protenas sealizadoras, como las cinasas de la familia Src (46), la xido ntrico sintasa (NOS) (47), el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFr) (48) o las subunidades G de las protenas G heterotrimricas (49), y las mantiene en una conformacin inactiva (revisado en 42). La unin de un ligando, como el factor de crecimiento (GF), a su receptor (EGFr) induce su dimerizacin y fosforilacin desencadenando la cascada de sealizacin de la MAP cinasas que promueve, en ltima instancia, la proliferacin celular. La caveolina acta como un inhibidor de este proceso al unirse por su dominio CSD al dominio de interaccin con caveolina del receptor que, en general, est localizado dentro de su dominio cataltico activo. Adems otras protenas de esta ruta sealizadora, como ERK, Grb-2, ras raf se han encontrado localizadas en rafts (revisado en 41), e incluso algunas de ellas interaccionan directamente con caveolina, como es el caso de ERK (50). Teniendo en cuenta que muchas de estas molculas sealizadoras pueden causar transformacin celular cuando se activan constitutivamente, es razonable pensar que la caveolina puede poseer por s misma actividad como oncosupresor. OTRAS FUNCIONES PROPUESTAS PARA LOS RAFTS El modelo original de Simons y WandingerNess (1990) fue formulado para explicar el transporte apical de lpidos y glicoprotenas en las clu-

las polarizadas. Posteriormente este modelo ha sido extendido a otros procesos en los que el reclutamiento especfico de protenas es necesario. Recientemente, se ha sugerido que los rafts podran ser importantes en el transporte dentro de la ruta endoctica tanto de lpidos (51) como de protenas ancladas por GPI (52). Los rafts podran servir como sitios de anclaje para la entrada de ciertos patgenos y toxinas (53). El procesamiento aberrante de la protena precursora del amiloide que contribuye a la enfermedad de Alzheimer podra ocurrir en rafts (41). La protena asociada a integrinas IAP (que regula la funcin de las integrinas) y las protenas G heterotrimricas forman un complejo estable dependiente de colesterol que se encuentra enriquecido en los rafts (54). Tambin se ha visto que los rafts se polarizan en el frente de clulas de adenocarcinoma que migran en un gradiente quimiotctico (55). En estas clulas, el desarrollo de la polaridad anteroposterior, que es necesaria para la migracin directa, es abolida cuando se reducen los niveles de colesterol. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Miguel A. Alonso, Alicia Batista y Maica de Marco por los comentarios aportados a este manuscrito. A la fundacin Ramn Areces por su apoyo institucional.

CORRESPONDENCIA: Fernando Martn-Belmonte Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa Universidad Autnoma de Madrid-Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, Cantoblanco, 28049 Madrid. E--mail: fmartin@cbm.uam.es

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