Distribuidora de Reactivos y Agentes de Diagnstico para Laboratorio

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Inserto Antgeno Carcinoembrionario (CEA) EIA

MONOBIND, INC. ANTGENO C ARCINOEMBRIONARIO (CEA) Cdigo de Producto: 1825-300 Intensin de uso:
La determinacin cuantitativa de la Carcinoembrionario (CEA) en suero inmunoenzimomtrico de microplato. Concentracin del Antgeno humano por un ensayo Despus de obtenido el equilibrio, la fraccin del anticuerpo-limite es separado del antgeno desatado por la decantac in o la aspiracin. La actividad enzimtica en anticuerpo-limita la fraccin es direc tamente proporc ional a la concentracin del antgeno nativo. Utilizando varias diversas referencias del suero de los valores del antgeno c onocido, una curva de la reaccin a c ierta dosis puede ser generada de la cual la conc entracin del antgeno de un desconocido puede ser comprobada.

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA.

El antgeno Carc inoembrionario (CEA) es una glicoprotena con un peso molecular de 180 kDA. El CEA es el primero de las nombradas protenas carcinoembrionarias que fueron descubiertas en 1965 por Gold y Freeman(1). El CEA es el marcador ms amplio usado para el cncer colo-rectal. A pesar de que el CEA est primariamente asociado con cncer colo-rec tal, otros males que pueden causar niveles elevados de CEA incluyendo senos, pulmn, estmago, pncreas , ovarios y otros rganos. Condiciones benignas que causan significativamente ni veles ms altos que los normales incluyendo inflamacin de pulmn y tracto Gastrointestinal (GI) y cncer benigno de hgado (2,3). Fumadores frecuentes, como grupo, tienen la concentracin mas alta que la lnea base de lo normal. En este mtodo, el calibrador CEA, el es pcimen del paciente o control es primero agregado a un pozo cubierto de streptavidin. El Monoclonal Biotinilado y anticuerpos etiquetados de enzima (directamente contra epitopes distintos y diferentes de CEA) son agregados y mezclados los reactivos. La reaccin entre varios anticuerpos de CEA y CEA nativos forma un sndwich complejo que ata con el streptavidin cubierto al pozo. Despus de completado el periodo de incubacin requerido, el anticuerpo de la enzima-CEA conjugada limite es separada de la enzima-CEA ilimitada conjugada por la aspiracin o decantacin. La actividad de la enzima presente sobre la s uperficie del pozo esta cuantificado por la reaccin con un sustrato adecuado para producir luz. El empleo de varias referencias de niveles de Antgeno Carcinoembrionario (CEA) conocida permite la construccin de una curva de respues ta de una dosis a la actividad y concentracin. De la comparacin de la dosis de la curva de respuesta, la actividad de un espcimen desconocido puede ser correlacionada con la concentracin de CEA.

REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO A. Antgeno Car cinoembrionario (CEA) -- 1ml/vial - frascos del A-F Seis (6) frascos de referencia de Antgeno CEA en niveles de 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D), 50(E) y 250(F) ng/ml. Almac n en 2-8C. Se ha agregado un preservativo. Nota: Los estndares, basados en suero humano, fueron calibrados usando una preparacin de referencia, la cual fue analizada contra la 1 Preparacin de Referencia Internacional (IRP# 73/601). B. TRAZADOR DE CEA - 13ml/vial. Un frasco (1) que contiene antic uerpo etiquetado de enzima, biotinilado monoclonal de ratn IgG en solucin, tinte y preservativo. Almacn de 2-8C C. 96 Pozos de Reaccin a la Luz - icono ? Un (1) microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en una bolsa de aluminio con un agente deshidratador. Almacn en 2-C. D. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA - 20ml - Icono Un (1) frasco que contiene un surfactante en solucin salina. Preservativo agregado. Almacn en 2-30 C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). A E. REACTIVO DE SEAL A -- 7ml/botella del icono S Un (1) bote que contiene Luminol en solucin. Almacn en 2-8C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). F. REACTIVO DE SEAL B -- 7ml/botella del icono SB Un (1) bote que contiene el perxido de hidrgeno (H O) en solucin. Almacn en 2-8C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). G. INSERTO DE LA PRUEBA. Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del kit. Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estn almacenados en 2-8C. Nota 3: Los reactivos son para un s olo microplato de 96-pozos. MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO: 1. Mida con una pipeta capaz de entregar los volmenes 25l y 50l con una precisin mejor de 1.5%. 2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.300ml con una precisin de mejor de 1.5%. 3. Lavador de Micro plac as o una botella de apretn (opcional). 4. Luminmetro de Microplatos. 5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la micro placa. 6. Plstico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la inc ubacin. 7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado. 8. Contador de tiempo. 9. Materiales del control de calidad.

PRINCIPIO
ENSAYO INMUNOENZIMOMTRICO (Tipo 3): Los reactivos esenciales requeridos por un ensayo Inmunoenzimomtrico incluyen alta afinidad y antic uerpos espec ficos (enzima e inmovilizado) con diferentes y reconocimiento distinto eptome, en exceso y antgeno nati vo. En este procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el ensayo en la s uperficie del micro pozo a travs de la interaccin de streptavidin recubierto en el pozo y exgeno agregado anticuerpo monoclonal biotinilado anti-CEA. Mezclando el anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo etiquetado y un suero que contienen el antgeno nativo, la reaccin de la competicin resulta entre el antgeno nativo y los anticuerpos, sin la competencia o steric hidrance, para formar un sndwich complejo soluble. La interaccin es ilustrada por la ecuacin seguida:

PRECAUCIONES
Para el Uso De Diagnstico in Vitro. No Para Uso Interno o Externo en Seres Humanos o Animales. Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antgeno superfic ial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer termine el as eguramiento que los agentes infecciosos estn ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la s angre se pueden encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgic os y biomdicos ," 2da Edicin, 1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la reaccin de alta afinidad de streptavidin y anticuerpo biotinilado. Esta interaccin esta ilustrada abajo:

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION

Los espec imenes sern sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente en la c oleccin de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para la comparacin exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la maana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo llano de venipunctura de tapn rojo sin aadidos o anticoagulantes. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espcimen para s eparar el suero de las clulas. Las muestras se pueden refrigerar en 2-8C por un perodo mximo de cinco (5) das. Si el espcimen no s e puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20C por hasta 30 das. Evite congelar y deshelar. Cuando sea analizado en duplicado, se requiere 0.050ml del espcimen.

PR EPARACION DE LOS REACTIVOS:

1. SOLUCIN LAVADORA. Diluir contenidos del concentrado lavador con 1000ml con agua desionizada o destilada en un contenedor adecuado para almacenar. Almacnese a temperatura ambiente 20-27C. has ta por 60 das. 2. SOLUCIN DE TRABAJO REACTIVO DE SEAL. Mezcle volmenes iguales de Reactivo de Seal A y Reactivo de Seal B en un contenedor limpio. sese dentro de las 36 horas siguientes. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos (2) tiras de oc ho pozos (se crea un pequeo exceso de solucin). Desec he la porcin sin usar.

* Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basars e en la curva preparada con cada ensayo. En adicin, los RLUs de los calibradores han sido normalizados aproximadamente a 100,000 RLUs para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversin elimina las diferencias causadas por la eficiencia de varios instrumentos que pueden s er usados para medir la salida de luz.

PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA.
Antes de proceder con el ensayo, tenga todos los reactivos cerca, las referencias del suero y controles a temperatura ambiente (20-27C). 1. Ajuste el formato de todos los pozos para cada referencia de suero, controles y espcimen del paciente a ser ensayados en duplicado. Reempaque cualquier tira de micro pozos dentro de la bolsa de aluminio, sllese y gurdese a 2-8C. 2. Pipetear 0.025 ml (25l) de la referencia de suero apropiada, diluir el control o espcimen en los pozos designados. 3. Aada 0.100 ml (100l) del trazador del reacti vo CEA a cada pozo. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo cubierto. 4. Remolinear el mic ro plato gentilmente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 45 minutos a temperatura ambiente. 6. Descarte los contenidos del micro plato por decantacin o aspirac in. Si decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con toalla absorbente. 7. Agregue 350l de solucin lavadora (ver la seccin de preparacin de reactivos) decante (golpee y borre) o aspire. Repetir cuatro (4) veces adicionales para un total de c inco (5) lavados . Un lavador automtico o manual de platos puede ser usado. Siguiendo las instrucciones del fabricante para un uso apropiado. Si una botella de apretn es empleada, llene cad a pozo presionando el envase (evite las burbujas) para dispensar el lavador. Decante el lavador y repita cuatro (4) veces adicionales. 8. Agregue 0.100 ml (100l) de solucin de trabajo Reactivo de Seal a todos los pozos (ver Seccin de Preparacin de Reactivos). Siempre agregue los reactivos en el mismo orden para minimizar la difer encia de tiempo de reaccin entre los pozos. 9. Incube por cinc o (5) minutos en la oscuridad. 10. Lea las Unidades Relativas de Luz (RLUs) en cada pozo en 0.2 1.0 segundos. Los resultados deben darse dentro de los 30 minutos que se agrego el Reactivo de Seal.

PARAMETROS DE CONTROL DE CALIDAD

El siguiente criterio debe ser conocido en orden de que los resultados de los anlisis sean considerados vlidos: 1. La curva de respuesta a la dosis (Intercepciones 80%; 50% & 20%) debe estar dentro de los parmetros establec idos. 2. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad debe estar dentro de los rangos establecidos.

CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la curva de la reaccin para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada mtodo de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos provedos. Los mtodos estadsticos pertinentes deben ser empleados para c omprobar las tendencias. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradacin del kit de reactivos. Reactivos frescos deben usarse para determinar la razn de las variaciones.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

A. Funcionamiento del Anlisis. 1. Es importante que el tiempo de la reaccin en c ada uno de los pozos, est llevada a cabo constante para los resultados por reproducir. 2. El medir c on una pipeta de muestras no debe extender ms all de diez (10) minutos para evitar la deriva del anlisis. 3. Si ms de un (1) plato es usado, se recomienda repetir la dosis de la c urva de respuesta. 4. La falta de retirar la solucin adecuadamente en el paso del lavado y de la aspiracin o de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a resultados falsos. 5. Las muestras que puedan estar contaminada microbiolgicamente, no deben ser usadas en este anlisis. Alta lipemic a o especimenes bemolizados no deben ser usados. 6. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reac tivos de diferentes lotes. 7. Las pipetas multicanales se recomiendan para la adicin de los reactivos. 8. Especimenes de pac ientes con concentraciones de CEA arriba de 250 ng/ml pueden diluirse (por ejemplo 1/10 o mayor) con suero masculino normal (CEA < 5 ng/ml) y reanalizado. Las concentraciones de muestras son obtenidas multiplicando el resultado por el factor de dilucin (10). B. Interpretacin 1. Si la reduccin c ontrolada de informacin de la computadora es usada para interpretar el resultado de la prueba, es imperativo que el valor predecible de los calibradores caiga dentro del 10% de las concentraciones asignadas. 2. EL CEA tiene una sens ibilidad clnica baja y es pecificidad como un marcador tumoral. Clnicamente, un CEA elevado no es un valor de diagnstico como prueba para el cncer y debe ser usada solamente en conjunto con otras manifestaciones clnicas (observaciones) y parmetros de diagnstic o. Hay pacientes con cncer colorectal que no exhiben valores elevados de CEA pero estos no siempre cambian con la progresin o regresin de la enfermedad. Los fumadores demuestran un rango alto de valores de la lnea bas e que los no fumadores .

RESULTADOS
Una curva de la reaccin a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentracin de CEA en especimenes desconocidos. 1. Registre los RLUs (Unidades Relativas de Luz) obtenidos de la impresora del lector del micro placas conforme al ejemplo 1. 2. Trac e los RLUs para cada referencia duplicada del suero contra la concentracin correspondiente de CEA en ng/ml en el papel de grfico lineal. (No promedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar). 3. Dibuje la mejor curva a travs de los puntos traz ados. 4. Para determinar la concentracin del CEA para un desconoc ido, localic e el promedio de RLUs de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical del grfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentrac in (en pg/ml) del eje horizontal del grfico (los duplicados del des conocido se pueden promediar segn lo indicado). En el siguiente ejemplo, promedie los RLUs (23210) de las intersecciones desconocidas la curva de calibracin a (88ng/ml) concentracin CEA (Ver figura 1)*. Nota: El software de reduccin de datos de c omputadora diseado para los anlisis de CLIA se puede utilizar tambin para la reduccin de datos. Los duplicados de un desconocido deben ser promediados como se indica (ver figura 1).

RANGOS ESPERA DOS DE VALORES

Cerca del 99% de los no-fumadores tienen una concentracin menor de los 5.0 ng/ml. Similarmente 99% de los fumadores tiene concentraciones menores a los 10ng/ml(4). TABLA I Valores Esperados para el Sistema CEA CLIA No Fumadores Fumadores < 5 ng/ml < 10 ng/ml

D. Especificidad. Los anticuerpos altamente especficos de las molculas del CEA han sido usadas en el procedimiento de ELISA del CEA. Ninguna interferencia fue detectada con el funcionamiento del CEA de ELISA una vez adicionando las cantidades masivas de las siguientes sustancias a una piscina de suero humano. cido Acetilsaliclico cido Ascrbico Cafena AFP PSA CA-125 hCG hLH hTSH hPRL 100 g/ml 100 g/ml 100g/ml 10 g/ml 1.0 g/ml 10,000 U/ml 1000 IU/ml 10 IU/ml 100 mlU/ml 100g/ml

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores que se pueden esperar s er encontrado por un mtodo dado para una poblacin de "personas -normales" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la especificidad del mtodo, de la poblacin probada y de la precisin del mtodo en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una lata interna de la gama determinada por los analistas usando el mtodo con una poblacin indgena al rea en la cual el laboratorio est situado.

REFERENCIAS.

CA RACTERISTICAS DE ACTUACIN
A. Precisin. La prec isin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de CEA CLIA fue determinada por anlisis en tres diversos niveles de los sueros de control. El nmero, el valor medio, la des viacin de estndar (? ) y el c oeficiente de variacin para cada uno de estos s ueros del control se presentan en la tabla 2 y la tabla 3.

B. Sensibilidad El procedimiento del CEA tiene una sensitividad de 0.0125 ng. Esto es el equivalente a una muestra que contiene una concentrac in de CEA de 0.5 ng/ml. C. Exactitud El procedimiento del CEA CLIA fue comparada con un mtodo de referencia de ELISA. Los especimenes biolgicos de concentraciones bajo, normal y elevado fueron analizados. El nmero total de especimenes fue 202. La ecuacin de regresin del ultimo cuadro y el coeficiente de correlacin fueron computadas para el CEA en comparacin del mtodo de referencia. La informacin obtenida se muestra en la Tabla 4. TABLA 4 Ultimo recuadro Mtodo Este mtodo (X) Referencia (Y) Significado 5.67 5.75 Regresin Correlacin Anlisis Coeficiente 0.998

y=0.1164+1.0324(X)