DETERMINACIN DE PESO SECO Y PESO HMEDO

PRACTICA N 2: DETERMINACIN DEL PESO SECO Y PESO HMEDO

I.

INTRODUCCIN

La centrifugacin es un mtodo que utiliza la propiedad de sedimentacin de partculas con base en la masa de las molculas para la separacin de partculas de una solucin. Una vez obtenido el lisado o homogenizado celular se ha de proceder a su fraccionamiento.

Una de las tcnicas ms empleadas es la centrifugacin. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulacin en el fondo del mismo de las partculas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran.

As, despus de la centrifugacin la muestra, homognea, se habr separado en dos fracciones: sobrenadante (supernatant), fraccin homognea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.

La fuerza centrfuga es aplicada a cada partcula de la muestra la cual ser sedimentada en un ndice que es proporcional a la fuerza centrfuga aplicada.

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II.

OBJETIVOS Determinar la concentracin en peso hmedo y seco de una muestra desconocida. Determinar la cantidad de cel/ml en la solucin, utilizando la cmara de Neubauer. MARCO TEORICO

III.

Las centrfugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentacin en poco tiempo de las partculas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en funcin de los mrgenes de aceleracin a que someten a las muestras en: centrfugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrfugas (o centrfugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrfuga (de 15000 g a 600000 g). En las centrfugas se suele controlar la temperatura de la cmara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la friccin. En la ultracentrfuga, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vaco en la cmara de la centrfuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. En una centrfuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos: Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposicin perpendicular al eje de giro. As pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.

Rotor de ngulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sita paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es tpico de ultracentrfuga y se emplea en separaciones de molculas en gradientes de densidad autogenerador (por ej. de cloruro de cesio).

Los parmetros a tener presentes en cualquier centrifugacin, que determinarn las condiciones son:

Volumen de solucin a centrifugar, que determinar el tipo de tubos y rotores a emplear.

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Naturaleza qumica de la solucin, que determinar la naturaleza del tubo a emplear Diferencial de densidad entre la partcula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleracin) sedimentar. Cuando el diferencial es muy pequeo se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podr centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ngulo de giro, el radio mnimo, medio y mximo, y la velocidad mxima de giro. La relacin entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleracin (fuerza centrfuga relativa, RCF: relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresin siguiente: RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2 NOTA: Si usted desea conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la frmula de fuerza de centrifugacin relativa:

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Centrifugacin diferencial La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de ms tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimentan de nuevo las partculas ms densas presentes y as sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y obtener una coleccin de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de diferente tamao y/o densidad

SEDIMENTACIN La sedimentacin es el transporte de partculas en un campo de fuerza de centrifugacin. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromolculas y organelos celulares. Coeficiente de sedimentacin Los principios bsicos de la teora de sedimentacin, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentacin de una esfera en un campo gravitacional, para as mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a travs del lquido. Coeficiente de sedimentacin 1 drS=-----X-----W2 r dt

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W: velocidad del rotor Dr/dt: ndice de movimiento de dos partculas (cm/s) Velocidad de sedimentacin Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas para realizar una centrifugacin en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Despus de un tiempo las diferentes poblaciones de partculas se sitan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeo orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamente de la ultracentrifugacin preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentacin de una partcula (medida en unidades Svedverg, (S). Los coeficientes de sedimentacin son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10-13s. De esta manera, una partcula cuyo coeficiente de sedimentacin es medido en 10-12s.= 10x10-13s., es decir que tiene un valor de 10S. Una partcula en un campo gravitacional se comporta segn la LEY DE STOKES.

Donde: V = velocidad de sedimentacin d = dimetro de la partcula P = densidad de la partcula L = densidad del lquido = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional Se cumple:

La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula. La velocidad de sedimentacin es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula. La velocidad de sedimentacin es 0, cuando la densidad de la partcula igual a la densidad del medio circundante. La velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio La velocidad de sedimentacin aumenta al aumentar la fuerza del campo centrfugo. El coeficiente de sedimentacin es una constante caracterstica de cada organelo o macromolcula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor.

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El tiempo de centrifugacin hasta la clarificacin de una organela se define por: K T (horas)= --S Donde: S= coeficiente de sedimentacin de la organela K= constante del rotor. (Depende del ngulo de inclinacin del tubo de respecto al eje de rotacin). IV. centrifugacin con

PROCEDIMIENTO Se utilizo un matraz en el cual se agreg 1 gr. de levadura en 100 ml de agua potable. Lugo se homogeniz y se prepar cuatro tubos de ensayo previamente rotulados y pesados en donde se adiciono 5 ml de la solucin homogenizada a cada tubo. Luego se procedi a llevar a la centrifuga por un tiempo de 10 minutos a 500 rpm. Despus del centrifugado se elimin con mucho cuidado el sobrenadante. Una vez eliminado el sobrenadante se llev a la estufa los 4 tubos de ensayo a una temperatura de 105 C por un tiempo de 2 horas. Luego de las 2 horas se volvi a pesar los tubitos y as poder hallar el peso del sedimentado por diferencia de pesos. Por ltimo se procedi a realizar el conteo de las clulas existentes mediante el mtodo de la cmara de neubauer.

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V.

RESULTADOS

CUADRO 1: CONTEO DE CELULAS EXISTENTES EN LAS MICROCELDAS

CUADRO 2: DATOS ESTADISTICOS OBTENIDOS DESPUES DEL RECUENTO EN EL MICROSCOPIO. N 1 2 3 4 Promedio C.V. D.S.
PESO TUBO PESO HMEDO PESO SECO [cel/ml]

11.0014 8.6224 11.0392 10.4942

0.0113 0.0164 0.0169 0.0173

0.0098 0.0144 0.0144 0.0137

VELOCIDAD DE CENTRIFUGACIN
v = rpm 2 x ( r )

r = distancia del brazo de la centrifuga V= (500rpm)2x 8.6cm

500 rev 2 2 m in 1m v = x x x (8.6cm ) x m in 1rev 60 seg 100 cm v = m / seg .

VI.

DISCUSIN

En el cuadro podemos darnos cuenta que los pesos finales no fueron similares, esto se puede deber a que la solucin no fue homogenizada en su totalidad y eso dio como consecuencia que la cantidad de sedimentado en cada tubito de ensayo no sea el mismo. Este tipo de sedimentado que se di es la Sedimentacin por gravedad, segn Tood, Stanford (1988) si la densidad de la partcula () es mayor que la densidad del disolvente (o). Esto se puede deducir a partir del Principio de Arqumedes. Segn este principio, cuando se sumerge un cuerpo en un fluido, el cuerpo experimenta una fuerza E (empuje) de sentido opuesto al Peso (P), que tiene igual valor que el peso del lquido que ha desplazado. Este principio, tambin conocido como la Ley de Hidrosttica, se aplica a los cuerpos, tanto en flotacin, como sumergidos y a todos los fluidos. El principio de Arqumedes tambin hace posible la determinacin de la densidad de un objeto de forma irregular, de manera que su

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volumen no se mide directamente. Si el objeto se pesa primero en el aire y luego en el en agua, entonces la diferencia de estos pesos igualar el peso del volumen del agua cambiado de sitio, que es igual al volumen del objeto. As la densidad del objeto puede determinarse dividendo el peso entre el volumen. La centrifugacin impone gracias a la aceleracin centrifuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partculas experimentan una aceleracin que las obliga a sedimentar. La centrifugacin puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analtica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que en la segunda se procede al anlisis de las macromolculas en una ultracentrifugacin. Existen diversos mtodos de centrifugacin y una extensa variedad de tcnicas derivadas de esta. El objetivo de la centrifugacin es separar partculas de diferentes caractersticas. Para ello, se aplica un fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del medio en el que se encuentren con la aceleracin G.

VII.

CONCLUSIONES
Se determin la biomasa de la levadura mediante el mtodo de peso seco.(utilizando la centrifuga) Determinamos la cantidad de cel/ml en la solucin, utilizando la cmara de neubauer.

VIII. BIBLIOGRAFA

1.-Tood, Stanford. Diagnstico y tratamiento clnico por el laboratorio. 1988. Salvat. Tomo I. Pg 14. 2.http://www.scribd.com/doc/13587987/Centrifugacion.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento. htm 3.-http://tecn.rutgers.edu/bio356/lectures/DNAprep.html 4.-http://ginger.cc.utexas.edu/ithk310/sedimentation.html

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