AMPLIFICACIN IN VITRO DEL ADN: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR Considerada hoy da como una herramienta imprescindible en el laboratorio

de biologa molecular e ingeniera gentica, el objetivo de esta tcnica es la amplificacin directa de un gen o un fragmento de ADN, o indirecta de un ARN (en este caso, a travs de su ADN complementario, o cADN), presentes en mezclas de muy diversas fuentes, sin necesidad de una purificacin previa de la muestra ntegra original. Se puede partir de homogenados, extractos, crudos de tejido, sangre completa, mezclas de fragmentos de ADN obtenidos con enzimas de restriccin, muestras resultantes de la extraccin y aislamiento de ADN, etc. Sin embargo, debe resaltarse que, por razones que se comprendern ms adelante, es un requisito imprescindible que se conozca la secuencia de una parte de la regin de ADN o ARN que se quiere amplificar (salvo en el caso de algunas variantes del mtodo clsico, como la PCR inversa). Por estas caractersticas, en especial la capacidad de amplificacin, la PCR es un mtodo muy adecuado para preparar cidos nucleicos en una cantidad muy superior a la de la muestra original, tanto como mtodo de clonacin acelular como para la deteccin.

Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas y variadas. Como ejemplos, pueden citarse: clonacin acelular de fragmentos de ADN, deteccin de secuencias sin purificacin previa, secuenciacin de cidos nucleicos, establecimientos de polimorfismos de secuencia, rastreo de mutaciones, tipado de ADN para trasplantes, diagnstico de enfermedades genticas prenatales o no, determinacin de secuencias especficas de ADN relacionadas con situaciones patolgicas definidas, resolucin de problemas forenses o arqueolgicos, estudios evolutivos, deteccin de microorganismos infecciosos, deteccin de clulas tumorales, amplificacin de ADN para su posterior clonacin celular, etc. PRINCIPIO DEL MTODO La PCR no es una tcnica analtica per se, sino ms bien una metodologa, resultante de la aplicacin prctica de tres conceptos: 1) Desnaturalizacin del ADN para dar hebras sencillas. 2) Hibridacin especfica de la hebra sencilla con un oligonucletido. Tambin se denomina etapa de templado (entendido como disminucin de temperatura que permite la reasociacin de hebras sencillas tras la desnaturalizacin trmica). sta es la etapa que explica por qu se debe conocer parte de la secuencia. 3) Replicacin de la hebra sencilla por una ADN polimerasa a partir del oligonucletido anterior como cebador: tambin, elongacin o extensin del cebador, o polimerizacin.

Mediante la aplicacin en forma cclica de estos tres procesos se consiguen mltiples copias del fragmento de cido nucleico en un corto espacio de tiempo, como se ver a continuacin. A pesar de esta aparente complejidad, en teora es un mtodo sencillo, sensible y relativamente rpido para amplificar secuencias. En la prctica, se requiere un control preciso de las variables que condicionan este triple proceso (secuencia diana, cebador, enzimas y resto de componentes), adems de instrumentos adecuados (termocicladores de ADN) para establecer las condiciones de cada etapa y repetirlas cclicamente (tiempo, temperatura, nmero de ciclos, etc). Se consigue as amplificar secuencias de tamaos diversos, comprendidos entre 50 pb y 2,5 kb. Para la realizacin prctica se precisan en la mezcla de reaccin los siguientes reactivos : a) Los cuatro dNTPs, en exceso, como sustratos para la sntesis de las innumerables copias de ADN. Para ser reconocidos por la polimerasa, deben ir acompaados de Mg2+. b) Dos oligonucletidos de cadena sencilla (coloquialmente, oligos ), generalmente sintticos, de 18 a 30 nt. Sus secuencias han de ser complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3 de la regin diana, uno en cada hebra, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicacin de las dos hebras en la regin diana. Por esta razn no se puede amplificar una regin de ADN si no se conoce la secuencia de sus dos extremos. De hecho, es la posicin donde hibridan los cebadores la que define la longitud del fragmento que se amplifica (secuencia diana).

c) Una ADN polimerasa termoestable, es decir, enzimticamente activa a temperaturas relativamente altas (al menos 75C, y estable con frecuencia hasta 95C). Esta caracterstica permite su actuacin en sucesivos ciclos sin inactivarse; adems, la replicacin a temperaturas elevadas impide la formacin de hbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. La enzima ms empleada se llama polimerasa taq, por proceder de la bacteria Thermus aquaticus, que vive en manantiales de agua caliente. Esta enzima tiene el inconveniente de carecer de la actividad correctora de pruebas (exonucleasa 3 ), por lo que la frecuencia de errores es superior a la de la replicacin (alrededor de un error por cada 5000 nucletidos incorporados); de ah que en ocasiones se sustituya por otras ADN polimerasas termoestables.

ETAPAS DEL PROCESO Como ya se ha indicado, se requiere una sucesin de ciclos (generalmente entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de duracin cada uno) de desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una enorme amplificacin del nmero de molculas que contienen la secuencia de inters o diana. La duracin total es de alrededor de 2 horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas. Cada ciclo de una PCR consta, pues, de tres etapas: 1) Desnaturalizacin: Calentamiento para la separacin de las dos hebras del ADN, mediante una incubacin breve (30-120 s) a una temperatura entre 68 y 97 C, que debe ser superior a la de fusin de la regin de ADN que se quiere amplificar. 2) Templado (o hibridacin): Enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas de ADN de inters con los oligos cebadores. Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65 C que se mantienen entre 10 y 120 s. 3) Elongacin (o replicacin): Etapa de amplificacin propiamente dicha (72-75 C, 1-3 min), en la que la ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin 5 - 3 a partir del extremo 3 OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de desnaturalizacin (siguiente ciclo). Adems de las 3 etapas de cada ciclo, comnmente se aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa, a elevada temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalizacin), sirve bsicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, as como para asegurar la desnaturalizacin completa del ADN de partida, especialmente si ste es de gran tamao o posee regiones muy compactadas (caso de un ADN genmico completo). La etapa final, por su parte, consiste en una prolongacin de la ltima elongacin, para permitir que se completen todos los fragmentos.