Evolucin Histrica de la Biologa (VI): los primeros pasos de la Biologa Molecular (los aos 40)

Manuel Gonzalo Claros En 1938 sir William Thomas Astbury (1898-1961) y Florence Bell, de la Universidad de Leeds, proponen que el DNA debe de ser una de fibra peridica, al encontrar un espaciado regular de 0,33 nm a lo largo del DNA mediante estudios de difraccin por rayos X. En aquel momento Astbury vea que las bases estaban apiladas a 0,33 nm unas de otras, y perpendiculares al eje de la molcula; de hecho, era la distancia que separaba los tetranucletidos planos que haba propuesto Levene (ver captulo anterior: Encuentros en la Biologa, 86). Astbury sigui trabajando desde el punto de vista estructural sobre protenas fibrosas, como las queratinas, en la lana. Su preocupacin por la estructura de las molculas hizo que consiguiera en 1945 la primera ctedra deEstructura Biomolecular; adems fue el primer cientfico en denominarse bilogo molecular aprovechando que el trmino biologa molecular haba sido acuado en 1938 por Warren Weaver (1894-1978). Weaver era matemtico y director del departamento de ciencias naturales de la Fundacin Rockefeller, donde trabajaba sobre la visin molecular de la vida. Estas coincidencias llevan a muchos autores a proponer que el nombramiento de Astbury marca el nacimiento de la biologa molecular como rea de conocimiento independiente, tal cual la conocemos hoy: La biologa molecular es el dominio de la biologa que busca explicaciones a las clulas y organismos en trminos de estructura y funcin de molculas; las molculas ms frecuentemente analizadas son las macromolculas del tipo protenas, cidos nucleicos y glcidos, as como conjuntos moleculares del tipo membranas o virus (H. Salter). Este concepto de biologa molecular llev a una tendencia reduccionista de los problemas biolgicos, favoreciendo que lo que se desarrollase en primer lugar fuera su vertiente estructuralista, cuyo objetivo era el conocimiento de la estructura atmica de las macromolculas antes mencionadas y que coincida en buena parte con la bioqumica estructural. A continuacin, sin embargo, veremos cmo nace la vertiente informacionista, cuyo objetivo era estudiar cmo la informacin se transfiere entre generaciones. La vertiente informacionista estudia cmo la informacin biolgica se traduce en molculas especficas, por lo que se solapa con la gentica en muchos aspectos. Entre los estudios de Astbury y el final de la Segunda Guerra Mundial comienza a gestarse en el California Institute of Technology (Caltech) el grupo del fsico nuclear alemn, y discpulo de Niels Bohr, Max Ludwig Henning Delbrck (1906-1981), que luego sera conocido como el grupo del bacterifago. El grupo tom forma durante los aos que Delbrck pas en la Vanderbilt University, al coincidir con Salvador Edward Luria (1912-1991) y Alfred Day Hershey (1908-1997). El inters de estos investigadores se centraba en entender de qu manera las molculas transmiten informacin de una generacin a la siguiente. Para ello utilizaron el modelo ms simple que conocan, los bacterifagos (o simplemente fagos), posiblemente guiados por los experimentos del franco-canadiense Flix dHrelle (1873-1949), que en 1917 de mostr que los bacterifagos infectaban, mataban y disolvan las clulas bacterianas en poco ms de media hora, as como el hecho de que las bacterias eran capaces de desarrollar de forma natural una resistencia al fago. Fue dHrelle quien acu el trmino bacterifago para referirse al microorganismo antagonista del bacilo que causaba la disentera. El grupo del bacterifago se dedic a estudiar las mutaciones genticas, la estructura de los genes, y los ciclos vitales de los fagos. Aunque su labor fue muy importante, tuvieron que esperar hasta 1969 para que fuera reconocida con la concesin del Nobel a Delbrck, Luria y Hershey. De hecho, sus trabajos son el origen de la vertiente informacionista de la biologa molecular. En 1941, George Wells Beadle (1903-1989) y Edward Lawrie Tatum (1909 -1975), en la Universidad de Stanford, encontraron en el hongo Neurospora crassa slidas evidencias de una correlacin entre los genes y las enzimas mediante el estudio de

rutas metablicas implicadas en la sntesis de aminocidos. Postularon por primera vez dicha correlacin como un gen, una enzima. El mdico italiano Salvador E. Luria (conocido por el medio de cultivo para E. coli, el LB, que significa Luria broth) y Max Delbrck demostraron en 1943 que las mutaciones en E. coli ocurren al azar, sin necesidad de exposicin a agentes mutagnicos, y que estas mutaciones se transmiten siguiendo las leyes de la herencia. En 1928 el microbilogo Fred Griffith (1881-1941) haba descubierto cmo el Streptococcus pneumoniae avirulento puede transformarse en virulento al infectar un ratn sano con la cepa avirulenta viva y la virulenta muerta. Empleando esta capacidad del estreptococo, Oswald Theodore Avery (18771955), Colin MacLeod y Maclyn McCarty intentan desentraar la naturaleza del material gentico en el Instituto Rockefeller, durante 1944. Dominados por el modelo del tetranucletido plano, y en contra de sus propias expectativas, demostraron que las cepas avirulentas de Griffith se transformaban en virulentas con la exposicin al DNA, pero no a las protenas. Los experimentos de Avery, MacLeod y McCarty fueron puestos en entredicho, porque asociadas al DNA podran ir en cantidades nfimas las protenas portadoras de la informacin gentica. Precisamente, uno de los ms escpticos con estos resultados fue el propio Levene (el creador del modelo del tetranucletido plano). Se necesitaron todava unos aos para que se demostrara claramente que el DNA era el nico responsable del principio transformante. Siguiendo la lnea de pensamiento abierto por Avery y sus colaboradores, en 1946 Joshua Lederberg (1925-*) y Edward Tatum demuestran en la Universidad de Yale que las bacterias tambin intercambian material gentico en funcin de su sexo. Estos experimentos han tenido una honda repercusin en la terminologa biotecnolgica actual. As, al hecho de que la bacteria tome el DNA de una manera estable se lo denomina transformacin las bacterias avirulentas que no producan la neumona se transformaban en virulentas al tomar el DNA de una virulenta. En 1959, trabajando en el Caltech, el italiano Renato Dulbecco (1914 -*) introdujo tambin el concepto de transformacin para explicar que mezclando in vitro clulas sanas con virus productores de polioma y SV40 se pudieran obtener clulas de aspecto oncognico; o sea, que las clulas sanas se haban transformado en clulas cancerosas en contacto con los virus. Por esta dualidad de significado del trmino transformacin, se impuso el trmino transfeccin para hacer referencia a la entrada de DNA en clulas eucariotas. Los trabajos de Dulbecco sobre clulas cancerosas le valieron el Nobel en 1975. Debido a que la mayora de los problemas biolgicos eran prcticamente inaccesibles a la experimentacin directa, muchos fsicos, sobre todo fsicos nucleares, se interesaron por ellos, y su incorporacin fue determinante para el desarrollo de la biologa molecular. Por ejemplo, Niels Bohr (1885-1962) escribi en 1933 un ensayo titulado Light and Life que influy directamente en la forma de pensar de muchos fsicos sin ir ms lejos, su ya mencionado discpulo Max Delbrck, hacindoles volverse hacia los problemas biolgicos. Marie Curie, por su parte, empez a probar sobre material biolgico el efecto de las radiaciones. No olvidemos a los fundadores del grupo del bacterifago: Delbrck era fsico en Alemania antes de la Segunda Guerra Mundial, y Salvador Luria se inici estudiando la estructura de los virus en el Instituto Pasteur, junto al fsico Fernand Holweck. El mismo ao que Astbury fue nombrado profesor de Estructura Biomolecular (1945) el fsico cuntico Erwin Schrdinger (1887-1961) publica el libro Qu es la vida?, que para muchos autores es ms importante para el desarrollo de la biologa molecular que el nombramiento de Astbury. El libro de Schrdinger indica que las leyes de la fsica son inadecuadas para explicar las propiedades del material gentico y, en particular, su estabilidad durante innumerables generaciones. La concepcin vital expresada por el fsico en su obra se basa en dos supuestos: en el primero se concibe al cromosoma como un cristal aperidico capaz de almacenar informacin y memoria . En el segundo, se establece que los organismos mantienen su orden minimizando su entropa, alimentndose de entropa negativa o del orden preexistente en el entorno.

Manuel Gonzalo Claros es Profesor Titular de Biologa Molecular en la UMA

EVOLUCIN HISTRICA DE LA BIOLOGA (VIII): HACIA LA INGENIERA DE LA VIDA

M. Gonzalo Claros

Profesor del Dpto. de Biologa Molecular y Bioqumica, Universidad de Mlaga.

Con la introduccin del mtodo cientfico en la Biologa, se ha ido acercando a diseos de ingeniera: se pueden modificar genes y molculas casi a volundad. Pero antes, haba que descubrir cmo funcionan los genes. : se confirma molecularmente el modelo del opern. En 1956, los franceses Franois Jacob (1920-*) y Jacques Lucien Monod (1910-1976) demuestran la existencia de genes estructurales y reguladores, que se organizan en operones. Poco despus, en 1959, Jacob a cua el trmino episoma para explicar una transferencia especfica de algunos marcadores genticos entre bacterias. Este trmino, hoy en da, se considera sinnimo del plsmido de Lederberg y se usan indistintamente. Aunque los episomas son la base de los vectores de clonacin, lo ms destacable del trabajo de Jacob y Monod es que en 1960 dedujeron el modo de funcionamiento del opern de la lactosa de E. coli a base de mutaciones y fenotipos. Tambin les debemos la terminologa relacionada con los operones y su regulacin. En sus estudios postularon la necesidad de una molcula intermediaria (el mRNA) entre el DNA y las protenas Meselson y Brenner demostraron en 1961 la existencia de esta molcula . Por todo, Jacob y Monod obtuvieron el Nobel en 1965. Poco despus, en 1968, Monod escribe el libro El azar y la necesidad, que revolucion la filosofa de la vida: Monod argumentaba que la vida surge del azar y progresa como consecuencia necesaria de las presiones ejercidas por la seleccin natural. Apoyando los trabajos de Monod y Jacob, en 1967 en la Universidad de Harvard, Walter Gilbert (1932-*) aisla el represor LacI y Mark Ptashne aisla el represor del fago Al igual que en su da la aparicin de la revista The Journal of Biologial Chemistry supuso la consolidacin de la bioqumica, la aparicin en 1959 de Journal of Molecular Biology de la mano del sudafricano Sydney Brenner (1927-*), en la Universidad de Cambridge, supuso la confirmacin de la biologa molecular como un rea de conocimiento e investigaci n independiente. A partir de entonces, aumentan vertiginosamente los conocimientos sobre la transferencia de informacin en los seres vivos: en 1958 S. B. Weis describe la sntesis del RNA por una RNA polimerasa dirigida por DNA; la replicacin semiconservativa del DNA propuesta por Watson y Crick es confirmada experimentalmente por Mathew Stanley Meselson (1930-*) y Franklin Stahl (1910-*) en Caltech; en 1960 Stewar Linn y Werner Arber (1929-*), en Ginebra, descubren los sistemas de restriccin de las bacterias, ottro de los descubrimientos esenciales para la vertiente ingeniera de la Biologa. En 1961, en la Universidad John Hopkins, Howard Dintzis descubre que el mRNA se traduce en sentido 5 a 3, y que las protenas de sintetizan desde el extremo amino al carboxilo. Este descubrimiento proporciona la base para establecer por convenio que la ordenacin del DNA sea desde el extremo 5 al 3, y la de las protenas desde el extremo amino al carboxilo. A su vez, Ben Hall y Sol Speigleman hibridan DNA y RNA, lo que demuestra su complementariedad y sienta las bases de la hibridacin de los cidos nucleicos. En la dcada de 1960 se prest especial inters al modo en que se descodificaba el RNA en aminocidos. As, en 1964, Charles Yanofsky comprueba en la Universidad de Stanford que la secuencia de nucletidos del DNA se corresponde exactamente con la de aminocidos. Ya vimos que en 1956 Berg demostr que el tRNA era el que descodificaba la informacin del mRNA y aseguraba la interpretacin exacta de la informacin gentica. Por su pequeo tamao (de 73 a 93 nucletidos), abundancia e importancia, fue el primer cido nucleico que se intent secuenciar y cristalizar. En 1965 Robert William Holley (1922-1993) obtuvo en la Cornell University la secuencia de nucletidos completa del tRNA de la Ala en las levaduras (77 nucletidos), para lo que necesit purificarlo a partir de 90 kg de Saccharomyces cerevisiae, lo que le vali el Nobel en 1968. Marshall Warren Nirenberg (1927 y Har Gobind Khorana -*)

(1922-1993), en el National Heart Institute del NIH, acaban de descifrar el cdigo gentico en junio de 1966 gracias a la aplicacin de la polinucletido fosforilasa de Ochoa, lo que fue recompensado en 1968 con el Nobel, compartido con Holley. Szybalski y Summers demostraron en 1967 que el RNA se transcribe a partir del DNA. A comienzos de la dcada de 1970 se es consciente de que los problemas biolgicos se deben explicar desde un punto de vista molecular. La validacin de hiptesis deja de ser exclusivo de la biologa molecular y pasa a todas las reas de la biologa. Esto conllev un olvido temporal de los mtodos de observacin y descripcin prevalentes durante el siglo XIX y el comienzo del XIX. (le supondr el Nobel en 1980). Esto sirvi para que un ao ms tarde (197 Herbert Boyer 3) (1936-*) y Stanley Norman Cohen (1922-*), de forma independiente, expresaran en una bacteria un plsmido que contena un gen recombinante. Nace as la clonacin. Smith y Nathans, junto con Arber (el descubridor de los sistemas de restriccin), reciben el Nobel en 1978. A partir de entonces se empieza a dejar de purificar y caracterizar enzimas para empezar a clonar genes: son los primeros experimentos de ingeniera biolgica. En 1970 Gunter Blobel (1936-*) demuestra la existencia de secuencias seal y receptores para estas secuencias, que regulan el trfico de protenas dentro de la clula. Por ayudar a conocer las reglas de este trfico recibi el Nobel en 1999. Tambin en 1970, Hamilton Smith (1931 descubre las -*) enzimas de restriccin y purifica la primera, que fue HindII, a partir de Hemophilus influenzae. Un ao despus, Daniel Nathans (1928-1999) elabora el primer mapa de restriccin del DNA, y al ao siguiente, Janet Mertz y Ron Davis demuestran que un fragmento de restriccin poda ser insertado y ligado a otro DNA cortado por la misma enzima. Paul Berg el mismo que demostr que el tRNA mediaba entre el mRNA y las protenas construye en 1972 la primera molcula de DNA recombinante o quimera entre el DNA plasmdico de E. coli y DNA del fago Howard Martin Temin (1934-1994) haba demostrado que en algunos virus RNA no apareca DNA en ningn momento de su ciclo vital. Posteriormente obtuvo indicios de que algunos virus RNA eran capaces de sintetizar DNA usando su RNA como plantilla. En 1970, Temin y David Baltimore (1938-*) demostraron que la copia de RNA en DNA durante la infeccin de algunos virus se deba a una nueva actividad cataltica que denominaron transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (reverse transcriptase). Temin y Baltimore fueron galardonados por ello con el Nobel en 1975. En 1974 J. Schell y M. Van Montagu sealan que las enfermedades provocadas por Agrobacterium se deben a la existencia de plsmidos en las cepas, que se denominan Ti (tumor inducing) y Ri (root inducing) y sientan las bases de lo que luego ser la transformacin de plantas superiores al lograr transferir un gen quimrico al tabaco. En 1974 John Shine (1946-*) y Lynn Dalgarno (1935-*) presentan en Canberra (Australia) la secuencia consenso de fijacin de los mRNA a los ribosomas procariotas. Este mismo ao se celebra un congreso internacional en Asilomar (California), donde se regula el uso de microorganismos modificados genticamente y la tecnologa del DNA recombinante. A su vez, se obtiene la estructura tridimensional del tRNA de Phe, demostrndose que tena forma de L. La determinacin de esta estructura es uno de los mltiples casos en los que dos laboratorios, el MIT americano y el MRC ingls, no compitieron limpiamente para ver quin publicaba primero los resultados. Como resultado de esta desafortunada carrera, poco ms se ha avanzado hasta hoy sobre la estructura de estas molculas. En 1975 el alemn Georges J. F. Khler (1946-1995) y el argentino Csar Milstein (1927-*), trabajando en el Medical Research Council britnico en Cambridge, fusionan clulas para producir anticuerpos monoclonales. Se trata del primer caso serio de aplicacin biotecnolgica de los resultados obtenidos por la ciencia bsica, por lo que se les galardon con el Nobel en 1984. Edward M. Southern (1938-*) desarrolla en Edimburgo la hibridacin de cidos nucleicos en soporte slido. En este mismo ao Walter Fiers, en la Universidad de Gante, publica la primera secuencia de nucletidos larga, la del fago MS2, gracias a un sistema de secuenciacin ms-menos que ide Fred Sanger. En 1977 Alan M. Maxam y Walter Gilbert (el mismo Gilbert que aisl el represor LacI y que acuara ms adelante los trminos intrn y exn) describen la secuenciacin qumica del DNA. Por su lado, Fred Sanger, el que vimos que secuenci por primera vez una protena, perfeccion su sistema ms -menos y lo convierte en el mtodo de secuenciacin con didesoxinucletidos, con lo que la obtencin de secuencias de DNA se convierte en una tcnica accesible a cualquier laboratorio. Gilbert y Sanger reciben el Nobel por ello en 1980 (se trata del segundo Nobel de Sanger). A partir de este momento, no basta con clonar los genes, sino que tambin hay que secuenciarlos. En 1977 Richard John Roberts (1943-*) y Phillip Allen Sharp (1944-*) descubren, de forma independiente y gracias que colaboraron francamente, que los genes eucariotas no son

continuos, lo que les valio el Nobel en 1993. Los trabajos de Roberts permitieron que en la dcada de 1970 se purificaran y comercializaran ms de 100 enzimas de restriccin. En 1978 Tilgman visualiza los intrones como lazos de DNA que no hibridan con el mRNA que producen. Los trabajos que realiz Keith Backman en el laboratorio de Mark Ptashne en la Universidad de Harvard hasta 1978 demostraron que los elementos genticos (promotores, sitios de unin al ribosoma, secuencias codificantes...) se podan reordenar en nuevas combinaciones funcionales. Es el nacimiento de la ingeniera gentica.