Biotechnologia – termin wprowadzony pod koniec lat 50-tych podagry, reumatyzmu, bólu zęba, głowy, w XIX w 4.
XIX w 4. Rozwój pąków bocznych w kulturze merystemów
XX wieku, oznacza konstruowanie nowych szczepów
drobnoustrojów i linii komórkowych organizmów wyższych o
niespotykanych dotąd walorach technologicznych.
Biotechnologia znana dziś ze względu na osiągnięcia biologii
molekularnej oraz inżynierii genetycznej towarzyszyła
człowiekowi od zarania dziejów( procesy mikrobiologicznej
fermentacji)
Biotransformacja – proces w wyniku którego dochodzi do
modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez
żywe komórki lub izolowanie z nich enzymy.
Organizmy transgeniczne – organizmy poddane transformacji
tzn. posiadające zmodyfikowany genom. Powstały z takiej
komórki, która włączyła do swego genomu fragment DNA
skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej. Fragment
ten może zawierać dowolna informację i może zostać włączony
w prawie każdym miejscu genomu.
Okresy w biotechnologii:
- okres przedpasteurowski( od zarania ludzkości do poł XIXw)
– era spontanicznych procesów fermentacyjnych w celu
pozyskania ważnych procesów spożywczych: chleba, wina,
piwa itd.
- okres przejściowy( II poł XIXw oraz pierwsze 40- lecie
XXw) – tworzenie podstaw biotechnologii
wielkoprzemysłowej, zapoczątkowanej przez L. Pasteura- era
mikrobiologii z wykorzystaniem aseptycznych kultur
drobnoustrojów. Opracowanie technologii produkcji kw
mlekowego, cytrynowego, acetonu, butanolu oraz kultur
drożdży
- era nowoczesnej biotechnologii – datowana do końca II
wojny św tj od opracowania przemysłowej produkcji
penicyliny w warunkach aseptycznych w bioreaktorach: *
podokres 1 ( do roku 1970) – opracowano nowe technologie m
in biosyntezy antybiotyków, aminokwasów, enzymów, oraz po
raz pierwszy zastosowano biokatalizatory immobilizowane *
podokres 2( od roku 1970 do dzisiaj) – praktyczne
wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w
biotechnologii. Narodziła się koncepcja manipulacji genami
poza komórką. Opracowano szereg nowych biotechnologii m
in produkcję insuliny, hormonów wzrostu itd.
Zastosowanie współczesnej biotechnologii:
Produkcja żywności: - tradycyjne procesy fermentacyjne(
produkcja pieczywa, produktów mlecznych), - nowe
technologie mikrobiologii( witaminy, aminokwasy), -
zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich( kefiry,
jogurty), - utrwalenie żywności( antyutleniacze)
Rolnictwo: - produkcja pasz( preparaty białkowe, witaminowe,
kiszonki roślinne),- kultury komórkowe i tkankowe in vitro, -
ochrona roślin( bioinsektycydy, antybiotyki), - lecznictwo
zwierząt( szczepionki)
Ochrona środow: - oczyszczanie ścieków, filtry biologiczne,
czynne osady
Co to są i na czym polegają biotransformacje roślin ?
Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych.
Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do
biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo
wartościowe, bądź pożądane produkty.
Typy reakcji biotransformacji: - utlenianie, redukcja, -
hydroliza, - rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, -
izomeryzacja
Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne(
ksenobiotyki), zw obce roślinie
Materiał stosowany: - izolowane enzymy, - zawiesiny
komórkowe, agregaty komórek, - immobilizowane(
unieruchamiane) enzymy i komórki
Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, -
bioreaktory
Dane ilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat roślin leczniczych
i aromatycznych wykorzystywanych do produkcji matabolitów
wtórnych lub do biotransformacji prekursorów, - w Polsce
tylko ok. 40 gat roślin ( zostało przebadanych)
Korzyści biotransf: - wysoka wydajność( często bliska 100%),
- duża czystość produktu reakcji, - wysoka specyficzność
reakcji, - możliwość zajścia reakcji w miejscach mało
reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości produktów
występujących w małych ilościach w roślinie, - otrzymanie
produktów o zwiększonej aktywności fermakologicznej lub
zmniejszonej toksyczności
Biotransf z użyciem kultur zawiesinowych – jest to najprostszy
model doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania
komórek z nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom
fizjologicznym
Czynniki regulujące reakcje biotransf: - rodzaj kultury(
zawiesina, kultury organów np. korzeni), - stadium rozwojowe
kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie, skład pożywki i
jej pH, - struktura chemiczna substratu, jego stężenie,
właściwości
Przykłady leków roślinnych:
OPIUM – otrzymany z gat maku pochodzącego z Azji
Mniejszej, legendy o opium spisano już egipskimi
hieroglifami, Homer w Odysei wspomina o leku który
„uśmierza i żółć i gładzi pamięć wszelkiego zła”, opium
zawdzięcza właściwości jednemu z 15 skł czynnych odkrytych
w niedojrzałych makówkach tj: „ morfinie”, w II poł XIXw
udało się zmodyfikować chemicznie morfinę otrzymując
silniejszą w uśmierzaniu bólu- heroinę.
KOKAINA – pochodzi z liści kokainowego krzewu zwanego
krasnodrzewem, liscie zawieraja 14 innych skł, wszystkie służą
do produkcji leków znieczulających i innych syntetyków, liście
kokainowe słyną jako środek stymulujący do nadludzkiej pracy
dla andyjskich robotników i tragarzy, żuty z dodatkiem limy
lub popiołu roślinnego powoduje uwalnianie się aktywnych
substancji stymulujących układ nerwowy i prace mięśni, nie
powoduje u Indian żujących liście uzależnienia jak w postaci
czystej.
MARIHUANA – zwana haszyszem, otrzymywana z konopi
indyjskich( haszysz – żywica z żeńskich kwiatów konopi)
CHININA – pochodzi z kory wiecznie zielonego drzewa
chinowca, rosnącego na stokach Andów w Ameryce Płd.,
najlepszy środek na malarie na którą zapada co roku 100 mln
ludzi, konkwistadorzy i jezuici przywieźli go z Europy w
XVIIw, długo odrzucany i wyśmiewany, pod k XIX w o korze
chinowca stało się głośno, wycięto prawie całą populacje tych
drzew, roślinę uratował brytyjski kolekcjoner nasion który
przesłał partie nasion do Europy, zakupił je rząd Holandii,
obecnie produkuje się syntetyczna chininę – chociaż pewne
szczepy zarodzce malarii stają się odporne na syntetyki w
przeciwieństwie do naturalnego specyfiku
ASPIRYNA – pierwotnie otrzymywana z wierzby białej oraz z
byliny wiązówki błotnej, już 2000 lat temu Dioskorides w
swym dziele pisał o przeznaczeniu wierzby w leczeniu
zidentyfikował czynny skł – kw salicylowy, a potem
zmodyfikował do kw acetylosalicylowego, lista zastosowań
jest niesłychanie długa i co roku dochodzą nowe
DISGENINA – odkryta w latach 40-tych XXw, substancja
pochodzi z pochrzyny ?, rodzina leśnych pnączy, odkryta przez
amerykańskich chemików, posłużyła do produkcji pierwszej
tabletki antykoncepcyjnej, ten fakt zapoczątkował na świecie
rewolucje seksualna
Opłacalność biotransformacji:
Kalkulacja kosztów: według szacunku przemysłowej produkcji
metabolitów wtórnych na drodze kultur tkankowych jest
opłacalna gdy cena kg produkcji przewyższa 1000$
Przykłady biotransf:
TAKSOL( cytostatyk) –diterpen, wyst w korze, igłach i
korzeniach cisa. Kuracja dla jednego pacjenta wymagałaby
ścięcia 3 dojrzałych okazów bardzo wolno rosnących drzew. Z
tego względu syntezę taksolu prowadzi się w kulturach
zawiesinowych. Planuje się izolowanie genów
odpowiedzialnych za biosyntezę taksolu i przeniesienie ich do
komórek szybko namnażajacych się.
Kastanospermina – izolowana z Castanospermum australe,
hamuje proces glikozylacji białek, płaszcza wirusów, w tym
HIV
Disgenina – steroid otrzymywany z Discoreadaltoidea,
używany do produkcji leków , które konfigurują na liście
najlepiej sprzedających się.
Winblastyna i winkrystyna- używane w terapii
nowotworowej.- kuracja winblastyną daje trwałe wyleczenia u
ponad 80 % chorych na ziarnice złośliwą. – winkrystyna daje
ustanie objawów u 90 % dzieci cierpiących na ostre białaczki
limfatyczne.
Rośliny zmodyfikowane genetycznie
Transgen- właściwy gen, przeniesiony do transformowanej
rośliny. Nie ma on w genomie rośliny swojego odpowiednika
w postaci allelu, stąd roślina transgeniczna jest heterozygotą.
Linia transgeniczna- samozapylone rośliny transgeniczne o
nowym fenotypie dają potomstwo rozszczepiające się lub
jednolite. Te ostatnie pochodzą z homozygoty i dają ustaloną
linie transgeniczną.
Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej
komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co
nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w
kolejnych pokoleniach.
Metody wprowadzania obcych genów:
-transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens,
A. rhizogenes (metoda wektorowa). Przydatna dla roślin 1-
liściennych.
-transformacja bezpośrednia (metoda bezwektorowa)-
mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych.
*metoda pośrednia- stosuje się komórki bakterii – E. coli i A.
tumefaciens jako biologiczne „pociski” do transformacji.
Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych
*bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą
elektroporcji lub glikolu polietylenowego- PEG
Etapy transformacji wektorowej:
-kokultywacja- umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści,
korzeni, liści) w roztworze bakterii, - odpłukanie bakterii, -
umieszczenie eksplantatów w pożywce z antybiotykiem w celu
zabicia bakterii, - umieszczenie dalsze materiału roślinnego na
pozywce – regeneracyjnej z odpowiednim czynniekiem
selekcyjnym: antybiotykiem lub herbicydem, - regeneracja
roslin jest możliwa najczęśćiej z pojedynczych
transformowanych komórek we wczesnym etapie regeneracji.
Przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych
wprowadzonych dodatkowo do plazmoidów. Geny te są
odpowiedzialne za kodowanie produktów które łatwo wykrywa
się testami enzymatycznymi, histochemicznymi lub
fluorymetrycznymi.
Mikrowstrzeliwanie:( zasady metody) – metoda
transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo dużą
prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek metali
pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie
skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem
przyśpieszającym ruch cząsteczek metala jest proch strzelniczy
lub obecnie hel.
Przydatność metody: rośliny 1-liścienne, nagonasienne, 2-
liścienne trudne dotąd do stransformowania np. soja, fasola
Obieg transf:- niedojrzałe zarodki, - kalus enbriogeniczny z
zarodków, - niedojrzałe kwiatostany, - zawiesina komórek
Wady metody: - niska wydajność transf ( mechaniczne
uszkodzenia komórek, szok akustyczny), - odrywanie się
metalu od DNA, - wprowadzenie do genomu roślinnego zbyt
dużo kopii genów jednocześnie
Jak funkcjonują bioreakt? Zasada działania bioreakt –
zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju
komórką somatycznym w kierunku zainicjowania
embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę
wewnętrzną czynników fizyko – chemicznych.
Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry: -
dozowanie świeżej pożywki, - kontrola ilości namnażanych
komórek, - temp( z dokładnością do 0,1◦), - szybkość rotacji
pozywki( przemiszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle
50 rpm, ponizej komórki sedymentuja i zamierają, pH sygnału
aktywowania pompy perystaltyczne wtłaczające sterylny
roztwór kwasu lub zasady, - poziom tlenu regulowany droga
dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki
(poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa), -potencjał redox, -
stężenie CO2
Podział bioreak ze względu na system napowietrzania
pożywki:
- bior zaopatrzone w mieszadła magnetyczne typu rotacyjne
bębny, wirujące filtry, - bior w których powietrze jest
wtłaczane często pod ciśnieniem poprzez system membran
umieszczonych w dolnej strefie urzadzienia, - zwykłe
napowietrzanie, - dodatkowe kolumny( bąbelkowe
napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych lub
polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne perforacje i
mikropory, - bior z równomiernym rozprowadzeniem
powietrza z góry bez mieszania zawartości pożywki, -
podświetlane przewody rozprowadzające tlen
Rozmnażanie wegetatywne in vitro( = rozmn klonalne,
mikrorozmnażanie, masowe rozmn)
Rozmnażanie wegetatywne in vitro:
1.Powstanie zarodków somatycznych kulturach tkanek i
organów
2.Różnicowanie pąków przybyszowych w kulturach kalusa
3.Różnicow pąków przybysz. bez pośrednictwa tkanki
kalusowej
wierzchołkowych
5.Rozwój pąków bocznych w kulturze fragmentów pędów i
innych organów
6. Kultury primordiów pędowych
Rozmnażanie wege in vitro realizuje się poprzez:
1.Organy przysposobione do rozmnażania wegetatywnego
(skrócone pędy)-bulwy, cebule, kłącza
2.Sadzonki-odciete części rośliny
3.Odkłady
4.Transplantacje: - szczepienie, - podkładki, - okulizacja
Dezynfekcja i traktowanie wstępne:
1.przemycie eksplantantu woda bieżącą przez1-2 godz. często z
dodatkiem detergentów
2.sterylizacja powierzchniowa 70%-etanol-30 sek. ; 80%-
etanol-5 min.(pąki drzew)
3.dezynfekcja właściwa:
-podchloryn wapnia lub sodu 2-10%- 5-20 min.
-HgCl2 0,2- 1,0% 3-10 min.
- chloroamina 0,2- 1,0% 5-10 min.
4.przemywanie 3-6- krotne sterylną wodą
Pożywka (Murashige i Skooga)
1.nieroganiczne sole (mikro i makroskl.)
2.witaminy
3.organiczny N
4.regulatory wzrostu
5.żródło energii i węgla + wyciąg: z mleczka kokosowego,
kukurydzianego, wyciąg z drożdży, bielma itd.
Warunki zewnętrzne:
-światło
-temp.ok.25"C
-źródło węgla (sacharoza)
-witaminy
- wielkość eksplantatu
AUKSYNY:
-stymulują podziały kom.w kierunku tworzenia się tkanki
kalusowej
-wpływają na organogenezę kalusa
-stymulują powstawanie tkanki embriogennej →zarodki
somatyczne
-indukują merystemy korzeni przybyszowych na pędach
- stymulują syntezę etylenu (efekt niepożądany) i starzenie się
kultur
CYTOKININY:
-pobudzają podziały kom. brak cytokinin zwiększa
poliploidalność jąder
-wpływają na różnicowanie się ksylemu i lignifikację komórek
-stymulują wyrastanie pędów bocznych
-hamują indukcję, wzrost i rozwój korzeni
-redukują długość pędów
-opóźniają starzenie
-likwidują zjawisko dominacji wierzchołkowej
- "odmładzają" i zwiększają wigor eksplantantów-
rejuwenalizacja drzew i krzewów, ukorzenianie pędów
-niskie dawki cytokininy +auksyna stymulują rozwój tkanki
embriogennej→ zarodki somatyczne
GIBERELINA: (GA 3)
-pobudza wydłużanie międzywęźli pędów
-przyspiesza wzrost merystemów
-stymuluje proliferację pędów bocznych
-hamuje ukorzenianie pędów
-hamuje indukcję embriogenezy somatycznej
-stymuluje kiełkowanie dojrzałych zarodków
ABA: (kwas abscysynowy)
-inhibitor wzrostu
-stymuluje tworzenie kalusa
-współdziała z cytokininą i auksyną w dojrzewaniu zarodków
somatycznych
-inicjuje embriogenezę
-pozytywnie wpływa na dojrzewanie i kiełkowanie sztucznych
nasion
-inicjuje rozwój minibulw
-zwiększa żywotność protoplastów i ich dzielenie się
ETYLEN:
-hamuje podziały kom. i morfogenezę
-wprowadza komórki w stan spoczynku
-hamuje embriogenezę somatyczną
-wywołuje objawy starzenia się eksplantantów (żółknięcie i
opadanie liści), epinastię i deformację organów
-wpływa na zanik wigoru
-stymuluje ukorzenianie sadzonek
Zdolności regeneracyjne roślin:
RESTYTUCJA - uzyskanie rośliny z np. .liścia innej rośliny,
powstała z różnych organów rośliny matecznej
TOTIPOTENCJA - powstanie rośliny z 1 komórki
PRZEBIEG MIKROROZMNAŻANIA:
I FAZA:
1.wybór rośliny matecznej, pobranie organu, dobór pożywki
2.stabilizacja kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji
eksplantantu (pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój
pąków, pędów)
II FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków
przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża
pożywkę
III FAZA:
-ukorzenienie eksplantatów
-przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu
-przywrócenie autotroficzności
-aklimatyzacja
Z chwila wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest
zakończony
Zdolności morfogenetyczne kom roslinnych:
- kom. roślinne są totipotentne czyli maja zdolność do dzielenia
się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego
organizmu z pojedynczej kom. rośl.
Ujawnienie pełnej totipotencji może nastąpić drogą
organogenezy bezpośredniej i pośredniej
*ORG.BEZPOŚREDNIA
-pierwotny eksplantat -(roślina) organ
- pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-organ (roślina)
*ORG.POŚREDNIA
- pierw ekspl.- kalus (zarodek, zawiązki korzenia, pędu)- organ
(roślina)
Najbardziej przydatne do rozwoju w kulturze in-vitro są
eksplantaty zawierające kom merystemów wierzchołkowych,
bocznych
i interkalarnych, potem w kolejności kom.kambialne, floem,
okolnica i promienie rdzeniowe.
U nasiennych regeneracja następuje łatwiej u dwuliściennych
niż jednoliść. a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego
gatunku można wybrać fragment rośliny dający dobre efekty.
Jeśli zregenerowany organ powstał z grupy kom.
niejednorodnych genetycznie to otrzymamy CHIMERĘ.
Bodźcem wyzwalającym odróżnianie w kulturach in vitro jest
odizolowanie kom. i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ
regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce.
KULTURA KALUSA
Zastosowanie:
-materiał wyjściowy do otrzymywania zawiesin komórkowych
i protoplastów
-szeroko wykorzystany do mikrorozmnażania i transformacji
-do pozyskiwania na skale masową zarodków somatycznych
-do biotransformacji i pozyskiwania metabolitów wtórnych
-do badań podstawowych nad morfologią i strukturą komórki
Geneza:
-w tworzeniu kalusa mogą brać udział wszystkie tkanki
eksplantatu
-mogą tez brać udział tylko nieliczne tkanki np. kom.
miękiszowe rdzenia łodygi lub kambium wiązkowe
BUDOWA TKANKI KALUSOWEJ
-początkowo są to niezróżnicowane kom. parenchymatyczne o
różnym kształcie i wielkości
-po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje
heterogeniczność i obok kom. parenchymatycznych powstają
nieregularne formacje tk. przewodzących, centra
merystematyczne
-kalus może mieć strukturę luźna i łatwo się rozpadać lub
bardzo zwartą
-barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomara. przez
różne odcienie zieleni
-analizy cytologiczne kalusa wykazują na wielką różnorodność
genetyczną kom.-od diploidalności do poliploidalności
KULTURA PĄKÓW PRZYBYSZOWYCH:
-w różnych częściach roślin z mniej lub bardziej dojrzałych
tkanek mogą powstawać wierzchołki pędów zwane
przybyszowymi .Tworzą się one na różnych organach roślin
(korzeniach, łodygach, liściach)
W łodygach i liściach pąki przybyszowe powstają z epidermy i
subepidermy. Eksplantaty korzenia wytwarzają pąki
przybyszowe w korze pierwotnej, a z budowy wtórnej tworzą
pąki w sąsiedztwie albo w obrębie floemu wtórnego.
Kierunek organogenezy eksplantatów pierwotnych a wiec
tworzenie pędów korzeni przybyszowych lub zarodków
somatycznych zależy nie tylko od rodzaju wzajemnych
proporcji zastosowanych auksyn i cytokinin ale również od
rodzaju tkanki, gatunku rośliny i kondycji kultury.Metoda
wykorzystywana do rozmnażania roślin cebulowych.
Embriogeneza somatyczna – jest procesem biologicznym,
podczas którego formują się zarodki z komórek
wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia się
zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest
indukcja embriogeniczności.
Budowa zarodka somatycznego: - istnieje wiele wspólnych
cech w formowaniu zarodków somatycznych i zygotycznych, a
poszczególne stadia rozwoju zarodków( globularne, serca) sa
podobne lub wręcz identyczne, - zarodki mają wyraźne
zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd- korzeń. Efektem
końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z
wykształconym jednym liscieniem(1-liścienne) lub dwoma
liścieniami( 2-liścienne), a także epikotylem i korzonkiem
zarodnikowym.
Zastosowanie: - metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie
w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle
wysoki współczynnik rozmnażania, - przykładowo w
Cyclamen persicum do 40 tys sztuk zarodków w 1 litrze
pożywki w czasie 10 tyg, - metoda znalazła zast do produkcji
drzew leśnych głównie iglastych, roślin ozdobnych i
warzywnych.
Izolowane merystemy
Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:
1. Wielokrotny podział roślin które rozwinęły się z
merystemów na „ sadzonki węzłowe” – metoda przydatna w
wielkotowarowym systemie uprawy roslin ozdobnych,
sadowniczych oraz Asparagus officinalis i Solanum tuberosum,
zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z
genotypem rośliny matecznej. Szczególna odmianą tej metody
jest indukowanie organów spichrzowych np. mikrobulwek lub
mikrokłączy u Alstromeria, Cymbidium, Gloriosa na pędzie
uzyskanym z merystemu. Pożywki nie zawierają lub zawierają
śladowe ilości substancji wzrostowych co zapobiega
zmienności somaklonalnej.
2. Pobudzenie pojedynczego merystemu do podziału –
poliferacja tk merystematycznej w której powstają liczne pąki i
pędy na drodze organogenezy bezpośredniej( bez stadium
kalusa), - duże wierzchołki pędów ( merystem wierzchołkowy,
zawiązki liści i powierzchniowo usytuowane paki boczne)
wkłada się na pozywkę z dodatkiem cytokinin o wysokim
stężeniu co powoduje rozwój tzw wieloroślinek. Ponowne
pasaże wieloroślinek gwarantuje w krótkim czasie uzyskanie
tysięcy roślin potomnych, - wykorzystywana do propagacji m
in Dianthus, Chrysantemum, Rosa multiflora, oraz drzew
Malus czy Prunus.
3. W ramach tej techniki obiecująca jest metoda
„ powiększania” lub „ rozszerzania” merystemów – praktykuje
się wykładanie merystemów na pożywkę zawierającą
retandanty( paklobutrazol, acymidol, diaminozyd, etylen lub
etafon), - w efekcie merystem powiększa się 56-krotnie , po
czym może być powtórnie podzielony i po kolejnych
subkulturach przeniesiony na pozywkę bez substancji
wzrostowych, na którego z każdego eksplantatu rozwiną się
rośliny
4. poliferacja tk merystematycznej drogą regeneracji czyli
organogenezy pośredniej poprzez stadium kalusa, rozwijające
się pąki i pędy, - izolowane merystemy wykładane są na
pozywki z dodatkiem dużych ilości auksyn przez co uzyskuje
się efekt namnożenia kalusa, w tk kalusa pojawiają się centra
merystematyczne z których dopiero masowo rozwijają się pęd i
rośliny, - wadą jest duża tendencja do zmienności
somaklonalnej
Kultura pędów bocznych( pachwinowych)
Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie mikrorozmnażania
mogą być: - merystemy pąków wierzchołkowych lub
bocznych, - wierzchołki pedów, - pąki kwiatowe( boczne), -
fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąków bocznych, -
wierzchołki mogą być izolowane z zarodków somatycznych.
Wymienione eksplantaty zawierają: merystem, 2-3 zawiązki
liści, oraz kilka paczków bocznych osadzonych w „ kątach
liści”, inaczej nazywana sadzonkowaniem in vitro
Procedura postępowania
- po wyłożeniu na pożywkę nie zawierającą substancji
wzrostowych paki nie krzewią się, rozwijają się w pojedynczą
roślinkę.
Za pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gat:
Nephrolepis, Arhidiaceae, Spatiphyllum.
Tempo mikrorozmnażania:
1roslina mateczna→ daje 3-krotny wzrost co 4 tyg lub 6-
krotny wzrost co 6 tyg→ milion roślin potomnych rocznie
Kultury primordiów pędowych
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych
merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi ,
umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład
pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki, -
temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość
2. Po wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie
primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe
agregaty
3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z dodatkiem
auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu gat
roślin 1 i 2 – liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo wysoki
współczynnik namnażania, porównywalny do embriogenezy
somatycznej.
Produkcja roślin in vitro na świecie
Rozmnażanie wegetatywne in vitro znalazłą zastosowanie
przede wszystkim w produkcji takich roslin, które trudno się
rozmnaża za pomocą tradycyjnych metod in vivo( rośliny
ozdobne, drzewa leśne, odm heterozygotyczne) oraz rośliny
elitarne o dużej wartości jednostkowej.
Morfologia i fizjologia aklimatyzowanych roślin:
1. Kutikula pozbawiona wosku, brak ochrony przed
transpiracją
2. Nie funkcjonujace aparaty szparkowe( brak reakcji na ABA)
3. Asymilacja CO2 bardzo niska w przybliżeniu 2,6 mg•dm-3h-1(
dorosłe rosliny ok. 10 mg CO2) Czasami bilans (-) przewaga
oddychania
4. Zawartość chlorofilu spada
5. Często eksplantaty są nie ukorzenione, stąd dodatkowo
problem indukcji rizogenezy
Okres fotosyntetycznej aklimatyzacji trwa ok. 4 tyg
Ukorzenianie: - stanowi 35-75% wszystkich kosztów
mikrorozmnażania: * cecha gatunkowa, * dopuszczalne
traktowanie regulatorami wzrostu( ex-vitro), * poza słojem np.
IBA, NAA, * istotna wielkość eksplantatu, * rodzaj podłoża(
mineralne)
Przygotowanie do samodzielnego wzrostu
-in vitro: pożywka ukorzeniająca, po właściwym
ukorzenieniu uchylić zamknięte naczynia, usunąć agar,doodać
fungicydy, umieścić w stałym podłożu (mineralne ,gleba)
-ex vitro: ukorzenianie poza szkłem (subst. stymulujące
ukorzenianie), umieścić w stałym podłożu (mineralne, gleba)
CZYNNIKI KORZYSTNE
-wysoka wilgotność
-cieniowanie
-właściwy fotoperiod
-ogrzewanie podłoży
↓ -Termoterapia- działanie podwyższoną temperaturą ( ok 3 tyg
po rozwinięciu nowych liści
-wyłączenie ogrzewania
-stopniowa redukcja wilgotności
-zwiększenie natężenia światła słonecznego
Podłoże mineralne np.Vernikulit, pianka poliuretanowa, perlit,
wełna mineralna, kostki torfopodobne
Zalety:
-sterylne, wolne od patogenów
-ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-
fibrylnej
-nie zawiera subst. odżywczych tj. zanieczyszczeń
organicznych
-sprasowane w bryłach lub kostkach ułatwia transport roślin
-gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów
-zapewnia optymalną dystrybucję H2O
Warunki fotoautotroficzne
-wysokie nat. światła
-wysokie stężenie CO2
Zalety hodowli autotroficznej
1.namnażanie roślin jest 2 razy szybsze
2.można zredukować lub wyeliminować subst .wzrostowe
3.spada wilgotność poniżej 100% co hamuje m.in. syntezę
etylenu, poprawia to wigor roślin, normalnie funkcjonują
aparaty szparkowe
4.przy braku cukru spada % infekcji bakteryjnej i grzybowej
5.można prowadzić hodowlę w dużych pojemnikach-spadek
kosztów
6.łatwa aklimatyzacja roślin przy wsadzaniu do gruntu
Korzyści z klonowania in vitro
- mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały rok
-umożliwia powrót do formy juwenilnej
-ułatwia prace hodowlane (pozyskanie nowych odmian,
skracanie cyklu hodowlanego, namnażanie genotypów
niestabilnych-chimer)
-zastępuje szczepienie bądź okulizację
-umożliwia przechowywanie ogromnej ilości materiału
namnożeniowego na stosunkowo małej pow.
-ułatwia fitosanitarne przemieszczanie się roślin między
różnymi krajami
-dostarcza materiał wolny od mikroorg .patogenicznych
-przy doborze właściwej metody klonowania obniża koszty
produkcji roślin
-gwarantuje stabilność genetyczną
Kultury protoplastów
- stanowią unikalną populację jednokomórkowych jednostek
odizolowanych od siebie.
-każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do
wszystkich komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z
jednakową częstotliwością.
-protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników
indukujących morfogenezę oraz badaniach mutacyjnych
Wykorzystanie protoplastów
Jako system jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i
zdolny do ich odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały
model doświadczalny służący do badania szeregu procesów
przebiegających na poziomie:
- bosyntezy ścian komórkowych
- badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku
receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i
transportu związków drobnocząsteczkowych
-funkcjonowanie organelli
-badanie wpływu patogenów na roślinę
-źródła pozyskania mieszańców somatycznych
- doskonały materiał do biotransformacji
-wpływ hormonów na morfogeneze
- badania czynników wpływających stymulująco bądź
hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne
Pozyskiwanie protoplastów:
-fragment tkanki (np. Liść), podajemy sterylizacji oraz
usuwamy epidermę
-skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących
ścianę komórkową ( istotny czas inkubacji, temp, pH)
-degradacja dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno-
a następnie celulityczne
-degradacja jednoetapowa: - stosuje się mieszaninę różnych
enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany
-ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych ( o charakterze
jonowym i niejonowym)
-mieszaninę filtruje się przez sita
-delikatnie wiruje się
-w zależności od zastosowania stabilizatora frakcję
protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu
-przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów
osmotycznych lub pożywką
- ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie morfologicznej i
jakościowej
Fuzja protoplastów:
Zlanie protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory które mogą być
różnego pochodzenia:
- natury fizycznej: wirowanie, impulsy elektryczne,
elektroforeza
- natury chemicznej: glikol polietylenowy, alkohol
poliwinylowy, lektyny, wysokie stężenie jonów wapnia o silne
alkalicznym pH
Somatyczna hybrydyzacja protoplastów polega na:
Fuzja protoplastów
↓
sekcja heterokariocytów
↓
hodowla mieszańców (krzyż. wsteczne)
↓
pełna regeneracja roślin ( nowa jakość)
Wydajność fuzji 30%
Heterokariony 10-40%
Selekcja heterokariocytów
Do czynników identyfikujących i selekcjonujących należą:
- barwienie różnymi barwnikami „ przyżyciowymi” np:
rodamina B- fluorescencyjna
-okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolicznych
-analiza izoenzymatyczna
-stosowanie różnych markerów cytochemicznych i
molekularnych
Kontrola zdrowotności kultur
Metody eliminowania wirusów:
-Chemioterapia- stosowanie związków, które włączają sie w
metabolizm wirusa i hamują jego namnażanie ( antymetabolity)
również antybiotykoterapia
w temp. 35-40C ) na roślinę w celu inaktywacji wirusów
-Izolowanie merystemów wierzchołkowych z roślin poddanych
uprzednio termoterapii
Kontrola zdrowotności namnożonego materiału.
-testowanie biologiczne
-testy sereologiczne ( gotowe przeciwciało zawarte w surowicy
łączy się z wirusem zawartym w ekstrakcie z rośliny)
-analiza pod mikroskopem elektronowym i fluorescencyjnym
-testy enzymoimmunologiczne- ELISA
-metody molekularne( hybrydyzacja kwasów nukleinowych
wirusa i znakowanej sondy)
Jak funkcjonują bioreaktory?
Zasada funkcjonowania bioreaktorów:
-zagwarantowanie optimum war. wzrostu i rozwoju kom
somatycznych w kierunku zainicjowania embriogenezy
somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrznych
czynników fizyko-chemicznych.
Komputerowej kontroli podlegają następujące parametry:
-dozowanie świeżej pożywki
-kontrola namnażanych komórek
-temp
- szybkość rotacji pozywki( przemieszczanie się suspensji w
bioreaktorze), zwykle 50 rpm, poniżej komórki sedymentują i
zamierają
-pH – sygnał uaktywnia pompy perystatycznej wtłaczającej
sterylny roztwór kwasu lub zasady
-poziom tlenu
-potencjał redox
-stężenie CO2
Zbyt gwałtowne dostarczanie O2 może spowodować lizę
komórek i stres mechanicznego urazu.
Ze względu na sposób napowietrzania bioreaktora dzielimy
na:
-bioreaktory zaopatrzone w mieszadła magnetyczne ( typu
rotacyjne bębny, wirujące filtry)
-bioreaktory do których powietrze jest wtłaczane często pod
ciśnieniem, poprzez system membran umieszczonych w dolnej
strefie urządzenia
-bioreaktory z równomiernym wprowadzaniem powietrza od
góry
- zwykłe napowietrzanie
- dodatkowe kolumny( bąbelkowe napowietrzanie)
- poprzez system silikonowych lub polipropylenowych węży
zaopatrzonych w liczne perforacje lub mokropory
Problemy związane z powiększaniem skali kultur
- przygotowanie inokultur
- metoda inkubacji, transfer do bioreaktora i odbiór
namnożonego materiału
- stres mechaniczny związany z mieszaniem pożywki
- wprowadzenie światła do bioreaktora
- problem zachowania podobieństw o charakterze fizycznym i
biologicznym
Embriogeneza somatyczna w bioreaktorach.
Modelowy system indukowania embriogenezy somatycznej w
bioreaktorze- na przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska-
Euphorbia pucherina)
Etapy:
* Faza proembriogenna ( inicjacja embriogenezy)
-kultura wstępna- eksplantant (merystem
wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni
umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej
kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na
pożywkę płynną o tym samym składzie i umieszcza się
na wytrząsarce
-pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek
filtruje się a większe skupiska komórek osadzone na
 sitach przenosi ponownie na pożywkę zestaloną agarem,
celem wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów”
mających zdolność do zarodnikowania klonalnego
-pozyskiwanie inokulum wyjściowego – po 2 tyg
szybko rosnącą masę poddaję się filtrowaniu na sitach i
uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką, otrzymana zawiesina
stanowi suspensję wyjściową dla bioreaktora
* Kultury w bioreaktorach – pożywka płynna ( ściśle
kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki stopniowo
osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca. Barwa suspensji
zmienia się z białawej na zielonkawo- brązową
*Konwersa embrionów w rośliny
-zarodki usuwa się z bioreaktorów, odsącza się na sita i
umieszcza na szalkach Petriego na pożywce zestalonej
pozbawionej auksyn- MS +0,05 mg BAP
-po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki izolowane są od
form dewiacyjnych i kalusujących
-prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza
na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki
kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla
poinsecji
-po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie do szklarni
( przeżywalność ok 90 %)
Efektywność stymulowania embriogenezy somatycznej w
bioreaktorach dla poinsecji.
Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tyś. zarodków z
1 litra suspensji -czas ok 3 miesiące
ztuczne nasiona:
-pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze
wysuszenia
-otoczkowanie zarodków poddane desykacji
-uwodnienie zarodki ( merystemy wierzchołkowe) otoczone
kapsułą z żelu
- uwodnione zarodki zanurzone w płynnym żelu
Otoczkowanie nasion:
-unieruchomienie fragmentu tkanki
-zminimalizowanie funkcji życiowych
-ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska
-ochrona przed utlenieniem i desykacja (odwodnienie)
-ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym podczas siewu i
transportu
-wprowadzenie regulatorów, mikroflory, pestycydów
- możliwość wprowadzenia do otoczek hydrofilnych
dodatkowych otoczek hydrofobowych
Etapy wytwarzania sztucznych nasion:
-roślina macierzysta
-eksplantat
-indukcja i proliferacja kalusa embriogennego
-namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej.
-synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków.
-filtrowanie
-suszenie
-otoczkowanie
-wysiew nasion in-vivo lub in-vitro
Rodzaje hydrożeli:
-otoczki polisocharydowe-najważniejsze ze wszystkich
-organiczne żele (poliakryloamidowe)
-żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub
formaldehydowy)
Pochodzenie chemiczne wiązań żelifikujących !!!!!
-żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie jonowe
odpowiednio naładowanych polimerów np. Alginian, chitozan,
karaginian
-żele powstałe zimnej lub gorącej polimeryzacji (agar, agaroza,
karaginian).
-żele powstałe drogą chemicznej reakcji (poliakrylamian,
formaldehyd).
Otoczki agarowe
Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków
czerwonych wodorostów
Procedura pozyskiwania:
- 2-4% agar rozpuszcza się w soli fiajologicznej w temp. 100C,
a następnie schładza do 50C
- dodaje się materiał roślinny (zarodki lub merystemy)
zawieszone w soli fizjologicznej
- po zestaleniu tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np.
olejem
- można ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju
silikonowego lub sojowego, umieścić na mieszadle
magnetycznym i po stężeniu oddziela się kuleczki (zawierające
materiał roślinny) droga wirowania
Otoczki agarozowe
Agaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany z agaru
pozbawionego grup estrowo-siarczanowych
Procedura pozyskiwania:
-agaroza 2-4% w temp. 35*C dobrze się rozpuszcza a
jednocześnie żelifikuje
-przygotowany już roztwór wraz z komórkami dodajemy
wkraplając do oleju roślinnego umieszczonego na mieszadle,
całość oziębiamy i wirujemy
Otoczki alginianowe
* Alginiany otrzymywane są z olbrzymich brązowych alg
morskich Macrocystis i Laminaria drogą ekstrachowania
zasadą sodową. Otrzymywany kwas alginianowy składa się z
jednostki M ( kwas manuroniowy ) oraz jednostki G ( kwas
gulurioniowy )
* Kiedy jony Na+ zastąpimy jonami dwuwartościowymi np.
Ca2+ ,Ba2+ , Si2+, Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa
pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy
grupami karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi.
Proces jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu
dopasowuje się wapń.
Procedura pozyskania
-suspensje komórek miesza się w temp. pokojowej ze
sterylnym roztworem
alginianu sodu 2-3%
-następnie mieszaninę tę wkrapla się do roztworu chlorku
wapnia (50-300 mM
CaCl2)
-perełki o określonej średnicy (0,5-5 mm) utwardzają się przez
kilkanaście minut do kilku godzin
- powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową
- na etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w
EDTA lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym )
Kiełkowanie i konwersja
Kiełkowanie- zdolność do formowania korzonka zarodkowego
Konwersja- równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i
merystemu pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie
właściwym dla danego gatunku
Otoczki karaginianowe -umieszczenie tkanki w silnie stężonym roztworze
Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu krioprotektantów (odciąganie wody do przestrzeni
Chondrus, Euchemia, Gigartina... międzykomórkowych i do roztworu)
Procedura pozyskiwania -zamrażanie w ciekłym azocie
- 2-5% roztwór karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po 4.przechowywanie właściwe (-196°C)
schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensją komórek 5.odmrażanie
- następnie wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do 6.przywrócenie właściwego tempa wzrostu komórek
roztworu KCl (kąpiel utwardzająca) Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności
perełki (2-4 mm) otrzymuje się w KCl przez 1-5 godz. genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stad z
- najczęściej stosowane powodzeniem stosowana jest do przechowywania tkanek
Inne roślinnych, sztucznych nasion.
-celuloza i jej pochodne Schemat zamrażania komórek w ciekłym azocie
-chitozan Komórki roślinne
-żelifikujące gumy ↓
-pektyny Pożywka adaptacyjna
-podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany , ↓
karaginian/ chitozan lub -algininian/ chitozan Mieszanina kriochronna
-najnowsze otoczki hydrofobowe ↓
-Tulanox, Elwox Zamrażanie
-Bio- kapsuły! (osłonki zaindukowane wokół zarodka
somatycznego imitujące okrywę nasienną z kutikulą
Efektywność maszyny do otoczkowania Wieloetapowe
-500000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul dziennie
maszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów, bawełny, Jednoetapowe
petunii, ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona, zbóż.
-Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i Przechowywanie
warunków kiełkowania. W warunkach polowych dla ↓
sztucznych nasion M. media (lucerna) A. gravedens (seler) czy Rozmrażanie
D. carota (marchew) wynosi 50-80%
Embriogeneza somatyczna, sztuczna nasion dla drzew i Przeżywalność zakonserwowanego materiału
krzewów zależy od:
Formy drzewiaste -tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych
Forma dojrzała --x→ forma juwenilna(młodociana) roztworów odwadniających
Zdrewniała → zielna -odporność na zamrażanie protoplastu (cecha uwarunkowana
rejuwenalizacja genetycznie)
→ -stopnia uwodnienia i wielkości zamrożonej struktury
”odmłodzenie” Banki genów
stymulacja wigoru Holandia, Francja, Anglia, Belgia
Polska- Leśny Bank Genów w Kostrzycy od 1995 r.
Uratowano wiele roślin reliktowych, np. tysiącletnie cyprysy Ex- situ (poza naturalnym środowiskiem) →banki
Rodzaje nasion: genów
-Ortodoks- genotypy, które można poddawać wysuszeniu In- situ (poza naturalnym ekosystemem)
-Rekakacitrant ?- genotypy bardzo wrażliwe na wysuszenia In vitro (w szkle)
(nie tolerują) Zachowanie zasobów genowych in vitro
Etapy wytwarzania sztucznych nasion -techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i
-Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego średnio- lub długoterminowe przechowywanie materiału
-Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do roślinnego w bankach genów roślinnych
suszenia i otoczkowania) GA3 , ABA zapewniają prawidłowy -izolowanie komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie,
rozwój zarodka, odporność na dehydratację oraz zapobiegają haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki,
przedwczesnemu kiełkowaniu. hartowanie polega na osuszeniu kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin
i lekkim schłodzeniu transgenicznych przechowywane są w:
-Odwodnienie- eksykator lub glikol polietylenowy *warunkach powolnego wzrostu
-Otoczkowanie- otoczka pełni rolę „sztucznego bielma„ a *warunkach kriogenicznych
dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienna” *w postaci sztucznych nasion
-Wysiew- w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się
je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub prof. Broda
wysiewu do gruntu in vivo
Problemy technologii sztucznych nasion Biotechnologia
-indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych substancji -tworzenie określonych produktów przez wykorzystanie
m. in. Aminokwasów) procesów biologicznych
-faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA Hodowla roślin
-problem O2 Biotechnologia
-wysychanie otoczek współczesna w hodowli roślin
-stopniowe uwodnienie nasion! Biotechnologia -
-koszty produkcji techniki kultur in vitro
próby tworzenia Bio- kapsuł klasyczna -
genetyka molekularna,
Ze względu na fazę wdrożeniową na dzień dzisiejszy namnaża (hodowla roślin istnieje już od tysięcy lat)
się przez sztuczne nasiona: hybrydy ryżu, geranium, inżynieria genetyczna
europejskie odm. ogórka , gerberę, kawę, lucerne.
Potencjalne korzyści Hodowla roślin. W cyklu hodowlanym wprowadza się nowe
-szybkie namnażanie pożądanej linii oraz doskonali już istniejące cechy użytkowe tworząc odmiany
-gwarancja genetycznej jednorodności roślin w gatunkach roślin uprawnych.
-bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby Rośliny nabierają nowych właściwości przez trwałą zmianę
-dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, składu genetycznego.
takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności Genetyka- nauka o dziedziczności i zmienności organizmów
genetycznej żywych
-dostarczenie sterylnych linii Badanie fenotypu → genomu (genotypu) (genetyka
-redukcja kosztów związanych z wegetatywnym namnażaniem molekularna, inżyniria genetyczna)
linii elitarnych Genomika- nauka o molekularnych badaniach genetycznych
-możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z Badanie genomu (zbiór informacji genetycznej) →
komórek poddanych inżynierii genetycznej fenotypu
Banki genów Rośliny transgeneniczne- rzepak, kukurydza, soja,
Przechowywanie materiału roślinnego bawełna
Krótkoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w Naukowe podstawy hodowli roślin
stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy niskim natężeniu 1800 r. – prace T. A. Knighta, krzyżowanie roslin groch I
światła i na ubogich pożywkach. pszenicy
Długoterminowo- 1840 r. – Louis de Vilma wprowadza nową metodę selekcji
- w temp. 70°C (zamrażanie przemian metabolicznych, chociaż indywidualnej, stosowaną do dnia
istnieje niebezpieczeństwo powolnego utleniania tłuszczów dzisiejszego
oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach 1866 r. – Grzegorz Mendel badania nad dziedziczeniem cech
- w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki przez wiele grochu, praca pt. „Versuche uber Pflanzen- hybriden”
lat nie tracą żywotności
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów
(zamrażanie)
- Prawa Mendla- ponowne ich odkrycie w
1900- Tschemark, de vries, Correns
Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy: 1900 r. – De Vries- mutacje
1.wzrost wstępny USA- kolekcjonowanie genotypów roślin
kultury prowadzi się w pożywkach o obniżonym uprawnych
potencjale chemiczny, wody (sacharoza, mannitol, 1910 r. – pierwsze prace nad heterozją kukurydzy
glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki - prawo Hardy-ego- Weineberga
są małe i słabo zwakuolizowane)
2.krioprotekcja (krioprezerwacja)
przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z
- prawo czystości Johanensena
komórek i przestrzeni międzykomórkowych. 1920 r. – Muller i Stader- indukcja mutacji promieniami X
Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworem - chromosomowa teoria dziedziczenia
gliceryny, sacharozy, dwufenylosulfanianem DMSO, Morgana
aminokwasem proliną lub glikolem plietylenowym. - zmiana ploidalności za pomocą kolchicyny
Możliwe jest łączenie kriopretaktantów w formie 2 1950 r. – wykorzystanie zjawiska heterozji i powszechna
lub 3 składników. uprawa
3.zamrażanie 1960 r. – odkrycie mechanizmu regulacji działania genów
a) zamrażanie metodą konwencjonalną ( Jackob i Monod)
-zamrażanie wstępne (0-40°C) optymalne tempo schładzania - kultury in vitro
0,5-2 C/min. (zależy od stopnia odwodnienia struktury i - kultury protoplastów
krystalizacji, wody w krioprotektancie) - uwodnienie totipotencji pojedynczej
-zamrażanie trwałe w cikłym azocie komórki roślinnej
b) metoda odwodnienia - wyhodowanie półkarłowych pszenic
-struktury roślinneulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temp. 1970 r. – kultury pylników- uzyskanie haploidów
pokojowej - embriogeneza somatyczna z protoplastów
-zamrażanie w ciekłym azocie - pierwsze doświadczenie z selekcjonowaniem
c) metoda witryfikacji DNA
1980 r. – zastosowanie metod biotechnologii
 - udowodnienie, że przeniesione
pozageneratywnie geny u roślin ulegają
dziedziczeniu zgodnie z prawami Mendla
1990 r. – transforowanie roślin
Kultury in vitro
To hodowla komórek i tkanek roślinnych na sztucznych
pżywkach w warunkach sterylnych.
Regeneracja roślin na drodze organogenezy lub embriogenezy
somatycznej
1.Mikrowstrzeliwanie- rozmnażanie klonalne
2.kultury zarodków
3.kultury roślin haploidalnych
Haploid- roślina zawierająca w swoich komórkach
somatycznych gametyczną liczbe chromosomów
Sposoby uzyskiwania roślin haploidalnych
-eliminacja chromosomów w zarodkach powstających w
wyniku krzyżowań między gatunkami i między rodzajami
-androgeneza – sporoficzny rozwój gametofitu męskiego
*kultury
pylnikowe
*kultury
izolowanch
mikrospor
-gynogeneza- sporoficzny rozwój z haploidalnych komórek
woreczka zalążkowego
*kultury niezapłodnionych zalążkó i zalążni
*kultury zapłodnionych zalążków i zalążni
Uzyskiwanie zmienności genetycznej
Mutacje
Rekombinacje i segregacje
-kultury merystemowe
- transformowanie obcego DNA
-kultury kalusa
-mieszańce płciowe
-kultury protoplastów
-mieszańce somatyczne
- haploidy
(-) androgeneza
(-) gynogeneza
Utrzymanie zmienności gamet i rozmnażania roślin
-Kultura merystemów i pąków przybyszowych
-Kultury kalusowe
Kultury komórki
-Kultury protoplastów
Zalety wynikające ze stosowania technik kultur in vitro w
pracach genetyczno- hodowlanych
-Dysponowanie ogromnymi liczebnościami genotypów na
bardzo małych powierzchniach
-Uzyskanie efektów selekcji w krótkim czasie
-Możliwości bardzo precyzyjnej kontroli czynników
dotyczących działania mutagetagenami, warunków selekcji i
wzrostu
Diagnostyka molekularna
Porównanie markerów molekularnych z markerami
morfologicznymi
- przy pomocy markerów molekularnych, genotypy roślin
mogą być określane w całym okresie wzrostu i rozwoju rośliny,
na poziomie tkankowym i komórkowym w przypadku
markerów morfologicznych, genotypy określane są tylko na
poziomie całych roślin i często dopiero w stanie dojrzałej
rośliny.
- w wielu gatunkach roślin występuje naturalna zmienność
alleli w większości loci markerów molekularnych. A zatem w
badaniach genetycznych można wykorzystać naturalną
zmienność w istniejących populacjach bez konieczności
zmienności wymaganej często dla loci morfologicznych
- zmienność izoenzymów i markerów DNA wykazuje zwykle
neutralność fenotypową podczas gdy markery morfologiczne
powodują zmienność fenotypowa często niepożądana w
populacjach hodowlanych
- allele niektórych typów loci molekularnych (np. izoenzymy,
RLFP) wykazują kodominujący charakter dziedziczenia.
Dominujący charakter dziedziczenia cech morfologicznych
uniemożliwia rozróżnienie wszystkich genotypów
- niepożądane działania epistatyczne występujące często
pomiędzy loci kodującymi morfologiczne cechy mogą
limitować liczbę segregującuch markerów możliwych do
obserwacji w jednej segregującej populacji. Większość
markerów molekularnyc pozbawiona jest tego typu
oddziaływań tak więc liczba loci, jaką można obserwować w
jednej populacji jest teoretycznie ograniczona.
Diagnostyka oparta o markery (znaczniki, własności)
-Diagnostyka oparta o markery morfologiczne (monogeniczne
dziedziczenie)
-Diagnostyka molekularna oparta o markery genetyczne
Wynik diagnostyczny powstaje na podstawie
-Oceny polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
-Określenie długości badanego fragmentu DNA
-Wykrycie delecji, insercji, mutacji punktowych
-Określenie sekwencji badanego fragmentu DNA
Diagnostyka oparta na amplifikacji DNA
Łańcuchowe reakcje polimerazy PCR
Stadia reakcji:
1.denaturacja DNA, w temp. od 95°C w wyniku której
powstają jednoniciowe cząsteczki DNA
2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki DNA w
miejscach komplementarnych do homologii starterów ich
długości itp.
3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C
Rodzaje markerów molekularnych
-izoenzymy (polimorfizm białek, kodominowanie)
markery DNA (polimorfizm DNA) RFLP,MAAP,
AFLP, STMS, SCAR (STS)
- RFLP badanie polimorfizmu
Diagnostyka oparta na hybrydyzacji z sondami
molekularnymi
-hybrydyzacja punktowa DNA lub RNA, unieruchomienie w
temp. 80°C lub promieniowanie UV, inkubacja z sondami
-metoda Sontherna hybrydyzacja DNA-DNA
-metoda Northen hybrydyzacja RNA-DNA
-hybrydyzacja in situ.
PTL- loci cech ilościowych
Inżynieria genetyczna
Genetyka molekularna i technika rekombinacji DNA
przyczyniły się do opracowania metod pozwalających na
uzyskanie nowej zmienności droga transformacji
Transformacja genetyczna – jest to proces przenoszenia
obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilna
ich integracje w tym genomie (przenoszenie genów bez
względu na ich oddalenie fitogenetyczne)
Etapy uzyskiwania roślin transgenicznych
1.wyizolowanie i sklonowanie genu przeznaczonego do
transformacji
2.opracowanie metody wprowadzenia genu do komórek
roślinnych
3.ustalenie metodyki regeneracji transformowanych komórek
kompletnie wykształcone rośliny
4.określenie sposobu sprawdzenia integracji i ekspresji
wprowadzonego genu
5.zbadanie stabilności transformowanego genu w następnych
pokoleniach roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej
cechy
Konstrukt stosowany w transformacji składa się z :
-gen strukturalny (cecha)
-gen markerowy ( selekcyjny) np. aro A, odporność na
glyfosad lub npt H, odporność na neomycyne i
kanamycyne oraz reporterowy (wizualizujący) np. GUS, β
glukuronidaza ,
-promotor i terminator, sekwencje regulacyjne ( promotor
poprzedzający gen strukturalny jest odpowiedzialny za
inicjację transkrypcji, a terminator za jej ukończenie)
Metody transformacji:
-wektorowe , bakterie z rodzaju Rhizobium- Agrobaterium
fumefaciens plazmid Ti oraz Agrobacterium rhizogenes ,
plazmid Ri
System Agrobacterium wykorzystuje się do roślin 2-
liściennych
- bezwektorowe , makroiniekcja,
mikroiniekcja, elektroporacja,
mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do
wprowadzenia konstruktów DNA u roślin 1-
liściennych
wektor binarny- układ 2 plazmidów
wektor monarny – 1 plazmid
Skuteczna transformacja nie oznacza stabilnej ekspresji
-problemem technologii roślin transgenicznych jest
niestabilność ekspresji wprowadzonych genów
-wprowadzone geny: nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba
ekspresja zanika w kolejnych pokoleniach
Dlaczego tak się dzieje???
„wyciszenie genów”- poznano powierzchownie
-przypadkowe miejsce integracji obcych genów w
transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu wyklucza z
reguły możliwość transkrypcji (rejony chromosomów
zwane heterochromatyną)
-modyfikacja obcego DNA przez metylacje, której ulega
cytozyna, prowadzi to do zablokowania trankrypcji
-trandezaktywacja ( kosupresja) polega na wyciszaniu
transkrypcji genu homologicznego za pomoca
transformacji
Gen męskiej sterylności- PGS
Geny rybonukleaz
RN-aza T1 (z Aspergillus oryzae)
BARNAZA ( z Bacillus amyliquefaciens)
PROMOTOR TA- 29 gen rozkładający komórki tapetum
-gen odpornosci na herbicydy
Bosta – gen Bor acetylotransferazy (ze Steptomyces
hygroscopicus)
RESTORERY- transformanty z inhibitorem Barnazy –
Bostor
Wykorzystanie roślin transgenicznych w hodowli
Metody transformowania roślin umożliwiają na drodze
pozageneratywnej wprowadzenie następujących cech :
1.odporność na szkodniki i choroby wirusowe,
bakteryjne i grzybowe
2.odporność na herbicydy
3.modyfikacje cech użytkowych roślin
-ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem
-modyfikowanie spektrum barw kwiatów
-zmiany w metabolizmie węglowodanów i tłuszczów
-rośliny transgeniczne jako bioreaktory do syntezy białek:
alfa- amylazy, beta- glukozydazy, peroksydaza ligniny –
białka przemysłowe oraz źródło przeciwciał i szczepionek
-rośliny transgeniczne mogą służyć do biodegradacji
plastiku
Obecnie wprowadzane są geny warunkujące cechy
jakościowe o prostym, jedno- lub kilkugenowym sposobie
dziedziczenia .