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Curso 2011
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires
Sumario
Introduccin Inseminacin artificial Superovulacin / Transferencia de embriones Produccin de embriones in vitro Micromanipulacin Criopreservacin Aplicacin a diferentes especies animales
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Conclusiones Referencias
Introduccin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
En la mayora de las especies domsticas existen entre 300.000 y 500.000 ovocitos por ovario en el momento del nacimiento. El ciclo estral en bovinos tiene una duracin de 21 das. En bovinos se produciran 17,4 ovulaciones por ao y 261 ovulaciones en 15 aos. La capacidad reproductiva de la hembra bovina es menor en comparacin a su potencial.
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
La biotecnologa de la reproduccin est fundamentalmente orientada a aumentar la capacidad reproductiva de las hembras.
Ovario
Folculo Primario Folculo Terciario
Folculo Secundario Folculo atr sico Cuerpo blanco Cuerpo hemorrgico Cue rpo lteo
Crecimiento Folicular
Independiente de gonadotrofinas
Folculo preantral Folculo en crecimiento Folculo antral temprano
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Control intraovrico
Control gonadotrofinas
Folculo antral
Ovocito Ncleo
Clulas de la granulosa
Ovocito
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
CL
Folculo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Ovario
Ovulacin Progesterona CA
Atresia
Estradiol PGF2
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
FSH LH
Ciclo estral
Dinmica folicular
Dimetro de los folculos (mm)
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 2
Folculo ovulatorio
Onda ovulatoria
10 12 14 16 18 20 22
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 2 4
GnRH
PF2
Folculo ovulatorio
10 12 14 16 18 20 22
Inseminacin artificial
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Oviducto
102
Vagina Cervix tero Unin tero-tubal
Sitio de fertilizacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
107
105
103
Gradiente en el nmero de espermatozoides viables despus del servicio en el tracto genital de la hembra
Control de enfermedades venreas Eliminacin de costos asociados al toro Uso de machos incapacitados Transporte y conservacin prolongada de material gentico Utilizacin de semen sexado
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Regin frica Norteamrica Sudamrica Lejano Oriente Oriente Medio Europa Total
Dosis producidas congeladas 1.484.850 43.270.500 5.917.269 63.938.027 2.559.640 115.176.785 232.347.071
Produccin animal Animales de compaa Deportes (perros, caballos) Investigacin Animales transgnicos Medicina humana
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Menor fertilidad
- Dosis de inseminacin reducidas (2x106) - Espermatozoides con reducida fertilidad
- Test de progenie - Aumento de la presin de seleccin - Asociado con otras tecnologas (superovulacin y transferencia de embriones, fertilizacin in vitro)
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
La superovulacin y transferencia de embriones permite incrementar la tasa reproductiva de hembras de alto valor gentico
Donante
Receptoras
Cras de la donante
Hormonas utilizadas:
Gonadotrofinas extradas de la hipfisis de porcinos u ovinos (pFSH y oFSH) - Relacin FSH/LH variable - Vida media corta, mltiples aplicaciones - Riesgo de Encefalopata Espongiforme Bovina (EEB) Gonadotrofina de yegua preada (eCG) - Vida media larga, anticuerpos anti-eCG Gonadotrofina de la menopausia humana (hMG) - Alto costo FSH y LH recombinante - Alto costo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Da 1
Da 6-8
Morfologa embrionaria
Embriones bovinos da 4 Embriones bovinos da 8
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Bsqueda de embriones
A A B
Interaccin patgenoembrion
zona pelcida
C
patgeno
Lavado de embriones
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Embriones no aceptables
Catter de transferencia metlico (Mintb, Alemania) Cargado de la pajuela empleada para la transferencia
Algodn Aire
Aire
Medio de cultivo
Medio de cultivo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Fertilizacin in vitro
Cultivo in vitro
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Reinicio de la meiosis
Vesicula germinal 10-12 h Metafase I 10-12 h Metafase II
CP
Inhibidor de la meiosis
Inhibidor de la meiosis
MPF
MAPKinasa
Vescula Ruptura de la germinal vescula germinal
Pico preovulatorio de LH Remocin del ovocito del folculo
Ovulacin Fertilizacin
Fertilizacin in vitro
Gradiente de Percoll
Antes de la centrifugacin Despus de la centrifugacin
90% Percoll
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Proncleos
2do CP 1er CP
1er y 2do CP
1er CP
Espermatozoide que no penetr la zona pelcida Proncleos
Estadio pronuclear
Embrin de 2 clulas
Embrin de 4 - 8 clulas
Mrula
Blastocisto expandido
Blastocisto protrudo
- Concentracin de O2: 5%
Biotecnologa en reproduccin animal
- Medio de cultivo: SOF (Synthetic Oviductal Fluid) . . + aminocidos + seroalbmina bovina (BSA)
Los embriones producidos in vitro son menos viables que los producidos in vivo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
- Menor tasa de preez despus de la transferencia - Mayores prdidas fetales durante la gestacin
Bomba de vaco
Ecgrafo
Transductor
Mango
Aguja 19-G
Conector de acero
Tubo de silicona
Tubo de acero
Transductor
Aguja
Pared rectal
Cervix
Investigacin bsica: - Produccin de embriones en diferentes estadios de . desarrollo a bajo costo a partir de ovarios de animales . sacrificados para consumo Aplicaciones comerciales: - Produccin de mayor nmero de embriones - Menor intervalo generacional por uso de animales . prepberes (OPU) - Obtencin de embriones de vacas preadas (OPU) - Obtencin de embriones de vacas que no pueden ser . superovuladas y/o con problemas reproductivos (OPU) - Obtencin de embriones de animales muertos
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Base para el desarrollo y/o aplicacin . de otras tcnicas: - Clonacin - Produccin de animales transgnicos
Micromanipulacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Unidad de micromanipulacin
Tomado de: Palma et al., Rev. Arg. Med. Vet.,1991.
Biopsia y sexado
Blastmero
PCR
Micropipeta
Inyeccin pronuclear
Ovocito fecundado
Micropipeta
Proncleo
Transplante nuclear
Ovocito en MII Enucleacin
Clula donante
Transplante nuclear
Blastocisto
Micropipeta
Clulas inyectadas
Criopreservacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Congelamiento gradual
Seeding
Vitrificacin
- No hay formacin de cristales de hielo - Alta concentracin de crioprotector: mayor . probabilidad de dao osmtico y por toxicidad - Bajo costo: enfriamiento directo en N2 lquido
Refrigeracin
- Enfriamiento a 4 oC por 24 a 72 h
Termo de nitrgeno lquido
Tapn algodn
Crioprotectores permeables:
- Glicerol - Dimetilsulfxido (DMSO) - Propilenglicol - Etilenglicol
Crioprotectores impermeables:
Embrin en solucin con crioprotectores
Africa Amrica del Norte Amrica del Sur Asia Europa Oceana Total
73.952
45.166
46.630
2.040
48.670
- Recuperacin mas eficaz de individuos exticos y razas en . peligro de extincin - Conservacin in vitro por tiempo indefinido de una amplia . variedad de especies mamferas
Micromanipulacin
- Produccin de mellizos idnticos para investigacin o aumentar . la eficiencia de los programas de transferencia de embriones - Clonacin por transferencia nuclear, inyeccin pronuclear o . produccin de quimeras para generar organismos transgnicos Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
3. IIUP
2. IIU
Unin terotubal (UUT)
Ovario
1. IA
Deteccin de celo
Maduracin in vitro:
- Maduracin nuclear: FSH, LH - Maduracin citoplasmtica: EGF, clulas del . cmulus, cistena.
Fertilizacin in vitro:
- Variabilidad del semen: fresco, criopreservado - Contenido de glutatin. - Factores para reducir poliespermia. - Formulacin de medio de FIV (TALP, mTBM)
Cultivo in vitro:
- Modified Whittens medium - North Carolina State University 23 medium - Iowa State University medium - Beltsvile Embryo Culture Medium 3
Superovulacin
- No existe producto comercial para superovular yeguas: Las hormonas eCG, GnRH y . FSH porcina no son activas. Extracto de pituitaria equina (EPE) aumenta 3-4 veces . la tasa de ovulacin. - Aplicaciones de la superovulacin: TE, puncin folicular, fertilizacin in vitro, ICSI, . criopreservacin.
Blastocisto expandido
Blastocele
Trofoblasto
Zona Pelcida
30 15
10.725
234
Transferencia de ovocitos
- Recoleccin de ovocitos: De folculos preovulatorios (madurados in vivo), o durante el diestro . (maduracin in vitro) - Aplicaciones de la transferencia de ovocitos: Infecciones uterinas persistentes; estudios sobre . maduracin de ovocitos in vitro; como alternativa a la FIV
Criopreservacin
- Congelacin gradual o vitrificacin - Embriones producidos in vitro son mas sensibles
Total
Estacionalidad de la actividad . reproductiva, que es mas marcada en los . camlidos silvestres (vicua y guanaco) Ovulacin inducida: 22 a 46 h despus de . la cpula Alta mortalidad embrionaria
Hbridos
Poblacin mundial: 163 millones de cabezas Produccin importante en regiones pantanosas y anegadizas, . donde es irremplazable Baja eficiencia de superovulacin y recoleccin de embriones
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Desarrollo de sistemas de produccin de embriones in vitro a . partir de ovarios de matadero o de animales vivos a travs de . la puncin folicular En India 124 embriones fueron recolectados in vivo, 78 fueron . transferidos frescos y 19 congelados en el 2002. Adems 265 . embriones de bfalo estn almacenados
Existen 2,4 millones de cabezas en 4.500 establecimientos. Altamente estacionales: La actividad ovulatoria comienza en . otoo, los partos estn sincronizados en el verano.
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
La produccin in vitro de embriones sera la mejor alternativa . para el uso eficiente del semen recuperado. En 2002, se colectaron ms de 1.000 embriones; cerca de . 800 fueron transferidos. Canad report preeces de . embriones producidos in vitro.
- Recuperacin mas eficaz de individuos exticos y razas en . peligro de extincin - Conservacin in vitro por tiempo indefinido de una amplia . variedad de especies mamferas
Micromanipulacin
- Produccin de mellizos idnticos para investigacin o aumentar . la eficiencia de los programas de transferencia de embriones - Clonacin por transferencia nuclear, inyeccin pronuclear o . produccin de quimeras para generar organismos transgnicos Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Referencias
1. Palma, G.A. Biotecnologa de la Reproduccin. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Gordon, I. Controlled reproduction in cattle and buffaloes. Centre for Agriculture and Biosciences International (CABI), 1996. 3. Karow, A.M. and Critser, J.K. Reproductive tissue banking. Academic Press, 1997. 4. Stringfellow, D.A. and Seidel, S.M. Manual of the International Embryo Transfer Society, IETS, 1998. 5. Larocca, C. Transferencia de embriones y biotecnologa rea de Biotecnologa de la Reproduccin Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de la Repblica, Montevideo, Repblica Oriental del Uruguay. Libro electrnico, 2001.
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal