COLORACIN DE GRAM Beatriz Salazar Giraldo La coloracin de Gram es una tincin diferencial usada para clasificar las bacterias

de acuerdo a su forma, tamao morfologa celular y afinidad tintorial de la pared celular. Es adicionalmente una prueba empleada para el diagnstico presuntivo de agentes infecciosos y para la evaluacin de la calidad de especimenes clnicos. La coloracin fue desarrollada por Christian Gram en 1884. La modificacin realizada por Hucker en 1921 es la actualmente usada ya que provee mayor estabilidad a los reactivos y mejor diferenciacin de los microorganismos. La modificacin de Kopeloff es til para colorear anaerobios y para organismos que se tien dbilmente Gram negativos como Legionella spp, Campylobacter spp, Brucella spp y otros y se usa carbol fuscina o fuscina bsica como contraste. PRINCIPIO La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como cristal violeta, azul de metileno y fuscina bsica pero tie pobremente con colorantes cidos como la eosina. Debido a la carencia de envoltura nuclear en las clulas procariticas, el protoplasma bacteriano es cido por contener grandes cantidades de cidos nucleicos presentando una marcada afinidad por los colorantes bsicos. Las bacterias pueden se coloreadas como Gram positivas o Gram negativas de acuerdo con las diferencias en la composicin de la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano y una gran cantidad de cidos teicoicos, ellas no son afectadas por la decoloracin con alcohol y retienen su coloracin inicial. Las bacterias Gram negativas tienen una sola capa de peptidoglicano unida a una bicapa compuesta por protenas fosfolpidos y lipoprotenas la cual es disuelta y decolorada con el alcohol removiendo el complejo cristal violeta-lugol y reemplazando el color con el colorante de contraste. APECTOS QUE PUEDEN MODIFICARLA Presencia de sustancias inhibidoras Edad del cultivo Tipo de medio de cultivo Atmsfera de incubacin Presencia de fagocitos en las muestras Tratamientos previos establecidos en el paciente

PROPOSITOS Observar la presencia, y cantidad de leucocitos presentes en la muestra que indican la magnitud y el tipo de respuesta inflamatoria Corroborar la calidad de algunas muestras para determinar si se acepta o no para su procesamiento Determinar la presencia y cantidad de bacterias as como su morfologa y agrupacin caractersticas Determinar la afinidad tintorial de las bacterias observadas

PROCEDIMIENTO El frotis debe ser lo suficientemente grueso de tal manera que cada campo microscpico contenga algunos elementos morfolgicos identificables, pero no tan grueso que las clulas queden superpuestas. Se deja que el frotis se seque al aire y luego debe fijarse con calentamiento lento (una o dos pases por la llama sin que la placa se caliente demasiado), tambin puede colocarse sobre una plancha elctrica o con 0.5 ml de metanol sobre la preparacin hasta que se evapore, una vez fijada se procede a colorear de la siguiente forma: Cubrir la preparacin con solucin de cristal violeta 30 seg Lavar con agua corriente agregar la solucin de lugol por 30 seg lavar con agua corriente decolorar con alcohol acetona por 1 a 5 seg lavar con agua corriente agregar la solucin de safranina por 30 seg lavar con agua corriente dejar secar observar al microscopio con objetivo de inmersin (100X)

INTERPRETACIN El nmero de clulas y de bacterias se debe determinar promediando 20 a 40 campos microscpicos.

Recuento de clulas se expresa as: 1+: (raras, ocasionales) menos de 1 por campo de bajo poder 2+: (pocos) de 1 a 9 por campo de bajo poder 3+:(moderado) 10 a 25 por campo de bajo poder 4+:(abundantes) > de 25 por campo de bajo poder El recuento de microorganismos se realiza as: 1+: (raros, ocasionales) menos de 1 por campo de inmersin 2+:(pocos) 1 a 5 por campo de inmersin 3+: (moderado) 6 a 30 por campo de inmersin 4+: (muchos o numerosos) >30 CONTROL DE CALIDAD A. Chequear la apariencia de los reactivos diariamente: Si el cristal violeta esta precipitado o presenta sedimento se debe refiltrar antes de usar. La evaporacin puede afectar los reactivos . Las soluciones de trabajo deben ser cambiadas regularmente de forma ideal antes de que se agoten en el envase o antes de un mes. Recordar que los colorantes deben ser almacenados en frascos ambar y a temperatura menor a 30C B. Cuando se usa un nuevo lote se debe realizar preparaciones semanales con E. coli (ATCC 25922) y S. epidermidis (ATCC 25923) fijarlas y realizar coloracin de Gram C. Cuando las placas son difciles de interpretar o se observa una tincin deficiente (Gram positivos poco coloreados, Gram negativos coloreados con violeta, placa teida solo en los extremos) es posible que se deba a la preparacin de la muestra, a los reactivos o al procedimiento siendo las siguientes las causas mas comunes: uso de portaobjetos sucios o engrasados, preparaciones muy gruesas, sobrecalentamiento de las placas cuando se fijan, exceso de lavado durante la tincin y precipitacin de los reactivos D. Para asegurar la uniformidad en la interpretacin debe establecerse un sistema para revisar los informes comparando los resultados de los cultivos con los hallazgos del Gram. La morfologa anotada en el directo debe ser recuperada en el cultivo y similarmente los microorganismos obtenidos en los cultivos y que no se observaron al Gram exigen una revisin del directo y los cultivos. Debe recordarse que no todas las bacterias observadas al Gram pueden ser cultivadas. Es apropiado adems tener una caja de coleccin referencia para la comparacin LIMITACIONES: 1. Los resultados del Gram deben ser interpretados en conjunto con otros resultados clnicos y de laboratorio. Otros procedimientos pueden ser requeridos como coloraciones y medios especficos para confirmar los resultados obtenidos a partir del Gram

2. La visualizacin o no de bacterias Gram positivas o Gram negativas puede ser el resultado de una contaminacin de los reactivos o de otros materiales empleados, de la presencia o no de agentes antimicrobianos que impidan visualizarlas o de fallas en el crecimiento de muchos microorganismos en los medios de cultivo usuales 3. Resultados falsos Gram negativos pueden ser ocasionados por inadecuada recoleccin del Espcimen BIBLIOGRAFIA: Alvarez GL, Alzate LM, Jaramillo GU, Restrepo GE, Vasquez ME. Manual de laboratorio de Bacteriologia. Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. 1986. York MK. Aerobic Bacteriology. In: Isemberg HD editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed.Washington, D.C: ASM Press; 2004 p. 3.2-3.2.2.4. Madigan MT, Martinko JM, Parker J editors. Brock Bology of Microorganism. 9th ed. Upper Saddle River, NJ:Prentice Hall;1997. Murray PR, Rosenthal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. Medical Microbiology.3rd ed. St Louis, Missouri: Mosby, Inc; 1998

Tabla 1: MODIFICACIONES DE LA COLORACIN DE GRAM Hucker Reactivos Tiemp o cristal violeta 30 seg yodo de Gram alcohl acetona safranina Bacteriologa general 30 seg 1-5 seg 30 seg Carbol fuscina Reactivos Tiempo cristal violeta yodo de Gram 95% de etanol carbol fuscina o 0.8% de fuscina bsica Bacteroides spp Fusobacteriu m spp Legionella spp Campylobact er spp Brucella spp 30 seg 30 seg 30 seg >o igual a 1 min Kopeloff Reactivos Tiempo cristal 2-3 min violeta alcalino yodo de > o igual a 2 Kopeloff min Alcohl lavar acetona inmediatamente safranina 10 a 30 seg de Kopeloff Otros anaerobios y diagnstico de Vaginosis bacteriana

COLORACIN Coloracin inicial yodo Decolorante Contraste Recomendaciones

Traducido de Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2004 p 3.2.1.7

Tabla 2: CARACTERSTICAS DE LA MEMBRANA DE LAS BACTERIAS G(+) Y G (-) CARACTERISTICA Otra membrana Pared celular lipopolisacarido Endotoxina Acidos Teicoicos Esporulacion Capsula lisozima sensibilida a penicilina produccin de exotoxina GRAM (+) ausente Gruesa ausente ausente frecuentemente presentes algunas algunas sensible muchas susceptibles algunas GRAM (-) presente delgada presente presente ausentes ninguna algunas resistente mas resistente algunas

Modificada de Medical Microbiology:1998. p 14

ANEXOS Fig 1: PARED CELULAR GRAM POSITIVA

Fig 2: PARED CELULAR GRAM NEGATIVA

Fig 3: MORFOLOGIAS CELULARES

Fig 4: PASOS PARA REALIZAR LA COLORACIN DE GRAM

Fig 5: DIFERENCIAS EN LA DISPOSICIN DEL PEPTIDOGLICANO EN G(+) Y G (-)

PREGUNTAS 1. Todas las bacterias se colorean con la coloracin de Gram? mencione algunos ejemplos 2. De que manera las diferencias entre las paredes celulares Gram negativas y Gram positivas influencian la supervivencia en el ambiente, las posibilidades de deteccin por el laboratorio y el tratamiento de muchas bacterias? 3. Porqu las esporas son mas resistentes a las condiciones ambientales? 4. Porqu el alcohol rpidamente decolora las bacterias Gram negativas? 5. Enumere las funciones de la otra membrana de los Gram negativos? 6. Explique en trminos qumicos como se forma la capa de peptidoglicano en las bacterias?