Biotechno konstruowanie nowych szczepów drobnoustrojów i izolowana z Castanospermum australe, hamuje proces -hamuje ukorzenianie pędów -hamuje indukcję
pędów -hamuje indukcję embriogenezy
linii komórkowych organizmów wyższych o niespotykanych
dotąd walorach technologicznych. Biotechnologia znana dziś
ze względu na osiągnięcia biologii molekularnej oraz inżynierii
genetycznej towarzyszyła człowiekowi od zarania dziejów(
procesy mikrobiologicznej fermentacji) Biotransfor– proces w
wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych
związków organicznych przez żywe komórki lub izolowanie z
nich enzymy. Organizmy transgeniczne –poddane
transformacji tzn. posiadające zmodyfikowany genom.
Powstały z takiej komórki, która włączyła do swego genomu
fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii
genetycznej. Fragment ten może zawierać dowolna informację
i może zostać włączony w prawie każdym miejscu
genomu.Okresy w biotech: przedpasteurowski( od zarania
ludzkości do poł XIXw) – era spontanicznych procesów
fermentacyjnych w celu pozyskania ważnych procesów
spożywczych: chleba, wina, piwa itd. przejściowy( II poł
XIXw oraz pierwsze 40- lecie XXw) – tworzenie podstaw
biotechnologii wielkoprzemysłowej, zapoczątkowanej przez L.
Pasteura- era mikrobiologii z wykorzystaniem aseptycznych
kultur drobnoustrojów. Opracowanie technologii produkcji kw
mlekowego, cytrynowego, acetonu, butanolu oraz kultur
drożdży- era nowoczesnej biotechnologii – datowana do końca
II wojny św tj od opracowania przemysłowej produkcji
penicyliny w warunkach aseptycznych w bioreaktorach: *
podokres 1 ( do roku 1970) – opracowano nowe technologie m
in biosyntezy antybiotyków, aminokwasów, enzymów, oraz po
raz pierwszy zastosowano biokatalizatory immobilizowane *
podokres 2( od roku 1970 do dzisiaj) – praktyczne
wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w
biotechnologii. Narodziła się koncepcja manipulacji genami
poza komórką. Opracowano szereg nowych biotechnologii m
in produkcję insuliny, hormonów wzrostu ZASTOSOW
BIOTECH Produkcja żywności: - tradycyjne procesy
fermentacyjne( produkcja pieczywa, produktów mlecznych), -
nowe technologie mikrobiologii( witaminy, aminokwasy), -
zastosowanie enzymów do wyrobów mleczarskich( kefiry,
jogurty), - utrwalenie żywności( antyutleniacze)Rolnictwo: -
produkcja pasz( preparaty białkowe, witaminowe, kiszonki
roślinne),- kultury komórkowe i tkankowe in vitro, - ochrona
roślin( bioinsektycydy, antybiotyki), - lecznictwo zwierząt(
szczepionki)Ochrona środow: - oczyszczanie ścieków, filtry
biologiczne, czynne osady Co to biotransformacje roślin ?
Reakcje biotransformacji w różnych kulturach zawiesinowych.
Zastosowanie: - do produkcji metabolitów wtórnych, - do
biotransformacji egzogennych prekursorów w bardzo
wartościowe, bądź pożądane produkty. Typy reakcji
biotransform - utlenianie, redukcja, - hydroliza, -
rozszczepienie wiązania C-C, - kondensacja, - izomeryzacja
Substraty: naturalne prekursory, - związki syntetyczne(
ksenobiotyki), zw obce roślinie Materiał stosowany: -
izolowane enzymy, - zawiesiny komórkowe, agregaty
komórek, - immobilizowane( unieruchamiane) enzymy i
komórki Lokalizacja procesu biotransf: - wytrząsanie kolby, -
bioreaktory Daneilościowe: - na swiecie jest ok. 137 gat
roślin leczniczych i aromatycznych wykorzystywanych do
produkcji matabolitów wtórnych lub do biotransformacji
prekursorów, - w Polsce tylko ok. 40 gat roślin ( zostało
przebadanych) Korzyści biotransf: - wysoka wydajność(
często bliska 100%), - duża czystość produktu reakcji, -
wysoka specyficzność reakcji, - możliwość zajścia reakcji w
miejscach mało reaktywnych, - otrzymanie dużej ilości
produktów występujących w małych ilościach w roślinie, -
otrzymanie produktów o zwiększonej aktywności
fermakologicznej lub zmniejszonej toksyczności Biotransf z
użyciem kultur zawiesinowych – jest to najprostszy model
doświadczalny, nie ma dodatkowego etapu wiązania komórek z
nośnikiem, komórki nie ulegają zmianom
fizjologicznymCzynniki regulujące reakcje biotransf: - rodzaj
kultury( zawiesina, kultury organów np. korzeni), - stadium
rozwojowe kultury i jej warunki, a zwłaszcza nadtlenianie,
skład pożywki i jej pH, - struktura chemiczna substratu, jego
stężenie, właściwości LEKI ROŚLINNE Opium z gat maku
pochodzącego z Azji Mniejszej, legendy o opium spisano już
egipskimi hieroglifami, Homer w Odysei wspomina o leku
który „uśmierza i żółć i gładzi pamięć wszelkiego zła”, opium
zawdzięcza właściwości jednemu z 15 skł czynnych odkrytych
w niedojrzałych makówkach tj: „ morfinie”, w II poł XIXw
udało się zmodyfikować chemicznie morfinę otrzymując
silniejszą w uśmierzaniu bólu- heroinę. Kokaina z liści
kokainowego krzewu zwanego krasnodrzewem, liscie
zawieraja 14 innych skł, wszystkie służą do produkcji leków
znieczulających i innych syntetyków, liście kokainowe słyną
jako środek stymulujący do nadludzkiej pracy dla andyjskich
robotników i tragarzy, żuty z dodatkiem limy lub popiołu
roślinnego powoduje uwalnianie się aktywnych substancji
stymulujących układ nerwowy i prace mięśni, nie powoduje u
Indian żujących liście uzależnienia jak w postaci czystej.
Marichuana, z konopi indyjskich( haszysz – żywica z
żeńskich kwiatów konopi) Chinina z kory wiecznie zielonego
drzewa chinowca, rosnącego na stokach Andów w Ameryce
Płd., najlepszy środek na malarie na którą zapada co roku 100
mln ludzi, konkwistadorzy i jezuici przywieźli go z Europy w
XVIIw, długo odrzucany i wyśmiewany, pod k XIX w o korze
chinowca stało się głośno, wycięto prawie całą populacje tych
drzew, roślinę uratował brytyjski kolekcjoner nasion który
przesłał partie nasion do Europy, zakupił je rząd Holandii,
obecnie produkuje się syntetyczna chininę – chociaż pewne
szczepy zarodzce malarii stają się odporne na syntetyki w
przeciwieństwie do naturalnego specyfiku Aspiryna –
pierwotnie otrzym z wierzby białej oraz z byliny wiązówki
błotnej, już 2000 lat temu Dioskorides w swym dziele pisał o
przeznaczeniu wierzby w leczeniu podagry, reumatyzmu, bólu
zęba, głowy, w XIX w zidentyfikował czynny skł – kw
salicylowy, a potem zmodyfikował do kw acetylosalicylowego,
lista zastosowań jest niesłychanie długa i co roku dochodzą
nowe Disgenina– odkryta w latach 40-tych XXw, z pochrzyny,
rodzina leśnych pnączy, odkryta przez amerykańskich
chemików, posłużyła do produkcji tabletki anty- rewolucja
seksualna Opłacalność biotransfor: Kalkulacja kosztów:
według szacunku przemysłowej produkcji metabolitów
wtórnych na drodze kultur tkankowych jest opłacalna gdy cena
kg produkcji przewyższa 1000$ Przykłady biotransf:
TAKSOL( cytostatyk) –diterpen, wyst w korze, igłach i
korzeniach cisa. Kuracja dla jednego pacjenta wymagałaby
ścięcia 3 dojrzałych okazów bardzo wolno rosnących drzew. Z
tego względu syntezę taksolu prowadzi się w kulturach
zawiesinowych. Planuje się izolowanie genów
odpowiedzialnych za biosyntezę taksolu i przeniesienie ich do
komórek szybko namnażajacych się. Kastanospermina –
glikozylacji białek, płaszcza wirusów, w tym HIV Disgenina –
steroid otrzymywany z Discoreadaltoidea, używany do
produkcji leków , które konfigurują na liście najlepiej
sprzedających się. Winblastyna i winkrystyna- używane w
terapii nowotworowej.- kuracja winblastyną daje trwałe
wyleczenia u ponad 80 % chorych na ziarnice złośliwą. –
winkrystyna daje ustanie objawów u 90 % dzieci cierpiących
na ostre białaczki limfatyczne.Rośliny zmodyfikowane
genetycznie Transgen- właściwy gen, przeniesiony do
transformowanej rośliny. Nie ma on w genomie rośliny
swojego odpowiednika w postaci allelu, stąd roślina
transgeniczna jest heterozygotą. Linia transgeniczna-
samozapylone rośliny transgeniczne o nowym fenotypie dają
potomstwo rozszczepiające się lub jednolite. Te ostatnie
pochodzą z homozygoty i dają ustaloną linie transgeniczną.
Zmienność samaklonalna- rośliny powstałe z transgenicznej
komórki i mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co
nazywamy zmiennością samoklonalną- dziedziczoną trwale w
kolejnych pokoleniach. Metody wprowadzania obcych
genów: transformacja za pośrednictwem Agrobacterium
tumefaciens, A. rhizogenes (metoda wektorowa). Przydatna dla
roślin 1-liściennych. -transformacja bezpośrednia (metoda
bezwektorowa)- mikrowstrzeliwanie. Przydatna dla roślin 1- i
2-liściennych. *metoda pośrednia- stosuje się komórki bakterii
– E. coli i A. tumefaciens jako biologiczne „pociski” do
transformacji. Przydatna dla roślin 1- i 2-liściennych
*bezpośrednie transformowanie protoplastów za pomocą
elektroporcji lub glikolu polietylenowego- PEG
ETAPY TRANSFORMA WEKTOROWEJ: -kokultywacja-
umieszczenie eksplantatów (fragmentów liści, korzeni, liści) w
roztworze bakterii, - odpłukanie bakterii, - umieszczenie
eksplantatów w pożywce z antybiotykiem w celu zabicia
bakterii, - umieszczenie dalsze materiału roślinnego na
pozywce – regeneracyjnej z odpowiednim czynniekiem
selekcyjnym: antybiotykiem lub herbicydem, - regeneracja
roslin jest możliwa najczęśćiej z pojedynczych
transformowanych komórek we wczesnym etapie regeneracji.
Przeprowadza się testy na aktywność genów reporterowych
wprowadzonych dodatkowo do plazmoidów. Geny te są
odpowiedzialne za kodowanie produktów które łatwo wykrywa
się testami enzymatycznymi, histochemicznymi lub
fluorymetrycznymi. Mikrowstrzeliwanie:( zasady metody) –
metoda transformacji polegająca na wprowadzeniu z bardzo
dużą prędkością rzędu kilkuset metrów/sekundę do komórek
metali pokrytych DNA. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie
skonstruowanych akceleratorach, czynnikiem
przyśpieszającym ruch cząsteczek metala jest proch strzelniczy
lub obecnie hel. Przydatność metody: rośliny 1-liścienne,
nagonasienne, 2-liścienne trudne dotąd do stransformowania
np. soja, fasola Obieg transf:- niedojrzałe zarodki, - kalus
enbriogeniczny z zarodków, - niedojrzałe kwiatostany, -
zawiesina komórek Wady metody: - niska wydajność transf
( mechaniczne uszkodzenia komórek, szok akustyczny), -
odrywanie się metalu od DNA, - wprowadzenie do genomu
roślinnego zbyt dużo kopii genów jednocześnie
funkcjonowanie bioreakt? Zasada działania bioreakt –
zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju
komórką somatycznym w kierunku zainicjowania
embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę
wewnętrzną czynników fizyko – chemicznych. Komputerowej
kontroli podlegają następujące parametry: - dozowanie świeżej
pożywki, - kontrola ilości namnażanych komórek, - temp( z
dokładnością do 0,1◦), - szybkość rotacji pozywki(
przemiszczania się suspensji w bioreaktorze) zwykle 50 rpm,
ponizej komórki sedymentuja i zamierają, pH sygnału
aktywowania pompy perystaltyczne wtłaczające sterylny
roztwór kwasu lub zasady, - poziom tlenu regulowany droga
dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki
(poziom tlenu mierzy elektroda tlenowa), -potencjał redox, -
stężenie CO2 Podział bioreak ze wzgl na system
napowietrzania pożywki: - bior zaopatrzone w mieszadła
magnetyczne typu rotacyjne bębny, wirujące filtry, - bior w
których powietrze jest wtłaczane często pod ciśnieniem
poprzez system membran umieszczonych w dolnej strefie
urzadzienia, - zwykłe napowietrzanie, - dodatkowe kolumny(
bąbelkowe napowietrzanie), - poprzez systemy sylikonowych
lub polipropylenowych węży zaopatrzonych w liczne
perforacje i mikropory, - bior z równomiernym
rozprowadzeniem powietrza z góry bez mieszania pożywki, -
podświetlane przewody rozprowadzające tlen ROZMNAŻ
WEGETATYWNE IN VITRO( klonalne, mikrorozmnażanie,
masowe) 1. Powstanie zarodków somatycznych kulturach
tkanek i organów 2. Różnicowanie pąków przybyszowych w
kulturach kalusa 3. Różnicow pąków przybysz. bez
pośrednictwa tkanki kalusowej 4. Rozwój pąków bocznych w
kulturze merystemów wierzchołkowych 5.Rozwój pąków
bocznych w kulturze fragmentów pędów i innych organów 6.
Kultury primordiów pędowychRozmna wege in vitro
realizow przez: 1. Organy przysposobione do rozmnażania
wegetatywnego (skrócone pędy)-bulwy, cebule, kłącza
2.Sadzonki-odciete części rośliny 3.Odkłady 4. Transplantacje:
- szczepienie, - podkładki, - okulizacja Dezynfekcja i
traktowanie wstępne: 1.przemycie eksplantantu woda bieżącą
przez1-2 godz. często z dodatkiem detergentów 2.sterylizacja
powierzchniowa 70%-etanol-30 sek. ; 80%-etanol-5 min.(pąki
drzew) 3.dezynfekcja właściwa: podchloryn wapnia lub sodu
2-10%- 5-20 min. -HgCl2 0,2- 1,0% 3-10 min.- chloroamina
0,2- 1,0% 5-10 min. 4. przemywanie 3-6- krotne sterylną wodą
Pożywka (Murashige i Skooga) 1.nieroganiczne sole (mikro i
makroskl.) 2. witaminy 3.organiczny N 4. regulatory wzrostu
5.żródło energii i węgla + wyciąg: z mleczka kokosowego,
kukurydzianego, wyciąg z drożdży, bielma itd. Warunki
zewn: -światło -temp.ok.25"C -źródło węgla (sacharoza)
-witaminy - wielkość eksplantatu AUKSYNY:-stymulują
podziały kom.w tworzeniu się tkanki kalusowej -wpływają na
organogenezę kalusa -stymulują powstawanie tkanki
embriogennej →zarodki somatyczne -indukują merystemy
korzeni przybyszowych na pędach- stymulują syntezę etylenu
(efekt niepożądany) i starzenie się kultur CYTOKININY:
-pobudzają podziały kom. brak cytokinin zwiększa
poliploidalność jąder -wpływają na różnicowanie się ksylemu i
lignifikację komórek -stymulują wyrastanie pędów bocznych
-hamują indukcję, wzrost i rozwój korzeni -redukują długość
pędów -opóźniają starzenie -likwidują zjawisko dominacji
wierzchołkowej - "odmładzają" i zwiększają wigor
eksplantantów- rejuwenalizacja drzew i krzewów, ukorzenianie
pędów -niskie dawki cytokininy +auksyna stymulują rozwój
tkanki embriogennej→ zarodki somatyczne GIBERELINA:
(GA 3) -pobudza wydłużanie międzywęźli pędów -przyspiesza
wzrost merystemów -stymuluje proliferację pędów bocznych
somatycznej -stymuluje kiełkowanie dojrzałych zarodków
ABA: (kwas abscysynowy) -inhibitor wzrostu -stymuluje
tworzenie kalusa -współdziała z cytokininą i auksyną w
dojrzewaniu zarodków somatycznych-inicjuje embriogenezę -
pozytywnie wpływa na dojrzewanie i kiełkowanie sztucznych
nasion -inicjuje rozwój minibulw -zwiększa żywotność
protoplastów i ich dzielenie się ETYLEN: -hamuje podziały
kom. i morfogenezę -wprowadza komórki w stan spoczynku
-hamuje embriogenezę somatyczną -wywołuje objawy starzenia
się eksplantantów (żółknięcie i opadanie liści), epinastię i
deformację organów -wpływa na zanik wigoru-stymuluje
ukorzenianie sadzonek Zdolności regeneracyjne roślin:
RESTYTUCJA - uzyskanie rośliny z np. .liścia innej rośliny,
powstała z różnych organów rośliny matecznej
TOTIPOTENCJA - powstanie rośliny z 1 komórki
PRZEBIEG MIKROROZMNAŻ: I FAZA: 1.wybór rośliny
matecznej, pobranie organu, dobór pożywki 2.stabilizacja
kultury- uzyskanie zdolnego do regeneracji eksplantantu
(pierwsze przyrosty tkanki kalusowej, rozwój pąków, pędów) II
FAZA: szereg pasaży tkanki kalusowej, paków
przybyszowych, zarodków, wierzchołków, pędów - na świeża
pożywkę III FAZA: -ukorzenienie eksplantatów
-przygotowanie do wysadzenia w pobliżu lub do gruntu
-przywrócenie autotroficzności –aklimatyzacja. Z chwila
wysadzenia do gruntu proces mikrorozmnażania jest
zakończony Zdolności morfogenetyczne kom roslinnych: -
kom. roślinne są totipotentne czyli maja zdolność do dzielenia
się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego
organizmu z pojedynczej kom. rośl. Ujawnienie pełnej
totipotencji może nastąpić drogą organogenezy bezpośredniej i
pośredniej *ORG.BEZPOŚREDNIA -pierwotny eksplantat -
(roślina) organ - pierwotny eksplantat- zarodek somatyczny-
organ (roślina) *ORG.POŚREDNIA - pierw ekspl.- kalus
(zarodek, zawiązki korzenia, pędu)- organ (roślina)
Najbardziej przydatne do rozwoju w kulturze in-vitro są
eksplantaty zawierające kom merystemów wierzchołkowych,
bocznych i interkalarnych, potem w kolejności kom.kambialne,
floem, okolnica i promienie rdzeniowe. U nasiennych
regeneracja następuje łatwiej u dwuliściennych niż jednoliść.
a najtrudniej u nagonasiennych. U każdego gatunku można
wybrać fragment rośliny dający dobre efekty. Jeśli
zregenerowany organ powstał z grupy kom. niejednorodnych
genetycznie to otrzymamy chimerę. Bodźcem wyzwalającym
odróżnianie w kulturach in vitro jest odizolowanie kom. i
tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu
zastosowanych w pożywce. KULTURA KALUSA
Zastosowanie *-materiał wyjściowy do otrzymywania
zawiesin komórkowych i protoplastów *szeroko wykorzystany
do mikrorozmnażania i transformacji *do pozyskiwania na
skale masową zarodków somatycznych *do biotransformacji i
pozyskiwania metabolitów wtórnych *do badań podstawowych
nad morfologią i strukturą komórki Geneza: *w tworzeniu
kalusa mogą brać udział wszystkie tkanki eksplantatu *mogą
tez brać udział tylko nieliczne tkanki np. kom. miękiszowe
rdzenia łodygi lub kambium wiązkowe BUDOWA TKANKI
KALUSOWEJ *początkowo są to niezróżnicowane kom.
parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości *po pewnym
czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność i obok
kom. parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tk.
przewodzących, centra merystematyczne *kalus może mieć
strukturę luźna i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą *barwa
może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomara. przez różne
odcienie zieleni *analizy cytologiczne kalusa wykazują na
wielką różnorodność genetyczną kom.-od diploidalności do
poliploidalności KULTURA PĄKÓW
PRZYBYSZOWYCH: *w różnych częściach roślin z mniej
lub bardziej dojrzałych tkanek mogą powstawać wierzchołki
pędów zwane przybyszowymi .Tworzą się one na różnych
organach roślin (korzeniach, łodygach, liściach) W łodygach i
liściach pąki przybyszowe powstają z epidermy i subepidermy.
Eksplantaty korzenia wytwarzają pąki przybyszowe w korze
pierwotnej, a z budowy wtórnej tworzą pąki w sąsiedztwie albo
w obrębie floemu wtórnego. Kierunek organogenezy
eksplantatów pierwotnych a wiec tworzenie pędów korzeni
przybyszowych lub zarodków somatycznych zależy nie tylko
od rodzaju wzajemnych proporcji zastosowanych auksyn i
cytokinin ale również od rodzaju tkanki, gatunku rośliny i
kondycji kultury. Metoda wykorzystywana do rozmnażania
roślin cebulowych. Embriogeneza somatyczna – jest
procesem biologicznym, podczas którego formują się zarodki z
komórek wegetatywnych, wyzwolenie potencjału do tworzenia
się zarodka w pojedynczej kom lub ich grupie nazywane jest
indukcja embriogeniczności. Budowa zarodka somatycznego:
- istnieje wiele wspólnych cech w formowaniu zarodków
somatycznych i zygotycznych, a poszczególne stadia rozwoju
zarodków( globularne, serca) sa podobne lub wręcz identyczne,
- zarodki mają wyraźne zaznaczoną biegunową strukturę typu
pęd- korzeń. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej
jest kompletna roślina z wykształconym jednym liscieniem(1-
liścienne) lub dwoma liścieniami( 2-liścienne), a także
epikotylem i korzonkiem zarodnikowym. Zastosowanie: -
metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i
szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik
rozmnażania, - przykładowo w Cyclamen persicum do 40 tys
sztuk zarodków w 1 litrze pożywki w czasie 10 tyg, - metoda
znalazła zast do produkcji drzew leśnych głównie iglastych,
roślin ozdobnych i warzywnych.Izolowane merystemy
Alternatywne sposoby prowadzenia kultur merystemów:1.*
Wielokrotny podział roślin które rozwinęły się z merystemów
na „ sadzonki węzłowe” – metoda przydatna w
wielkotowarowym systemie uprawy roslin ozdobnych,
sadowniczych oraz Asparagus officinalis i Solanum tuberosum,
zapewnia ciągłą produkcję mikrosadzonek identycznych z
genotypem rośliny matecznej. Szczególna odmianą tej metody
jest indukowanie organów spichrzowych np. mikrobulwek lub
mikrokłączy u Alstromeria, Cymbidium, Gloriosa na pędzie
uzyskanym z merystemu. Pożywki nie zawierają lub zawierają
śladowe ilości substancji wzrostowych co zapobiega
zmienności somaklonalnej. 2.* Pobudzenie pojedynczego
merystemu do podziału – poliferacja tk merystematycznej w
której powstają liczne pąki i pędy na drodze organogenezy
bezpośredniej( bez stadium kalusa), - duże wierzchołki pędów (
merystem wierzchołkowy, zawiązki liści i powierzchniowo
usytuowane paki boczne) wkłada się na pozywkę z dodatkiem
cytokinin o wysokim stężeniu co powoduje rozwój tzw
wieloroślinek. Ponowne pasaże wieloroślinek gwarantuje w
krótkim czasie uzyskanie tysięcy roślin potomnych, -
wykorzystywana do propagacji m in Dianthus, Chrysantemum,
Rosa multiflora, oraz drzew Malus czy Prunus.3.* W ramach
tej techniki obiecująca jest metoda „ powiększania” lub
„ rozszerzania” merystemów – praktykuje się wykładanie
merystemów na pożywkę zawierającą retandanty(
paklobutrazol, acymidol, diaminozyd, etylen lub etafon), - w
efekcie merystem powiększa się 56-krotnie , po czym może
być powtórnie podzielony i po kolejnych subkulturach
przeniesiony na pozywkę bez substancji wzrostowych, na
którego z każdego eksplantatu rozwiną się rośliny 4.*
poliferacja tk merystematycznej drogą regeneracji czyli
organogenezy pośredniej poprzez stadium kalusa, rozwijające
się pąki i pędy, - izolowane merystemy wykładane są na
pozywki z dodatkiem dużych ilości auksyn przez co uzyskuje
się efekt namnożenia kalusa, w tk kalusa pojawiają się centra
merystematyczne z których dopiero masowo rozwijają się pęd i
rośliny, - wadą jest duża tendencja do zmienności
somaklonalnej KULTURA PĘDÓW BOCZNYCH
(pachwinowych) Inicjalnymi eksplantatami w tej metodzie
mikrorozmnażania mogą być: - merystemy pąków
wierzchołkowych lub bocznych, - wierzchołki pedów, - pąki
kwiatowe( boczne), - fragmenty pędów z węzłem, parą liści i
pąków bocznych, - wierzchołki mogą być izolowane z
zarodków somatycznych. Wymienione eksplantaty zawierają:
merystem, 2-3 zawiązki liści, oraz kilka paczków bocznych
osadzonych w „ kątach liści”, inaczej nazywana
sadzonkowaniem in vitro Procedura postępowania * po
wyłożeniu na pożywkę nie zawierającą substancji wzrostowych
paki nie krzewią się, rozwijają się w pojedynczą roślinkę.Za
pomocą tej metody rutynowo namnaża się wiele gat:
Nephrolepis, Arhidiaceae, Spatiphyllum.Tempo
mikrorozmnażania: 1roslina mateczna→ daje 3-krotny
wzrost co 4 tyg lub 6- krotny wzrost co 6 tyg→ milion roślin
potomnych rocznie KULTURY PRIMORDIÓW PĘDOWYCH
1. Zakładamy je izolując z pąków wierzchołkowych
merystemy z 3 zawiązkami( primordiami) liściowymi ,
umieszczamy je na pożywce płynnej, ważne jest: - skład
pożywki(NAA•BAP), - cyrkulacja, - objętość płynu i tkanki,
- temp, - intensywność naświetlenia, - częstotliwość 2. Po
wstępnym okresie stabilizacji- intensywne namnażanie
primordiów pedowych, które tworzą zielone eulorofilowe
agregaty 3. Po wyłożeniu ich na pożywkę zestaloną z
dodatkiem auksyny→ ukorzenianie→ regeneracja rośliny
Metoda znalazła zastosowanie w masowej produkcji wielu
gat roślin 1 i 2 – liściennych oraz drzewiastych, ma bardzo
wysoki współczynnik namnażania, porównywalny do
embriogenezy somatycznej. Produkcja roślin in vitro na
świecie Rozmnażanie wegetatywne in vitro znalazłą
zastosowanie przede wszystkim w produkcji takich roslin,
które trudno się rozmnaża za pomocą tradycyjnych metod in
vivo( rośliny ozdobne, drzewa leśne, odm heterozygotyczne)
oraz rośliny elitarne o dużej wartości jednostkowej.
MORFOLOG I FIZJOLOG AKLIMATYZOWANYCH
ROŚLIN: 1. Kutikula pozbawiona wosku, brak ochrony przed
transpiracją2. Nie funkcjonujace aparaty szparkowe( brak
reakcji na ABA)3. Asymilacja CO2 bardzo niska w
przybliżeniu 2,6 mg•dm-3h-1( dorosłe rosliny ok. 10 mg CO2)
Czasami bilans (-) przewaga oddychania4. Zawartość
chlorofilu spada5. Często eksplantaty są nie ukorzenione, stąd
dodatkowo problem indukcji rizogenezy Okres
fotosyntetycznej aklimatyzacji trwa ok. 4 tyg Ukorzenianie: -
stanowi 35-75% wszystkich kosztów mikrorozmnażania: *
cecha gatunkowa, * dopuszczalne traktowanie regulatorami
wzrostu( ex-vitro), * poza słojem np. IBA, NAA, * istotna
wielkość eksplantatu, * rodzaj podłoża( mineralne)
Przygotowanie do samodzielnego wzrostu -in vitro:
pożywka ukorzeniająca, po właściwym ukorzenieniu uchylić
zamknięte naczynia, usunąć agar,doodać fungicydy, umieścić
w stałym podłożu (mineralne ,gleba) -ex vitro: ukorzenianie
poza szkłem (subst. stymulujące ukorzenianie), umieścić w
stałym podłożu (mineralne, gleba) Czynniki korzystne
-wysoka wilgotność –cieniowanie -właściwy fotoperiod
-ogrzewanie podłoży- po rozwinięciu nowych liści -wyłączenie
ogrzewania -stopniowa redukcja wilgotności -zwiększenie
natężenia światła słonecznego, Podłoże mineralne
np.Vernikulit, pianka poliuretanowa, perlit, wełna mineralna,
kostki torfopodobne Zalety:-sterylne, wolne od patogenów
*ułatwia ukorzenianie dzięki specjalnej strukturze porowato-
fibrylnej *nie zawiera subst. odżywczych tj. zanieczyszczeń
organicznych *sprasowane w bryłach lub kostkach ułatwia
transport roślin *gwarantuje dogodną migrację i dyfuzję gazów
*zapewnia optymalną dystrybucję H2O Warunki
fotoautotroficzne -wysokie nat. Światła -wysokie stężenie
CO2 Zalety hodowli autotroficznej 1. namnażanie roślin jest 2
razy szybsze 2 .można zredukować lub wyeliminować subst
.wzrostowe 3. spada wilgotność poniżej 100% co hamuje m.in.
syntezę etylenu, poprawia to wigor roślin, normalnie
funkcjonują aparaty szparkowe 4. przy braku cukru spada %
infekcji bakteryjnej i grzybowej 5. można prowadzić hodowlę
w dużych pojemnikach-spadek kosztów 6 .łatwa aklimatyzacja
roślin przy wsadzaniu do gruntu Korzyści z klonowania in
vitro - mikrorozmnażanie może być kontynuowane przez cały
rok, umożliwia powrót do formy juwenilnej -ułatwia prace
hodowlane (pozyskanie nowych odmian, skracanie cyklu
hodowlanego, namnażanie genotypów niestabilnych-chimer)
-zastępuje szczepienie bądź okulizację -umożliwia
przechowywanie ogromnej ilości materiału namnożeniowego
na stosunkowo małej pow. -ułatwia fitosanitarne
przemieszczanie się roślin między różnymi krajami -dostarcza
materiał wolny od mikroorg .patogenicznych -przy doborze
właściwej metody klonowania obniża koszty produkcji roślin
-gwarantuje stabilność genetyczną KULTURY
PROTOPLASTÓW
stanowią unikalną populację
jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie.-każdy
zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich
komórek jednakowo tj. w tym samym czasie i z jednakową
częstotliwością. - protoplasty są bardzo przydatne w badaniach
czynników indukujących morfogenezę oraz badaniach
mutacyjnych Wykorzystanie protoplastów Jako system
jednokom. pozbawiony ścian komórkowych i zdolny do ich
odtwarzania, protoplasty stanowią doskonały model
doświadczalny służący do badania szeregu procesów
przebiegających na poziomie: bosyntezy ścian komórkowych -
*badania właściwości plazmolemy, składu błon, ładunku
receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego, pobierania i
transportu związków drobnocząsteczkowych
-*funkcjonowanie organelli *badanie wpływu patogenów na
roślinę *źródła pozyskania mieszańców somatycznych
*doskonały materiał do biotransformacji*wpływ hormonów na
morfogeneze *badania czynników wpływających stymulująco
bądź hamująco na podstawowe funkcje metaboliczne
Pozyskiwanie protoplastów: fragment tkanki (np. Liść),
podajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę *skrawki
umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę
komórkową ( istotny czas inkubacji, temp, pH) *degradacja
dwuetapowa: -najpierw działają enzymy peptyno- a następnie
celulityczne *degradacja jednoetapowa: - stosuje się
mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie
degradującej ściany * ważny dodatek stabilizatorów
osmotycznych ( o charakterze jonowym i niejonowym)
*mieszaninę filtruje się przez sita *delikatnie wiruje się *w
zależności od zastosowania stabilizatora frakcję protoplastów
zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu * przemywa
kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub
pożywką *ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie
morfologicznej i jakościowej Fuzja protoplastów: Zlanie
protoplastów ułatwiają tzw. stymulatory które mogą być
różnego pochodzenia: *natury fizycznej: wirowanie, impulsy
elektryczne, elektroforeza *natury chemicznej: glikol
polietylenowy, alkohol poliwinylowy, lektyny, wysokie
stężenie jonów wapnia o silne alkalicznym pH Somatyczna
hybrydyzacja protoplastów polega na: Fuzja protoplastów --
> sekcja heterokariocytów --> hodowla mieszańców (krzyż.
wsteczne) -->pełna regeneracja roślin ( nowa jakość)
Wydajność fuzji 30% , Heterokariony 10-40% Selekcja
heterokariocytów Do czynników identyfikujących i
selekcjonujących należą: barwienie różnymi barwnikami
„ przyżyciowymi” np: rodamina B- fluorescencyjna
*okresowe stosowanie różnych inhibitorów metabolicznych
*analiza izoenzymatyczna * stosowanie różnych markerów
cytochemicznych i molekularnych KONTROLA
ZDROWOTNOŚCI KULTUR Metody eliminowania
wirusów: * Chemioterapia- stosowanie związków, które
włączają sie w metabolizm wirusa i hamują jego namnażanie
( antymetabolity) również antybiotykoterapia Termoterapia-
działanie podwyższoną temperaturą ( ok 3 tyg w temp. 35-
40C ) na roślinę w celu inaktywacji wirusów Izolowanie
merystemów wierzchołkowych z roślin poddanych uprzednio
termoterapii Kontrola zdrowotności namnożonego
materiału. testowanie biologiczne *testy sereologiczne
( gotowe przeciwciało zawarte w surowicy łączy się z wirusem
zawartym w ekstrakcie z rośliny) * analiza pod mikroskopem
elektronowym i fluorescencyjnym *testy
enzymoimmunologiczne- ELISA * metody molekularne(
hybrydyzacja kwasów nukleinowych wirusa i znakowanej
sondy) Problemy z powiększaniem skali kultur
przygotowanie inokultur *metoda inkubacji, transfer do
bioreaktora i odbiór namnożonego materiału *stres
mechaniczny związany z mieszaniem pożywki *
wprowadzenie światła do bioreaktora *problem zachowania
podobieństw o charakterze fizycznym i biologicznym
EMBRIOGENEZA SOMATYCZNA W
BIOREAKTORACH. Modelowy system
indukowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorze- na
przykładzie poinsecji (Gwiazda betlejemska-Euphorbia
pucherina) Etapy: Faza proembriogenna ( inicjacja
embriogenezy) kultura wstępna- eksplantant (merystem
wierzchołkowy) pobrany z rośliny rosnącej w szklarni
umieszczony na pożywce zestalonej agarem indukującej
kalusowanie. Po 2-3 tygodniach kalus przenosi się na pożywkę
płynną o tym samym składzie i umieszcza się na wytrząsarce
pasażowanie- po kolejnych 3 tyg agregaty komórek filtruje się
a większe skupiska komórek osadzone na sitach przenosi
ponownie na pożywkę zestaloną agarem, celem
wyprodukowania tzw „ wtórnych kalusów” mających zdolność
do zarodnikowania klonalnego pozyskiwanie inokulum
wyjściowego – po 2 tyg szybko rosnącą masę poddaję się
filtrowaniu na sitach i uzupełnia w 2\3 swieżą pożywką,
otrzymana zawiesina stanowi suspensję wyjściową dla
bioreaktora Kultury w bioreaktorach – pożywka płynna
( ściśle kontrolowane warunki wewnętrzne). Zarodki
stopniowo osiągaja stadium globuli i dalej stadium serca.
Barwa suspensji zmienia się z białawej na zielonkawo-
brązową Konwersa embrionów w rośliny -zarodki usuwa się z
bioreaktorów, odsącza się na sita i umieszcza na szalkach
Petriego na pożywce zestalonej pozbawionej auksyn- MS
+0,05 mg BAP po 3 tyg. normalnie rozwijające się zarodki
izolowane są od form dewiacyjnych i kalusujących
prawidłowo rozwijające się zarodki ponownie się umieszcza
na pożywce o tym samym składzie i po 1-2 tyg zarodki
kiełkują wytwarzając długi hypokotyl charakterystyczny dla
poinsecji po osiągnięciu 20 -25 mm eksplantaty przenosi sie
do szklarni ( przeżywalność ok 90 %)Efektywność
stymulowania embriogenezy somatycznej w bioreaktorach dla
poinsecji. Wydajność- teoretycznie można otrzymać 100 tyś.
zarodków z 1 litra suspensji -czas ok 3 miesiące SZTUCZNE
NASIONA: *pozbawione otoczki zarodki somatyczne
poddane procedurze wysuszenia *otoczkowanie zarodków
poddane desykacji *uwodnienie zarodki ( merystemy
wierzchołkowe) otoczone kapsułą z żelu *uwodnione zarodki
zanurzone w płynnym żelu Otoczkowanie nasion:
unieruchomienie fragmentu tkanki *zminimalizowanie funkcji
życiowych *ochrona przed niekorzystnymi czynnikami
środowiska *ochrona przed utlenieniem i desykacja
(odwodnienie) *ochrona przed uszkodzeniem mechanicznym
podczas siewu i transportu *wprowadzenie regulatorów,
mikroflory, pestycydów* możliwość wprowadzenia do otoczek
hydrofilnych dodatkowych otoczek hydrofobowych Etapy
wytwarzania sztucznych nasion: roślina macierzysta,
*eksplantat *indukcja i proliferacja kalusa embriogennego
*namnożenie komórek w zawiesinie embriogennej. *
synchronizacja stadiów embiogenezy i hartowanie zarodków.
*filtrowanie *suszenie *otoczkowanie *wysiew nasion in-vivo
lub in-vitro RODZAJE HYDROŻELI: otoczki polisocharydowe-
najważniejsze ze wszystkich *organiczne żele
(poliakryloamidowe) *żele białkowe (żelatyna, polimer
glutaraldehydowy lub formaldehydowy Pochodz wiązań
żelifikujących żele powstają poprzez krzyżowe wiązanie
jonowe odpowiednio naładowanych polimerów np. Alginian,
chitozan, karaginian żele powstałe zimnej lub gorącej
polimeryzacji (agar, agaroza, karaginian). żele powstałe drogą
chemicznej reakcji (poliakrylamian, formaldehyd).Otoczki
agarowe Agar- polisacharyd ekstrahowany z różnych
gatunków czerwonych wodorostów pozyskiwanie: 2-4% agar
rozpuszcza się w soli fiajologicznej w temp. 100C, a następnie
schładza do 50C dodaje się materiał roślinny (zarodki lub
merystemy) zawieszone w soli fizjologicznej po zestaleniu
tnie się żel lub otacza fazą hydrofobową np. olejem można
ciepły agar wraz z komórkami wkraplać do oleju silikonowego
lub sojowego, umieścić na mieszadle magnetycznym i po
stężeniu oddziela się kuleczki -droga wirowania Otoczki
agarozowe Agaroza- naturalny czynnik żelifikujący otrzymany
z agaru pozbawionego grup estrowosiarczanowych
pozyskiwanie agaroza 2-4% w temp. 35*C dobrze się
rozpuszcza a jednocześnie żelifikuje przygotowany już roztwór
wraz z komórkami dodajemy wkraplając do oleju roślinnego
umieszczonego na mieszadle, całość oziębiamy i wirujemy
Otoczki alginianowe Alginiany otrzymywane są z olbrzymich
brązowych alg morskich Macrocystis i Laminaria drogą
ekstrachowania zasadą sodową. Otrzymywany kwas
alginianowy składa się z jednostki M ( kwas manuroniowy )
oraz jednostki G ( kwas gulurioniowy )Kiedy jony Na+
zastąpimy jonami dwuwartościowymi np. Ca2+ ,Ba2+ , Si2+,
Zn2+ lub Al3+ tworzy się sieć polimerowa pomiędzy jonami.
Powstają wiązania krzyżowe pomiędzy grupami
karboksylowymi, a molekułami polisacharodowymi. Proces
jest termo niezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu
dopasowuje się wapń. Procedura pozyskania suspensje
komórek miesza się w temp. pokojowej ze sterylnym
roztworem alginianu sodu 2-3% *następnie mieszaninę tę
wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300
mM
CaCl2) *perełki o określonej średnicy (0,5-5
mm) utwardzają się przez kilkanaście minut do kilku
godzin - powleka się je dodatkową warstwą hydrofobową na
etapie kiełkowania zarodków, otoczki rozpuszcza się w EDTA
lub buforze cytrynianowym ( fosforanowym )
KIEŁKOWANIE I KONWERSJA Kiełkowanie- zdolność do
formowania korzonka zarodkowego Konwersja-
równoczesny rozwój korzonka zarodkowego i merystemu
pędu, z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla
danego gatunku Otoczki karaginianowe Otrzymywane z
komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus,
Euchemia, Gigartina... pozyskiwania2-5% roztwór
karaginianu ogrzewa się do temp. 45°C, a po schłodzeniu
miesza się w/w roztwór z suspensją komórek *następnie
wkrapla się zawiesinę w karaginianie komórki do roztworu
KCl (kąpiel utwardzająca) *perełki (2-4 mm) otrzymuje się
w KCl przez 1-5 godz. najczęściej stosowane Inne celuloza i
jej pochodne,chitozan, żelifikujące gumy, pektyny,
podwójne otoczkowanie np. alginiany/ pektyniany ,
karaginian/ chitozan lub -algininian/ chitozan, najnowsze
otoczki hydrofobowe, Tulanox, Elwox, Bio- kapsuły!
(osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego
imitujące okrywę nasienną z kutikulą Efektywność maszyny
do otoczkowania -500000 sztucznych nasion o średnicy 80 ul
dziennie maszyna otoczkuje zarodki somatyczne: pomidorów,
bawełny, petunii, ogórka, sałaty, papryki, tytoniu, melona,
zbóż. *Stopień konwersji 8-90% i zależy od gatunku rośliny i
warunków kiełkowania. W warunkach polowych dla
sztucznych nasion M. media (lucerna) A. gravedens (seler) czy
D. carota (marchew) wynosi 50-80 RODZAJE NASION:
Ortodoks- genotypy, które można poddawać wysuszeniu
Rekakacitrant - genotypy bardzo wrażliwe na wysuszenia (nie
tolerują) Etapy wytwarzania sztucznych nasion Uzyskanie i
namnażanie materiału wyjściowego Dojrzewanie i hartowanie
(przygotowanie materiału do suszenia i otoczkowania) GA3 ,
ABA zapewniają prawidłowy rozwój zarodka, odporność na
dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu.
hartowanie polega na osuszeniu i lekkim schłodzeniu
Odwodnienie- eksykator lub glikol polietylenowy
Otoczkowanie- otoczka pełni rolę „sztucznego bielma„ a
dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienna” Wysiew-
w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do
warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub
wysiewu do gruntu in vivo Problemy technologii sztucznych
nasion indukcja zarodków somatycznych (dodatek różnych
substancji m. in. Aminokwasów), faza dojrzewania zarodków i
konwersji → podstawa ABA, problem O2, wysychanie otoczek,
stopniowe uwodnienie nasion!, koszty produkcji, próby
tworzenia Bio- kapsuł namnaża się przez sztuczne nasiona:
hybrydy ryżu, geranium, europejskie odm. ogórka , gerberę,
kawę, lucerne. Potencjalne korzyści szybkie namnażanie
pożądanej linii, gwarancja genetycznej jednorodności roślin
bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby dostarczanie i
namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów, takich jak
rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej
dostarczenie sterylnych linii redukcja kosztów związanych z
wegetatywnym namnażaniem linii elitarnych możliwość
masowej produkcji tkanki embriogennej z komórek poddanych
inżynierii genetycznejBANKI GENÓW Przechowywanie
materiału roślinnego Krótkoterminowe przechowywanie
materiału roślinnego w stosunkowo niskiej temp. Ok. 4°C, przy
niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach.
Długoterminowo- w temp. 70°C (zamrażanie przemian
metabolicznych, chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego
utleniania tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w
komórkach *w temp. -196°C (temp. Ciekłego azotu) komórki
przez wiele lat nie tracą żywotności Przechowywanie
komórek in vitro w bankach genów (zamrażanie)
Etapy:.wzrost wstępny kultury prowadzi się w pożywkach o
obniżonym potencjale chemiczny, wody (sacharoza, mannitol,
glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i
słabo zwakuolizowane) krioprotekcja (krioprezerwacja) przed
zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni
międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki
roztworem gliceryny, sacharozy, dwufenylosulfanianem
DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem plietylenowym.
Możliwe jest łączenie kriopretaktantów w formie 2 lub 3
składników. zamrażanie metodą konwencjonalną zamrażanie
wstępne (0-40°C) optymalne tempo schładzania 0,5-2 C/min.
(zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji, wody
w krioprotektancie) , zamrażanie trwałe w cikłym azocie
metoda odwodnienia struktury roślinneulegają odwodnieniu
(dehydratacji) w temp. Pokojowej, zamrażanie w ciekłym
azocie metoda witryfikacji umieszczenie tkanki w silnie
stężonym roztworze krioprotektantów (odciąganie wody do
przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu), zamrażanie w
ciekłym azocie przechowywanie właściwe (-196°C),
odmrażanie, przywrócenie właściwego tempa wzrostu
komórek Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności
genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stad z
powodzeniem stosowana jest do przechowywania tkanek
roślinnych, sztucznych nasion. Schemat zamrażania komórek
w ciekłym azocie Komórki roślinne--> Pożywka adaptacyjna--
> Mieszanina kriochronna -->Zamrażanie-->
Przechowywanie--> Rozmnażanie Przeżywalność
zakonserwowanego materiału zależy od: tolerancji na
dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów
odwadniających odporność na zamrażanie protoplastu (cecha
uwarunkowana genetycznie) stopnia uwodnienia i wielkości
zamrożonej struktury Banki genów Holandia, Francja, Anglia,
Belgia, Polska- Leśny Bank Genów w Kostrzycy od 1995 r.,
Ex- situ (poza naturalnym środowiskiem) →banki genów, In-
situ (poza naturalnym ekosystemem), In vitro (w szkle),
Zachowanie zasobów genowych in vitro techniki kultur in roślin transgenicznych 1*wyizolowanie i sklonowanie genu
vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio- lub przeznaczonego do transformacji 2*opracowanie metody
długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w wprowadzenia genu do komórek roślinnych, 3*ustalenie
bankach genów roślinnych izolowanie komórki, tkanki metodyki regeneracji transformowanych komórek kompletnie
zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, wykształcone rośliny, 4*określenie sposobu sprawdzenia
rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub integracji i ekspresji wprowadzonego genu, 5*zbadanie
arboretów, roślin transgenicznych przechowywane są w: stabilności transformowanego genu w następnych pokoleniach
warunkach powolnego wzrostu, warunkach kriogenicznych, w roślin i określenie sposobu dziedziczenia nabytej cechy
postaci sztucznych nasion PROF. BRODA Hodowla roślin. Konstrukt stosowany w transformacji składa się z : gen
W cyklu hodowlanym wprowadza się nowe oraz doskonali już strukturalny (cecha), gen markerowy ( selekcyjny) np. aro A,
istniejące cechy użytkowe tworząc odmiany w gatunkach odporność na glyfosad lub npt H, odporność na neomycyne i
roślin uprawnych. Rośliny nabierają nowych właściwości przez kanamycyne oraz reporterowy (wizualizujący) np. GUS, β
trwałą zmianę składu genetycznego. Genetyka- nauka o glukuronidaza , promotor i terminator, sekwencje regulacyjne
dziedziczności i zmienności organizmów NAUKOWE ( promotor poprzedzający gen strukturalny jest odpowiedzialny
PODSTAWY HR 1800 r. – prace T. A. Knighta, krzyżowanie za inicjację transkrypcji, a terminator za jej ukończenie)
roslin groch I pszenicy 1840 r. – Louis de Vilma wprowadza METODY TRANSFORMACJI: wektorowe , bakterie z
nową metodę selekcji indywidualnej, stosowana do dnia rodzaju Rhizobium- Agrobaterium fumefaciens plazmid Ti oraz
dzisiejszego 1866 r. – Grzegorz Mendel badania nad Agrobacterium rhizogenes , plazmid Ri System Agrobacterium
dziedziczeniem cech grochu, praca pt. „Versuche uber wykorzystuje się do roślin 2-liściennych bezwektorowe ,
Pflanzen- hybriden”; *Prawa Mendla- ponowne ich odkrycie makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja,
w 1900- Tschemark, de vries, Correns 1900 r. – De Vries- mikrowstrzeliwanie- wykorzystuje się do wprowadzenia
mutacje, *USA- kolekcjonowanie genotypów roślin uprawnych konstruktów DNA u roślin 1-liściennych wprowadzone geny:
1910 r. – pierwsze prace nad heterozją kukurydzy *prawo nie ulęgają ekspresji, bardzo słaba ekspresja zanika w
Hardy-ego- Weineberga *prawo czystości Johanensena 1920 r. kolejnych pokoleniach bo „wyciszenie genów”- poznano
– Muller i Stader- indukcja mutacji promieniami X, powierzchownie, przypadkowe miejsce integracji obcych
*chromosomowa teoria dziedziczenia Morgana *zmiana genów w transkrypcyjnie nieaktywne obszary genomu
ploidalności za pomocą kolchicyny 1950 r. – wykorzystanie wyklucza z reguły możliwość transkrypcji (rejony
zjawiska heterozji i powszechna uprawa 1960 r. – odkrycie chromosomów zwane heterochromatyną) modyfikacja obcego
mechanizmu regulacji działania genów ( Jackob i Monod), DNA przez metylacje, której ulega cytozyna, prowadzi to do
kultury in vitro, kultury protoplastów, uwodnienie totipotencji zablokowania trankrypcji trandezaktywacja ( kosupresja)
pojedynczej komórki roślinnej, wyhodowanie półkarłowych polega na wyciszaniu transkrypcji genu homologicznego za
pszenic 1970 r. – kultury pylników- uzyskanie haploidów, pomoca transformacji WYKORZYSTANIE ROŚLIN
embriogeneza somatyczna z protoplastów, pierwsze TRANSGEN W HODOWI wprowadzenie cech : odporność na
doświadczenie z selekcjonowaniem DNA 1980 r. – szkodniki i choroby wirusowe, bakteryjne i grzybowe
zastosowanie biotechnologii, udowodnienie, geny u roślin odporność na herbicydy modyfikacje cech użytkowych roślin
ulegają dziedziczeniu zgodnie z prawami Mendla 1990 ingerencja w metabolizm związany z dojrzewaniem
transforowanie roślin KULTURY IN VITRO To hodowla modyfikowanie spektrum barw kwiatów zmiany w
komórek i tkanek roślinnych na sztucznych pżywkach w metabolizmie węglowodanów i tłuszczów rośliny
warunkach sterylnych. Regeneracja roślin na drodze transgeniczne jako bioreaktory do syntezy białek: alfa-
organogenezy lub embriogenezy somatycznej amylazy, beta- glukozydazy, peroksydaza ligniny – białka
Mikrowstrzeliwanie- rozmnażanie klonalne, kultury zarodków, przemysłowe oraz źródło przeciwciał i szczepionek rośliny
kultury roślin haploidalnych Haploid- roślina zawierająca w transgeniczne mogą służyć do biodegradacji plastiku
swoich komórkach somatycznych gametyczną liczbe
chromosomów Sposoby uzyskiwania roślin haploidalnych
eliminacja chromosomów w zarodkach powstających w
wyniku krzyżowań między gatunkami i między rodzajami,
androgeneza – sporoficzny rozwój gametofitu męskiego:
kultury pylnikowe , kultury izolowanch mikrospor
gynogeneza- sporoficzny rozwój z haploidalnych komórek
woreczka zalążkowego: kultury niezapłodnionych zalążkó i
zalążni, kultury zapłodnionych zalążków i zalążni
Uzyskiwanie zmienności
genetycznej:Mutacje
Rekombinacje i segregacje, kultury merystemowe,
transformowanie obcego DNA, kultury kalusa , mieszańce
płciowe , kultury protoplastów, mieszańce somatyczne,
haploidy (-) androgeneza (-) gynogeneza Utrzymanie
zmienności gamet i rozmnażania roślin Kultura
merystemów i pąków przybyszowych, Kultury kalusowe,
Kultury komórki, Kultury protoplastów Zalety z kultur in
vitro w pracach genetyczno- hodowlanych Dysponowanie
ogromnymi liczebnościami genotypów na bardzo małych
powierzchniach, Uzyskanie efektów selekcji w krótkim czasie
,Możliwości bardzo precyzyjnej kontroli czynników
dotyczących działania mutagetagenami, warunków selekcji i
wzrostu DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA Porównanie
markerów molekularnych z morfologicznymi *przy
pomocymarkerów molekularnych, genotypy roślin mogą
być określane w całym okresie wzrostu i rozwoju rośliny, na
poziomie tkankowym i komórkowym w przypadku
markerów morfologicznych, genotypy określane są tylko na
poziomie całych roślin i często dopiero w stanie dojrzałej
rośliny. *w wielu gatunkach roślin występuje naturalna
zmienność alleli w większości loci markerów
molekularnych. A zatem w badaniach genetycznych można
wykorzystać naturalną zmienność w istniejących
populacjach bez konieczności zmienności wymaganej często
dla loci morfologicznych *zmiennośćizoenzymów i
markerów DNA wykazuje zwykle neutralność fenotypową
podczas gdy markery morfologiczne powodują zmienność
fenotypowa często niepożądana w populacjach
hodowlanych *allele niektórych typów loci molekularnych
(np. izoenzymy, RLFP) wykazują kodominujący charakter
dziedziczenia. Dominujący charakter dziedziczenia cech
morfologicznych uniemożliwia rozróżnienie wszystkich
genotypów *niepożądane działania epistatyczne występujące
często pomiędzy loci kodującymi morfologiczne cechy mogą
limitować liczbę segregującuch markerów możliwych do
obserwacji w jednej segregującej populacji. Większość
markerów molekularnyc pozbawiona jest tego typu
oddziaływań tak więc liczba loci, jaką można obserwować
w jednej populacji jest teoretycznie ograniczona.
Diagnostyka oparta o markery (znaczniki, własności)
Diagnostyka oparta o markery morfologiczne (monogeniczne
dziedziczenie)Diagnostyka molekularna oparta o markery
genetyczne Wynik diagnostyczny powstaje na podstawie
Oceny polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych
(RFLP)Określenie długości badanego fragmentu DNA
Wykrycie delecji, insercji, mutacji punktowych Określenie
sekwencji badanego fragmentu DNA Łańcuchowe reakcje
polimerazy PCR stadia reakcji: denaturacja DNA, w temp.
od 95°C w wyniku której powstają jednoniciowe cząsteczki
DNA 2.przyłączanie starterów do jednoniciowej cząsteczki
DNA w miejscach komplementarnych do homologii starterów
ich długości itp. 3.synteza nowych nici DNA w temp. od 72°C
Rodzaje markerów molekularnych izoenzymy (polimorfizm
białek, kodominowanie) *markery DNA (polimorfizm DNA)
RFLP,MAAP, AFLP, STMS, SCAR (STS) *RFLP badanie
polimorfizmu Diagnostyka oparta na hybrydyzacji z
sondami molekularnymi hybrydyzacja punktowa DNA lub
RNA, unieruchomienie w temp. 80°C lub promieniowanie UV,
inkubacja z sondami metoda Sontherna hybrydyzacja DNA-
DNA metoda Northen hybrydyzacja RNA-DNA hybrydyzacja
in situ. PTL- loci cech ilościowych Inżynieria
genetycznaGenetyka molekularna i technika rekombinacji
DNA przyczyniły się do opracowania metod pozwalających na
uzyskanie nowej zmienności droga transformacji
Transformacja genetyczna – jest to proces przenoszenia
obcych fragmentów DNA (genów) do genomu biorcy i stabilna
ich integracje w tym genomie (przenoszenie genów bez
względu na ich oddalenie fitogenetyczne) Etapy uzyskiwania